JPWO2004105774A1 - オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、主成分として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とから構成されるカチオニックリポソームにオリゴ核酸が担持されている複合体を提供する。また本発明は、前記複合体が生体に投与可能であり、生体内での薬効発揮により医薬品として実用可能であることから、前記複合体を含む、前記オリゴ核酸の標的分子（標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ、標的タンパク質）が関与する疾患の治療用または予防用医薬組成物を提供する。

Description

本発明は、主成分として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とから構成されるカチオニックリポソームにオリゴ核酸が担持されている複合体に関するものである。
ここで本発明でいう「オリゴ核酸」とは、一分子内に１０〜５０の核酸塩基を有する、ＲＮＡないしＤＮＡからなる核酸分子またはその誘導体であって、細胞内において生理活性作用を発揮し、標的となるＤＮＡ、ＲＮＡ、ないしその発現産物であるタンパク質に作用することによって本来の細胞機能を制御または破壊せしめるものをいい、その構造は一本鎖の核酸分子、もしくは一分子内に二重鎖もしくは多重鎖を含む核酸分子、またはその組み合せ（例えば、２つの一本鎖核酸分子から形成される二本鎖核酸分子）によりなる。

細胞の遺伝子発現を塩基配列特異的に阻害する方法としてアンチセンス核酸の技術が知られている。ここで言うアンチセンス核酸とは、２０塩基程度の鎖長を有する一本鎖ＤＮＡ誘導体であり、ホスホロチオエート体が最も知られている化合物であり、この分子単独でのｉｎ ｖｉｖｏ投与が可能である。ホスホロチオエート体のアンチセンス核酸は、本発明の対象であるカチオニックリポソームのような担体と複合体を形成することなしに細胞内の標的ＲＮＡを切断することが可能であり、生体内における生理機能抑制や医薬品としての作用を発揮するとされている。その他にもＲＮＡ切断活性を有する化合物としてリボザイムやＤＮＡエンザイム（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅまたはＤＮＡｚｙｍｅ）が知られている。しかし、これらの化合物は天然の核酸構造を含むことから核酸分解酵素による分解を受けやすく、また細胞内への取り込みが極めて低いという性質を有している。従って、その生理活性作用を細胞内で効率的に発揮させるためにはカチオニックリポソームのような担体が必要である。
最近においては、ＲＮＡ干渉作用（相補鎖ｍＲＮＡの分解）を示すオリゴＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ） が見いだされている。ｓｉＲＮＡは、細胞内に存在するダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮＡａｓｅＩＩＩ様の活性をもつ酵素によって二本鎖ＲＮＡから生成される１９から２３塩基程度の二本鎖ＲＮＡ型の分子であり、それぞれの鎖の３’末端に２〜３塩基の一本鎖構造をもつ突出型の構造を有している。ｓｉＲＮＡの誘導体も幾つか報告されているが、少なくとも３’末端に突出をもつ分子が十分なＲＮＡ干渉作用を示すとされている。また一本鎖のＲＮＡからなり、ステムループ構造（分子内で二本鎖構造）を持つオリゴＲＮＡもｓｉＲＮＡの前駆体（一般的にｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡと呼ばれる）として働くことが知られている。この分子はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によってプロセッシングされ、ｓｉＲＮＡと同様の構造になることによってＲＮＡ干渉作用を示すものである。しかしながら、前述したように、以上のような天然の構造およびそれに近い誘導体の核酸分子の場合は、細胞内に効率よく安定に移入されることが医薬品としての実用化に極めて重要な課題となっている。
水溶液中で正に荷電する脂質により構成されるリポソーム（カチオニックリポソーム）が遺伝子等の核酸の細胞内移入に有効であることが知られている。遺伝子等の核酸は負に荷電しているためカチオニックリポソームと容易に複合体を形成し、細胞の食作用により複合体が細胞内に取り込まれると考えられている。培養細胞を使った実験においては、アンチセンスＤＮＡやｓｉＲＮＡはカチオニックリポソームで細胞内に移入されることで、初めて十分な効果を発揮することが広く知られている。
しかしながら、これまでに前記のような核酸分子とカチオニックリポソームからなる複合体を動物に投与したときに標的遺伝子の発現を抑制するような、医薬品としての実用化が可能な複合体は未だ見いだされていない。その主要な理由として、カチオニックリポソームの細胞毒性があると考えられている。
ところで、ある種のグリセロール誘導体とリン脂質とから構成されるカチオニックリポソームがｐｏｌｙ（Ｉ）：ｐｏｌｙ（Ｃ）などの長鎖の二本鎖ＲＮＡ（５０〜１０，０００塩基対）を細胞内へ移入するのに有効であることが知られている（例えば、ＷＯ９４／１９３１４、ＷＯ９９／２０２８３、ＷＯ９９／４８５３１）。このとき形成される複合体は１００ｎｍを超える平均粒子径をもち、肝臓や脾臓の細網内皮系に多く分布する傾向にある（例えば、ＷＯ９９／４８５３１）。
ＷＯ９４／１９３１４、ＷＯ９９／２０２８３およびＷＯ９９／４８５３１号公報においては、５０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡが用いられている。５０塩基対未満の長さのオリゴ核酸と当該文献記載のカチオニックリポソームとの複合体形成が、複合体として物性的に十分な安定性を有し、かつｉｎ ｖｉｖｏ投与が十分に可能な複合体形成ができるかどうかは未知である。また、その複合体をｉｎ ｖｉｖｏ投与した場合、医薬品としての実用化に耐え得る安全性と薬効の発揮がなされるかどうかについては全くわかっていない。

本発明は、主として、医薬品として十分な薬効の発揮と安全性が確保され得る、オリゴ核酸とカチオニックリポソームとの複合体を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ある種のカチオニックリポソームとオリゴ核酸との複合体が生体に投与可能であり、生体内での薬効発揮により医薬品として実用可能であることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、例えば、主成分として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とから構成されるカチオニックリポソーム（以下、「当該リポソーム」という）にオリゴ核酸が担持されている複合体を提供する。
また、本発明者らは、更に鋭意努力を重ねた結果、複合体粒子の平均粒子径が代謝動態に大きな変動を与えることを見出した。即ち、平均粒子径が１００ｎｍを超える複合体を動脈あるいは静脈内に投与したときには、それが主に肝臓部位に集積するのに比べ、１００ｎｍ以下、例えば８０ｎｍに満たない複合体の場合は、それが肝臓や脾臓のような細網内皮系での補足を逃れ、全身に広く分布することを見出した。このことは、医薬品治療の標的となる疾患部位が肝臓以外の肺や、循環器系臓器などを対象とした用途にも拡大することを明らかにしている。
従って、本発明は、当該リポソームにオリゴ核酸が担持されている、平均粒子径が１００ｎｍ以下の複合体を提供する。
また本発明は、当該リポソームにオリゴ核酸が担持させてなる複合体を含む、当該オリゴ核酸の標的分子（標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ、標的タンパク質）が関与する疾患の治療用または予防用医薬組成物を提供する。

図１は、推奨される方法でオリゴフェクトアミンのｓｉＲＮＡ複合体を調製したときの複合体分散液の様子である。１０μＭの複合体では凝集体が見える。
図２は、当該リポソームでｓｉＲＮＡ複合体を調製したときの複合体分散液の様子である。
図３は、Ａ４３１細胞にｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を添加し、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現抑制効果をウエスタンブロッティングで調べた図である。
図４は、Ａ５４９細胞にｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を添加し、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現抑制効果をウエスタンブロッティングで調べた図である。
図５は、Ａ４３１細胞にｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を添加し、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの発現抑制効果を準定量的ＲＴ−ＰＣＲで調べた図である。
図６は、Ａ５４９細胞にｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を添加し、細胞の増殖抑制効果を調べた図である。グラフの縦軸は吸光度で生細胞数を反映している。
図７は、Ａ５４９細胞肝転移マウスにｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を投与し、投与５分後の癌増殖巣内でのｓｉＲＮＡの分布を調べた図である。左図はヘマトキシリン−エオシン染色、右図はフルオレセイン抗体を用いて免疫組織染色を行った図である。上段はｓｉＲＮＡ複合体を投与したマウスの、下段は裸のｓｉＲＮＡを投与したマウスのＡ５４９細胞の増殖部位である。
免疫組織染色では陽性シグナルが青色で確認される。
図８は、Ａ５４９細胞肝転移マウスにｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を投与したとき、転移癌の増殖を抑制している結果を示した図である。
図９は、Ａ５４９細胞肝転移マウスにｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を投与したときのマウスの生存曲線を示した図である。
図１０は、Ａ５４９細胞肝転移マウスにｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を投与したときのマウスの生存曲線を示した図である。
図１１は、Ａ５４９細胞肝転移マウスにｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体を投与したときの延命作用における用量依存性を示した図である。
図１２は、Ａ５４９細胞肝転移マウスにおけるｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体の投与スケジュール検討結果を示した図である。
図１３は、ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームの複合体の局所投与効果を示した図である。
図１４は、マウスに二種類の粒子径のｓｉＲＮＡ複合体をそれぞれ投与し、血漿、肝臓、脾臓におけるｓｉＲＮＡの組織内濃度を比較した図である。
図１５は、Ａ４３１細胞にｂｃｌ−２ アンチセンスＤＮＡと当該リポソームの複合体を添加し、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現抑制効果をウエスタンブロッティングで調べた図である。
図１６は、Ａ４３１細胞にＢｃｌ−２ ＤＮＡ エンザイムと当該リポソームの複合体を添加し、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現抑制効果をウエスタンブロッティングで調べた図である。

以下に本発明を詳細に説明する。
（１）当該リポソーム
当該リポソームの構成成分である２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール（以下、「グリセロール誘導体Ａ」という）は、 ＷＯ９４／１９３１４号公報に開示されており、下記の構造式を有する。グリセロール誘導体Ａの合成方法に関しては ＷＯ９４／１９３１４号公報を参照されたい。
グリセロール誘導体Ａの構造式

当該リポソームの構成成分であるリン脂質は、医薬品として許容されるものであれば特に制限されるものではない。例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチンを挙げることができる。好ましいリン脂質としては卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン等を挙げることができる。
当該リポソーム担体中のグリセロール誘導体Ａおよびリン脂質の混合比は、リン脂質の種類にもよるが、グリセロール誘導体Ａ １重量部に対してリン脂質０．１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．５〜３重量部の範囲内が好ましく、１〜２重量部の範囲がより好ましい。
当該リポソームは、グリセロール誘導体Ａとリン脂質を混合し、水溶液中で分散させることにより調製することができる。分散には超音波分散装置、乳化分散装置等の装置を適宜用いることができる。
（２）オリゴ核酸
本発明でいう「オリゴ核酸」とは、前述のとおり、一分子内に１０〜５０の核酸塩基を有する、ＲＮＡないしＤＮＡからなる核酸分子またはその誘導体であって、細胞内において生理活性作用を発揮し、標的となるＤＮＡ、ＲＮＡ、ないしその発現産物であるタンパク質に作用することによって本来の細胞機能を制御または破壊せしめるものをいい、その構造は一本鎖の核酸分子、もしくは一分子内に二重鎖もしくは多重鎖を含む核酸分子、またはその組み合せ（例えば、２つの一本鎖核酸分子から形成される二本鎖核酸分子）によりなる。
本発明で使用されるオリゴ核酸の制限的でない例として、一般的なＲＮＡおよびＤＮＡ、およびそれらの誘導体を挙げることができる。具体的なオリゴ核酸としてはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマー等の文献的にもよく知られた核酸分子を挙げることができる。
オリゴ核酸は、ほとんど全ての標的となるＲＮＡあるいはＤＮＡの配列に対して設計可能であり、また標的がタンパク質の場合においても同様である。いずれの場合においても本発明に用いることができる。オリゴ核酸の標的分子の制限的でない例としては、ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ−ａｂｌなどの癌遺伝子、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなどのウイルス遺伝子、ＴＮＦ−αやＦａｓなどの炎症関連遺伝子が挙げられる。また上記の遺伝子の転写産物のみならず翻訳産物もオリゴ核酸の標的になり得る。更に構造遺伝子のみならず、任意のタンパク質をコードしないゲノムＤＮＡやタンパク質発現の調節に働くＲＮＡ分子、例えばスプライシング配列をもつｔＲＮＡ前駆体のマチュレーションに働くＲＮＡ分子やｍｉｃｒｏＲＮＡのようなＲＮＡ分子も標的に含まれる。
本発明に使用されるオリゴ核酸は天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性など、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖またはリン酸バックボーンなどの、少なくとも一部が修飾されていてもよい。修飾される場合、望ましい修飾は、糖の２’位の修飾、糖のその他の部分の修飾、オリゴ核酸のリン酸バックボーンの修飾等である。糖の２’位の修飾として、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなどの置換基が挙げられる。ここで、Ｒはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１〜６のアルキレンを示す。糖のその他の部分の修飾体としては、４’チオ体などが挙げられる。オリゴ核酸のリン酸バックボーンの修飾体としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体などが挙げられる。
本発明に係るオリゴ核酸は、一分子中に１０〜５０の核酸塩基を有するが、１５〜３５の核酸塩基のものや、１８〜２５の核酸塩基のものも挙げることができる。
オリゴ核酸は、当業者に既知のホスホアミダイト法またはトリエステル法により固相で、または液相で合成できる。最も一般的な態様はホスホアミダイト法による固相合成法であり、核酸自動合成機または手動にて合成することができる。固相での合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度９０％以上、好ましくは９５％以上の核酸を得るのが望ましい。
（３）複合体
複合体を形成させるときのオリゴ核酸と当該リポソームの構成比率は、オリゴ核酸の種類にもよって異なるが、オリゴ核酸１重量部に対して当該リポソーム０．０１から１００重量部が適当であり、１から３０重量部が好ましく、１０から２０重量部がさらに好ましい。
当該リポソームは中性以下のｐＨでは正電荷を有しているので、負に荷電したオリゴ核酸とは容易に複合体を形成することができる。従って、本発明の複合体は、水性溶媒中でグリセロール誘導体Ａおよびリン脂質をまず分散処理して当該リポソームを形成させ、続いてオリゴ核酸を加え再度分散処理する方法、またはグリセロール誘導体Ａ、リン脂質およびオリゴ核酸を水性溶媒中で分散処理することにより製造することができる。
複合体形成のために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液やマルトース液などの糖液を挙げることができる。
分散処理は例えば、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散機、超音波ホモジナイザー、高圧乳化分散機、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、ＤｅＢＥＥ２０００（商品名）、マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザー等が挙げられる。処理条件や処理時間、処理温度等は適宜選択される。また、当該分散処理は、粗分散を経るなど数段階に分けて行うことができる。
本発明に係る複合体の平均粒子径は特に制限されないが、３００ｎｍまでの粒子サイズが適当である。本発明に係る複合体の好ましい平均粒子径は１０〜１００ｎｍの範囲内であり、２０〜８０ｎｍがより好ましく、３０ｎｍから５０ｎｍが更に好ましい。分散処理条件の設定を変えることによって、１０ｎｍから３００ｎｍまでの適宜サイズ調節が可能である。
（４）複合体の用途
本発明の複合体は、細胞内に取り込まれ、標的分子であるＲＮＡ、ＤＮＡあるいはタンパク質に対する生理活性作用あるいは薬効薬理作用を発揮する。本発明の複合体を用いることにより、体内における細胞内でのＲＮＡ、あるいはＤＮＡやタンパク質に対するターゲティング作用を発揮させることが可能である。このような細胞内ターゲティングによって、標的ＲＮＡの分解、標的ＤＮＡの発現制御、標的タンパク質への結合による機能阻害を生じさせることが可能であり、最終的には疾患治療の標的であるタンパク質の発現抑制あるいは機能阻害をおこすことができる。これらの作用はオリゴ核酸のもつ諸機能を医薬品用途に用いることを可能せしめ、本発明の複合体はオリゴ核酸医薬品による種々の疾患の治療および予防をすることができる医薬組成物の成分として有用である。
（５）医薬組成物
本発明は、オリゴ核酸と当該リポソームとの複合体を含むことを特徴とする医薬組成物、すなわちヒトに安全に投与できる医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、たとえば、本複合体が水溶液中に分散している液剤（注射剤、点滴剤等）やその凍結乾燥製剤の形態をとることができる。液剤の場合、本複合体が、０．００１〜２５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものが適当であり、０．０１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものが好ましく、０．１〜２％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものがより好ましい。本発明の医薬組成物は、任意の医薬上許容される添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリステン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬上許容される塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）、アルブミン、デキストラン等の乳化補助剤、コレステロール、ホスファチジン酸等の安定化剤、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等の等張化剤、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤などを挙げることができる。
医薬上許容される任意の添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
また、十分な除菌または滅菌処置を行うことによって、医薬品として供することが可能である。
上記分散処理によって得られた本複合体を凍結乾燥処理することにより、本発明医薬組成物の凍結乾燥製剤を調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記分散処理して得られた本複合体を滅菌後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本複合体の凍結乾燥製剤を得ることができる。
本発明医薬組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
本発明の医薬組成物は、投与単位形態で投与することが望ましく、ヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与または経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。また癌内局所投与などの局所投与も行うことができる。これらの投与に適した剤型、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤等で投与されるのはもちろんである。
例えば、本発明組成物の医薬としての用量は、薬物、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、通常は、成人に対してオリゴ核酸量として、１日当たり０．１ｍｇから１０ｇ／ヒトの範囲が、好ましくは１ｍｇから数ｇの範囲が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与または１日から数日間の間隔で投与することができる。

以下にｂｃｌ−２のｍＲＮＡを標的分子としたオリゴ核酸を例に説明するが、本発明はこれらの例に示される範囲に限定されるものではない。その際に用いたオリゴ核酸の配列については以下に示した。
配列番号１ （ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡセンス鎖）

配列番号２ （ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖）

配列番号３ （ルシフェラーゼ ｓｉＲＮＡセンス鎖）

配列番号４ （ルシフェラーゼ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖）

配列番号５ （ｂｃｌ−２ アンチセンスＤＮＡ）

配列番号６ （ｂｃｌ−２ アンチセンスＤＮＡ逆向き配列／陰性対照）

配列番号７ （ｂｃｌ−２ ＤＮＡエンザイム）

配列番号８ （ｂｃｌ−２ ＤＮＡエンザイム ミュータント／陰性対照）

配列番号９ （ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡセンス鎖）

配列番号１０ （ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖）

配列番号１１ （ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡセンス鎖）

配列番号１２ （ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖）

上記の一部のオリゴ核酸の合成はＤｈａｒｍａｃｏｎ社（コロラド州、米国）、日本バイオサービス（埼玉県）および北海道システム・サイエンス株式会社（北海道）に依頼した。なおｓｉＲＮＡは３’末端の２塩基が２’デオキシ体である。アンチセンスＤＮＡおよびＤＮＡエンザイムはすべて２’デオキシ体であるが、ｓで表記した部分のリン酸バックボーンはホスホロチオエート体で修飾されている。
製造例１ ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡの合成
配列番号１および２ならびに配列番号９および１０のｓｉＲＮＡの合成は、標準的なアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８４，１２， ４５３９．）で自動ＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステムズ、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９）により合成した。濃水酸化アンモニウム−エタノール（３／１）混合液を用いてＣＰＧより開裂させ、さらに同溶液中で５５℃（１８時間）において脱保護した。その後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液を用いて室温（２０時間）で２’位のシリル基を脱保護した。得られたオリゴリボヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーにて精製した。さらに、８０％酢酸水溶液にて室温（３０分）で５’位のＤＭＴｒ基を脱保護した後、イオン交換クロマトグラフィーにて再度精製した。脱塩後に得られたオリゴリボヌクレオチドは、キャピラリーゲル電気泳動により９０％以上が全長物質であると判定された。
参考例１ 当該リポソームの調製
グリセロール誘導体Ａ１．２ｇと高純度卵黄レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース２０ｇを添加し、実験用小型乳化分散機を用いて３０分間分散処理した。注射用水で２００ｍＬに定容して１６ｍｇ／ｍＬの当該リポソームを得た。
実施例１ ｓｉＲＮＡと当該リポソームとの複合体の調製（１）
２００μＭの二本鎖ｓｉＲＮＡ溶液（配列番号１および２）１００μＬに１０％マルトースを９００μＬ添加し、２０μＭ（２６８μｇ／ｍＬ）濃度のｓｉＲＮＡ溶液１ｍＬを調製した。また１６ｍｇ／ｍＬの参考例１記載の当該リポソーム液２６８μＬに１０％マルトース７３２μＬを添加し、４．３ｍｇ／ｍＬの当該リポソーム液１ｍＬを調製した。この当該リポソーム液１ｍＬに上記ｓｉＲＮＡ溶液１ｍＬを、攪拌しながら徐々に添加した。以上の操作によりｓｉＲＮＡとしての終濃度が１０μＭであるｓｉＲＮＡ複合体を得た。この複合体の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置（ＮＩＣＯＭＰ ３８０ＺＬＳ、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，米国）にて、測定モードとしてＶｅｓｉｃｌｅモードを用いて（以下、平均粒子径の測定は同機により、同測定モードにて行った）測定すると１８１ｎｍであった。この複合体をさらに水浴型超音波装置により分散処理することにより、平均粒子径が１５５ｎｍの複合体を得た。
配列番号９および１０からなる二本鎖ＲＮＡないし配列番号１１および１２からなる二本鎖ＲＮＡと当該リポソームとの複合体についても上記ｓｉＲＮＡ複合体と同様に調製した。
実施例２ ｓｉＲＮＡと当該リポソームとの複合体の調製（２）
グリセロール誘導体Ａ３００ｍｇ、高純度卵黄レシチン５００ｍｇ、マルトース１ｇに蒸留水８ｍＬを加え、激しく攪拌し分散させた。プローブ型の超音波破砕機で、氷水で冷却しながら１５分間超音波を照射した。この照射後の分散液を蒸留水で１０ｍＬに定容後、０．２２μｍのフィルターでろ過し、平均粒子径４４．４ｎｍの当該リポソーム （８０ｍｇ／ｍＬ）を得た。この当該リポソーム液１ｍＬに２．６１ｍＬの１５．３％マルトース水溶液を加え攪拌した。この溶液を再び氷冷し、超音波照射しながら、３．６ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ（配列番号１および２）１．３９ｍＬを当該リポソーム液に注入した。その後、超音波照射を行い、平均粒子径３８．５ｎｍ、１ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ複合体を得た。
実施例３ アンチセンスＤＮＡと当該リポソームの複合体の調製
２００μＭのアンチセンスＤＮＡ（配列番号５）溶液１００μＬに１０％マルトースを９００μＬ添加し、２０μＭ（１１４μｇ／ｍＬ）濃度のアンチセンスＤＮＡ溶液 １ｍＬを調製した。また１６ｍｇ／ｍＬの参考例１記載の当該リポソーム液１１４μＬに１０％マルトース８８６μＬを添加し、１．８ｍｇ／ｍＬの当該リポソーム液１ｍＬを調製した。この当該リポソーム液１ｍＬに上記アンチセンスＤＮＡ溶液１ｍＬを、攪拌しながら徐々に添加した。以上の操作によりアンチセンスＤＮＡとしての終濃度が１０μＭであるアンチセンスＤＮＡ複合体を得た。この複合体粒子を水浴型超音波装置により分散処理することにより、平均粒子径が１２０．５ｎｍの複合体粒子を得た。
実施例４ ＤＮＡエンザイムと当該リポソームの複合体の調製
２００μＭのＤＮＡエンザイム（配列番号７）溶液１００μＬに１０％マルトースを９００μＬ添加し２０μＭ（１９１μｇ／ｍＬ）の濃度のＤＮＡエンザイム溶液１ｍＬを調製した。また１６ｍｇ／ｍＬの参考例１記載の当該リポソーム液１９１μＬに１０％マルトース８０９μＬを添加し、３．１ｍｇ／ｍＬの当該リポソーム液１ｍＬを調製した。この当該リポソーム液１ｍＬに上記ＤＮＡエンザイム溶液１ｍＬを、攪拌しながら徐々に添加した。以上の操作によりＤＮＡエンザイムとしての終濃度が１０μＭであるＤＮＡエンザイム複合体を得た。この複合体粒子を水浴型超音波装置で分散処理することにより、平均粒子径が１３５．１ｎｍの複合体粒子を得た。
比較例１ 市販の担体と当該リポソームの溶血性比較
一般的にカチオン性担体は界面活性作用を有するものが多いことから、担体自身の赤血球溶血性について各種市販担体と当該リポソームの比較を行った。市販担体として、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名）、Ｔｒａｎｓ ＩＴ−ＴＫＯ（商品名）、Ｔｒａｎｓ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ（商品名）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商品名）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名）、およびＤＭＲＩＥ−Ｃ（商品名）を用いた。
ヘパリン処理して回収したラット血液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層の血漿および白血球層を除いた。得られた赤血球に対し２倍量の注射用生理食塩水を加え、混和後３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この操作をさらに２回繰り返して得られた赤血球は注射用生理食塩水を用いて１×１０^８個／ｍＬになるように希釈し、赤血球懸濁液とした。８５０μＬの測定用バッファー（７４ｍＭ ＮａＣｌ、１４７ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、 ６ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．２）に生理食塩水で適当な濃度に希釈した当該リポソームもしくは市販担体を１００μＬ添加し、３７℃で予備加温した後、上記赤血球懸濁液５０μＬを加え混和し、３７℃で４５分間インキュベートした。反応液を３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、５４３ｎｍにおける上清の吸光度を測定し、式１を用いて溶血率（％）を算出した。
式１

表１にラット赤血球を４０％溶血させる担体濃度を示した。
このように当該リポソームは他の市販担体と比較して、溶血作用が極めて低いことが判った。

比較例２ 市販の担体と当該リポソームの細胞毒性比較
ヒトさい帯静脈内皮細胞（三光純薬）を３，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。当該リポソームもしくは市販担体とホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡ（配列番号３および４）との複合体を調製して１／１０容量添加した。７２時間培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ８（ＷＳＴ−８、同仁化学）を加えて生存細胞数を吸光度により測定した。ただしｓｉＲＮＡと担体の混合比率（重量比）は１：１６で、複合体調製は各試薬の添付プロトコルに準じて行った。
表２に、ヒトさい帯静脈内皮細胞の増殖を５０％阻害する各種担体の濃度を示した。当該リポソームを用いた複合体は他の市販担体（比較例１で用いた市販品）からなる複合体より低毒性であることが判った。

比較例３ オリゴフェクトアミンとｓｉＲＮＡの複合体、当該リポソームとｓｉ ＲＮＡの複合体の形態比較
オリゴフェクトアミン^ＴＭ（インビトロジェン社）を用いてｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号１，２）との複合体を形成させた。ｓｉＲＮＡとオリゴフェクトアミンの混合比は、Ｔｕｓｃｈｌらの手引き書（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｐｉｂｐｃ．ｇｗｄｇ．ｄｅ／ａｂｔｅｉｌｕｎｇｅｎ／１００／１０５／ｓｉＲＮＡ．ｈｔｍｌ）に従い、６０ｐｍｏｌｅのｓｉＲＮＡ（二本鎖）に対してオリゴフェクトアミン３μＬの比で混合した。ｓｉＲＮＡについては同手引書に従いアニーリング操作を行って用いた。この方法で１０μＭ、３μＭおよび１μＭのｓｉＲＮＡ複合体をそれぞれ調製し、その形態を比較した。ただしｓｉＲＮＡ複合体の濃度は複合体に含まれている二本鎖ｓｉＲＮＡのモル濃度で示している。その結果１μＭの複合体調製品では若干白濁する程度であったが、３μＭの複合体では凝集体が見え始め、１０μＭの複合体では完全に粗大な粒子が目視できる状態になった（図１）。
一方、実施例１と同様の方法により、終濃度が１０μＭ、３μＭ、および１μＭのｓｉＲＮＡ複合体となるように、当該リポソームとｓｉＲＮＡとの複合体を調製し、その形態を比較した（図２）。
オリゴフェクトアミンの場合、３μＭ以上で目視できる凝集体が形成されていたが、当該リポソームを用いた場合１０μＭの濃度でも目立った凝集体は認められなかった。
試験例１ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（１）−タンパク質レベル −
６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞（ヒト類表皮癌細胞）を２×１０^５個／ｄｉｓｈで播種し一晩培養した。翌日新鮮な上記培地２．７ｍＬに交換し、これに実施例１記載の方法により調製した、ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号１および２）を含む複合体分散液０．３ｍＬを培地に添加した。添加時の複合体分散液は１０％マルトース液により終濃度の１０倍濃度に調製して添加している。なお陰性対照としてホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（配列番号３および４）を含む複合体も同時に調製し添加した。添加７２時間後に細胞を回収し、回収した細胞は細胞溶解緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｘＣｏｍｐｌｅｔｅ^ＴＭ（ロシュ・ダイアグノスティックス）〕で溶解した。１レーンあたり総タンパク質の量を１５μｇとしたサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５−２０％グラディエントゲル）に供した。分離したタンパク質を、セミドライ式ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写後、抗ヒトＢｃｌ−２抗体（Ｍ０８８７、ＤＡＫＯ）または抗アクチンポリクローナル抗体（ｓｃ−１６１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてウエスタンブロット解析を行った。なお、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体または同標識抗ヤギＩｇＧ抗体を用い、化学発光試薬（ルネッサンス・ルミノール、第一化学薬品社）を用いて目的タンパク質のバンドを検出した。
図３に示すようにｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡは濃度依存的にＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制しており、陰性対照であるルシフェラーゼのｓｉＲＮＡでは抑制は認められなかった。また他の内在性タンパク質であるベータアクチンの発現にはまったく影響を及ぼしていなかった。このことからｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡは配列特異的にＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制することが判り、当該リポソームがｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果発現に有効であることが判った。また、配列番号１１および１２からなるｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡについても、濃度依存的にＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制した。
試験例２ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（２）−タンパク質レベル −
試験例１記載の方法と同様にＡ５４９細胞（ヒト肺上皮癌細胞）に対するＢｃｌ−２タンパク質発現抑制効果を調べた。図４に示すように、当該リポソームの有効性が示された。
試験例３ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（３）−ｍＲＮＡレベル−
当該リポソームによるｓｉＲＮＡのタンパク質抑制作用はｍＲＮＡの発現抑制に起因するものかどうかを調べるため、標的遺伝子のｍＲＮＡの発現量を調べた。
試験例１と同様の処理を行い、複合体添加２４時間後に回収したＡ４３１細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。続いて、一定量のトータルＲＮＡを鋳型に、ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン）を用いた逆転写反応でｃＤＮＡを合成した。さらに、この逆転写反応液の一定量をＰＣＲ反応の鋳型に用い、キャピラリーＰＣＲ法による検出・定量システム（ライトサイクラー、ロッシュ・ダイアグノスティックス）により、ｂｃｌ−２の ｍＲＮＡレベルの準定量を行った。
その結果、１０ｎＭ、２４時間のｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ複合体の処理でｂｃｌ−２の ｍＲＮＡの量は陰性対照の複合体を添加した場合の２０％程度に減少していた（図５）。この結果から当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡのタンパク質抑制作用はｍＲＮＡの発現抑制に起因するものであることが確認できた。
試験例４ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（４） −細胞増殖抑制−
Ａ５４９細胞を９６穴プレートに１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養し、翌日これに実施例１で述べた方法により調製した、ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号１および２）を含む複合体分散液１／１０容量を培地に添加した。なお陰性対照としてホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（配列番号３および４）を含む複合体も同時に調製し添加した。複合体添加６日後に、生細胞数をＣｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ １（ロシュ・ダイアグノスティックス）にて測定した。図６に示すようにｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ複合体でＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制したＡ５４９細胞は濃度依存的に増殖が抑制されることが確認できた。
試験例５ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの癌病巣へのデリバリー
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。この操作によりＡ５４９細胞は肝臓に着床し、転移増殖巣を形成する。手術から５週間後に５’末端をフルオレセイン標識したｓｉＲＮＡ（配列番号お１よび２）と当該リポソームの複合体を実施例１と同様の方法で調製し、５ｍｇ／ｋｇで上記マウスの尾静脈より投与した。このとき投与した複合体の平均粒子径は２３５．４ｎｍであった。複合体投与５分および１時間後にマウスから肝臓を摘出し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定した。さらに定法に従いパラフィン包埋した後、厚さ３ミクロンの組織切片を作成した。それぞれの組織切片に対してアルカリフォスファターゼ標識の抗フルオレセイン抗体（Ｄ５１０１、ＤＡＫＯ）を用いた免疫組織染色を行い、組織中のｓｉＲＮＡの分布を調べた。なおアルカリフォスファターゼの発色にはＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質（ＤＡＫＯ）を用いた。その結果、複合体投与後５分および１時間後にＡ５４９細胞の増殖部位において広範囲に陽性シグナルが確認できた。しかしフルオレセイン標識したｓｉＲＮＡを裸で投与した場合は癌病巣でのシグナルはまったく確認できなかった。図７は複合体投与５分後のマウス肝臓における癌病巣の連続切片である。上段は複合体を投与したマウスの癌病巣であり、下段は裸のｓｉＲＮＡを投与したマウスの癌病巣である。フルオレセインが検出された上段右の図では広範囲に青色に染色された。したがって当該リポソームを用いることにより、増殖巣の癌細胞へｓｉＲＮＡがデリバリーされる可能性が示唆された。
試験例６ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（５）−ｉｎ ｖｉｖｏ効 果−
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ，オス，５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植６日後から４５日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号１および２）を含む複合体を週１回（計６回）または週３回（計１８回）の頻度で各回１０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した。コントロール群には週３回、１０％マルトース溶液を投与した（計１８回）。図８および表３に、移植３４日後（投与期間途中）の各群のマウス肝臓観察結果と肝重量を示す。

試験例７−１ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（６） −ｉｎ ｖｉ ｖｏ 効果−
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ，オス，５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植６日後から４５日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号１および２）を含む複合体を週１回（計６回）または週３回（計１８回）の頻度で静脈内投与した。コントロール群には週３回、１０％マルトース溶液を投与した（計１８回）。図９は移植後１００日までのマウスの生存匹数を示したグラフである。
両薬物投与群とコントロール群との間のカプランマイヤー曲線を一般化ウイルコクソン検定したところ、統計的に有意差が認められた（Ｐ＜０．０１）。
試験例７−２ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（７） −ｉｎ ｖｉ ｖｏ効果−
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植６日後から４４日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号９および１０）を含む複合体を、週２回（計１２回）の頻度で静脈内投与した。１回当たりの投与量は、当該ｓｉＲＮＡとして１０ｍｇ／ｋｇ体重とした。コントロール群には週２回、１０％マルトース溶液を投与した（計１２回）。図１０は移植後１００日までのマウスの生存匹数を示したグラフである。
ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ投与群とコントロール群との間のカプランマイヤー曲線を一般化ウイルコクソン検定したところ、統計的に有意差が認められた（Ｐ＜０．０１）。
試験例７−３ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（８） −用量依存性 −
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植６日後から４４日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号９および１０）を含む複合体を、週２回（計１２回）の頻度で静脈内投与した。１回当たりの投与量は、当該ｓｉＲＮＡとしてそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重とした。コントロール群には週２回、１０％マルトース溶液を投与した（計１２回）。その結果を図１１に示す。
１ｍｇ／ｋｇ体重投与群、３ｍｇ／ｋｇ体重投与群、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群とコントロール群との間の、癌移植６９日後までのカプランマイヤー曲線を一般化ウイルコクソン検定したところ、統計的に有意差が認められた（それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０１）。
試験例７−４ 当該リポソームを用いたｓｉＲＮＡの効果（９） −連続投与ス ケジュールの検討−
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植５日後から１０日後まで、または移植５日後から２０日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号９および１０）を含む複合体を、週５回（計５回または１２回）の頻度で静脈内投与した。１回当たりの投与量は、当該ｓｉＲＮＡとして１０ｍｇ／ｋｇ体重とした。コントロール群には週５回、１０％マルトース溶液を投与した（計１２回）。その結果を図１２に示す。
癌移植６９日後において、５回投与群および１２回投与群共に１０匹全てが生存していた。そして、両薬物投与群とコントロール群との間の、癌移植６９日後までのカプランマイヤー曲線を一般化ウイルコクソン検定したところ、統計的に有意差が認められた（Ｐ＜０．０１）。
試験例７−５ 当該リポソームを用いた局所投与効果 −ｉｎ ｖｉｖｏ効果−
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の右脇腹皮下に、１００μＬのＰＢＳに懸濁した２．５×１０^６個のＰＣ−３細胞を移植した。移植７日後から１８日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡ（配列番号１および２、配列番号９および１０）を含む複合体を、週５回（計１０回）の頻度で癌周辺部の皮下へ投与した。１回当たりの投与量は、当該ｓｉＲＮＡとして０．１ｍｇ／マウスとした。コントロール群には週５回、１０％マルトース溶液を投与した（計１０回）。腫瘍体積は、腫瘍を楕円体とみなし、「体積＝短径×短径×長径÷２」の式により求めた。その結果を図１３に示す。
腫瘍体積の増加は、各複合体投与群とコントロール群との間でいずれも癌移植１４日後から３６日後に渡って統計的に有意に減少した（Ｐ＜０．０１、ダネット検定）。
試験例８ ｓｉＲＮＡ／当該リポソーム複合体の組織内濃度
（１）トリチウム標識ｓｉＲＮＡの合成
トリチウム（^３Ｈ）による内部標識のｓｉＲＮＡの合成にはＳｉｌｅｎｃｅｒ^{Ｔ Ｍ} ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、Ｔ７ポリメラーゼの転写反応の際、^３Ｈ標識ＡＴＰ（ＮＥＴ−４２０、パーキンエルマーライフサイエンス）を基質の一部として取り込ませた。^３Ｈ標識ＡＴＰは反応液２０μＬにつき３．７Ｍｂｑ（２．７ｎｍｏｌｅ）を添加し、キットの添付書類に従い二本鎖ｓｉＲＮＡを合成した。その後反応液をフェノール／クロロホルム処理してタンパク質を除去し、さらにＧ−２５スピンカラム（ファルマシア）による未反応モノマーの除去を行った。得られた^３Ｈ標識二本鎖ｓｉＲＮＡを１２％アクリルアミドゲルで電気泳動し、イメージアナライザー（ＢＡＳ２５００、富士写真フィルム）で検定したところ、サイズは２０から２１塩基対でモノマーを含まないことを確認した。
（２）複合体の調製
実施例１の方法および実施例２の方法によりそれぞれ平均粒子径が１８７．５ｎｍのｓｉＲＮＡ複合体と４３．３ｎｍのｓｉＲＮＡ複合体を調製した。それぞれの複合体は^３Ｈ標識体と未標識体を混合したもので調製し、比活性は１０００ｄｐｍ／μｇから２０００ｄｐｍ／μｇに調整した。
（３）組織内濃度の測定
マウス（ｄｄｙ、４週齢、オス、日本エスエルシー）に５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ濃度）で上記の２種類の大きさの複合体を尾静脈より投与した。投与後、５、１５および６０分後にマウスをエーテル麻酔下で採血致死させた。血漿取得のための抗血液凝固剤にはヘパリンを用いた。次いで肝臓、肺、心臓、脾臓および腎臓を摘出し、それぞれの湿重量を測定した。摘出した臓器を含むバイアル中に１ｍＬの組織溶解剤（ソルバブル^ＴＭ、パッカード）を加え、４０℃で一晩振とうして組織を溶解させた（ただし肝臓と腎臓は一部を秤量し溶解した）。赤血球由来の着色が認められるサンプルには３０％過酸化水素水を１００μＬ添加して脱色した後、各バイアルに１０ｍＬのシンチレーションカクテル（ハイオニックフロー^ＴＭ、パッカード）を添加、混合した。液体シンチレーションカウンター（２５００ＴＲ、パッカード）により各臓器の単位重量あたりに含まれる放射活性を測定し、複合体として投与したｓｉＲＮＡの組織内濃度を算出した。
（４）結果
図１４から明らかなように、平均粒子径が４３．３ｎｍの複合体は１８７．５ｎｍの複合体に比べて肝臓および脾臓といった細網内皮系における捕捉が極めて減少し、血漿中濃度が著しく上昇していることが判った。
試験例９ 当該リポソームを用いたアンチセンスＤＮＡの効果
６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞を２．５×１０^５個／ｄｉｓｈで播種し一晩培養した。翌日新鮮な上記培地２．２５ｍＬに交換し、これに実施例３で述べたのと同様の方法で調製したｂｃｌ−２に対するアンチセンスＤＮＡ（配列番号５）を含む複合体分散液０．２５ｍＬを培地に添加した。添加時の複合体分散液は１０％マルトース液により終濃度の１０倍濃度に濃度調整して添加している。なお陰性対照として逆向き配列（配列番号６）を含む複合体も調製し、同時に添加した。添加７２時間後に細胞を回収し、試験例１記載の方法と同様にＢｃｌ−２タンパク質の発現を解析した。
図１５に示すように当該リポソームでｂｃｌ−２に対するアンチセンスＤＮＡを細胞に移入させることにより、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現が特異的に抑制できた。
試験例１０ 当該リポソームを用いたＤＮＡエンザイムの効果
６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞を２．５×１０^５個／ｄｉｓｈで播種し一晩培養した。翌日新鮮な上記培地１．８ｍＬに交換し、これに実施例４で述べたのと同様の方法で調製したＢｃｌ−２に対するＤＮＡエンザイム（配列番号７）を含む複合体分散液０．２ｍＬを培地に添加し終濃度１μＭとした。添加時の複合体分散液は１０％マルトース液により終濃度の１０倍濃度に濃度調整して添加している。なお陰性対照の ＤＮＡエンザイムとして、その酵素活性を消失するようにポイントミューテーションを導入したもの（配列番号８）を含む複合体も同時に調製し添加した。さらに複合体添加後２４時間に新鮮な培地に交換し、再度同様の複合体を添加し、最初の複合体添加から７２時間後に細胞を回収し、試験例１記載の方法と同様にＢｃｌ−２タンパク質の発現を解析した。
図１６に示した結果のように、当該リポソームでＢｃｌ−２に対するＤＮＡエンザイムを細胞に移入させることにより、Ｂｃｌ−２のタンパク質の発現を特異的に抑制することが示された。

本発明は、主成分として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とから構成されるカチオニックリポソームにオリゴ核酸が担持されている複合体を提供する。前記複合体は生体への投与が可能であり、生体内での薬効発揮により医薬品として実用可能であり、前記複合体を含む前記オリゴ核酸の標的分子（標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ、標的タンパク質）が関与する疾患の治療用または予防用医薬組成物として利用することができる。

【配列表】

Claims (12)

1. 主成分として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とから構成されるカチオニックリポソームに１０〜５０の核酸塩基を有するオリゴ核酸が担持されている複合体。
2. 前記リン脂質がレシチンである、請求項１記載の複合体。
3. 平均粒子径が１０〜１００ｎｍの範囲内である、請求項１または２記載の複合体。
4. 前記オリゴ核酸が、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらいずれかの誘導体である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の複合体。
5. 前記ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらいずれかの誘導体が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、またはアプタマーである、請求項４記載の複合体。
6. 前記オリゴ核酸が、配列番号１に示す配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなるセンス鎖ＲＮＡと、配列番号２に示す配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ２本鎖ＲＮＡである、請求項１ないし４記載の複合体。
7. オリゴ核酸の標的分子（標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ、標的タンパク質）が存在する細胞内へデリバリーされる、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の複合体。
8. オリゴ核酸の標的分子が、ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ−ａｂｌに代表される癌遺伝子、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスに代表されるウイルス遺伝子、もしくはＴＮＦ−α、Ｆａｓに代表される炎症関連遺伝子、もしくはこれら遺伝子の転写産物もしくは翻訳産物、または任意のタンパク質をコードしないゲノムＤＮＡもしくはタンパク質発現の調節に働くＲＮＡである、請求項７記載の複合体。
9. 請求項１ないし８のいずれか１項に記載の複合体を含む、オリゴ核酸の標的分子（標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ、標的タンパク質）が関与する疾患の治療用または予防用医薬組成物。
10. 該疾患が癌である、請求項９記載の医薬組成物。
11. 該疾患がウイルス性疾患である、請求項９記載の医薬組成物。
12. 該疾患が炎症性疾患である、請求項９記載の医薬組成物。

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