JP2004519457A - 標的遺伝子の発現を阻害する方法および腫瘍を治療するための医薬 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、細胞内の少なくとも1つの標的遺伝子の発現を阻害する方法、ならびに腫瘍を治療するための医薬に関する。
【背景技術】
【0002】
2本鎖オリゴリボヌクレオチドによって標的遺伝子の発現を阻害する方法は、WO 99/32619に開示されている。この方法は無脊椎動物の細胞内の遺伝子の発現の阻害を目的としている。このため、2本鎖オリゴリボヌクレオチドは、少なくとも25塩基からなる、標的遺伝子と同一の、配列を示す必要がある。
【0003】
細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する方法ならびに医薬は、WO 00/44895に開示されている。この方法において、2本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチド(dsRNA)は、細胞内に導入される。1つのdsRNA鎖は、標的遺伝子と少なくとも部分的に相補性を有する、最大で49の連続するヌクレオチド対から成る領域を示す。医薬は、所定の標的遺伝子の発現を阻害する少なくとも1つのdsRNAを含み、ここで、1つのdsRNA鎖は、標的遺伝子と少なくとも部分的に相補的である。
【0004】
抗アポトーシスタンパク質Bcl−2およびBcl−xLの発現の増大は、多くの腫瘍の発生および進行に関与していることは、Gautschi O.ら、(2001)J Natl Cancer Inst 93、463頁〜471頁に開示されている。ヌードマウスにおいて生じさせたインビボのデータは、Bcl−2およびBcl−xL遺伝子の発現に対して指向された1本鎖アンチセンスオリゴリボヌクレオチドによる組み合わせ治療が、腫瘍の成長を約50%から60%減少し得たことを証明している。このために、1日に、体重1kgあたり20mgのオリゴリボヌクレオチドでの治療が必要であった。大量のオリゴリボヌクレオチドが必要とされるので、この治療は比較的高価である。それに加えて、使用された1本鎖オリゴリボヌクレオチドは、血清中で速やかに分解され得る。アンチセンスオリゴリボヌクレオチドは、少なくとも標的細胞にある標的遺伝子のmRNAの量と同じ量で、最終的に標的細胞に導入されなければならないので、大量のオリゴリボヌクレオチドが必要である。この方法は、腫瘍の減縮ではなく、単に腫瘍の成長の減少を達成したにすぎない。
【特許文献1】WO 00/44895
【非特許文献1】Gautschi O.ら、(2001)J Natl Cancer Inst 93、463頁〜471頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、最先端技術の、これらの欠点を取り除くことである。特に腫瘍細胞の増殖を、効果的かつ経済的に阻害することができる方法および医薬を開示する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
この課題は、請求項1および11の特徴によって解決される。有利な実施形態は、請求項2〜10および請求項12〜22に帰結する。
【0007】
本発明の条件に従って、腫瘍細胞中のアポトーシスを阻害もしくは妨害する少なくとも1つの標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、少なくとも1つの2本鎖リボ核酸(dsRNA)が、上記の腫瘍細胞へと導入される方法が意図される。ここで、上記の2本鎖リボ核酸のS1鎖は、標的遺伝子に少なくとも部分的に相補的である25未満の連続したヌクレオチドからなる領域を含む。「標的遺伝子」という用語は、腫瘍細胞内の2本鎖DNAのDNA鎖であって、すべての転写される領域を含む転写のためのマトリックスとして供されるDNA鎖に相補的であるDNA鎖を意味するものと理解される。そのような標的遺伝子は、一般的にセンス鎖である。従って、S1鎖は、標的遺伝子の発現の間に形成されるRNA転写物、またはそのプロセシング産物(例えば、mRNA)に相補的であり得る。リボ核酸が、1本または2本のリボ核酸鎖からなり、2本鎖構造を示す場合、dsRNAが存在する。すべてのdsRNAヌクレオチドが、ワトソン−クリックの塩基対形成を示すわけではない。特に、単一の非相補的塩基対は、この方法を用いて全く干渉を受けない。塩基対の可能な最大数は、dsRNAに含まれる最も短い鎖のヌクレオチドの数である。「〜に導入される」という用語は、細胞への取り込みという意味にとらえられる。取り込みは細胞自体を用いて起こり得る。しかしながら、取り込みはまた、補助的な薬剤または装置によっても仲介され得る。
【0008】
驚くべきことに、この方法を用いると、伝統的なアンチセンス技術を用いて匹敵する結果を達成するためにオリゴヌクレオチドを使用する場合に必要であるよりも、かなり少量のオリゴリボヌクレオチドで、腫瘍細胞の増殖が阻害できることが示された。これらに加えて、本発明の主題であるこの方法を使うことによって、腫瘍細胞の集団において集団の増殖を減少させるだけでなく、腫瘍細胞の全数も減少させるまでアポトーシスを誘導することが可能である。正常の細胞(すなわち、形質転換されていない細胞)を用いる方法を実装すると、コントロールのdsRNAを用いて実施された方法と比較して、アポトーシスの比率は、有意に増加しない。コントロールdsRNAは、上記細胞中に存在する遺伝子の1つに相補的な鎖を示さないdsRNAである。
【0009】
dsRNAの少なくとも1つの末端が、1〜4個のヌクレオチド、特に2または3個のヌクレオチドからなる1本鎖のオーバーハングを示す場合、特に有利であることが示された。少なくとも1つの末端に1本鎖オーバーハングを有しないdsRNAとの比較において、このような(オーバーハングを有する)dsRNAは、標的遺伝子の発現阻害において特に優れた効果を示す。ここで、1つの末端とは、5’および3’末端が存在するdsRNA領域である。従って、S1鎖のみからなるdsRNAは、ループ構造と1つの末端のみを示す。S1鎖およびS2鎖からなるdsRNAは、2つの末端を示す。ここで、1つの末端は、S1鎖上の鎖末端およびS2鎖上の鎖末端に各々の場合において形成される。
【0010】
1本鎖オーバーハングは、好ましくは、S1鎖の3’末端に配置される。この1本鎖オーバーハングの配置により、本方法の効力がさらに増大する。1つの例において、dsRNAは、1つの末端にのみ、特にS1鎖の3’末端に位置する末端に1本鎖オーバーハングを示す。2個の末端を示すdsRNAにおいて、他の末端は、平滑末端(すなわちオーバーハングが存在しない)である。このようなdsRNAは、種々の細胞培地中で、および血清中で特に安定であることがわかった。
【0011】
相補的なdsRNA領域は、19〜24個のヌクレオチド、好ましくは21〜23個のヌクレオチド、特に22個のヌクレオチドを有し得る。この構造を有するdsRNAは、標的遺伝子の阻害において特に効果的である。dsRNAのS1鎖は、30個未満のヌクレオチド、好ましくは25個未満のヌクレオチド、特に21〜24個のヌクレオチドを有し得る。これらのヌクレオチドの数は、同時に、dsRNA中で可能な最大の塩基対の数である。
【0012】
dsRNAの少なくとも一方の末端は、腫瘍細胞における破壊または2本鎖構造の解離に対抗するために、改変され得る。さらに、相補的なヌクレオチド対によって生じる2本鎖構造の結合は、少なくとも1つの他の化学結合、好ましくは2つの他の化学結合によって強められ得る。この化学結合は、共有結合またはイオン性結合、水素結合、疎水性相互作用、好ましくはファンデルワールス相互作用またはスタッキング相互作用、または金属−イオン配位のいずれかによって形成され得る。また、この化学結合は、2本鎖構造においてプリンの代わりにプリンアナログを用いることによっても形成される。
【0013】
本方法の好ましい実施形態において、標的遺伝子は、Bcl−2ファミリー、特にBcl−2、Bcl−w、またはBcl−xLに属する少なくとも1つの遺伝子である。また、いくつかの遺伝子が標的遺伝子であることも可能である。それゆえ、Bcl−2およびBcl−xLの両方が、標的遺伝子であり得る。Bcl−2ファミリーの遺伝子の阻害が、特に良好である。なぜなら、これらの発現の増加は、多くの腫瘍細胞の発生および増殖に関連しているからである。数個の抗アポトーシス遺伝子を発現する腫瘍遺伝子が存在することから、数個の標的遺伝子の阻害が有利である。
【0014】
dsRNAは、好ましくは、添付の配列表に記載の、配列番号1の配列を有するS2鎖と、配列番号2の配列を有するS1鎖とからなるか、または配列番号3の配列を有するS2鎖と、配列番号4の配列を有するS1鎖からなる。このようなdsRNAは、特に、Bcl−2標的遺伝子の発現の阻害において有効である。腫瘍細胞は、膵臓癌細胞であり得る。dsRNAを腫瘍細胞へと導入するために、dsRNAを取り囲むミセル構造、好ましくはリポソーム、またはdsRNAを取り囲むキャプシドが、使用され得る。特に、キャプシドは、天然ウイルスキャプシド、または化学的手段または酵素手段によって生成される合成キャプシド、またはそれから誘導される構造であり得る。
さらに、本発明は、少なくとも1つの標的遺伝子の発現を阻害するための少なくとも1つの二本鎖リボ核酸(dsRNA)を含有する腫瘍疾患を治療するための医薬に関し、ここで、dsRNAのS1鎖は、標的遺伝子に対して少なくとも部分的に相補的な25個未満の連続したヌクレオチドからなる領域を有する。ここで、標的遺伝子は、それが発現することによって、腫瘍細胞でのアポトーシスを阻害または阻止する遺伝子である。医薬の投与量は、少なくとも1つの標的遺伝子の発現が、阻害され得るようなものである。驚くべきことに、そのような医薬は、非常に低用量で使用され得ることが示されている。1日当たり、1kg体重当たり5mgのdsRNAの投与量は、腫瘍細胞での標的遺伝子の発現の阻害または完全な抑制に十分である。このような投与量では、副作用は大幅に回避される。
【0015】
好ましくは、dsRNAの少なくとも一端は、1〜4個、特に2個または3個のヌクレオチドからなる一本鎖のオーバーハングを有する。一本鎖のオーバーハングは、S1鎖の3’末端に位置していてもよい。dsRNAが、一端のみに一本鎖のオーバーハングを有する場合、特にS1鎖の3’末端に一本鎖のオーバーハングを有する場合、特に有利である。このようなdsRNAは、体内で特に安定であることが実証されている。このdsRNAは、両端に一本鎖のオーバーハングを有するdsRNAに比べ、血液中での排出または分離が遅い。これが低投与量を可能にする。
【0016】
相補的な領域は、19〜24個、好ましくは21〜23個、特に22個のヌクレオチドを発現してもよい。S1鎖は、30個未満、好ましくは25個未満、そして特に21〜24個のヌクレオチドを有し得る。一実施形態において、dsRNAの少なくとも一端は、腫瘍細胞内での破壊または分離に対抗するために修飾される。相補的なヌクレオチド対によって生じる二本鎖構造の結合は、少なくとも1つ、好ましくは2つのさらなる化学結合によって増強されてもよい。
【0017】
標的遺伝子は、好ましくは、Bcl−2ファミリー、特にBcl−2、Bcl−wまたはBcl−xLのうちの少なくとも1つに属する遺伝子である。Bcl−2標的遺伝子およびBcl−xL標的遺伝子の両方に特異的なdsRNAを発現する医薬は、特に効果的である。
【0018】
dsRNAは、添付の配列表に基づく配列番号1を有するS2鎖および配列番号2を有するS1鎖から構成されるか、または配列番号3を有するS2鎖および配列番号4を有するS1鎖から構成されていてもよい。この医薬で治療され得る腫瘍疾患は、膵臓ガンであり得る。膵臓ガンに対して十分な成功率がある治療法は現在存在していない。約3%という5年間の生存率は、全てのガンの中で最も低い。dsRNAは、溶液中に存在するか、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、もしくはカプシドによって囲まれて医薬中に存在していてもよい。ミセル構造またはカプシドは、腫瘍細胞中でのdsRNAの取り込みを促進し得る。医薬は、吸入、経口摂取または注射、特に静脈内もしくは腹腔内注射、または腫瘍細胞への直接注射に適した調製物であり得る。吸入または注射に適した調製物は、最も単純には、dsRNAおよび生理学的耐容性を有する緩衝溶液、特にリン酸緩衝生理食塩水から構成され得る。驚くべきことに、このような緩衝液に単に溶解したdsRNAは、特別なビヒクル中にパッケージする必要もなく、腫瘍細胞に取り込まれ、標的遺伝子の発現を阻害する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0019】
図面を参照して、本発明の実施例について説明する。
【0020】
ヒト膵臓ガン細胞系YAP Cの細胞(微生物および細胞培養物のドイツコレクション、Braunschweig、(No.ACC382)から入手可能)は、10% ウシ胎仔血清(FCS)および1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培養液(Biochrom Corp.,Berlin)中で、37℃、5% CO2の一定条件下で培養した。ヒト表皮の線維芽細胞を、10% FCSおよび1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコMEM中で、同様の条件で培養した。
【0021】
トランスフェクションに用いた二本鎖のオリゴリボヌクレオチドは、以下に示す配列(配列表の配列番号1〜配列番号6に指定した)を有する。
【0022】
dsRNA 1は、ヒトBcl−2遺伝子の第1の配列に相補的である。
S2:5’− cag gac cuc gcc gcu gca gac c−3’(配列番号1)
S1:3’−cg guc cug gag cgg cga cgu cug g−5’(配列番号2)
dsRNA 2は、ヒトBcl−2遺伝子の第2の配列に相補的である。
S2:5’− g ccu uug ugg aac ugu acg gcc−3’(配列番号3)
S1:3’−uac gga aac acc uug aca ugc cgg−5’(配列番号4)
dsRNA 3は、ネオマイシン抵抗性遺伝子の配列に相補的である。
S2:5’− c aag gau gag gau cgu uuc gca−3’(配列番号5)
S1:3’−ucu guc cua cuc cua gca aag cg−5’(配列番号6)
トランスフェクションを、オリゴフェクタミン(Invitrogen Corp.,Karlsruhe)と共に6−ウェルプレートで行った。250,000個の細胞を、各ウェルに配置した。二本鎖のオリゴリボヌクレオチドのトランスフェクションを、Invitrogenが推奨するオリゴフェクタミン用のプロトコルに従って行った(データは6−ウェルプレートの1ウェルに関する)。
【0023】
10μlの二本鎖オリゴリボヌクレオチド(0.1〜10μM)を、175μlの添加剤を含まない細胞培養培地で希釈した。3μlのオリゴフェクタミンを12μlの添加剤を含まない細胞培養培地で希釈し、室温で10分間インキュベートした。希釈したオリゴフェクタミンを、すでに希釈した二本鎖のオリゴヌクレオチドに加え、混合し、そして室温で20分間インキュベートした。この間、トランスフェクトされるべき細胞を添加剤を含まない細胞培養培地で1回洗浄し、そして800μlの新鮮な細胞培養培地を加えた。その後、前述の200μlのオリゴフェクタミンdsRNA混合液を、トランスフェクションの最終容量が1000μlとなるように各ウェルに添加した。その結果、二本鎖のオリゴリボヌクレオチドの最終濃度は1〜100μMとなる。トランスフェクションアッセイでは、37℃で4時間インキュベートした。その後、30% FCSを含む細胞培養培地を、FCSの最終濃度が10%となるように、各ウェルに500μlずつ加えた。このアッセイでは、次いで37℃で120時間インキュベートした。
【0024】
インキュベート後に上清を回収し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄して、トリプシンを用いて剥離し、そして100×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、そして、ペレットを4℃の低浸透圧性のプロピジウムヨウ化物溶液中で30分間暗所でインキュベートした。次いで、FACSCalibur蛍光活性化細胞選別機(BD GmbH,Heidelberg)でフローサイトメトリーを用いて分析を行った。
【0025】
二本鎖オリゴリボヌクレオチドのdsRNA 1およびdsRNA 2は、研究したヒト膵臓ガン細胞において、Bcl−2によって仲介されるアポトーシスの阻害を減少させる。アポトーシスを誘導または開始するために、アポトーシスに追加の刺激を与える必要はない。アポトーシス率は、インキュベート時間に依存して上昇する。図1はdsRNA 1を用いた結果を示し、図2はdsRNA 2を用いた結果を示す。120時間のインキュベート後、未処理のYAP C コントロール細胞はわずか3.8%のアポトーシスを示し、二本鎖オリゴリボヌクレオチドを加えずに前述した方法でトランスフェクション処理した細胞(偽トランスフェクション細胞)は、わずか7.1%のアポトーシスを示した。これに対し、100nMのdsRNAでトランスフェクションすることによって、120時間のインキュベート後のアポトーシス率は、dsRNA 1でトランスフェクションした場合は37.2%、dsRNA 2でトランスフェクションした場合は28.9%に増加し得た。dsRNA3でのコントロールトランスフェクションは、最大13.5%のアポトーシス率をもたらした。これは、偽トランスフェクション細胞と比較しても有意に増加しないことを意味し、そして、dsRNA 1およびdsRNA 2の作用が配列に特異的であることを証明している。
【0026】
コントロールとして、非形質転換細胞としての表皮線維芽細胞もまた、dsRNA 1およびdsRNA 2でトランスフェクトした。120時間のインキュベート後、これらの細胞は、アポトーシス率の有意な増加を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】ヒトBcl−2遺伝子の第1の配列に相補的なdsRNA 1を用いたトランスフェクションの120時間後の、ヒト膵臓ガン細胞YAP Cのアポトーシス率(%)を示す図である。
【図2】ヒトBcl−2遺伝子の第2の配列に相補的なdsRNA 2を用いたトランスフェクションの120時間後の、YAP C細胞のアポトーシス率(%)を示す図である。
【図3】ネオマイシン抵抗性遺伝子の配列に相補的なdsRNA 3を用いたトランスフェクションの120時間後の、YAP C細胞のアポトーシス率(%)を示す図である。
Claims (22)
- 腫瘍細胞のアポトーシスを阻害または阻止する少なくとも1つの標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、少なくとも1つの二本鎖リボ核酸(dsRNA)が、前記腫瘍細胞中に導入され、ここで当該dsRNAのS1鎖は、前記標的遺伝子に対して少なくとも部分的に相補的な25個未満の連続したヌクレオチドからなる領域を有し、前記S1鎖の3’末端に位置するdsRNAの末端のみが、当該S1鎖の3’末端で1〜4個のヌクレオチドからなる一本鎖オーバーハングを有する、方法。
- 前記一本鎖のオーバーハングは、2個または3個のヌクレオチドからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記相補的なdsRNA領域は、19〜24個、好ましくは21〜23個、特に22個のヌクレオチドを有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記S1鎖は、30個未満、好ましくは25個未満、特に21〜24個のヌクレオチドを有する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記dsRNAの少なくとも一端は、腫瘍細胞中での破壊また分離に対抗するために修飾される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 相補的なヌクレオチド対によって生じる前記dsRNAの結合は、少なくとも1つ、好ましくは2つの他の化学結合によって増加する、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記標的遺伝子は、Bcl−2ファミリー、特にBcl−2、Bcl−w、もしくはBcl−xLに属する少なくとも1つの遺伝子であるか、またはBcl−2およびBcl−xLが標的遺伝子である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記dsRNAは、添付の配列表の、配列番号1を有するS2鎖および配列番号2を有するS1鎖、または配列番号3を有するS2鎖および配列番号4を有するS1鎖からなる、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記腫瘍細胞は膵臓ガン細胞である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記dsRNAは、当該dsRNAを囲むミセル構造、好ましくはリポソームによって、または当該dsRNAを囲むカプシドによって、前記腫瘍細胞中に導入される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 腫瘍疾患を治療する医薬であって、腫瘍細胞のアポトーシスを阻害または阻止する少なくとも1つの標的遺伝子の発現を阻害する少なくとも1つの二本鎖リボ核酸(dsRNA)を含み、前記dsRNAのS1鎖は、前記標的遺伝子に対して少なくとも部分的に相補的な25個未満の連続したヌクレオチドからなる領域を有し、前記S1鎖の3’末端に位置するdsRNAの末端のみが、当該S1鎖の3’末端で1〜4個のヌクレオチドからなる一本鎖オーバーハングを有する、医薬。
- 前記一本鎖のオーバーハングは、2個または3個のヌクレオチドからなる、請求項11に記載の医薬。
- 前記相補的なdsRNA領域は、19〜24個、好ましくは21〜23個、特に22個のヌクレオチドを有する、請求項11または12に記載の医薬。
- 前記S1鎖は、30個未満、好ましくは25個未満、特に21〜24個のヌクレオチドを有する、請求項11〜13のいずれかに記載の医薬。
- 前記dsRNAの少なくとも一端は、腫瘍細胞中での破壊また分離に対抗するために修飾される、請求項11〜14のいずれかに記載の医薬。
- 相補的なヌクレオチド対によって生じる前記dsRNAの結合は、少なくとも1つ、好ましくは2つの他の化学結合によって増加する、請求項11〜15のいずれかに記載の医薬。
- 前記標的遺伝子は、Bcl−2ファミリー、特にBcl−2、Bcl−w、もしくはBcl−xLに属する少なくとも1つの遺伝子であるか、またはBcl−2およびBcl−xLが標的遺伝子である、請求項11〜16のいずれかに記載の医薬。
- 前記dsRNAは、添付の配列表の、配列番号1を有するS2鎖および配列番号2を有するS1鎖、または配列番号3を有するS2鎖および配列番号4を有するS1鎖からなる、請求項11〜17のいずれかに記載の医薬。
- 前記腫瘍細胞は膵臓ガン細胞である、請求項11〜18のいずれかに記載の医薬。
- 前記dsRNAは、溶液中で、または囲むミセル構造、好ましくはリポソームによって、もしくはカプシドによって囲まれて医薬の中に存在する、請求項11〜19のいずれかに記載の医薬。
- 前記医薬は、吸入、経口摂取または注射、特に静脈内もしくは腹腔内注射、または腫瘍細胞への直接注射に適した製剤である、請求項11〜20のいずれかに記載の医薬。
- 前記製剤は、dsRNAと生理学的耐容性を有する緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水とからなる、請求項21に記載の医薬。
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