NO174392B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av acyldeoksyribonukleosidderivater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører analogifremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk aktivt acylderivat av et 2'-deoksyribomikleosid, med formel:

eller et farmasøytisk akseptablet salt derav, hvori R4 er

Ri er en lineær fettsyrerest med 3 til 22 karbonatomer, og

R 2 er hydrogen, eller

R^ og Rg er lavere alkanoyl, og

hvor R4 er

Ri er en lineær fettsyrerest med 18 til 22 karbonatomer,

R2 er hydrogen.

Det er fundamentalt to mulige kjemiske eller biokjemiske metoder for attemiering av de skadelige effektene av ionisert bestråling på organismer: (1) attenuering av opprinnelig skade på biologiske strukturer,

(2) forbedring eller aksellerasjon av helbredelsen.

Et antall forbindelser som tilveiebringer en viss grad av beskyttelse overfor ionisert bestråling når de er tilstede i kroppen i løpet av bestrålingen er kjente. Slike forbindelser er vanligvis antioksydanter eller fri-radikalkonsumenter som inaktiverer reaktive kjemiske former dannet i løpet av bestrålingen før de kan skade viktige biologiske strukturer. Viktige eksempler på radiobeskyttende forbindelser omfatter cysteamin, 2-beta-amino-etyl-isotiouronium-Br-HBr (AET), og S-2-(3-aminopropylamino )etylfosfortiosyre (WR-2721 ). På grunn av at disse forbindelsene må bli ført inn i organismen før eller i løpet av bestrålingen er disse tydeligvis ikke nyttige i situasjoner innbefattet uventet eller tilfeldig utsetting. Disse forbindelsene er forøvrig toksiske i mennesket. Hovedmulighetene for effektiv kjemisk terapi i organismer hvori bestråling allerede har oppstått er: (1) å fremme preparering og helbredelse av individuelle celler innenfor organismen, eller (2) å akselerere eller forsterke proliferasjonen og/eller differensieringen av overlevende stamceller.

Benmarg og tarmepitel er blant de vevene som er følsomme overfor strålingsskade; og forsøk på å fremme helbredelse fra bestråling må baseres på stamcellene i disse vevene.

Det eksisterer flere midler som kan forbedre overlevelsen av bestrålte pattedyr når disse blir administrert etter bestråling. Disse omfatter gjær-avledet polysakkaridglukan og polypeptidcytokiner såsom interleukin-1, granulocytt-koloni-stimulerende faktor og granulocytt/makrofag-kolonistimuler-ende faktor, og alle disse midlene forbedrer benmargsstam-celleproliferasjon eller differensiering. Effektiviteten til disse er derimot beskjeden og produserer dosereduksjons-faktorer på mindre enn 1,1 når de blir administrert etter at bestrålingen allerede har oppstått og anvendelsen av disse er vanskelig på grunn av bieffektene. De er derimot alle makromolekyler som bare kan bli administrert parenteralt.

Det er nødvendig med forbindelser som på en effektiv måte fremmer helbredelse når de blir administrert etter utsetting for ioniserende bestråling og som har viktige farmasøytiske kvaliteter såsom ikke-toksisitet og aktivitet etter oral administrasjon. Slike midler vil være nyttige i tilfeller av tilfeldig utsetting for ioniserende bestråling, og også i sammenheng med bestrålingsterapi ved kreft, for å fremme helbredelse av normalt vev etter bestråling. Slike midler kan også forbedre helbredelsen ved visse former av kjemisk skade, f.eks. benmargssupresjon etter enten tilfeldig eller terapeutisk utsetting for forbindelser såsom cyklofosfamid eller busulfan, som begge er blitt anvendt ved kreftkjemoterapi. Det er blitt demonstrert at administrasjon av eksogen deoksyribonukleinsyre (DNA) til eksperimentelle dyr etter utsetting for ioniserende bestrålning kan resultere i forbedret overlevelse og funksjonell helbredelse. Kanazir et al., Bull. Inst. Nuc. Sei. "Boris Kidrich" 9:145-153 (1959); Wilczok, T. , et al., Int. J. Rad. Biol. 9:201-211 (1965 ); Golba, S., et al., Int. J. Rad. Biol. 13:261-268 (1967); US patent nr. 3,803,116.

Studier i cellekulturer in. vivo foreslår at de egentlige helbredende midlene er deoksyribonukleosider som utgjør de enzymatiske degraderingsproduktene av DNA. Petrovic, D. , et al., Int. J. Rad. Biol. 18:243-258 (1970 ). Depolymeri sert DNA eller deoksyribonukleosider administrert til dyr var derimot ueffektive når det gjelder forsterking av overlevelse eller helbredelse etter bestrålning. Kanazir et al., Bull. Inst. Nuc. Sei. "Boris Kidrich" 9:145-153 (1959). Det er grunn til å tro at denne tilsynelatende motsigelsen er forårsaket av hurtig katabolisme av deoksyribonukleoisder in vivo av enzymer i plasma og forskjellige organer. Derfor blir vev etter administrasjon av deoksyribonukleosidene til gnagere utsatt for effektive konsentrasjoner i mindre enn 5 minutter. Beltz et al., Bioch. Biophys., Acta. 297:258-267 (1973). I cellekulturer ble optimal overlevelse etter bestrålning funnet når deoksyribonukleosider var tilstede i kulturmediet i minst 3 timer. Når DNA blir administrert parenteralt blir det sannsynligvis gradvis depolymerisert for å gi en vedvarende frigjøring av frie deoksyribonukleosider inn i sirkula-sj onen.

Det kan eksistere andre fysiologiske eller patologiske betingelser i pattedyrvev hvor tilførselen av eksogene deoksyribonukleosider kan ha terapeutiske anvendelser. Newman et al., Am. J. Physiol. 164:251-253 (1951) beskriver en studie av rotter utsatt for partiell hepatektomi. Forløpet av leverregenereringen ble fulgt i 11 dager. Leverene til rotter behandlet med DNA regenererte betraktelig hurtigere enn leverene til ubehandlede dyr. Det er sannsynlig at deoksyribonukleosidene var de aktive midlene i denne studien på grunn av at DNA er et stort molekyl som ikke blir tatt opp effektivt av pattedyrcellene. Videre har DNA påført på hudsår vist å aksellerere noen aspekter av legingsprosessen, f.eks. dannelsen av granuleringsvev. Dumont, Ann. Surg. 150:799-807

(1959); Marshak et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 58:62-63

(1945); Nicolau et al., Der Hautartzt 17:512-515 (1966), Yane og Kitano, U.S. Patent nr. 4,656,896 beviser fordelaktige effekter av parenteralt administrert DNA ved behandling av mavesår i rotter.

I disse eksemplene er det sannsynlig at effekten av DNA var relatert til dets gradvise degradering resulterende i frigjøring av deoksyribonukleosider over en forlenget tidsperiode. DNA er derimot ikke et egnet farmasøytisk middel å administrere til mennesker hverken oralt eller parenteralt. Ved oral administrasjon vil nukleosider frigjort fra DNA hovedsakelig bli degradert av enzymer i tarmhulrommet, i tarmveggene, i plasma og i leveren enn å være tilgjengelig for vev. Problemer med parenteralt administrert DNA omfatter mulig antigenisitet (forverret ved adhererende proteiner som er vanskelig å fjerne i løpet av ekstraksjonen), ujevnheter i batchene og mulige uønskede effekter som ikke er relatert til nukleosidfrigjøring, f.eks. forsterking av interferonfrigjø-ring fra lymfocytter som er en kjent effekt ved dobbelttrådet nukleinsyre.

Administrasjon av deoksyribonukleosider har hittil blitt betraktet for reversering av tydelige deoksyribotidmangler (f.eks. tymidinadministrasjon for å reversere toksisiteten forårsaket av metotreksat, et antineoplastisk middel som hemmer tymidinnukleotidbiosyntesen; administrasjon av deoksycytidin for å reversere arabinosylcytosintoksisitet eller gitt til mennesker som mangler spesielle enzymer (f.eks. purinnukleosidfosforylase) som fører til forringet deoksyribonukleotidsyntese). Tymidinadministrasjon er også blitt betraktet som antineoplastisk behandling på grunn av at tymidin har cytostatiske eller cytotoksiske egenskaper i høye konsentrasj oner.

Det er blitt oppdaget at uventede fordelaktige virkninger kan bli tilveiebragt etter administrasjon av suprafysiologiske mengder av deoksyribonukleosidblandinger på en slik måte at de er tilgjengelige for vev i en lengre periode. Dette målet blir best oppnådd ved anvendelse av deoksyribonukleosidderivater fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Strategien for tilføring av DNA og/eller deoksyribonukleosider til fysiologisk eller patologisk skadet vev er blitt oppdaget. Det er tidligere ikke vært mulig å tilveiebringe tilfredsstillende metoder for tilføring av deoksyribonukleosider i tilstrekkelige høye og pålitelige mengder in vivo for å behandle de patologiske og fysiologiske tilstandene tilfredsstillende og å fremme cellulær reparering og overlevelse av dyret. Til tross for at forskjellige forbindelser som beskytter dyrene for noen effekter ved ionisert bestråling eller kjemiske mutagener er blitt utviklet, fører tilføring av deoksyribonukleosider til vev i tilstrekkelig tid til det største kliniske potensialet for etter-utset-tingsbehandling av en slik skade. Klinisk gjennomføring av denne strategien venter på utvikling av tilfredsstillende og hensiktsmessige metoder for tilføring av tilstrekkelige mengder av deoksyribonukleosider til vev in vivo. Fullstendig forståelse og klinisk gjennomføring av kapasiteten til deoksyribonukleosidene for å fremme leging av sår eller reparering av vev venter på utvikling av tilfredsstillende metoder for tilføring til vev in vivo.

Deoksyribonukleosidderivatene kan bli effektivt administrert oralt eller parenteralt, med minimal toksisitet. De kan bli administrert til dyr og mennesker for effektivt å fremme cellulær reparering i et antall fysiologiske og patologiske tilstander og å fremme overlevelsen av dyr når disse blir administrert etter utsetting for bestråling.

En annen og tilknyttet hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe visse derivater av 2'-deoksyadenosin, 2'-deoksyguanosin, 2'-deoksycytidin, og 2'-deoksytymidin som ved administrering til et dyr vil tilføre disse deoksyribonukleosidene til dyrevevet.

Den biologiske tilgjengeligheten av deoksyribonuklosid-derivatene blir forbedret ved å øke transporten av disse gjennom fordøyelseskanalen og andre biologiske membraner.

Deoksyribonukleosidderivatene kan anvendes for behandling av forskjellige lever, ben, hud hematoglogiske og andre patologiske og fysiologiske tilstander, samt for å forhindre eller behandle bestrålnings-, sollys- og mutagen-induserte cellulære skader.

De er billige og aksellerer de normale cellulære prosessene omfattende regenerering og leging.

Tidligere teknikk beskriver noen acylerte derivater av deoksyribonukleosider idet deres substituenter (f.eks. pivaloat, isobutyrat, benzoat, eller adamantoat) ble valgt for egenskaper tilknyttet anvendelse som beskyttende grupper i kjemisk syntese (f.eks. av oligonukleotider) og er generelt ikke akseptable for administrasjon til dyr. Den nye forbindelsen beskrevet heri er foretrukket på grunn av de ikke-toksiske substituentene. Disse medfører minimal skade på organismen som de blir administrert til og kan bli valgt på en slik måte at de tilveiebringer ønskelige farmasøytiske og farmakologiske egenskaper uten unødig eksperimentering.

Acylerte derivater til noen antineoplastiske og antivirale nukleosidanaloger er blitt anvendt som promedikamenter til disse cytotoksiske midlene. Veldig forskjellige biokjemiske og fysiologiske tilstander er innbefattet ved forbedring av den terapeutiske indeksen til toksiske nukleosidanaloger versus tilføring av ikke-toksiske deoksyribonukleosider i hensiktsmessige mengder og kombinasjoner for forbedring av reparering eller regenerering av vev, som i foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig analogifremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk aktivt acylderivat av et 2'-deoksyribonuklesid, med formel: eller et farmasøytisk akseptablet salt derav, hvori R4 er

R^ er en lineær fettsyrerest med 3 til 22 karbonatomer, og R2 er hydrogen, eller

R^ og R2 er lavere alkanoyl, og

hvor R4 er

Ri er en lineær fettsyrerest med 18 til 22 karbonatomer,

R2 er hydrogen,

kjennetegnet ved å

i) omsette syreanhydridet til den ønskede acylforbindelsen med det tilsvarende deoksyribonukleosidet i pyridin, dimetylformamid eller en blanding av de to, eller

li) omsette syrekloridet til den ønskede acylforbindelsen med tilsvarende deoksyribonukleosid i pyridin, dimetylformamid eller en blanding av de to.

Avgivelse av eksogene deoksyribonukleosider til vevet i et dyr kan effektivt oppnås ved administrering av en effektiv mengde av et acylderivat av et 2'-deoksyribonukleosid til dyret. Ved å øke avlevering av eksogene deoksyribonukleosider og dermed øke den biologiske tilgjengeligheten kan det være mulig å behandle fysiologiske eller patologiske tilstander i vevet til et dyr ved hovedsakelig å understøtte noen metabolske funksjoner derav. Den biologiske tilgjengeligheten av nukleosidanabolitter, f.eks. nukleotider eller nukleotid-avledete kofaktorer kan økes. Administrasjon av selve nukleosidene øker deres biologiske tilgjengelighet, men dette behøver ikke å resultere i vedvarende forhøyede cellulære nukleotidnivåer på grunn av den hurtige ekstra-cellulære katabolismen. Ved lavere nukleosidnivåer foregår et raskt opptak og anvendelse ved cellene, mens ved høyere nivåer er det metning og overskuddet blir nedbrutt.

De spesifikke betingelsene hvor fordelene kan bli oppnådd ved anvendelse av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen omfatter situasjoner hvor forbedring av DNA-reparering eller forbedring av stamcelledifferensiering og proliferasjon er nyttig. Slike tilstander omfatter spesielt: (1) behandling eller forhindring av skade forårsaket av ionisering eller ultrafiolett bestrålning, (2) forbedring av gjenopprettelsen av hematopoiesis ved redusert benmargsfunksjon forårsaket av ionisert bestrålning, kjemisk skade (f.eks. bivirkninger ved anticancer eller antivirale behandlinger), eller sykdommer, og (3) aksellerering av regenerasjonen og reparasjon av forskjellig skadet vev, f.eks. leging av sår og brannskader, eller ved fremming av regenerasjon av skadet levervev. Administrasjon av de acylerte derivatene tilveiebringer visse fordeler i forhold til de ikke-derivatiserte forbindelsene. Acylsubstituentene kan bli valgt slik at de øker lipofilisi-teten til nukleosidet som forbedrer dets transport fra mave-tarmkanalen og inn i blodstrømmen. De acylerte derivatene er effektive når de blir administrert oralt og kan i noen tilfeller bli påført topisk. De acylerte derivatene er motstandsdyktige overfor katabolisme ved nukleosiddeminaser og nukleosidfosforylaser i tarmen, leveren, andre organer og blodstrømmen. Administrasjon av de acylerte derivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, enten oralt, parenteralt eller topisk tillater dermed vedvarende avgivelse av ønskelige kombinasjoner og mengder deoksyribonukleosider til vevet til et dyr på grunn av at acylsubstituentene blir gradvis fjernet av enzymer (esteraser og peptidaser) i plasma og vev som frigjør frie deoksyribonukleosider over tid.

Fig. 1 er en grafisk fremstilling som illustrerer ned-brytningshastigheten til deoksyribonukleosider i plasma. Følgende forkortelser blir anvendt:

dT = 2'-deoksytymidin

dC = 2'-deoksycytidin

dG = 2'-deoksyguanosin

dA = 2'-deoksyadenosin

Fig. 2 er en grafisk fremstilling som illustrerer den hurtige katabolismen av deoksyadenosin og den gradvise deacyleringen av adenosinderivater (for å gi deoksyadenosin) i plasma. Fig. 3 er en grafisk fremstilling som illustrerer den hurtige katabolismen av deoksyadenosinderivater (for å gi deoksyadenosin) i leverekstrakt. Fig. 4 er en grafisk fremstilling som illustrerer plasma-tymidinkonsentrasjoner etter oral administrasjon av tymidin eller di-O-acetyltymidin til rotter.

En "metabolitt" er en kjemisk forbindelse som blir dannet ved, eller som deltar i, en metabolsk reaksjon. Metabolitter omfatter her ikke bare karboksylsyrer som er kjent for å bli syntetisert i menneskekroppen, men også naturlig forekommende (men kanskje syntetisert istedenfor ekstrahert) karboksylsyrer som kan være avledet fra andre dyre- eller plante-kilder. Det begrensende kriteriet er at forbindelsen bør være vesentlig ikke-toksisk og biokompatibelt og bør lett gå inn i metabolske veier in vivo, slik at den ikke medfører toksisitet i løpet av langstidskonsumering i de foreslåtte dosene. Det er foretrukket at forbindelsene blir metabolisert og ikke utskilt intakt (eller konjugert via detoksifiseringsreak-sjoner), idet konsentrering av karboksylsyrer i nyrene kan føre til omfattende uønsket surhet. Derfor er karboksylsyrer som vanligvis eller lett deltar i intermediær, katabolsk eller anabolsk metabolisme foretrukne substituenter. Betegn-elsen "farmasøytisk akseptable salter" betyr salter med farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter av deoksyribonukleosidderivatene, som omfatter, men ikke er begrenset til svovelsyre, saltsyre eller fosforsyre.

"Acylderivater" betyr derivater av et 2'-deoksyribonukleosid hvori en vesentlig ikke-toksisk organisk acylsubstituent avledet fra en karboksylsyre blir festet til en eller flere av de frie hydroksylgruppene til riboseandelen av deoksyribonukleosidet med en esterbinding og/eller hvor en slik substituent er festet til et primært eller sekundært amin i pyrimidinringen til deoksycytidin eller deoksytymidin, eller i purinringen til deoksyadenosin eller deoksyguanosin, med en amidbinding. Slike acylsubstituenter er avledet fra karboksylsyre som omfatter, men er ikke begrenset til, forbindelser fra gruppen bestående av melkesyre, en aminosyre, en fett-syre, nikotinsyre, dikarboksylsyrer, p-aminobenzosyre eller orotisk syre. Foretrukne acylsubstituenter er grupper som normalt er tilstede i kroppen, enten som bestanddeler i dietten eller som intermediære metabolitter som hovedsakelig er ikke-toksiske når de blir spaltet fra deoksyribonukleosidet in vivo.

"Fettsyrer" er alifatiske karboksylsyrer med 2-22 karbonatomer. Slike fettsyrer kan være mettede, delvis mettede eller polyumettede.

Foretrukne acylderivater av 2-deoksyribonukleosider for øking av transporten over biologiske membraner innbefatter slike som er mer lipofile enn foreldrenukleosidene. Generelt har lipofile acylnukleosidderivater acylsubstituenter som er upolare (bortsett fra karboksylatgruppen). Lipofile acylsubstituenter omfatter spesielt grupper avledet fra fettsyrer inneholdende 2 til 22 karbonatomer. Fagmannen kan bestemme om et bestemt acylsubstituert nukleosidderivat er mere lipofilt enn det ikke-derivatiserte nukleosidet ved anvendelse av standardteknikk, dvs. sammenligning av fordelingskoeffisien-tene bestemt i vann-oktanolblandinger.

Etter passering av det acylerte nukleosidderivatet fra mave-tarmkanalen og inn i blodstrømmen, eller over andre biologiske membraner blir acylsubstituentene spaltet av plasma og vevsesteraser (eller amidaser) for å gi de frie nukleosidene. De foretrukne acylgruppene er naturlig forekommende metabolitter i kroppen eller forbindelser som lett går inn i intermediære metaboliske veier. De frembringer dermed lite toksisitet når de blir frigjort in vivo av endogene esteraser eller amidaser.

Det er også mulig å fremstille acylnukleosider som inneholder både polare og upolare acylsubstiuenter. Den polare acyl-gruppen hemmer passasjen av nukleosidderivater fra mave-tarmkanalen og tillater en mere vedvarende avgivelse av forbindelsen inn i blodstrømmen etter en enkelt dose. Den polare gruppen kan bli spaltet av esteraser, amidaser eller peptidaser tilstede i tarmkanalen for å gi et nukleosid med en upolar acylsubstituent som deretter effektivt kan gå inn i sirkulasjonen. Polare acylsubstituenter kan bli valgt av fagmannen uten unødig eksperimentering og disse blir spaltet i en hurtigere hastighet enn upolare acylsubstituenter. Slike foretrukne substituenter omfatter basiske aminosyrer (lysin eller arginin), sure aminosyrer (glutamat eller aspartat), eller dikarboksylsyrer.

For parenteral injeksjon kan acylderivater med polare substituenter som derfor er vannoppløselig, men mostands-dyktige mot prematurnedbrytning eller eliminasjon også med fordel bli anvendt.

De lipofile acyldeoksyribonukleosidderivatene fremstilt Ifølge oppfinnelsen er nyttige for forsterking av transporten av deoksyribonukleosider gjennom biologiske membraner omfattende mave-tarmkanalen i dyr og som dermed øker den biologiske tilgjengeligheten av deoksyribonukleosidene. Slike dyr omfatter først og fremst mennesket.

De farmasøytiske aktive acylderivatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli administrert til et dyr enten før eller etter utsetting for bestråling, sollys eller mutagener. Acylderivatformen av deoksyribonukleosidene tilveiebringer en oral effektiv måte for avgivelse av deoksyribonukleosider til vevene. Disse derivatene kan også bli gitt parenteralt eller topisk. Administrasjon av derivatene unngår problemet med hurtig katabolisme av mave-tarmenzymene, leverenzymene og plasmaenzymene.

Som vist i fig. 1 blir fritt deoksyguanosin (dG) og deoksyadenosin (dA) ekstremt hurtig nedbrutt i plasma.

Forløpene til deoksyadenosin, 5'-O-acetyldeoksyadenosin, og 5'-O-valeryldeoksyadenosin i plasma er vist i fig. 2. Hver av disse forbindelsene blir satt til separate aliquoter av rotteplasma i opprinnelige konsentrasjoner på 20 jjmolar. Det ble tatt prøver av plasmaet ved forskjellige tidspunkter og de ønskede forbindelsene ble analysert ved vaeskekromatograf i .

Deoksyadenosin (dA) blir veldig raskt nedbrutt i plasma og forsvinner i løpet av 10 minutter. Administrasjon av denne forbindelsen til et dyr eller menneske vil gjøre deoksyadenosin tilgjengelig for vev i et veldig kort tidsrom.

5'-O-acetyldeoksyadenosin og 5'-O-valeryldeoksyadenosin blir derimot deacylert i plasma (for å danne deoksyadenosin) i løpet av en periode på flere timer. Derfor vil administrasjon av en hvilken som helst av disse forbindelsene resultere i forlenget tilgjengelighet av deoksyadenosin for vevene.

Forløpet til deoksyadenosin, 5'-O-acetyldeoksyadenosin og 5'-O-valeryldeoksyadenosin i leverekstrakt er vist i fig. 3. Hver av disse forbindelsene ble satt til separate aliquoter av et vandig ekstrakt av rottelever ved opprinnelige konsentrasjoner på 20 jjmolar. Ekstraktet ble tatt prøver av ved forskjellige tidspunkter og de ønskede forbindelsene ble analysert ved vaeskekromatograf i .

Deoksyadenosin (dA) blir ekstremt hurtig nedbrutt i plasma og forsvinner i løpet av 1 minutt. Det opprinnelige de-graderingsproduktet er deoksyinosin som ikke direkte blir påny utnyttet av vevene. Administrasjon av deoksyadenosin per se til et dyr eller mennesket ville gjøre deoksyadenosin tilgjengelig for vevene i bare kort tid.

5'-O-acetyldeoksyadenosin og 5'-O-valeryldeoksyadenosin blir derimot deacylert i leverekstrakt (for å danne deoksyadenosin) i løpet av en periode på mer enn 1 time. Derfor ville administrasjon av hvilke som helst av disse forbindelsene resultere i forlenget tilgjengelighet av deoksyadenosin for lever eller andre organer.

Derfor kan en blanding av flere forskjellige acylderivater av hvert deoksyribonukleosid i en administrert dose bli valgt for å tilveiebringe optimal biologisk tilgjengelighet. En sammensetning inneholdende 3',5'-diacetyl-2'-deoksycytidin og 5'-palmitoyl-2'-deoksycytidin (og korresponderende derivater av andre deoksyribonukleosider) tilveiebringer en mere forlenget biologisk tilgjengelighet av nukleosider etter en enkeltdose enn administrasjon av et enkelt acylderivat av hvert nukleosid. Etter administrasjon av blandingen beskrevet ovenfor blir den acetylerte forbindelsen relativt hurtig deacylert som tilveiebringer fritt deoksycytidin (eller andre ønskede deoksyribonukleosider) kort etter administrasjon. 5'-palmitoylderivatet blir deacylert saktere, og tilveiebringer ytterligere fritt deoksycytidin etter at deoksycytidinet avledet fra 35'-diacetyl-2'-deoksycytidin er blitt metabolisert av vevene.

Acyldeoksyribonukleosidsammensetningen kan bli formulert som en del av en solkrem som kan bli påført før eller etter utsetting for sollys. Solkremen kan også omfatte en eller flere solblokkerende midler såsom PABA, estere av PABA og andre ikke-PABA kjemiske solblokkerende midler. Acyldeoksy-nukleotidene blir absorbert av huden og tatt opp av cellene. Acyldeoksyribonukleosidene blir deretter spaltet av esteraser i vevet som gir frie deoksyribonukleosider i mengder som er effektive for reparering av sollysindusert skade. Kombinasjon av acyldeoksyribonukleosidsammensetningene og et solblokkerende middel såsom PABA gir hudet maksimal beskyttelse for solen.

Acyldeoksyribonukleosidene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også bli anvendt for forbedring av noen av effektene ved aldring ved å tilveiebringe, et høyt og vedvarende nivå av deoksyribonukleosidene for å forsterke de naturlige DNA-reparasjonsprosessene til cellene og dermed behandle den naturlig forekommende progressive akkumulasjon av skade på DNA som oppstår ved aldring. Sammensetninger for behandling eller forbedring av effektene ved aldring kan bli påført topisk, i form av et hudvann, eller kan bli administrert oralt eller parenteralt.

Det eksisterer betingelser forskjellig fra bestrålingsskade hvori eksogene deoksyribonukleosider eller derivater derav har nyttige terapeutiske anvendelser.

Deoksyribonukleinsyre er blitt anvendt får å akselerere arrdannelsen ved sår eller leging av sår, og også for å akselerere lever-regenerering i forsøksdyr. Det er sannsynlig at i disse situasjonene, samt i situasjoner hvor DNA blir anvendt for å fremme overlevelse etter bestrålning av dyrene, virker DNAet som et lagringsdepot for deoksyribonukleosider, som gradvis frigjør deoksyribonukleosidene og deoksyribonukleosidene i løpet av enzymatisk degradering.

Administrasjon av acylerte deoksyribonukleosider, som beskrevet heri, er en metode for levering av deoksyribonukleosider til vevene, som er fordelaktig i forhold til administrasjon av fremmed DNA for å forbedre leging av sår eller for vevsregenerering. I forhold til DNA er acylerte deoksyribonukleosider effektive etter oral administrasjon. De er også ikke-antigene og det er mye lettere å rense disse enn

DNA.

Det er i enkelte tilfeller nyttig å avgi et enkelt deoksyribonukleosid til vevene, f.eks. deoksycytidin for behandling av toksisitet forårsaket av antineoplastisk medikament-arabinosylcytosin, eller tymidin for behandling av toksisiteten forårsaket av metotreksat. I slike tilfeller kan acylderivatene av et enkelt depksyribonukleosid bli administrert.

Når syrekilden til det ønskede acylderivåtet har grupper som interferer med acyleringsreaksjonene, f.eks. hydroksyl eller aminogrupper, kan disse gruppene bli blokkert med beskyttende grupper, f.eks. t-butyldimetylsilyletere eller t-BOC-grupper, respektivt, før fremstilling av anhydridet. For eksempel kan melkesyre bli omdannet til 2-t-butyldimetylsiloksypropionsyre med t-butyldimetylklorsilan, etterfulgt av hydrolyse av den resulterende silylesteren med vandig base. Anhydridet kan bli dannet ved omsetting av den beskyttede syren med DCC. Med aminosyrene kan N-t-BOC-derivatet bli fremstilt ved anvendelse av standardteknikker som deretter blir omdannet til anhydridet med DCC. Med syrer som inneholder mere enn en karboksylatgruppe (f.eks. ravsyre, fumarsyre eller adipisk syre) blir syreanhydridet til den ønskede dikarboksylsyren omsatt med et 2'-deoksyribonukleosid i pyridin.

3',5'-diacyldeoksytymidin kan bli fremstilt ifølge fremgangs-måtene beskrevet av Nishizawa et al., Biochem. Pharmacol. 14:1605 (1965), ved behandling av deoksytymidin med 2,1 ekvivalenter av et syreanhydrid av den ønskede acylforbindelsen i pyridin etterfulgt av oppvarming til 80-85°C i minst en time. Alternativt kan deoksytymidinet bli behandlet med 2,1 ekvivalenter av et syreklorid i pyridin ved romtemperatur. (Se eksempel 1).

5'-hydroksylgruppen til deoksytymidin kan selektivt bli acylert med 1 ekvivalent av syreanhydridet til den ønskede acylforbindelsen i pyridin som blir oppvarmet til 80-85°C ifølge Nishazawa et al.. Alternativt kan syrekloridet (1 ekvivalent) bli omsatt med deoksytymidin i pyridin og DMF i romtemperatur ifølge Baker et al., J. Med. Chem. 21:1218

(1978). (Se eksempel 2).

3'-hydroksylgruppen deoksytymidin kan selektivt bli acylert ved selektiv dannelse av 5.'-O-t-butyldimetylsilylderivatet med 1,2 ekvivalenter t-butyldimetylklorsilan i DMF inneholdende imidizol etterfulgt av acylering av 3'-hydroksylgruppen med det hensiktsmessige syreanhydridet og spalting av 5'-t-butyldimetylsilyleter ifølge Baker et al. (Se eksempel 3).

3',5'-diacyldeoksycytidin kan bli fremstilt ifølge en fremgangsmåte ifølge Gish et al., J. Med. Chem. 14:1159

(1971), ved behandling av deoksycytidinhydroklorid med 2,1 ekvivalenter av det hensiktsmessige syrekloridet i DMF. (Se eksempel 5).

5'-hydroksygruppen til deoksycytidin kan bli selektivt acylert ved behandling av deoksycytidinhydroklorid med 1,1 ekvivalenter av det hensiktsmessige syreanhydridet i DMF. Gish et al. (Se eksempel 6).

3',5'-diacylderivatet til deoksyadenosin kan bli fremstilt ved behandling med 2,1 ekvivalenter av det hensiktsmessige syrekloridet i DMF. (Tilpasset fra Gish et al, se eksempel 7).

5'-hydroksylgruppen til deoksyadenosin kan bli selektivt acylert ved behandling av deoksyadenosinhydroklorid med 1,1 ekvivalenter av det ønskede syrekloridet i DMF (Tilpasset fra Gish et al., se eksempel 8).

3',5'-diacyl-2'-deoksyguanosin kan bli fremstilt ved behandling av deoksyguanosinhydroklorid med 2,1 ekvivalenter av det

hensiktsmessige syrekloridet i DMF (Tilpasset fra Gish et al., se eksempel 9 ).

5'-hydroksylgruppen til deoksyguanosin kan bli selektivt acylert ved behandling av deoksyguanosinhydroklorid med 1,1 ekvivalenter av det hensiktsmessige syrekloridet i DMF.

(Tilpasset fra Gish et al., se eksempel 10).

Aminosyrene kan bli koblet til.de eksocykliske aminogruppene til deoksyadenosin, deoksycytidin og deoksyguanosin (eller 3' eller 5' acylderivatene derav) ved standardmetoder ved anvendelse av dicykloheksylkarbodiimid (se eksempel 11).

Disse acylsammensetningene kan bli administrert kronisk til et dyr som risikerer utsetting for bestråling, sollys eller kjemiske mutagener. Acylderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også bli administrert etter utsetting for bestråling, sollys eller kjemiske mutagener eller etter at et sår er oppstått for å forsterke reparasjon av DNA og dermed forbedre skaden og fremme overlevelse av dyret. De kan fordelaktig bli administrert før eller etter radioterapi eller kjemoterapi for å forbedre uønskede bieffekter ved behandlingen.

De farmakologiske aktive acylderivatene kan bli kombinert med egnede farmasøytisk akseptable bærere omfattende tilsetningsstoffer og hjelpestoffer som letter opparbeidingen av de aktive forbindelsene. Disse kan bli administrert som tabletter, drasjeer, kapsler og suppositorier. Sammensetningene kan bli administrert oralt, rektalt, vaginalt eller frigjort gjennom kinnhulen i munnen og påført i oppløsningsform ved injeksjon, oralt eller ved topisk administrasjon. Sammensetningene kan inneholde fra omtrent 0,1 til 99$, fortrinnsvis fra omtrent 50 til 90$ av den aktive forbindelsen(e), sammen med tilsetningsstoffet(ene).

De farmasøytiske preparatene

blir fremstilt på en måte som i seg selv er kjent, for eksempel ved hjelp av konvensjonell blanding, granulering, drasjefremstilling, oppløsning eller lyofili-seringsprosesser. Farmasøytiske preparater for oral anvendelse kan dermed bli tilveiebragt ved kombinering av den aktive forbindelsen (ene) med faste tilsetningsstoffer, eventuelt maling av den resulterende blandingen og be-arbeiding av granulblandingen . etter tilsetting av egnede hjelpestoffer, hvis det er ønsket eller nødvendig, for å tilveiebringe tabletter eller drasjekjerner.

Egnede tilsetningsstoffer omfatter fyllmidler såsom sukker-forbindelser, f.eks. laktose, sukrose, mannitol eller sorbitol, cellulosepreparater og/eller kalsiumfosfater, for eksempel trikalsiumfosfat eller kalsiumhydrogenfosfat, samt bindemidler såsom stivelsespasta ved for eksempel anvendelse av maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse eller potetstiv-else, gelatin, tragakant, metylcellulose, hydroksypropyl-metylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon.

Hjelpestoffer er først og fremst strømningsregulerende midler og smøremidler, for eksempel silisiumoksyd, talk, stearinsyre eller saltene derav, såsom magnesiumstearat eller kalsium-stearat og/eller polyetylenglykol. Drasjekjernene blir tilveiebragt med egnede belegg som om ønskelig er motstandsdyktige mot mavesafter. Her kan konsentrerte sukkeroppløs-ninger bli anvendt som eventuelt inneholder gummi arabikum, talk, polyvinylpyrrolidon, polyetylenglykol og/eller titan-dioksyd, lakkoppløsninger og egnede organiske oppløsnings-midler eller oppløsningsmiddelblandinger. For å fremstille belegg motstandsdyktige mot mavesafter, blir oppløsninger av egnede cellulosepreparater såsom acetylcelluloseftalat eller hydroksypropylmetylcelluloseftalat anvendt. Farvestoffer eller pigmenter kan bli tilsatt til tablettene eller drasje-beleggene for eksempel for identifikasjon eller for å karakterisere forskjellige kombinasjoner av f orbindelses-doser.

Andre farmasøytiske preparater som kan bli anvendt oralt omfatter "push-fit" kapsler fremstilt av gelatin, samt bløt-forseglede kapsler fremstilt av gelatin og et bløtgjørende middel såsom glycerol eller sorbitol. "Push-fit"-kapslene inneholder den aktive forbindelsen(e) i form av granuler som kan bli blandet med fyllstoffer såsom laktose, bindemidler såsom stivelse og/eller smør.emidler såsom talk eller magnesiumstearat og eventuelt stabiliserende midler. I bløte kapsler blir de aktive forbindelsene fortrinnsvis oppløst eller suspendert i egnede væsker såsom fettoljer, flytende parafin eller polyetylenglykoler. I tillegg kan stabiliserende stoffer bli tilsatt.

Mulige farmasøytiske preparater som kan bli anvendt rektalt omfatter f.eks. suppositorier som består av en kombinasjon av aktive forbindelser med en suppositoriumsbase. Egnede suppositoriumsbaser omfatter for eksempel naturlige eller syntetiske triglycerider, parafinhydrokarboner, polyetylenglykoler eller høyere alkanoler. Det er i tilegg også mulig å anvende gelatin rektale kapsler som består av den kombinasjon av de aktive forbindelsene med en base. Mulige basematerialer omfatter for eksempel flytende triglycerider, polyetylenglykoler eller parafinhydrokarboner.

Egnede formuleringer for parenteral administrasjon omfatter vandige oppløsninger av de aktive forbindelsene i vannopp-løselig form, for eksempel vannoppløselige salter. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene som hensiktsmessige oljeinjeksjonssuspensjoner bli administrert. Egnede lipofile oppløsningsmidler eller beholdere omfatter fettoljer, for eksempel sesamolje eller syntetisk fettsyreestere for eksempel etyloleat eller triglycerider. Vandige injek-sjonssuspensjoner kan omfatte forbindelser som øker viskosi-teten til suspensjonen som for eksempel omfatter natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol og/eller dekstran. Suspensjonen kan eventuelt også inneholde stabiliserende midler. Acyl-deoksyr ibonukleosidene kan bli formulert som en del av et hudvann eller en solkrem for topisk administrasjon. Egnede formuleringer for topisk administrasjon omfatter hensiktsmessige oljesuspensjoner eller oppløsninger. Egnede lipofile oppløsningsmidler eller beholdere omfatter fettoljer, for eksempel sesamolje eller kokosolje, eller syntetiske fettsyreestere, for eksempel etyloleat eller triglycerider. Disse topiske formuleringene kan bli anvendt for å behandle skadet vev såsom hudskader eller forbrenninger, eller for å behandle eller forhindre sollysinduserte cellulære skader (solbrent-het).

For å fremme leging av sår kan sammensetningene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bli formulert som en del av sårbehandlingen, eller inkorporert i biologisk nedbrytbare mikrokapsler for topisk administrasjon. Slike mikrokapsler kan for eksempel omfatte polylaktat eller laktat-glykolat-kopolymerer. Se Veise, D.L. et al., Drug Carriers in Biology and Mediclne, Gregoriadis G. et al., Academic Press, NY s. 237-270 (1979).

Følgende eksempler skal illustrere foreliggende oppfinnelse.

Eksempler og fremgangsmåter for fremstilling av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1: Fremstilling av 35'- diacyl- 2'- deoksytymidin fra syreanhydrider: 2'-deoksytymidin blir løst opp i vannfri pyridin ved romtemperatur. 2,1 molar ekvivalenter av syreanhydridet av den ønskede acylforbindelsen (f.eks. eddikanhydridet, laktatan-hydridet, smøranhydridet osv.) blir deretter tilsatt. Reaksjonsblandingen blir deretter oppvarmet til 80-85°C i 1 til 4 timer, avkjølt, helt inn i isvann og esterene blir utvunnet ved ekstraksjon med kloroform eller et lignende oppløsningsmiddel. Kloroformet blir deretter vasket med iskald 0,01 N svovelsyre, 1% vandig natriumbikarbonat og til slutt med vann. Etter tørking med natriumsulfat blir kloroform avdampet og den gjenværende oljen eller krystallene blir utsatt for kromatografi (tilpasset fra Nishizawa et al., Biochem. Pharmacol. 14:1605 (1965).

Fra syreklorider:

Til 2'-deoksytymidin løst opp i vannfri pyridin blir det ved 5°C tilsatt 2,1 molar ekvivalenter av syrekloridet av den ønskede acylforbindelsen (f.eks. palmitoylklorid, acetyl-klorid osv.). Blandingen blir holdt ved romtemperatur over natt, isvann ble tilsatt og opparbeidet som angitt ovenfor (tilpasset fra Nishizawa).

Eksempel 2: Fremstilling av 5'- acyl- 2'- deoksytymidin

Til 2'-deoksytymidin løst opp i vannfri pyridin blir det ved romtemperatur tilsatt 1,0 molar ekvivalent av syreanhydridet av den ønskede acylforbindelsen. Reaksjonen blir deretter oppvarmet til omtrent 80-85°C i flere timer, avkjølt, helt i isvann og esterene utvunnet ved ekstraksjon med kloroform eller et egnet oppløsningsmiddel. Kloroformet blir deretter vasket i iskald 0,01 N svovelsyre, 1% vandig natriumbikarbonat og til slutt vann. Etter tørking med natriumsulfat blir kloroform avdampet og den gjenværende oljen eller krystallene blir utsatt for kromatografi. Hovedproduktet som blir isolert ved kromatografi er 5'-substituert ester

(tilpasset fra Nishizawa et al.)

Alternativt kan selektiv 5'-acylering av deoksytymidin bli tilveiebragt ved suspendering av 2'-deoksytymidin i en blanding av pyridin og N,N-dimetylformamid avkjølt til 0°C i et isbad. 1,0 molar ekvivalent av syrekloridet av den ønskede acylforbindelsen blir dråpevis tilsatt til blandingen som blir omrørt ved 9°C i 12-24 timer. Vann blir deretter tilsatt for å stoppe reaksjonen og deretter blir oppløsningsmidlene avdampet under vakuum ved 50°C. Resten blir løst opp i metanol og renset ved kromatografi på silisiumoksydgel (tilpasset fra Baker et al., J. Med. Chem. 21:1218 (1978)).

Eksempel 3: Fremstilling av 3'- acyl- 2'- deoksytymidin

Til en omrørt suspensjon av 2'-deoksytymidin i tørr N,N-dimetylformamid blir 2,4 ekvivalenter imidazol tilsatt etterfulgt av 1,2 molar ekvivalenter t-butyldimetylklorsilan. Blandingen blir omrørt med beskyttelse mot fuktighet ved romtemperatur i 20 timer, og oppløsningsmiddelet blir deretter fjernet ved 5CC under vakuum. Resten blir løst opp i 15 ml etylacetat, vasket, og avdampet for å gi en sirup som ved krystallisering fra varm kloroform ved tilsetting av heksan til opaliseringspunktet 5'-(t-butyldimetylsilyl)-2'-deoksytymidin.

Til en omrørt suspensjon av 5 '-(t-butylmetylsilyl)-2'-deoksytymidin i tørr pyridin avkjølt til 0°C blir 1,1 molar ekvivalent av det hensiktsmessige syreanhydridet av den ønskede acylforbindelsen tilsatt og blandingen blir omrørt med beskyttelse mot fuktighet i 20 timer ved 0-5'C, idet reaksjonen blir avsluttet ved tilsetting av noen ml vann. Oppløsningsmiddelet blir avdampet og resten ekstrahert og avdampet for å gi en tykk, klar sirup som deretter blir tørket under vakuum ved 25°C.

t-butylmetylsilylgruppen blir fjernet med. iseddiksyre og tetrabutylammoniumfluorid i tetrahydrofuran som gir det ønskede 3'-acyl-2'-deoksytymidinderivatet (tilpasset fra Baker et al.).

Eksempel 4: Fremstilling av N^- Acyl- 2'- deoksytymidin

Acylering av det sekundære aminet i 3-posisjonen til pyrimidinringen blir tilveiebragt ved omsetting av 3',5'-diacyldeoksytymidin med 1,1 molar ekvivalenter av syrekloridet til den ønskede acylsubstituenten i et aprotisk oppløsningsmiddel (såsom eter, dioksan, kloroform, etylacetat, acetonitril, pyridin, dimetylformamid og lignende) i nærvær av 1-5 molare ekvivalenter av en organisk base (spesielt aromatiske aminer såsom pyridin, trialkylaminer eller N,N-dialkylaniliner)

(tilpasset fra Fuji et al., US patent nr. 4,425,335). Åcylsubstituenten på det sekundære aminet kan være lik eller forskjellig fra de på hydroksylgruppene til riboseandelen.

Eksempel 5: Fremstilling av 35'- diacyl- 2'- deoksycytidin

2-deoksycytidinhydroklorid blir løst opp i N,N-dimetylformamid. 2,1 molare ekvivalenter av syreklorider til den ønskede åcylsubstituenten blir tilsatt <p>g blandingen blir omrørt over natt ved romtemperatur-, Reaksjonsblandingen blir konsentrert under vakuum til en olje og triturert med en blanding av acylacetat og dietyleter eller lignende oppløsningsmidler. Oljen blir deretter triturert med IN natriumhydrogenkarbonat. Det krystallinske faste stoffet blir oppsamlet, vasket med vann, tørket og omkrystallisert (tilpasset fra Gish et al., J. Med. Chem. 14:1159 (1971)).

Eksempel 6: Fremstilling av 5'- acyl- 2'- deoksycytidin 2-deoksycytidinhydroklorid blir løst opp i N,N-dimetylformamid. 1,1 molare ekvivalenter av syrekloridet til den ønskede åcylsubstituenten blir tilsatt og blandingen omrørt over natt ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen blir konsentrert under vakuum til en olje og triturert med en blanding av etylacetat og dietyleter eller lignende oppløs-ningsmidler. Oljen blir deretter triturert med IN natriumhydrogenkarbonat. Det krystallinske faste stoffet blir oppsamlet, vasket med vann, tørket og omkrystallisert (tilpasset fra Gish et al.).

Eksempel 7: Fremstilling av 35'- diacyl- 2'- deoksyadenosin 2'-deoksyadenosin blir løst opp i N,N-dimetylformamid og pyridin (1:1). 2,1 molare ekvivalenter av syrekloridet til den ønskede åcylsubstituenten blir tilsatt og blandingen blir omrørt over natt ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen blir konsentrert under vakuum til en olje og triturert med en blanding av etylacetat og dietyleter eller lignende oppløs-ningsmidler. Oljen blir deretter triturert med IN natriumhydrogenkarbonat. Det krystallinske faste stoffet blir oppsamlet, vasket med vann, tørket og omkrystallisert.

Eksempel 8: Fremstilling av 5'- acyl- 2'- deoksyadenosin 2'-deoksyadenosin blir løst opp i N,N-dimetylformamid og pyridin (1:1). 1,1 molar ekvivalenter av syrekloridet til den ønskede åcylsubstituenten blir tilsatt og blandingen omrørt over natt ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen blir konsentrert under vakuum til en olje, og triturert med en blanding av etylacetat og dietyleter eller lignende oppløs-ningsmidler. Oljen blir deretter triturert med IN natriumhydrogenkarbonat. Det krystallinske faste stoffet blir oppsamlet, vasket med vann, tørket og omkrystallisert.

Eksempel 9: Fremstilling av 35'- diacyl- 2'- deoksyguanosin 2'-deoksy<g>uanosin blir løst opp i N,N-dimetylformamid og pyridin (1:1). 2,1 molare ekvivalenter av syrekloridet til den ønskede åcylsubstituenten blir tilsatt og blandingen omrørt over natt ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen blir konsentrert under vakuum til en olje og triturert med en blanding av etylacetat og dietyleter eller lignende oppløs-ningsmidler. Oljen blir deretter triturert med IN natriumhydrogenkarbonat. Det krystallinske faste stoffet blir oppsamlet, vasket med vann, tørket og omkrystallisert. Eksempel 10: Fremstilling av 5'- acyl- 2'- deoksyguanosin 2'-deoksyguanosin blir løst opp i N,N-dimetylformamid og pyridin. 1,1 molare ekvivalenter av syrekloridet til den ønskede åcylsubstituenten blir tilsatt og blandingen omrørt over natt ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen blir konsentrert under vakuum til en olje og triturert med en blanding av etylacetat og dietyleter eller lignende oppløs-ningsmidler. Oljen blir deretter triturert med IN natriumhydrogenkarbonat. Det krystallinske faste stoffet blir oppsamlet, vasket med vann, tørket og omkrystallisert (tilpasset fra Gish et al.).

Eksempel 11: Fremstilling av N- lysyl- 5'- O- palmitoyl- deoksycytidin

5'-O-palmitoyldeoksycytidin blir fremstilt ved omsetting av deoksycytidinhydroklorid med 1,1 ekvivalenter palmitoylklorid i tørr dimetylformamid. 14 gram 5'-O-palmitoyl-deoksycytidin blir løst opp i 100 ml dimetylacetamid, 1 molar ekvivalent di-tert-butoksykarbonyl-lysin blir tilsatt og blandingen blir avkjølt i et isbad. 1,2 molare ekvivalenter (7,4 g) dicykloheksylkarbodiimid blir tilsatt og blandingen blir omrørt ved 4°C i 90 timer. Presipitatet (dicykloheksylurea) blir fjernet ved filtrering. 100 ml vann blir tilsatt til filtratet, etterfulgt av 1 liter etylacetat.

N4- (di-N-tert-butoksykarbonyl-lysyl )-5 '-O-palmitoyl-deoksycytidin blir separert fra ikke reagerte reagenser ved kromatografi over silisiumoksydgel. t-butoksykarbonylbeskyt-tende grupper blir fjernet ved standard fremgangsmåter for behandling med en syre, såsom trifluoreddiksyre.

På lignende måte kan 5'-0-acyl eller 3',5'-O-diacylderivater av deoksycytidin, deoksyadenosin eller deoksyguanosin generelt ha lysin eller arginin koblet til deres eksocykliske primære aminogrupper med dicykloheksylkarbodiimid.

Eksempler på beskyttelse av nukleosider.

Fra enzymatisk nedbryting ved acylering

Deoksyribonukleosider blir raskt nedbrutt etter administrasjon til dyr. For å anvende acylerte nukleosider for å levere nukleosider til vev på en vellykket måte, er det innlysende at acylering skal forhindre nedbrytning av nukleosidandelen ved enzymene som normalt nedbryter nukleosidene. For hver av hoveddeoksyribonukleosidene er et annet enzym innbefattet i det første trinnet av deres nedbrytning. Det første trinn ved nedbrytning av deoksyadenosin er deaminering katalysert av adenosindeaminase. Tymidin blir opprinnelig katabolisert av tymidinfosforylase; deoksyguanosin av purinnukleosidfosforylase, og deoksycytidin blir nedbrutt av deoksycytidin-deaminase. • •

Eksempel 17

Oppløsninger (100 jjmolar i f osf at-buf ret saltvann) av hver av deoksyribonukleosidene eller deres acylerte derivater • ble inkubert ved 37°C med hver av de fire enzymene: adenosindeaminase (ADA), cytidindeaminase (CDA), purinnukleosidfosforylase (PNP), og tymidinfosforylase (TP). Enzymatisk nedbrytning av forbindelsene ble bestemt ved HPLC.

Disse data viser at 5'-O-acylering av deoksyribonukleosider beskytter dem fra enzymene som katalyserer de opprinnelige trinnene ved deres degradering. Nukleosidandelen til acylerte nukleosider vil dermed forbli intakt in vivo helt til deacylering oppstår.

Eksempler på deacylering av acylerte deoksyribonukleosider i leverekstrakter.

Acylerte deoksyribonukleosider ble inkubert med rottelever-ekstrakter for å fastsette den relative hastigheten av enzymatisk deacylering av derivatene med forskjellige substituenter og bestemme om forskjellige nukleosider med de samme substituentene blir deacylert i lignende hastigheter. Deacylering av derivatene ifølge oppfinnelsen in vivo resulterer i frigjøring av foreldrenukleosider som deretter kan bli anvendt av cellene.

Eksempel 12

Hele rotteleveren blir homogenisert i fosfatbufret saltvann (10 ml per gram lever) og sentrifugert. Supernatanten ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 50 ml buffer per gram lever og stokkoppløsninger av acylerte deoksyribonukleosider ble tilsatt slik at forbindelsene var tilstede i konsentrasjoner på 100 jjmolar. 100 pl. aliquoter ble fjernet periodisk for å- bestemme ved HPLC mengdene av frie nukleosider som ble produsert som en funksjon av tiden.

Disse data indikerer at i leverekstraktene blir di-0-acetylderivatene av hver av de fire deoksyribonukleosidene deacylert i veldig lignende hastigheter. Dette er også tilfellet for 5'-0-palmitoylderivatene til tross for at palmitoyl-substituentene blir spaltet i en mye saktere hastighet enn acetatgruppene. Dette tyder på at deacyleringshastigheten til O-substituerte deoksyribonukleosider er hovedsakelig en funksjon av naturen til åcylsubstituenten og ikke av nukleosidet som det er koblet til. Dette er viktig ved utførelse av denne oppfinnelsen på grunn av at noen terapeutiske effekter blir bare tilveiebragt når derivater av mere enn et nukleosid blir koadministrert. Det er foretrukket hvis deacylering av forskjellige nukleosider i en terapeutisk blanding oppstår ved lignende hastigheter in .vivo på grunn av optimale proporsjoner av nukleosider blir avgitt til vevene simultant. Den store variasjonen i deacyleringshastighetene for nukleosider substituert med kortkjedete (acetyl) i forhold til langkjedete (palmitoyl) fettsyrer gir opphav til muligheten for velging av acylsubstituentene ifølge deacyleringshastighetene (eller nukleosidleveringshastighetene) som er nødven-dig i forskjellige kliniske situasjoner. Fettsyresubstitu-enter med middels lengde (f.eks. valeryl og oktanoyl) blir spaltet hurtigere enn kortere (acetat) eller lengre (palmi-tat) substituenter.

I dette samme leverekstraktet blir deoksyribonukleosider per se hurtigere gradert, f.eks. deoksyadenosin ved en konsentra-sjon på 100 jjmolar blir fullstendig degradert, opprinnelig ved deaminering for å danne inosin i løpet av 2 minutter. Etter administrasjon vil dermed de 0-acylerte deoksyribonukleosidene ifølge oppfinnelsen gradvis bli frigjort og tilveiebringe frie nukleosider til vevene for en vedvarende tidsperiode sammenlignet med den korte perioden av nukleosid-tilgjengelighet etter administrasjon av selve foreldredeoksy-ribonukleosidene. Fettsyrene på primæraminer av enten pyrimidinringen til deoksycytidin eller purinringene til deoksyguanosin blir ikke fjernet i tilstrekkelig hastighet av leverenzymene.

Eksempler på oral administrasjon av acylerte nukleosider For å demonstrere levering av deoksyribonukleosider etter oral administrasjon av acylerte nukleosider ble plasmatymidinnivåene målt etter oral administrasjon av enten 3',5'-di-O-acetyltymidin eller bare tymidin.

Eksempel 13

Han F344-rotter (350 g) ble implantert med kronisk jugular-vene-katetere for blodprøvetakning og restituert i to dager. En basal blodprøve ble tatt og deretter ble 0,7 millimol tymidin eller 3 ' ,5'-di-O-acetyltymidin (DAT) administrert ved sondeforing. Blodprøvene ble tatt 0,5, 1,2 og 4 timer etter administrasjon, sentrifugert og supernatanten (plasma) ble deproteinsert med metanol. Konsentrasjonen av tymidin i plasmaprøvene ble bestemt ved HPLC med UV-absorbansdeteksjon.

Den basale plasma tymidinkonsentrasjonen var 1 jjmolar. Etter oral administrasjon av tymidin nådde plasmatymidinnivåene et maksimum på 9 jjmolar en time etter administrasjon og retur-nerte til basale konsentrasjoner etter 4 timer. Etter oral administrasjon av en ekvimolar dose 3',5'-di-O-acetyltymidin, nådde plasmatymidinkonsentrasjonen derimot et maksimum på 80 jjmolar i løpet av 30 minutter, og var enda forhøyede over basalverdiene fire timer etter administrasjon.

Oral administrasjon av di-O-acetyltymidin gir dermed mye større mengder tymidin til vevene (med lengre varighet) enn administrasjon av det ikke-derivatiserte nukleosidet som vist i fig. 4 hvori sammenlignende data er plottet.

Eksempler på klinisk administrasjon utsetting for bestråling Tre situasjoner hvori acylderivater avd deoksyribonukleosider kan være klinisk nyttige ved behandling av bestrålningsskade er 1) tilfeldig utsetting for ioniserende bestrålning som ved kjerneulykke; 2) utsetting for røntgenbestrålning i løpet av radiografi; og 3) radioterapi ved kreft.

I det første tilfellet bør acyldeoksyribonukleosidderivatene bli administrert i en formulering egnet for parenteral injeksjon etterfulgt av oral administrasjon flere ganger per dag med doser ekvivalent med 0,5. til 2 gram av hver av de fire hoveddeoksyribonukleosidene. Det er viktig at derivatene av alle nukleosidene blir administrert samtidig.

I det andre tilfellet, røntgenutsetting i løpet av diagnos-tisk radiografi, blir acyldeoksyribonukleosidderivater gitt oralt før og etter utsettingen.

I det tredje tilfellet, i løpet av cancerradioterapi, er acylribonukleosidderivatene spesielt nyttige ved gjenopprett-else av benmargsfunksjonen etter den uønskelige, men uunngåe-lige suppresjonen i løpet av bestrålningen. I formuleringen konstruert for selektiv levering av nukleosider til normalt, men ikke neoplastisk vev, vil acylnukleosidderivatene forbedre den terapeutiske indeksen (forholdet mellom virk-ningsfullheten og toksisiteten) til bestrålingsbehandlingen. Lignende doser deoksyribonukleosidderivater kan også bli anvendt for å behandle benmargssuppresjon forårsaket av antineoplastisk eller antiviral kjemoterapi.

Følgende eksempel beskriver fordelene med oppfinnelsen ved behandling av bestrålte mus.

Fremgangsmåter

Balb/c+ mus ble utsatt for gammabestrålning (Cobalt 60) ved en dosehastighet på 7,3 Rad/min. Feltet ble målt to ganger ved Frlcke dosimetri for å forsikre jevnt felt og konstant dose for hver mus. Grupper på 15 mus mottok totale doser gammabestrålning på 675, 700, 725, og 750 R.

Mus ble delt inn i fire behandlingsgrupper (5 mus ved hver bestrålingsdose), idet hver mottok en forskjellig post-bestrålningsbehandling: Gruppe 1: 0,9 1o saltvann (kontrollgruppe);

Gruppe 2: En blanding av deoksyribonukleosider (ekvimolar blanding av deoksyadenosin, deoksyguanosin,

deoksycytidin, og tymidin);

Gruppe 3: En blanding av 3,5'-di-O-palmitoylderivater av deoksyadenosin, deoksyguanosin, deoksycytidin og tymidin, ekvimolar til dosene av ikke-derivatiserte nukleosider.

Gruppe 4; En blanding av 5'-O-aceylderivater av deoksyadenosin, deoksyguanosin, deoksycytidin og tymidin (bare testet ved 750 R).

Nukleosidene eller di-O-acetylderivatene ble administrert ved intraperitoneal injeksjon (8 jjmol/0,2 ml fysiologisk saltvann tre ganger daglig (hver 8. time) i 4 dager, begynnende 30 minutter etter bestrålning). Mus i kontrollgruppene mottok injeksjoner på 0,2 ml fysiologisk saltvann etter samme skjema. Mus som mottok 5'-O-palmitoylnukleosidderivater ble gitt 8 jjmol bare en gang per dag i fire dager etter bestrålning; de mottok dermed bare en tredjedel av den molare mengden nukleosider som ble gitt til mus som enten får ikke-der ivatiserte eller acetylerte nukleosider.

Dødeligheten ble registrert daglig i 30 dager.

Resultater og diskusjon

LD 50/30 (bestrålningsdosen som produserer 50$ dødelighet i løpet av 30 dager etter bestrålning) i denne musestammen er omtrent 650R. Ved bestrålningsdosene som ble testet oppsto død (dersom oppsto) 12 til 20 dager etter bestrålning, som er et kjennetegn på letal post-bestrålningsbenmargs-svikt.

Ved den laveste bestrålningsdosen testet i dette eksperi-mentet (675 R), overlevde bare 20$ av saltvanns-behandlete kontrollmus; ingen kontrolldyr overlevde ved noen av de høyere bestrålningsdosene (tabell 1). Post-bestrålnings-administrasjon av deoksyribonukleosider forbedret ikke overlevelsen betraktelig i forhold til overlevelsen av musene i kontrollgruppen. I kontrast til dette overlevde dyr behandlet med di-O-acetylribonukleosider etter bestrålningsdoser som var dødelige for dyr som fikk enten deoksyribonukleosider eller saltvann (700 R til og med 750 R). Mus behandlet med 5'-O-palmitoyldeoksyribonukleosider overlevde også bestrålningsdoser som var skadelige for ubehandlede mus (750 R). Det er tydelig at palmitoylder ivatene (8 pmol administrert en gang per dag) er minst like effektiv som forbedring av overlevelsen til bestrålte mus ved en tre ganger høyere dose av di-O-acetylnukleosider (8 jjmol administrert tre ganger per dag).

Midler som forbedrer overlevelsen når de blir administrert etter bestrålning gjør dette ved å forbedre proliferasjon og differensiering av overlevende hematopoietiske stamceller. Det er derfor tydelig at nukleosidderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen vil være nyttige i andre situasjoner ved forringelse av benmarg så som oppstår etter behandling med visse antineoplastiske midler.

Leging av sår

Ved å fremme leging av hudsår (kirurgiske inngrep eller tilfeldige sår), er det hest å applisere acyldeoksyribonukleosidderivatene topisk, enten i en salve, i bionedbryt-bare mikrokapsler eller inkorporert i sårbelegg. Et topisk antibiotika kan bli koadministrert. En molar ekvivalent på 2 til 20 mg av en blanding av alle fire hoved deoksyribonukleosider bør bli applisert per kvadratcm sårareal, eller 1 til 10 mg per cm lineært kutt. Begynnelsen på den tidligste fasen av sårlegningen blir spesielt påskyndet.

Regenerering av lever

Acylderivater av deoksyribonukleosider er nyttige for fremming av regenerering av skadet eller syk lever, spesielt for akselerering av nyvekst eller kirurgisk fjerning av en del av leveren. I dette tilfellet er oral administrasjon av derivatene foretrukket i doser korresponderende til molare ekvivalenter på 0,2 til 2 gram av hvert nukleosid. Det er viktig at derivater av alle fire hoveddeoksyribonukleosider blir koadministrert.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk aktivt acylderivat av et 2'-deoksyribonuklesid, med formel:

   eller et farmasøytisk akseptablet salt derav, hvori R4 er

   Ri er en lineær fettsyrerest med 3 til 22 karbonatomer, og R2 er hydrogen, eller

   Ri og R2 er lavere alkanoyl, og

   hvor R4 er

   Ri er en lineær fettsyrerest med 18 til 22 karbonatomer, R2 er hydrogen,

   karakterisert ved å i) omsette syreanhydridet til den ønskede acylforbindelsen med det tilsvarende deoksyribonukleosidet i pyridin, dimetylformamid eller en blanding av de to, eller ii) omsette syrekloridet til den ønskede acylforbindelsen med tilsvarende deoksyribonukleosid i pyridin, dimetylformamid eller en blanding av de to.