CN105555279B - 用于治疗脓毒症的MicroRNA抑制 - Google Patents
用于治疗脓毒症的MicroRNA抑制 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105555279B CN105555279B CN201480047629.XA CN201480047629A CN105555279B CN 105555279 B CN105555279 B CN 105555279B CN 201480047629 A CN201480047629 A CN 201480047629A CN 105555279 B CN105555279 B CN 105555279B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- mirna
- sepsis
- agent
- antagomir
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
一种治疗脓毒症的方法,包括施用抑制在脓毒症中上调的miRNA的活性的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及miRNA。更具体地,本发明涉及通过使用miRNA抑制剂来治疗脓毒症和其他疾病的方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是小的非编码RNA分子,平均22个核苷酸长,其在基因表达的转录和转录后调节中发挥作用。由真核生物的核DNA编码,miRNA通过在mRNA分子内与互补序列的碱基配对发挥作用,一般通过翻译抑制或靶向降解造成基因沉默。人基因组可编码超过1000个miRNA,其可靶向约60%的哺乳动物基因,且在很多人细胞类型中含量很高。各种疾病状态已经涉及miRNA的异常表达,基于miRNA的治疗正在研究中。
例如,Zhu等(Cardiovascular Research,2011,92:75-84)发现在心肌细胞中microRNA-195(miR-195)通过下调Sirt1促进棕榈酸酯诱导的细胞凋亡。
Wang等(PLoS ONE,2012,7(6):e38885)发现血清miRNA特征可以预测脓毒症患者的死亡率。
仍然需要鉴定能够特异性靶向治疗或预防各种疾病状态的一个miRNA或miRNA的组合。
发明简述
一个方面,本发明涉及通过使用靶向和/或抑制miR-15家族的miRNA活性的miRNA抑制剂来治疗脓毒症或其他相关疾病的方法。以这种方式,在一个方面,miRNA抑制剂有助于治疗涉及miR-15家族成员上调的疾病、紊乱或病症,例如脓毒症。
在一个方面,提供用于治疗脓毒症的方法,包括施用抑制在脓毒症中上调的miRNA的活性的试剂。
在一个方面,miRNA是miRNA-15家族的成员。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,miRNA是miR-195。
在一个方面,试剂保护器官功能。
在一个方面,器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
在一个方面,试剂降低细胞凋亡。
在一个方面,试剂降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋亡。
在一个方面,免疫细胞是巨噬细胞。
在一个方面,试剂降低炎性反应。
在一个方面,炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
在一个方面,脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便诱导的脓毒症。
根据另一个方面,提供保护器官功能的方法,包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
根据另一个方面,提供降低细胞凋亡的方法,包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,试剂降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋亡。
在一个方面,免疫细胞是巨噬细胞。
根据另一个方面,提供降低炎性反应的方法,包括施用抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
在一个方面,试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基寡聚物、2’-O-甲基RNA寡聚物、antagomir、抑制miRNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断mRNA转录体的miRNA靶标位点的空间阻断的寡聚物。
根据另一个方面,提供用于治疗脓毒症的方法,包括施用增强在脓毒症中上调的miRNA的靶基因活性的试剂。
根据另一个方面,提供抑制在脓毒症中上调的miRNA活性的试剂用于治疗脓毒症的用途。
在一个方面,miRNA是miRNA-15家族的成员。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,miRNA是miR-195。
在一个方面,用途是保护器官功能。
在一个方面,器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
在一个方面,用途是降低细胞凋亡。
在一个方面,用途是降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋亡。
在一个方面,免疫细胞是巨噬细胞。
在一个方面,用途是降低炎性反应。
在一个方面,炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
在一个方面,脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便诱导的脓毒症。
根据另一个方面,提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂用于保护器官功能的用途。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
根据另一个方面,提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂用于降低细胞凋亡的用途。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,用途是降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋亡。
在一个方面,免疫细胞是巨噬细胞。
根据另一个方面,提供抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂用于降低炎性反应的用途。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
在一个方面,试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基寡聚物、2’-O-甲基RNA寡聚物、antagomir、抑制miRNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断mRNA转录体的miRNA靶标位点的空间阻断的寡聚物。
根据另一个方面,提供增强在脓毒症中上调的miRNA的靶基因活性的试剂用于治疗脓毒症的用途。
根据另一个方面,提供用于治疗脓毒症的组合物,其包含抑制在脓毒症中上调的miRNA活性的试剂。
在一个方面,miRNA是miRNA-15家族的成员。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,miRNA是miR-195。
在一个方面,试剂用于保护器官功能。
在一个方面,器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
在一个方面,试剂用于降低细胞凋亡。
在一个方面,试剂用于降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋亡。
在一个方面,免疫细胞是巨噬细胞。
在一个方面,试剂用于降低炎性反应。
在一个方面,炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
在一个方面,脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便诱导的脓毒痖。
根据另一个方面,提供用于保护器官功能的组合物,其包含抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
根据另一个方面,提供用于降低细胞凋亡的组合物,其包含抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,组合物用于降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋亡。
在一个方面,免疫细胞是巨噬细胞。
根据另一个方面,提供用于降低炎性反应的组合物,其包含抑制miRNA-15家族的miRNA活性的试剂。
在一个方面,miRNA是mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497中的至少一个。
在一个方面,炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
在一个方面,试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基寡聚物、2’-O-甲基RNA寡聚物、antagomir、抑制miRNA成熟的空间阻断的寡聚物、或阻断mRNA转录体的miRNA靶标位点的空间阻断的寡聚物。
根据另一个方面,提供用于治疗脓毒症的组合物,其包含增强在脓毒症中上调的miRNA的靶基因活性的试剂。
本发明的其他特征和优势将在以下详细描述中变得明显。然而,应当理解,当显示本发明的方面时,详细描述和具体的实施例仅以说明性的方式给出,因为从所述详细描述中,在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
将参照附图从以下描述中进一步理解本发明,其中:
图1A和1B显示上调miR-195足以诱导内皮细胞中的细胞凋亡。
图2A和2B显示抑制miR-195降低了内皮细胞中脂多糖诱导的细胞凋亡。
图3A、3B和3C显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的肝组织中的细胞凋亡的影响。
图4显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的肺组织中的细胞凋亡的影响。
图5A、5B和5C显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的肝组织中的炎性反应的影响。
图6显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的肾组织中的炎性反应的影响。
图7A、7B和7C显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的器官功能障碍的影响。
图8A、8B、8C和8D显示miR-195抑制对腹膜中的粪便-诱导的脓毒症小鼠模型的肝脏的细胞凋亡和炎症的影响。
图9A、9B、9C、9D和9E显示miR-195抑制对腹膜中的粪便-诱导的脓毒症小鼠模型的肺的细胞凋亡和炎症的影响。
图10显示miR-195抑制对腹膜中的粪便-诱导的脓毒症小鼠模型的存活率的影响。
图11A、11B、11C、11D、11E和11F显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋亡、炎症和器官功能障碍的治疗性作用。
图12显示miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的微血管功能障碍的治疗性作用。
发明详述
本发明涉及与在脓毒症或其他病症中上调(与不存在这些疾病的正常水平相比)的miRNA序列结合和/或相互作用的试剂。因此,这些试剂可用于治疗病症例如脓毒症、用于保护器官功能、降低细胞凋亡和降低炎性反应。由本文所述的试剂靶向的特定miRNA属于,例如miRNA-15家族,例如mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497。
除非另有定义,本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。参见例如Singleton等,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994);Sambrook等,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor,NY 1989),其各自通过引用并入本文。为本发明的目的,下面定义以下术语。
如本文所用,术语“miRNA”是指microRNA分子,其是小的(大约22个核苷酸)非编码RNA分子,通过结合mRNA序列并靶向它们用于降解来转录后调节基因表达。特定miRNA用前缀“mir”加破折号和数字来命名。例如,miRNA-15家族的成员包括mir-15a、mir-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195、mir-322/424和miR-497。
本文所述的序列的“变体”是生物活性的序列,其因为在天然序列中一个或多个核苷酸的插入、缺失、修饰和/或替换具有与天然序列或野生型序列(或其补体)不同的核苷酸序列。这种变体通常与天然序列或其补体的序列一致性小于100%。然而,生物活性的变体通常与对应的天然存在的序列或其补体具有至少约70%的序列一致性,通常至少约75%、更通常至少约80%、甚至更通常至少约85%、甚至更通常至少约90%、且甚至更通常至少约95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。任何长度的变体核苷酸片段保留对应天然序列的生物活性。变体还包括其中在5’或3’端或在天然序列或其补体内添加一个或多个核苷酸的序列。变体还包括其中一些核苷酸被删除和任选地被一个或多个不同核苷酸替换的序列。
本文的“百分比序列一致性”定义为在比对序列并引入空位(如有必要)以获得最大百分比序列一致性之后,在候选序列中与目标序列的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或残基的百分比,且不考虑任何保守性替换作为序列一致性的部分。在候选序列中的5’、3’或内部延伸、缺失或插入均应不被解释为影响序列一致性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的,例如“BLAST”。
用于本文目的的“活性的”或“活性”是指天然或天然存在的miRNA、miRNA抑制剂或miRNA靶序列的生物活性,其中“生物”活性是指由天然或天然存在的miRNA、miRNA抑制剂或miRNA靶序列引起的生物功能(抑制或刺激)。
因此,当“生物学活性的”或“生物活性”与“miRNA”、“miRNA抑制剂”或“miRNA靶序列”组合使用时,是指表现或共有天然miRNA、miRNA抑制剂或miRNA靶序列的效应子功能的核苷酸序列。例如,抑制miRNA活性的miRNA抑制剂或试剂的生物活性是抑制特定miRNA序列的抑制性活性。同样,miRNA序列通常的生物活性是抑制特定mRNA序列的翻译,从而抑制基因表达。
当“生物学活性的”或“生物活性”与变体序列组合使用时,是指变体序列表现或共有亲本序列的效应子功能。与亲本序列相比,变体的生物活性可以增加、降低、或是相同水平。
术语“抑制”或“抑制性”是指miRNA的功能或活性被降低、限制、阻断或中和。这些术语涵盖miRNA功能或活性的完全或部分抑制,包括特定miRNA与其靶mRNA的结合。
“miRNA靶序列”是特定miRNA结合和抑制的mRNA分子。例如,miRNA-15家族可以靶向并抑制重要抗凋亡蛋白表达。这些蛋白包括但不限于BCL-2、Sirt1、Pim-1等。抗凋亡蛋白的下调将促进凋亡性细胞死亡,这明显促进导致死亡的脓毒症相关的器官功能障碍。因此,抑制miR-15家族的成员可以预防脓毒症中的细胞凋亡和多种器官功能障碍。
“分离的”是指已经从其来源纯化的或已经通过重组或合成方法制备并纯化的分子。纯化核苷酸基本上不含其它核苷酸或碱基。
本文中“基本上不含”是指其它来源核苷酸的污染少于约5%、通常少于约2%、更通常少于约1%、甚至更通常少于约0.5%、最通常少于约0.1%。“基本上纯的”核苷酸是指组合物包含基于组合物总重量的至少约90重量%的核苷酸、基于组合物总重量的通常至少约95重量%、更通常至少约90重量%、甚至更通常至少约95重量%和甚至更通常至少约99重量%的核苷酸。
如在本文所用,“治疗”或“疗法”是指用于获得有益或期望临床结果的方法。为本发明的目的,有益或期望临床结果包括但不限于,症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定(例如没有恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和,和缓解(部分或总体上),无论是可检测的或不可检测的。“治疗”或“疗法”还可以是指与如果不接受治疗或疗法的期望存活率相比,存活率延长。因此,“治疗”或“疗法”是意欲改变病症的病理而进行的干预。具体地,治疗或疗法可以直接预防、减缓或降低细胞退化或损伤的病理,例如在炎性反应中免疫细胞的病理,或脓毒症中器官细胞的病理、或可以使细胞对其他治疗剂的治疗或疗法更敏感。
术语“治疗有效量”、“有效量”或“足够量”是指当向受试者,包括哺乳动物,例如人施用时,足以获得期望结果的量,例如有效治疗脓毒症的量。本文所述的试剂的有效量可以根据因素,例如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重而改变。如技术人员所理解,可以调节剂量或治疗方案以提供最佳治疗反应。
此外,受试者治疗方案的治疗有效量可以由单次施用组成,或包括一系列应用。治疗期的长度取决于各种因素,例如疾病严重度、受试者的年龄、试剂浓度、患者对试剂的反应性或其组合。还将理解,用于治疗的试剂的有效剂量可以在具体的治疗方案过程中增加或减少。剂量变化可以通过本领域已知的标准诊断分析产生并变得明显。一方面,本发明的试剂可以在用常规疗法治疗之前、期间或之后施用,所述常规疗法用于讨论的疾病或病症,例如脓毒症。
如在本文所用,术语“受试者”是指动物界的任何成员,通常是哺乳动物。术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物,包括人、其他高等灵长类、家畜和农畜以及动物园、运动或宠物动物,例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。通常,哺乳动物是人。
与一种或多种进一步的治疗剂“组合”施用包括同时(同时发生)施用和任何顺序的连续施用。
如在本文所用,“载体”包括药学上可接受的、在使用的剂量和浓度下对暴露其下的细胞或哺乳动物无毒的载体、赋形剂或稳定剂。药学上可接受的载体一般是水性pH缓冲液。药学上可接受的载体的实例包括缓冲液、例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白质,例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,例如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖和糊精;螯合剂,例如EDTA;糖醇,例如甘露醇和山梨醇;成盐抗衡离子,例如钠;和/或非离子表面活性剂,例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡,其用于将药物递送至受试者,例如哺乳动物。脂质体的成分一般以双层形式排列,与生物膜的脂质排列相似。
如在本文所用,在理解本申请的范围中,术语“包含”及其衍生体意欲是开放性术语,其指定所说明的特征、因素、成分、组、整数、和/或步骤的存在,但不排除其他未说明的特征、因素、成分、组、整数、和/或步骤的存在。以上对具有相似含义的词语同样适用,例如术语“包括”、“具有”及其衍生体。将理解描述为“包含”某些成分的任何方面也可以“由……组成”或“基本上由……组成”,其中“由……组成”具有封闭或限制性含义,“基本上由……组成”是指包括指定的成分但除以下之外不包括其他成分:作为杂质存在的物质、作为用来提供成分的方法结果而存在的不可避免的物质和不是为获得本发明的技术效果的目的而添加的成分。例如,用短语“基本上由……组成”定义的组合物涵盖任何已知的药学上可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。通常,基本上由一组成分组成的组合物将包含少于5重量%、通常少于3重量%、更通常少于1重量%的非指定成分。
将理解,本文定义的包括的任何成分或序列可以通过限制性条款或负面限制明确地从要求保护的发明中排除。同样,待治疗的受试者或患者可以定义为患有或不患有本文所述的或技术人员已知的脓毒症的任何症状或结果。
最后,本文所用的程度术语,例如“基本上”、“约”和“大约”是指该修饰术语的合理的偏差量,以使最终结果没有明显改变。这些程度术语应当理解为包括至少±5%的该修饰术语的偏差,如果该偏差没有否定其修饰的词语的含义。
炎症
“炎性病症”通常由炎性细胞因子级联介导,在本文中炎性细胞因子级联被定义为受试者中至少一种促炎细胞因子从细胞的体内释放,其中细胞因子释放影响受试者的生理状况。产生促炎细胞因子的细胞的非限制性实例是单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、上皮细胞、成骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和神经元。
“细胞因子”是哺乳动物细胞天然产生的可溶性蛋白或肽,并且在微摩尔至皮摩尔浓度下在体内作为体液调节物。无论在正常条件或病理条件下,细胞因子可以调节个体细胞和组织的功能活性。促炎细胞因子是能引起任何下述炎症相关生理反应的细胞因子:血管舒张、充血、血管透过性增加伴有相关水肿、粒细胞和单核吞噬细胞的积聚或纤维蛋白的沉积。促炎细胞因子的非限制性实例是肿瘤坏死因子α(TNF)、白细胞介素(IL)-1a、IL-1-β、IL-6、IL-8、IL-18、干扰素-γ、HMG-1、血小板活化因子(PAF)和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)。促炎细胞因子可以介导多种炎性病症的不利状况,例如内毒素性休克、哮喘、风湿性关节炎、炎性胆汁病、心力衰竭和同种移植物排斥。
促炎细胞因子应当与不是炎症调节物的诸如IL-4、IL-10和IL-13的抗炎细胞因子区分开。在某些实例中,本文所述的治疗不抑制抗炎细胞因子的释放。
在某些实例中,本文所述的治疗抑制TNF的促炎性效应。TNF作为各种炎性病症中的调节物。几种这类实例包括:脓毒性休克、癌症、AIDS、移植排斥、多发性硬化、糖尿病、风湿性关节炎、外伤、疟疾、脑膜炎、缺血再灌注损伤和成人呼吸窘迫综合征。
TNF在数种炎性病症中发挥作用,并且因此进行了关于TNF疗法和抗TNF疗法的研究。研究集中于在炎性病症以及预防同种异体反应性和移植排斥中抑制TNF活性,所述炎性病症例如风湿性关节炎、克罗恩氏病、AIDS、细菌脓毒性休克(由某些革兰氏阴性菌引起)和细菌中毒性休克(由超抗原引起)。缺少TNF的突变小鼠对革兰氏阴性菌诱导的脓毒症具有抗性(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Capra,J.Immunobiology:The Immune Systemin Health and Disease.New York,N.Y:Garland Publishers.1999),并且抗TNF单克隆抗体已用于抑制TNF活性和治疗内毒素血症(Beutler等,Science 229;867-871)。控制TNF活性的治疗的一个优势来自它在多种炎症中的作用。例如,通常难于确定烧伤和外伤受害者中的炎症是否为感染性病因学的以及抗生素治疗是否合理;因此抑制TNF活性的治疗可能是有利的。抑制TNF活性的策略包括通过抗TNF抗体、可溶性受体或受体融合蛋白来中和细胞因子;通过诸如环孢霉素A、糖皮质激素或细胞因子IL-10的药物来抑制TNF-A合成;通过重复的低剂量刺激来降低对TNF的反应性;或通过抑制诸如IL-1、IL-6或一氧化氮的次级调节物。本文所述的试剂可用来抑制TNF活性。
炎性病症可以是其中炎性细胞因子级联引起全身性反应,例如全身炎症反应综合征(SIRS)或脓毒性休克。或者,病症可以由局部炎性细胞因子级联介导,正如在风湿性关节炎中。可用本文所述的试剂有效治疗的病症的非限制性实例包括阑尾炎、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、急性结肠炎、缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失弛缓症、胆管炎、胆囊炎、肝炎、克罗恩氏病、小肠炎、惠普尔氏病、过敏症、过敏性休克、免疫复合物病、多器官功能障碍综合征(MODS)、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症、脓毒症、内毒素性休克、恶病质、高热、嗜酸粒细胞肉芽肿、肉芽肿病、结节病、脓毒性流产、附睾炎、阴道炎、前列腺炎、尿道炎、支气管炎、肺气肿、鼻炎、肺炎、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、鼻窦炎、流感、呼吸道合胞体病毒感染、HIV感染、AIDS、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、疱疹病毒感染、弥散性菌血症、登革热、念珠菌病、疟疾、丝虫病、阿米巴病、棘球囊肿病、烧伤、皮炎、皮肌炎、晒伤、风疹、疣、风团、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性动脉周围炎、风湿热、阿尔察默病、乳糜泄、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、多发性硬化、脑梗死、脑栓塞、格林-巴利综合征、神经炎、神经痛、脊髓损伤、麻痹、葡萄膜炎、关节炎性疹、关节痛、骨髓炎、筋膜炎、帕哲病、痛风、牙周病、风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、古德帕斯丘综合征、贝赫切特综合征、同种异体移植排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、肥胖症、强直性脊柱炎、伯格氏病、瑞特氏综合征和何杰金氏病。
在某些非限制性实例中,所述炎性病症选自哮喘、过敏症、过敏性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)、器官缺血、缺血-再灌注损伤、器官坏死、SIRS、脓毒症、脓毒症、内毒素性休克、恶病质、脓毒性流产、弥散性菌血症、烧伤、乳糜泄、充血性心力衰竭、心肌炎、心肌缺血、成人呼吸窘迫综合征、脑梗死、脑栓塞、脊髓损伤、麻痹、同种异体移植排斥或移植物抗宿主病。
在一个实例中,所述炎性病症是内毒素性休克。在另一个实例中,所述炎性病症是SIRS。另一个实例中,所述炎性病症是脓毒症。另一个实例中,所述炎性病症是多器官功能障碍综合征(MODS)。
脓毒症
脓毒症是对感染的全身炎性反应,并且是重症监护病房中最常见的死因。脓毒症的死亡率为20-30%,败血性休克的死亡率为40-80%(Angus等,Crit Care Med 2001;29:1303-1310)。心肌功能障碍是脓毒性休克的常见并发症(Parrillo等,Ann Intern Med1990;113:227-242)。该全身炎性病症是对感染的失调的宿主反应的结果,并且特征为过量的促炎细胞因子产生。宿主固有免疫反应的起始通过在识别病原相关的分子模式(PAMP)中细胞膜toll样受体-4(TLR4)的活化所介导。脂多糖(IPS)是革兰氏阴性菌外膜中最主要的PAMP,并且以CD-14和LPS结合蛋白(LBP)依赖性方式与TLR4结合。通过LPS结合的TLR4活化起始导致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活和TNF产生的信号通路,其中TNF是重要的细胞因子并且是脓毒症中器官功能障碍(例如,心脏功能障碍)中起主要作用的因子(Suffredini等,N Enl J Med 1989;321:280-287;Natanson等,J Exp Med 1989;169:823-832)。
如果高度怀疑有感染或已证实有感染并满足下述全身炎症反应综合征(SIRS)标准中的两条或更多条,则考虑存在脓毒症(Bone RC,Balk RA,Cerra FB,et al(June1992).“Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use ofinnovative therapies in sepsis.The ACCP/SCCM Consensus ConferenceCommittee.American College of Chest Physicians/Society of Critical CareMedicine”.Chest 101(6):1644-55.):
●心率>每分钟90次跳动(心动过速);
●体温<36℃(96.8°F)或>38℃(100.4°F)(低体温或发烧);
●呼吸速率>每分钟20次呼吸,或血气PaCO2小于32mm Hg(4.3kPa)(由于过度换气的呼吸急促或低碳酸血症);
●白细胞计数<4000个细胞/mm3或>12000个细胞/mm3(<4×109或>12×109个细胞/L),或大于10%带形(未成熟白细胞);(白细胞减少症、白细胞增多症或杆状核粒细胞增多症)。
发烧和白细增多症是急性期反应的特征,而心动过速通常是血液动力不足的初始体征。呼吸急促可与由于感染和炎症的增加的代谢应激有关,但是也可以是导致厌氧菌细胞代谢的开始的灌注不足的体征。
对于儿童,按照以下方式修改了SIRS标准(Goldstein B,Giroir B,Randolph A(2005).″International pediatric sepsis corsensus conference:definitions forsepsis and organ dysfunction in pediatrics″.Pediatr Crit Care Med 6(1):2-8):
●心率>不存在诸如疼痛和药物施用的刺激的情况下的年龄正常值2倍标准差、或者不明原因持续升高30分钟至4小时。婴儿中还包括心率<不存在迷走神经刺激物、β-受体阻滞剂或先天性心脏病的情况下的年龄正常值的10个百分点,或不明原因的持续降低超过30分钟;
●经口或经直肠、从Foley导管探头或从中央静脉导管探头获得的体温>38.5℃或<36℃。在儿科患者中,温度必须异常才能确定为SIRS;
●呼吸速率>年龄正常值2倍标准差,或需要人工呼吸,但与神经肌肉疾病或施用麻醉无关;
●与化疗无关的白细胞计数相对于年龄升高或降低,或大于10%杆状白细胞+其它未成熟形式。
本领域技术人员应当意识到,在临床环境中必须谨慎解释SIRS标准。存在这些标准的主要目的是更客观地对危重患者进行分类,以便将来的临床研究可以更严谨且更容易重复。
随着反映临床经验的脓毒症体征和症状的最新列表,一致性定义也在不断演变。
为了确定为脓毒症,必须有怀疑的或被证实(通过培养、染色或聚合酶链式反应(PCR))的感染,或具有感染特定的临床综合征。感染的特定证据包括正常情况下无菌液体(例如尿液或脑脊髓液(CSF))中的WBC、内脏穿孔的证据(腹部x-射线或CT扫描上的游离空气、急性腹膜炎体征)、符合肺炎的异常的胸部x-射线(CXR)(病灶处混浊)或瘀点、紫癜或爆发性紫癜。脓毒症更危重的亚类是重度脓毒症(伴有急性器官功能障碍的脓毒症)和脓毒性休克(伴有难治性低动脉压的脓毒症)。或者,当满足两条或更多条全身炎症反应综合征标准而没有感染证据时,可将患者简单地诊断为“SIRS”。患有SIRS和急性器官功能障碍患者可以称为“重度SIRS”。
如果患者患有脓毒症并伴有全身灌注不足(器官功能障碍或血清乳酸盐大于4mmol/dL)的体征,则将他们确定为“重度脓毒症”。其它体征包括少尿和改变的精神状态。如果患者患有脓毒症并伴有积极液体复苏(通常多至6升或40ml/kg的晶体)之后的血压过低,则也将他们确定为患有脓毒性休克。
终末器官功能障碍的实例包括以下(Abraham E,Singer M(2007).″Mechanismsof sepsis-induced organ dysfunction″.Crit.Care Med.35(10):2408-16):
●肺-急性肺损伤(ALI)(PaO2/FiO2<300)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(PaO2/FiO2<200);
●脑-脑病(症状:焦虑、混乱、昏迷);(病因:缺血、出血、微血栓、微脓疡、多病灶坏死脑白质病);
●肝脏-蛋白合成功能的破坏:由于不能合成凝血因子而表现为急性进行性凝血病;代谢功能的破坏:表现为胆红素代谢停止,导致非结合血清胆红素水平(间接胆红素)上升;
●肾脏-少尿和无尿;电解质异常;容量过度负荷;
●心脏--收缩性和舒张性心力衰竭,至少部分原因是降低肌细胞功能的细胞因子;细胞损伤,表现为肌钙蛋白泄露(但实际上未必缺血)。
microRNA
本发明涵盖与miRNA序列相互作用从而调节miRNA的功能和/或活性的试剂。通常,本文所述的试剂靶向的miRNA序列包括靶向并抑制抗细胞凋亡蛋白表达的任何miRNA,包括miRNA-15家族的成员,例如mir-15a,、mir-15b、miR-16、miR-195、mir-322/424和miR-497。这些miR-15家族成员的序列如下:
miR-15a:5’uagcagcacauaaugguuugug 3’
miR-15b:5’uagcagcacaucaugguuuaca 3’
miR-16:5’uagcagcacguaaauauuggcg 3’
miR-195:5’uagcagcacagaaauauuggc 3’
miR-322/424:5’cagcagcaauucauguuuugga 3’
miR-497:5’cagcagcacacugugguuugua 3’
已经表明这些miRNA在诸如脓毒症的病症中被上调,因此造成脓毒症中涉及的败血性基因表达的抑制。通过抑制这些miRNA中的一个或多个,它们对脓毒症中涉及的基因的抑制被阻断,这些基因的表达被允许,从而治疗脓毒症。
microRNA抑制性试剂
本文所述的试剂与特定miRNA序列相互作用,从而调节它们的功能和/或活性。也可以使用试剂的组合,其一起具有协同作用或累加作用。该试剂可以特异性结合miRNA序列并通过反义或siRNA技术沉默它们,或它们可以是与天然miRNA靶序列竞争的用于被讨论的miRNA抑制的对应miRNA靶序列或其变体或片段。
通常,该试剂是antagomir,它是阻止其他分子例如miRNA与mRNA分子上的期望位点结合的化学工程化寡核苷酸。术语“antagomir”是指单链、双链、部分双链或发夹结构的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或两者或其修饰的寡聚物或聚合物,其对于它的miRNA靶标而言是反义的。
antagomir和其他miRNA抑制剂的实例描述于WO2009/20771、WO2008/91703、WO2008/046911、WO2008/074328、WO2007/90073、WO2007/27775、WO2007/27894、WO2007/21896、WO2006/93526、WO2006/112872、WO2007/112753、WO2007/112754、WO2005/23986或WO2005/13901,其全部通过引用并入本文。
定制设计的antagomir分子可从例如Applied Biosystems商购。这些分子是设计以特异性抑制细胞中天然存在的成熟miRNA分子的化学修饰的优化的单链核酸。例如,来自Applied Biosystems的产品ID AM12607是靶向人miR-33a的Anti-miRTM抑制剂。
antagomir还可从Thermo Scientific商购。这些抑制剂包括化学修饰和二级结构基序。例如,Vermeulen等在美国专利公开2006/0223777中报道了增强这些分子效力的二级结构元件的鉴定。具体地,在反向互补核周围整合高度结构化的双链侧翼区显著提高了抑制剂功能,并允许以亚纳摩尔的浓度抑制多个miRNA。Antagomir设计中的其他这些改进预期用于所公开的方法中。
在一个方面,antagomir包括足够长的核苷酸和足以与目标miRNA互补的区域,从而antagomir与miRNA形成双链体。给定所讨论的miRNA的序列,可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计antagomir。
因此,antagomir可以是具有与所讨论的miRNA的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的单链核酸序列的反义寡核苷酸,其中所述反义寡核苷酸与miRNA在生理条件下形成双链体。
antagomir可以包括长度为至少8个连续核苷酸的反义寡核苷酸。因此,反义寡核苷酸可以具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸。寡核苷酸的长度通常少于30个连续核苷酸。寡核苷酸的长度可以少于25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个连续核苷酸。
公开的antagomir可以包括具有与目标miRNA至少部分,和在一些方面全部互补的区域的反义寡核苷酸。antagomir和靶标之间不需要完美互补,但对应性必须足以使该反义寡核苷酸与miRNA形成双链体,并随后降低其活性。例如,在通常的方面,反义寡核苷酸抑制miRNA与其mRNA靶标的结合。
公开的antagomir可以包括具有与目标miRNA至少65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互补的区域的反义寡核苷酸。
通常,公开的antagomir具有与目标miRNA的核苷酸序列互补的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸。在一个方面,公开的antagomir具有与目标miRNA互补的核苷酸序列。因此,在一个方面,公开的antagomir具有与目标miRNA互补的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸。
在一些方面,在互补区存在核苷酸错配。在通常的方面,互补区将具有不超过1、2、3、4或5个错配。
在一些方面,antagomir与目标miRNA“严格互补”。因此,在一个方面,antagomir可以退火至目标miRNA以形成杂合体,该杂合体仅由严格互补区的Watson-Crick碱基对组成。因此,在一些方面,antagomir特异性的区别是单核苷酸的差异。在这种情况下,只有在单核苷酸差异区发现严格互补时,antagomir才抑制miRNA活性。
公开的antagomir包括核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或两者或其修饰的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核酸碱基、糖和共价核苷间(骨架)连接以及具有相似功能的非天然存在部分的寡核苷酸组成的寡核苷酸。这种修饰的或替换的寡核苷酸由于期望性质,例如,诸如细胞摄入增强、对核酸靶标的亲和性增强,和/或在核酸酶存在下稳定性增强,而优于天然形式使用。
antagomir寡核苷酸可以包括未修饰的RNA和DNA以及已经被修饰例如以提高功效的RNA和DNA,和核苷替代物的聚合物。“未修饰的”RNA是指其中核酸成分(即糖、碱基和磷酸盐部分)与其天然存在的,通常在人体内天然存在的核酸成分相同或基本上相同的分子。如在本文所用,“修饰的”RNA是指其中一种或多种核酸成分(即糖、碱基和磷酸盐部分)与其天然存在的核酸成分不同,通常与在人体内天然存在的核酸成分不同的分子。当称为“修饰的RNA”时,它们当然包括严格来说不是RNA的分子(由于修饰)。
可以修饰公开的antagomir寡核苷酸以增强对核酸酶的抗性。antagomir寡核苷酸可以包括使其对核酸酶降解稳定的核苷酸修饰。寡聚物可以是totalmer、mixmer、gapmer、tailmer、headmer或blockmer。“totalmer”是只包含非天然存在的核苷酸的单链寡核苷酸。
术语“gapmer”是指由在至少5个天然存在的核苷酸(即未修饰核苷酸)侧翼的修饰核苷酸片段组成的寡核苷酸。
术语“blcokmer”是指两侧是至少5个天然存在的核苷酸的核酸片段的中央修饰的核酸片段。
术语“tailmer”是指具有在5’端的至少5个天然存在的核苷酸接着在3’端的修饰的核酸片段的寡核苷酸。
术语“headmer”是指具有在5’端的修饰的核酸片段接着在3’端的至少5个天然存在的核苷酸的寡核苷酸。术语“mixmer”是指包含天然和非天然存在的核苷酸两者的寡核苷酸。然而,与gapmer、tailmer、headmer和blockmer不同,其中不存在超过5个天然存在的核苷酸的连续序列,例如DNA单元。
修饰的核酸和核苷酸代替物可以包括以下的一种或多种:(i)一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧的替换;(ii)核糖成分例如核糖2’羟基的替换,或用除核糖之外的结构完全替换核糖;(iii)用“去磷酸”接头完全替换磷酸酯部分;(iv)天然存在的碱基的修饰或替换;(v)核糖-磷酸酯骨架的替换或修饰;或(vi)RNA 3’端或5’端的修饰,例如在RNA的3’端或5’端去除、修饰或替换末端磷酸酯基团或链接部分,例如荧光标记部分。
可以通过用不同取代基替换氧原子之一来修饰核酸中的磷酸盐基团。这种对RNA磷酸酯骨架的修饰的一种结果可以是增强寡核糖核苷酸对核酸酶降解的抗性。因此,在一些方面,期望引入造成不带电接头或具有不对称电荷分布的带电接头的变化。
修饰的磷酸盐基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸硼烷、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯、其中两个非连接氧均被硫取代的二硫代磷酸酯。
还可以通过用氮(桥联氨基磷酸酯)、硫(桥联硫代磷酸酯)和碳(桥联亚甲基膦酸)替换连接氧来修饰磷酸酯接头。替换可以发生在末端氧上。
可以用包含非磷酸的连接子替换磷酸酯基团。可以替换磷酸酯基团的部分的实例包括硅氧烷、碳酸盐、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸、磺酰胺、硫甲缩醛、甲缩醛(formacetal)、肟、亚甲基亚胺、亚甲基甲基亚胺、亚甲基氢偶氮基、亚甲基二甲基氢偶氮基和亚甲基羟甲基亚胺。替换通常包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基氨基基团。
修饰的RNA可以包括核糖核酸的全部或一些糖基。例如,可以用很多不同“含氧的”或“脱氧的”取代基修饰或替换2’羟基基团(OH)。
“含氧的”2’羟基基团修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR,例如R=H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖);聚乙二醇(PEG),O(CH2CH2O)nCH2CH2OR;“锁”核酸(LNA),其中羟基例如通过亚甲基桥联至相同核糖的4’碳;胺、O-AMINE和氨基烷氧基,O(CH2)nAMINE,(例如AMINE=N3/4;烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)。仅包含甲氧基乙基基团(MOE)(OCH2CH2OCH3,PEG衍生物)的寡核苷酸与用强大的硫代磷酸酯修饰所修饰的那些相比显示核酸酶稳定性。
“脱氧的”修饰包括氢(例如脱氧核糖);卤代(例如氟代);氨基(例如NH2;烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸);NH(CH2CH2NH)nCH2CH AMINE(AMINE=NH2;烷基烷基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、-NHC(O)R(R^烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖),氰基;巯基;烷基-硫代-烷基;硫代烷氧基;和烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基,其可以任选地用例如氨基功能取代。
因此,antagomir可以包括2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)。在一些方面,antagomir包括至少一个2’-O-甲基-修饰的核苷酸,且在一些方面,antagomir的所有核苷酸包括2’-O-甲基修饰。
糖基还可以包含与核糖中对应的碳具有相反立体化学构型的碳。因此,修饰的RA可以包括,含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
修饰的RNA还可以包括“脱碱基”糖,其在C-P缺少核碱基。这些脱碱基糖还可以进一步包含在一个或多个组成糖原子上的修饰。所述修饰还可以引起用另一个实体(SRMS)在寡核苷酸试剂的一个或多个位点完全替换核糖结构。
可以修饰寡核苷酸的3’和5’端。这种修饰可以在分子的3’端、5’端或两端。它们可以包括整个末端磷酸酯或一个或多个磷酸酯基团原子的修饰或替换。例如,可以将寡核苷酸的3’和5’端与其他功能性分子实体,例如标记部分,如荧光团(例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基团(例如基于硫、硅、硼或酯)结合。功能性分子实体可以通过磷酸酯基团和/或间隔基与糖连接。间隔基的末端原子可以连接至或取代磷酸酯基团的连接原子或糖的C-3′或C-5′O、N、S或C基团。或者,间隔基可以连接至或取代核苷酸取代物(例如PNA)的末端原子。这些间隔基或接头可以包括例如-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(C3/4CH2O)n 3/4O3/4OH(例如nTM3或6)、脱碱基糖、酰胺基、羧基、胺、羟基胺、羟基亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺或吗啉、或生物素和荧光素试剂。
末端修饰的其他实例包括燃料、螯合剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、特沙弗林、Sapphyrin)、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶(例如EDTA)、亲脂性载体(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶草氧基己烷基、十六烷基甘油、冰片、薄荷脑、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、03-(油酰基)胆石酸、03-(油酰基)胆烯酸、二甲氧三苯甲基或吩嗪)和肽偶联物(例如触角足基因肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40)、MPEG、[MPEG]2、polyaraino、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、转运吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑集群、吖啶-咪唑偶联物、四氮杂大环的Eu3+复合物)。
末端修饰包括将甲基膦酸酯添加至3-最末端连接;3’C5-铵烷基(ammoalkyl)-dT;3’阳离子基团;或抑制3’-5’外切核酸酶降解的另一个3’偶联物。
有助于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物修饰5’端。例如,在一些方面,寡核苷酸试剂被5’磷酸化或在5’末端包括磷酰基类似物。5’磷酸酯修饰包括其中与RISC介导的基因沉默相容的那些。合适的修饰包括:5’-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5’);5’-二磷酸酯((HO)2(O)P-P-(HO)(O)-O-5’);5’-三磷酸酯((HO)2(O)P”O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’);5’鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’);5’腺苷帽(Appp),和任何修饰或未修饰的核苷酸结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’);5f-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯;(HO)2(S)P-O-5’);5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯;(HO)(HS)(S)P-O-5’),5’-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5’);氧/硫替换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何其他组合(例如5’-α-三硫代磷酸酯、5’-γ-三硫代磷酸酯等)、5’-磷酰胺((HO)2(O)P-NH-5\(HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸(R=烷基-甲基、乙基、异丙基、丙基等,例如RP(OH)(O)-O-5\(OH)2(O)P-5’-CH2-)、5’-烷基醚磷酸酯(R=烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等,例如RP(OH)(O)-O-5’-)。
腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是RNA中最常见的碱基。可以修饰或替换这些碱基以提供具有改进性质的RNA。例如,可以用这些碱基或合成的和天然的核碱基(例如肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟苷或tubercidin)和任何一种以上修饰来制备耐核酸酶的寡核苷酸(例如寡核糖核苷酸)。或者,可以使用任何以上碱基,例如“不寻常碱基”和“通用碱基”的取代或修饰类似物。实例包括2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、8-卤代、氨基、硫代、硫代烷基、羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟代甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、5-取代的嘧啶、6-偶氮嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤、包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶、2-氨基嘌呤、5-烷基尿嘧啶、7-烷基鸟嘌呤、5-烷基胞嘧啶-脱氮腺嘌呤、N6,N6-二甲基腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-氨基-烯丙基-尿嘧啶、N3-甲基尿嘧啶、取代的1,2,4-三氮唑、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基氨基氨基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3羧基丙基)尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-乙酰基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、N-甲基鸟嘌呤、或O-烷基化的碱基。antagomir可以包括有助于增强核酸酶抗性的核苷酸间连接(例如手性硫代磷酸酯连接)。
硫代磷酸酯(或S-寡聚物)是其中一个非桥联氧原子被硫替换的正常DNA或RNA的变体。核苷酸间键的硫化急剧降低了内切和外切核酸酶(包括5’到3’和3’到5’的DNA POL1外切核酸酶、核酸酶SI和PI、核糖核酸酶、血浆核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶)的作用。此外,交联脂双层的潜力增加。由于这些重要的改进,硫代磷酸酯在细胞调节中的应用正在增加。
硫代磷酸酯通过两条主要途径制备:通过二硫化碳中元素硫的溶液对氢膦酸酯的作用,或通过用四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)或3H-1,2-苯并二硫代-3-酮-1,1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯这一最近的方法。
增强抗性的一种方式是鉴定切割位点并修饰这种位点以抑制切割。例如,二核苷酸5′-UA-3′、5′-UG-3\5′-CA-3\5′-UU-3′或5′-CC-3′可以作为切割位点。因此,可以通过修饰5′核苷酸获得增强的核酸酶抗性,所述5′核苷酸形成例如至少一种5′-尿嘧啶-腺嘌呤-3′(5′-UA-3′)二核苷酸,其中所述尿嘧啶是2′-修饰的核苷酸;至少一种5′-尿嘧啶-鸟嘌呤-3′(5′-UG-3′)二核苷酸,其中所述5′-尿嘧啶是2′-修饰的核苷酸;至少一种5′-胞苷-腺嘌呤-3′(5′-CA-3′)二核苷酸,其中所述5′-胞苷是2′-修饰的核苷酸;至少一种5′-尿嘧啶-尿嘧啶-3′(5′-UU-3′)二核苷酸,其中所述5′-尿嘧啶是-修饰的核苷酸;或至少一种5′-胞苷-胞苷-3′(5′-CC-3′)二核苷酸,其中所述5′-胞苷是-2′修饰的核苷酸。因此,antagomir可以包括至少2种、3种、4种或5中此类二核苷酸。在一些方面,antagomir的所有嘧啶带有2′-修饰,因此antagomir具有对内切核酸酶的增强的抗性。
antagomir可以具有二级结构,但在生理条件下,它通常基本上是单链的(至少在与miRNA互补的antagomir区域内)。基本上是单链的antagomir是以下程度的单链:小于约50%(例如小于约40%、30%、20%、10%或5%)的antagomir与其自身形成双链体。因此,在生理条件下,antagomir通常不会在互补区内形成发夹环、凸起或内环。
在一个典型的方面,antagomir不包括有义链。在一些方面,antagomir是部分双链,但至少在于miRNA互补的antagomir区域内是单链。术语“部分双链”是指其中一条链包含的核苷酸少于其互补链的双链结构。一般这种部分双链的试剂将具有小于75%的双链结构、通常小于50%、更通常小于25%、20%或15%的双链结构。
在一个典型的方面,antagomir适于体内递送至细胞,例如至生物体的细胞。在另一个方面,antagomir适于体外递送至细胞,例如至培养物或悬浮液中的细胞系的细胞。Antagomir可以包括选择以提高稳定性、分布或试剂的细胞内摄入的配体。例如,配体可以是增强antagomir进入细胞的亲脂性部分,例如胆固醇。
Antagomir还可以被阳离子脂质颗粒包封。阳离子脂质饱和影响包封的核酸的分子内递送。阳离子脂质包括1,2-双十八烷氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)和1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。
在一些方面,公开的antagomir可以包括氨基糖苷类配体,其可以是antagomir具有改进的杂交性质或改进的序列特异性。示例性的氨基糖苷包括糖基化的多聚赖氨酸;半乳糖基化的多聚赖氨酸;新霉素B;妥布霉素;卡那霉素A;和氨基糖苷类的吖啶偶联物,例如Neo-N-吖啶、Neo-S-吖啶、Neo-C-吖啶、Tobra-N-吖啶和KanaA~N-吖啶。使用吖啶类似物可以增加序列特异性。例如,新霉素B对RNA的亲和性高于DNA,但序列特异性低于DNA。在一些方面,氨基糖苷类配体的胍基类似物(胍基糖苷)与寡核苷酸试剂相连。在胍基糖苷中,氨基酸的氨基与胍基交换。连接胍基类似物可以增强寡核苷酸试剂的细胞渗透性。
在细胞内可以从具有编码antagomir的核酸的表达载体表达公开的antagomir。核酸序列可以可操作地与表达控制序列,例如启动子相连。本领域技术人员理解,可以在真核细胞内从合适的DNA RNA载体表达任何核酸。
因此,可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达公开的antagomir。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达寡核苷酸试剂的病毒载体可以基于但不限于以下来构建:腺病毒群、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、或甲病毒。能够表达寡核苷酸试剂的重组载体可以如上所述递送,并在靶细胞中保留。或者,可以使用提供核酸分子瞬时表达的病毒载体。如有需要,这种载体可以重复施用。一旦表达,公开的antagomir与目标miRNA相互作用并抑制其活性。在典型的方面,至少部分的antagomir与内源miRNA形成双链体,其阻止内源miRNA与其靶mRNA结合,造成靶mRNA的翻译增加。表达寡核苷酸试剂的载体的递送可以是全身性的,例如通过静脉内或肌内施用、通过向从受试者前移植的靶细胞施用接着再引入受试者,或通过允许引入期望靶细胞的任何其他手段(综述参见Couture等,Trends in Genetics 12:510,1996)。
试剂还可以是小分子抑制剂。如本文所用,术语“小分子”是指抑制或降低所讨论的miRNA活性的小有机化合物、无机化合物或其组合;该术语可以包括单体或初级代谢物、次级代谢物、生物胺、类固醇、或合成或天然的非肽类生物分子。
例如,Huang和他的同事开发了一种在人活细胞中鉴定miRNA通路的抑制剂的方法(Angew Chem Int Ed Engl.2008;47(39):7482-4)。具体地,他们设计了筛选分析以寻找选择性抑制miRNA的小分子或化合物。他们选择了miR-21作为靶试剂,因为据记录其在预防细胞死亡中起作用-从而允许与癌症相关的未检查的细胞增殖-及其在各种癌症中的升高的水平。他们的分析包括与miRNA互补的与报告基因例如荧光素酶结合的DNA结合序列。在正常条件下,miRNA与互补序列结合并抑制报告基因例如荧光素酶的翻译。然后在样品中加入候选试剂以确定所述候选试剂是否降低miRNA对报告基因表达的抑制。
因此,提供一种方法,其涉及提供具有带有在允许目标miRNA与寡核苷酸结合的条件下与目标miRNA互补的DNA结合序列的寡核苷酸的样品,将样品与候选试剂接触,检测miRNA/寡核苷酸的结合水平,将结合水平与对照比较,与对照相比miRNA/寡核苷酸的结合降低则鉴定miRNA抑制剂。
可以使用常规方法检测miRNA与寡核苷酸的结合。在一个典型的方面,将与目标miRNA互补的DNA结合序列可操作地与报告构建体例如荧光素酶或GFP连接,其中目标miRNA与寡核苷酸的结合抑制报告基因的表达。一般可以从天然产物的大文库或合成(或半合成)提取物或化学文库中根据本领域已知的方法鉴定候选试剂。药物发现和开发领域的技术人员将理解,测试提取物或化合物的精确来源对于本发明的筛选程序不是关键的。因此,事实上可以使用本文所述的示例性方法筛选任何数量的化学提取物或化合物。这种提取物或化合物的实例包括但不限于基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物、发酵液、和合成化合物,以及已有化合物的修饰。还可以获得用于制备随机或定向合成(例如半合成或全合成)任何数量的化学化合物(包括但不限于基于糖、脂质、肽、多肽和核酸的化合物)的各种方法。可商购合成化合物文库,例如从Brandon Associates(Merrimack,NH)和AldrichChemical(Milwaukee,WI)。或者,可从各种来源(包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce,Fla.)和PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,Mass.))商购细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库。此外,如有需要,根据本领域已知的方法例如通过标准提取和分级方法产生天然和合成制备的文库。此外,如有需要,使用标准化学、物理或生物方法容易地修饰任何文库或化合物。
当发现粗提取物具有期望活性是,需要进一步分级主要是阳性的提取物(positive lead extract)以分离引起观察到的效果的化学组分。因此,提取、分级和纯化过程的目的是仔细表征并鉴定粗提取物中具有刺激或抑制miRNA活性的化学个体。本文所述的用于在化合物混合物中检测活性的相同分析可用于纯化活性成分并测试其衍生物。分级并纯化这种异源提取物的方法是本领域已知的。如有需要,根据本领域已知的方法化学修饰表明是用于治疗的有用试剂的化合物。随后可使用疾病或病症(如本文公开的那些)的动物模型分析鉴定为具有治疗价值的化合物。
候选试剂涵盖各种化学类别,但最通常是有机分子,例如分子量大于100且小于约2500道尔顿的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构上相互作用(尤其是氢键)所需的官能团,一般包括至少一个胺基、羰基、羟基或羧基,例如官能化学基团中的至少两个。候选试剂通常包含环状碳或杂环结构和/或用一个或多个以上官能团取代的芳族和多环芳烃结构。候选试剂还在生物分子中发现,所述生物分子包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。在进一步的方面,候选试剂是肽。
在一些方面,候选试剂是蛋白质。在一些方面,候选试剂是天然存在的蛋白质或天然存在蛋白质的片段。因此,可以使用例如包含蛋白质的细胞提取物或蛋白质细胞提取物的随机或定向消化产物。以这种方式,可以制备用于本文的方法筛选的原核和真核蛋白的文库。文库可以是细菌、真菌、病毒和脊椎动物蛋白和人蛋白。
使用本领域已知的方法,可以用化学合成和/或酶连接反应构建antagomir,例如单链核苷酸试剂。例如,可以使用天然存在的核苷酸或设计以增加分子的生物稳定性或增加antagomir和靶核酸之间形成的双链体的物理稳定性的各种修饰核苷酸(例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成antagomir。本文描述了其他合适的核酸修饰。或者,可以使用表达载体制备antagomir,其中核酸以反义方向亚克隆至所述表达载体(即从插入核酸转录的RNA对于目标靶miRNA而言将是反义的方向)。
本文所述的试剂可以配制成组合物,其可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、助剂或其混合物。
以冻干制剂或水溶液的形式通过以下制备试剂的治疗性组合物:将具有合适纯度的期望试剂与任选的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合(Remington′sPharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.ed.(1980),其全文通过引用并入本文)。如上所述,可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对接受者无毒。
这种载体的其他实例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐、或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质和聚乙二醇。用于局部或基于凝胶的试剂形式的载体包括多糖,例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和木蜡醇。对于所有施用,可以使用常规的储库形式。这种形式包括例如微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏药、雾化形式、鼻喷剂、舌下片和缓释制剂。
通常将试剂以以下浓度配制入这种载体:对于质粒DNA,约0.01mg/ml-约100mg/ml,例如约0.1-约1mg/ml,或通常约0.4mg/ml,对于反义寡聚物,例如约1-约10mg/ml,或通常约4mg/ml。
用于体内施用的试剂通常是无菌的。这容易达成,例如在冻干和重组之前或之后通过无菌过滤膜过滤。如果全身施用,一般将试剂以冻干形式或在溶液中储存。如果是冻干形式,一般将试剂与其他用于在使用时用合适的稀释剂重组的成分一起配制。本文所述的试剂的液体制剂的实例是用于皮下注射的装在单剂量小瓶中的无菌、透明、无色无防腐剂溶液。用于重复使用的防腐的药物组合物主要根据试剂的指示和类型可以包含,例如:所述试剂;在溶液中能将pH保持在试剂的最大稳定性范围(通常约4-8)内的缓冲剂;主要使试剂对于振荡诱导的聚集稳定的洗涤剂/表面活性剂;等渗剂(isotonifier);选自苯酚、苯甲醇和苄乙氧铵卤化物,例如氯化物的防腐剂;和水。
如果所用洗涤剂是非离子的,它可以包含例如聚山梨醇酯(例如POLYSORBATETM(TWEENTM)20、80等)或泊洛沙姆(例如POLOXAMERTM 188)。使用非离子表面活性剂使制剂暴露于剪切面应力而不引起试剂变性。此外,可以在雾化装置例如在肺部给药、无针喷射枪中所用的那些中使用这种包含表面活性剂的制剂(参见例如其全文通过引用并入本文的EP257,956)。
可以存在等渗剂以确保本文所述的试剂的液体组合物的等渗性,包括多元糖醇,通常是三元或更多元糖醇,例如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。这些糖醇可以单独或组合使用。或者,可以使用氯化钠或其他合适的无机盐使溶液等渗。
缓冲剂取决于所需的pH可以是例如醋酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、或磷酸盐缓冲剂。将一种类型的本发明液体制剂的pH缓冲至约4-8的范围,通常约生理pH。
防腐剂苯酚、苯甲醇和苄乙氧铵卤化物,例如氯化物是可以使用的已知抗菌剂。
本文所述的治疗性组合物一般置于具有无菌接入端口的容器,例如具有可用皮下注射针刺穿的塞的输液袋或瓶。通常以重复地静脉(i.v.)、皮下(s.c.)或肌内(i.m.)注射施用制剂,或作为适于鼻内或肺内递送的雾化制剂施用(对于肺内递送,参见例如其全文通过引用并入本文的EP 257,956)。
包含用于治疗本文所述的疾病的试剂的制造物品,例如试剂盒包含至少容器和标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料例如玻璃或塑料制成。容器容纳有效诊断或治疗病症的组合物,并可以具有无菌接入端口(例如,容器可以是具有可用皮下注射针刺穿的塞的输液袋或瓶)。组合物中的活性剂是本文所述的试剂。容器上的或与容器相关的标签说明该组合物用于治疗选择的病症。制造物品可以进一步包含含有药学上可接受的缓冲液,例如磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏液或葡萄糖溶液的第二容器。它可以进一步包括从商业和使用者角度所需的其他材料,包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明的包装说明书。制造物品还可以包含含有本文所述的另一种药学活性剂的第二或第三容器。
本文所述的试剂还可以缓释制剂的形式施用。缓释制剂的合适实例包括含有试剂的固体疏水性聚合物的半透基质,所述基质是成型制品的形式,例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如Langer等,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982)描述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(Sidman等,Biopolymers 22:547-556(1983))、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等,以上)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物,例如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。这些文献的每一个的全文通过引用并入本文。
缓释组合物还包括脂质体包埋剂。包含本文所述的试剂的脂质体通过本身已知的方法制备:DE 3,218,121;Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692(1985);Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034(1980);EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949;EP 142,641;日本专利申请83-118008;美国专利号4,485,045和4,544,545;和EP 102,324,其各自通过引用并入本文。通常脂质体是小(约200-800埃)单层型,其中脂质含量大于约30mol%胆固醇,调整选择的比例用于最佳疗法。
考虑其他相似的递送方法,例如通过纳米胶囊、微粒、微球、纳米颗粒、脂质颗粒、囊泡等。通常,试剂配制为包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或例如纳米颗粒中用于递送,且可以进一步包括暴露以协助位点特异性递送试剂的靶向分子。
脂质体的形成和使用是本领域技术人员已知的(参见例如Couvreur等,FEBSLett.1977 Dec.15;84(2):323-6;Couvreur,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1988;5(1):1-20;Lasic,Trends Biotechnol.1998 July;16(7):307-21;Gabizon&Papahadjopoulos,Proc Natl Acad Sci USA.1988 September;85(18):6949-53;Allen和Chonn,FEBS Lett.1987 Oct.19;223(1):42-6;U.S.Pat.No.5,741,516,其全文通过引用并入本文)。此外,已经综述了各种将脂质体和脂质体样制剂用作潜在药物载体的方法(Takakura,Nippon Rinsho,1998 March;56(3):691-5;Chandran等,Indian J ExpBiol.1997 August;35(8):801-9;Margalit,Crit RevTher Drug Carrier Syst.1995;12(2-3):233-61;美国专利号5,567,434;美国专利号5,552,157;美国专利号5,565,213;美国专利号5,738,868和美国专利号5,795,587,其全文通过引用并入本文)。
脂质体由在水性介质中分散并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV的直径通常为25nm-4μm。超声MLV导致形成直径为的核心包含水性溶液的小单层囊泡(SUV)。
脂质体与细胞膜相似,预期用作本发明中试剂的载体。它们广泛适用,因为可以捕获水溶和脂溶物质,例如分别在水性空间和本身的双层内。
除了Couvreur等FEBS Lett.1977 Dec.15;84(2):323-6;和Couvreur等,Crit RevTher Drug Carrier Syst.1988;5(1):1-20的教导,可以使用以下信息制备脂质体制剂。当在水中分散时,取决于脂质与水的摩尔比,磷脂可以形成除脂质体之外的各种结构。在低比例时,脂质体是典型的结构。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可以降低离子和极性物质的渗透性,但当温度升高时,其经历显著改变其渗透性的相变。相变涉及从紧密堆积的有序结构(称为凝胶态)到松散堆积的较无序的结构(称为流体态)的变化。这在特征性的相变温度发生,导致对离子、糖和药物的渗透性增加。
除了温度,对蛋白质的暴露可以改变脂质体的渗透性。一些可溶蛋白,例如细胞色素C结合双层膜、使其变形并渗透双层膜,从而造成渗透性的改变。胆固醇明显通过将磷脂更紧密地堆积来抑制蛋白质的这种渗透。预期最典型的用于抗生素和抑制剂递送的脂质体形式将包含胆固醇。
捕获溶质的能力在不同类型的脂质体之间不同。例如,MLV在捕获溶质上中等有效,但SUV极度无效。SUV在尺寸分布上提供均匀性和再现性的优势,但大单层囊泡(LUV)提供尺寸和捕获效率之间的平衡。这些通过蒸发来制备,在溶质捕获上比MLV有效3-4倍。
除了脂质体的特征,捕获化合物的一个重要决定因素是化合物本身的理化性质。极性化合物被捕获于水性空间中,非极性化合物与囊泡的脂双层结合。极性化合物通过渗透或当双层膜被破坏时释放,但非极性化合物仍然与双层膜相连,除非双层膜被温度破坏或暴露于脂蛋白。两种类型均在相变温度显示最大释放率(efflux rate)。
或者,可以使用药学上可接受的纳米胶囊制剂以稳定和可再现的方式捕获试剂((Henry-Michelland等,J Pharm Pharmacology.1987 December;39(12):973-7;Quintanar-Guerrero等,Drug Dev Ind Pharm.1998 December;24(12):1113-28;Douglas等,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1987;3(3):233-61,其通过引用并入本文)。为了避免细胞内聚合物超载引起的副作用,应当用体内能够降解的聚合物设计这种超细颗粒(大小约0.1μm)。例如预期在本发明中使用满足这些要求的生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。这种颗粒可如所描述的容易地制备(Couvreur等,1980,以上和1988,以上;zur Muhlen等,Eur J Pharm Biopharm.1998 March;45(2):149-55;Zambaux等J ControlRelease.1998 Jan.2;50(1-3):31-40;Pinto-Alphandry等,1995 J Drug Target.1995;3(2):167-9和美国专利号5,145,684,其全文通过引用并入本文)。
当然,试剂的治疗有效剂量将根据以下因素变化:所讨论的特定试剂、待治疗(包括预防)的病理病症、施用方法、涉及的任何共疗法、受试者的年龄、重量、总体医疗状况、病史等,其施用在执业医师的能力范围内。因此,临床医生有必要根据需要滴定剂量并改变施用途径以获得最大疗效。临床医生将施用试剂直到达到治疗所讨论病症获得期望效果的剂量。例如,如果目的是治疗脓毒症,在一个方面,量将是改善脓毒性状况的量。
根据以上指导,有效剂量一般是约1.2-约24mg/kg、更通常约2.4-约24mg/kg、最通常约2.4-约4mg/kg。
对于非口服用途,可以注射形式以每kg体重约2-24mg、通常约2.4-约24mg、最通常约2.4-约4mg施用试剂,静脉注射每天1-2次。应当理解,应当将内毒素污染保持在最小安全水平,例如小于约0.5ng/mg蛋白。此外,对于人施用,制剂通常满足FDA办公室和生物标准所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度。
一些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量,包括但不限于疾病或病症的严重程度、之前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄,和存在的其他疾病。还将理解,用于治疗的试剂的有效剂量可以在具体治疗过程中增加或减少。剂量变化可以从诊断分析结果中得出并变得明显。例如,可以在施用本文所述的试剂后监控受试者。基于监控信息,可以施用额外量的试剂。
剂量取决于待治疗疾病状况的严重程度和反应性,治疗过程持续几天至几个月或直到有效治愈或达到疾病状态减少。可以测量患者体内药物累积来计算最佳剂量方案。普通技术人员可以容易确定最佳剂量、给药方法和重复频率。最佳剂量可以根据单个化合物的相对功效变化,且通常可以基于体外和体内动物模型中发现有效的EC50来估计。
有助于治疗疾病的剂量水平范围为每次施用约1μg/kg-100mg/kg体重。本领域技术人员还可以容易确定将公开的向指定受试者使用的合适的剂量方案。例如,可以向受试者单次施用,例如单次注射本文所述的试剂。或者,在约3-约28天或约7-约10天期间,每天一次或两次向受试者施用试剂。
因此,可以以单位剂量施用试剂,所述单位剂量小于约75mg/kg体重,或小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重,并小于200nmol试剂/kg体重,或小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmol试剂/kg体重。
向器官直接递送(例如直接递送至肝脏)本文所述的试剂例如antagomir的剂量范围可以是约0.00001mg-约3mg/器官、或通常约0.0001-0.001mg/器官、约0.03-3.0mg/器官、约0.1-3.0mg/器官或约0.3-3.0mg/器官。
当剂量方案包含多次施用时,应理解向受试者施用的试剂的有效量可以包括在整个剂量方案中施用的试剂总量。本领域技术人员将理解,可以根据各种因素在一定程度上调节精确的个人剂量,所述因素包括施用的具体试剂、施用时间、施用途径、制剂性质、排泄率、治疗的具体疾病、疾病的严重度、寡核苷酸试剂的药代动力学和患者的年龄、性别、体重和总体健康。鉴于各种施用途径的效率不同,可以预计必要剂量水平内的大差异。例如,口服施用将需要比静脉注射施用更高的剂量水平。可以使用本领域公知的标准的凭经验的优化途径来调节这些剂量水平的差异。精确的治疗有效剂量水平和模式通常由主治医师考虑以上鉴定的因素来确定。在一个方面,使用单位剂量的频率少于每天一次,例如少于每2、4、8或30天一次。在另一个方面,不以某个频率施用单位剂量(即不是固定频率)。例如,可以单次施用单位剂量。因为在施用antagomir组合物后,寡核苷酸介导的沉默可以持续几天,在很多情况下,可能以少于每天一次的频率施用组合物,或在一些情况下,整个治疗方案仅施用一次。
在一些方面,向受试者施用初始剂量和一次或多次维持剂量的本文所述的试剂。维持剂量通常低于初始剂量,例如低于初始剂量的一半。维持方法可以包括用0.01g-75mg/kg体重/天,例如70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重/天的剂量治疗受试者。维持剂量的施用通常不超过每5、10或30天一次。此外,治疗方案可以持续一段时间,其取决于具体疾病的性质、其严重程度和患者的总体状况。在一个典型的方面,剂量的递送不超过每天一次,例如不超过每24、36、48或更多小时一次,例如不超过每5或8天一次。治疗之后,可以监控患者的病症变化以及疾病状态的症状缓解。如果患者对目前的剂量水平没有明显反应,可以增加化合物的剂量,或如果观察到疾病状态的症状缓解,如果疾病状态已经消除或如果观察到不良副作用,可以减少剂量。
根据需要或在具体环境下认为合适,有效剂量可以以单次剂量或两次或多次剂量施用。如果需要促进重复或频繁输注,可以建议植入递送装置,例如泵、半永久性支架(例如静脉内、腹腔内、脑池内或中央囊内)或储液器。成功治疗之后,可能需要让患者进行维持治疗以预防疾病状态的复发,其中本发明化合物以0.01μg-100g/kg体重的维持剂量施用。
除了治疗已有的疾病或病症,还可以预防性地施用本文所述的试剂以预防或减缓具体疾病或病症的发生。在预防性应用中,向容易患或者有风险患特定病症(例如与目标miRNA的异常或多余表达相关的疾病)的患者施用antagomir。
施用途径按照已知的方法,例如通过静脉内、肌内、脑内、腹腔内、脑脊液内、皮下、眼内、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部或吸入途径、或通过缓释系统注射或输注。
试剂预防或治疗讨论疾病的功效可以通过与对类似目的有效的另一种药剂连续或组合施用(在相同组合物内或作为不同组合物)来改进。
例如,可以将治疗脓毒症的试剂与抗生素疗法组合,且与这种其他疗法协同或累加起作用。与本文所述的试剂组合施用的治疗剂的有效量将由医生或兽医决定。进行剂量施用和调节以获得对待治疗病症的最大管理。剂量还取决于待使用的治疗剂的类型和治疗的具体患者这些因素。通常,如果指定的治疗剂不与本文所述的试剂一起施用,所用的量将与已用的剂量相同。
可以将本文所述的试剂与另一种试剂,例如稳定寡核苷酸试剂的试剂,如与寡核苷酸试剂复合的蛋白质组合配制。其他试剂还包括螯合剂,例如EDTA(即去除二价氧离子如Mg2+)、盐和RNA酶抑制剂(例如广泛特异性RNA酶抑制剂如RNAsin)。
在一个方面,当试剂是antagomir时,antagomir制剂包括另一种antagomir,即可以下调第二种miRNA的第二antagomir。在一些方面,试剂靶向同一靶核酸但不同靶序列。在另一个方面,各antagomir靶向不同靶标。
一种化合物可以与一种或多种其他化合物,尤其是涉及胆固醇合成或摄入的其他化合物,例如他汀类、胆汁酸螯合剂、胆固醇吸收抑制剂如贝特类、烟酸等组合配制。
使用miRNA抑制剂治疗的方法
本文所述的在体内和/或体外分析中具有活性的试剂可能在与脓毒症、炎症、器官保护、微血管功能和/或细胞凋亡相关的各种疾病中有治疗用途。
脓毒症和随后的多个器官衰竭仍然是重症监护病房中发病率和死亡率的主要原因。脓毒症是患者对重度感染的反应。革兰氏阴性菌的细胞壁成分(内毒素或脂多糖)是引起脓毒症开始的优势种。脓毒症的病理生理学是对消除病原体的反应的不恰当调节。在正常情况下,与炎症系统接触的第一个病原菌将消除微生物感染并使宿主快速恢复体内平衡。在脓毒症中,炎症系统常常是过度活化,从而加速对感染的反应。快速的淋巴细胞凋亡、延迟的中性粒细胞凋亡和增强的细胞/组织的细胞凋亡和坏死均是脓毒症和多个器官衰竭的发病机制。因此,消除细胞凋亡保护器官,并代表对脓毒症及其相关的多个器官衰竭的潜在治疗策略。这样,抑制miR-15家族可以上调抗细胞凋亡蛋白(和/或防止细胞凋亡蛋白的下调),从而保护器官不受脓毒症诱导的凋亡性细胞死亡。
以上公开总体上描述了本发明。参照以下具体实施例可以获得更完整的理解。这些实施例仅为说明目的描述,不意欲限制本发明的范围。认为在等同物的形式和取代上的变化是可以建议的情况或是权宜之计。尽管本文中使用特定术语,这些术语意欲是描述性的含义,而不是为限制的目的。
具体实施方式
材料和方法:
1.材料
从Invitrogen购买原代人脐静脉内皮细胞,并根据制造商的说明培养。从Sigma购买脂多糖(LPS)。
2.转染
分别使用化学修饰的反义寡核苷酸(antagomir,GenePharm Co.Ltd)和合成的miR-195模拟物(Qiagen)抑制和过表达miR-195的表达。使用错义寡核苷酸(GenePharmCo.Ltd)作为对照。根据制造商的说明使用TransMessenger转染试剂(Qtagen)对人脐静脉肉皮细胞进行转染。
3.半胱天冬酶-3活性
如之前详述,使用半胱天冬酶-3荧光分析试剂盒(BIOMOL ResearchLaboratories)测量半胱天冬酶-3的活性。简言之,将组织或培养细胞均质化,使用Bradford方法测定蛋白浓度。将两次重复的样品(200-400μg蛋白质)与半胱天冬酶-3底物Ac-DEVD-AMC或Ac-DEVD-AMC加上抑制剂AC-DEVD-CHO于37℃孵育2小时,然后用荧光分光光度计(激发波长是380nm,发射波长是405nm)进行测量。来自抑制剂处理的样品的信号作为背景。
4.测量细胞DNA片段化
预先用BrdU标记细胞,然后与棕榈酸盐一起孵育。用细胞DNA片段化ELISA试剂盒(Roche Applied Science)根据制造商的说明测量DNA片段化。
5.凋亡细胞的原位检测
为了定位组织中正在进行核DNA片段化的细胞,如之前所述,使用原位细胞凋亡检测试剂盒(Roche Biochemicals)进行原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)。
6.测定肝脏损伤
使用来自BioAssay Systems的分析试剂盒根据制造商的说明测量丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)作为肝脏损伤的指标。
7.评估肾功能
使用尿素氮检测试剂盒根据制造商的说明测定血尿氮。
8.MPO活性
作为中性粒细胞渗透的指数,测定组织中的髓过氧化物酶(MPO)活性。简言之,切除组织,将其置于磷酸盐缓冲液中并均质化。将1∶1O稀释的均质物(10%wt/vol)于4-8℃在6000g下离心20分钟。将沉淀再次均质化并在包含0.5%CETOH洗涤剂的1ml 50mM乙酸(pH6.0)中超声处理10秒。制备的样品在MPO活性的反应中使用,所述MPO活性用分光光度法(650nm)通过测量3.3V,5.5V-四甲基联苯胺的过氧化氢依赖性氧化来测定。
9.TNF-α和iNOS mRNA表送的实时RT-PCR
按照制造商的说明使用Trizol Reagent(Gibco-BRL)从新鲜或冷冻组织中提取总RNA。对小鼠TNF-α、iNOS和甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)mRNA进行实时RT-PCR。TNF-α、iNOS和GAPDH的引物如之前所述。
10.LPS诱导的脓毒症小鼠模型
成年雄性小鼠(C57BL/6,2个月大)接受LPS(4mg/kg,i.p.)。在LPS处理后的不同时间点(6、12和30小时),杀死小鼠并收集组织。
11.腹膜中的粪便-诱导的脓毒症小鼠模型
如之前所述通过将粪便注射入腹腔在成年雄性C57BL/6小鼠(2个月大)中诱导脓毒症。从供体小鼠的盲肠收集粪便,以最高75mg/ml的浓度与无菌盐水混合,然后以50mg/kg腹腔注射。对照小鼠用无菌盐水进行腹腔注射(50ml/kg)。
12.DNA质粒和寡核苷酸的递送
根据制造商的说明,将质粒DNA(60μg)或寡核苷酸(600μg)与40μl转染剂NANOPARTICLE(Altogen Biosystems,Las Vegas,NV,USA)混合,总体积为5%葡萄糖500μl(W/V)。将混合物通过尾静脉静脉注射至C57/BL6小鼠。
System Biosciences提供用于敲除miR-195的miRZip shRNA(miRZipTM反义microRNA-195)。使用空miRZip shRNA质粒作为对照。
miR-195反义链(miRZip-195)的序列是:5′GCCAATATTTCTGTGCTGCTA3′,错配序列(miRZip000)作为对照:5′GTTAACACCCTCGCGTCGTCA3’。
13.评估微血管功能障碍
使用活体的视频显微镜来分析微血管功能障碍。我们采用用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉的小鼠中的趾长伸肌(EDL)。用加热灯使动物保暖。使用肌肉作为活体显微镜可用的“生物分析”,因为其他器官难以用这种技术研究,主要是因为器官的物理运动和透射的技术问题。对于脓毒症诱导的微血管功能障碍,肌肉显示在脓毒症患者中可见的典型的毛细血管流动障碍。
为了评估肌肉表面的毛细血管血流停止,用强光从上方照明(epi-illuminate)肌肉,目视检查并视频记录毛细血管血流,从记录中测量具有移动红血细胞和静止红血细胞的毛细血管的密度。如之前所述,从这些测量中计算血流停止的毛细血管的百分比。
14.统计分析
所有数据以MEAN±SD给出。用非配对学生t检验比较2组之间的差异。对多组比较进行ANOVA和随后的Newman-Keuls检验。认为P值<0.05是统计学上显著的。
实施例1-microRNA-195的上调足以诱导内皮细胞的细胞凋亡
凋亡性内皮细胞死亡在脓毒症中引起内皮功能障碍。为了测定miR-15家族的上调是否诱导内皮细胞的细胞凋亡,我们用microRNA-195(miR-195)模拟物或对照寡聚物转染了内皮细胞。24小时后,通过半胱天冬酶-3活性(图1A)和DNA片段化(图1B)测定细胞凋亡。这些结果表明miR-195的上调明显诱导了内皮细胞的细胞凋亡。因此,有可能血液中miR-15家族成员的升高促进内皮细胞的凋亡性死亡,在脓毒症中造成内皮功能障碍。
实施例2-抑制miR-195降低内皮细胞中脂多糖诱导的细胞凋亡
如果在脓毒症条件下miR-15家族的上调引起细胞凋亡,抑制miR-15家族将为内皮细胞提供保护作用。为此目的,用miR-195antagomir或对照寡聚物转染内皮细胞,然后与脂多糖(LPS)或作为假对照(sham)的盐水一起孵育。24小时后,测定细胞凋亡。用antagomir抑制miR-195明显降低了LPS诱导的细胞凋亡,如半胱天冬酶-3活性(图2A)和DNA片段化(图2B)所示。这些结果支持了在脓毒症条件下抑制miR-15家族防止内皮细胞的细胞凋亡,从而在脓毒症中保护微血管这一观点。
实施例3-抑制miR-195对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋亡、炎症和器官功
能障碍的影响
为了研究miR-195抑制在脓毒症中的体内重要性,我们向成年小鼠注射表达miR-195antagomir的质粒或作为对照的空质粒(80μg/小鼠,i.v.)和纳米颗粒转染剂。全身注射表达miR-195antagomir的质粒抑制小鼠中miR-195的表达。48小时后,小鼠接受LPS(4mg/kg,i.p.)或盐水。LPS注射24小时后,收集来自肝、肺和肾组织。在肝组织(图3A、3B和3C)和肺组织(图4)中测量细胞凋亡;在肝组织(图5A、5B和5C)和肾组织(图6)中测量炎性反应;并测量器官功能障碍(图7A、7B和7C)。
抑制miR-195降低了由LPS诱导的肝(图3B)和肺(图4)中的半胱天冬酶-3活化。miR-195抑制对细胞凋亡的抑制性作用进一步用肝中的TUNEL染色确认(图3A和C)。抑制miR-195还明显减弱了作为肝(图5A)和肾(图6)中中性粒细胞渗透的指标的MPO活性,肝中的iNOS(图5B)和TNF-α表达(图5C),表明内毒素血症小鼠炎性反应的抑制。因此,内毒素血症小鼠的miR-195抑制后,肝损伤指标ALT活性(图7A)和AST活性(图7B)降低,肾功能障碍指标BUN水平也降低。这些结果表明抑制miR-195降低了LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋亡、炎症和器官损伤。
实施例4-抑制miR-195对腹腔内粪便诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋亡和炎症的
影响
为了进一步评估miR-195在脓毒症中的作用,我们使用了临床上更相关的腹腔内粪便诱导的脓毒症的小鼠模型。为此目的,向成年小鼠注射表达miR-195 antagomir的质粒或作为对照的空质粒(80μg/小鼠,i.v.)和纳米颗粒转染剂。48小时后,向成年小鼠注射粪便(75mg/kg,i.p.)或作为假对照的盐水。粪便注射8小时猴,在肝(图8)和肺(图9)中测定细胞凋亡和炎症。
如图8所示,抑制miR-195明显降低了注入粪便的小鼠的肝中的MPO活性(图8A)、半胱天冬酶-3活性(图8B)、ALT活性(图8C)和AST活性(图8D)。如图9所示,抑制miR-195明显降低了注入粪便的小鼠的肺中的MPO活性(图9A和9B)、半胱天冬酶-3活性(图9C)和细胞凋亡(图9D和9E)。如图10所示,抑制miR-195明显增加了这些小鼠的存活率。
因此,抑制miR-195降低了细胞凋亡和炎症,以及肺和肝损伤,并增加了临床上更相关的腹腔内粪便诱导的脓毒症的小鼠模型的存活率,进一步支持了miR-195抑制对脓毒症的保护性作用。
实施例5-miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的细胞凋亡、炎症和器官功
能障碍的治疗性作用
在以上结果中,在小鼠中先抑制了miR-195,然后诱导了脓毒症。因此,这些研究已经表明,抑制miR-195防止脓毒症中的细胞凋亡、炎性反应和器官损伤。在该研究中,检查miR-195抑制在脓毒症中的治疗性作用。向成年小鼠注射LPS(4mg/kg,i.p.),在LPS注射后的30分钟内,向动物施用合成的miR-195反义寡聚物或对照寡聚物(600μg,i.v.)。30小时后,评估细胞凋亡、炎症和肾功能(图1A、11B、11C、11D、11E和11F)。
施用miR-195反义寡聚物在脓毒症中降低了BUN水平(肾功能障碍减弱的指标,图11A)、降低了肝中的半胱天冬酶-3活性(抑制细胞凋亡的指标,图11B),并降低了肺(图11C)和肝(图11D)中的MPO活性(炎性细胞渗透减少的指标)。此外,施用miR-195反义寡聚物降低了AST活性(图11E)和ALT活性(图11F),表明脓毒症诱导的肝损伤减少。这些结果表明了miR-195抑制在脓毒症中的治疗性作用。
实施例6-miR-195抑制对LPS-诱导的脓毒症小鼠模型的微血管功能障碍的治疗性
作用
向成年小鼠注射LPS(4mg/kg,i.p.),并在LPS注射后的30分钟内,向动物施用合成的miR-195反义寡聚物或对照寡聚物(600μg,i.v.)。30小时后,评估微血管功能障碍(图12)。一致地,施用miR-195反义寡聚物减弱了脓毒症中的微血管功能障碍。
以上公开总体上描述了本发明。尽管本文中使用特定术语,这些术语意欲是描述性的含义,而不是为限制的目的。
所有出版、专利和专利申请的全文以与各单独公开、专利或专利申请特意地单独地指明其全文通过引用并入本文相同的程度通过引用并入本文。
尽管本文详细描述了本发明的示例性方面,本领域技术人员将理解,在不背离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下,可以对其进行变化。
Claims (11)
1.一种抑制在脓毒症中上调的miRNA的活性的试剂在制备用于治疗脓毒症的药物中的用途,其中所述miRNA是miR-195且其中所述试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基寡聚物、2’-O-甲基RNA寡聚物或antagomir。
2.权利要求1所述的用途,其中所述试剂保护器官功能。
3.权利要求2所述的用途,其中所述器官功能是肝功能、肺功能、肾功能和微血管功能中的至少一个。
4.权利要求1所述的用途,其中所述试剂降低细胞凋亡。
5.权利要求4所述的用途,其中所述试剂降低内皮细胞、肝细胞、肾细胞和免疫细胞中至少一种的细胞凋亡。
6.权利要求5所述的用途,其中所述免疫细胞是巨噬细胞。
7.权利要求1所述的用途,其中所述试剂降低炎性反应。
8.权利要求7所述的用途,其中所述炎性反应是在肝、肺、肾和微血管的至少一个中。
9.权利要求1-8任一项所述的用途,其中所述脓毒症是脂多糖诱导的脓毒症或粪便诱导的脓毒症。
10.权利要求1所述的用途,其中所述试剂是antagomir。
11.一种增强在脓毒症中上调的miRNA的靶基因活性的试剂在制备用于治疗脓毒症的药物中的用途,其中所述miRNA是miR-195且其中所述试剂是锁核酸(LNA)寡聚物、吗啉基寡聚物、2’-O-甲基RNA寡聚物或antagomir。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361840981P | 2013-06-28 | 2013-06-28 | |
US61/840,981 | 2013-06-28 | ||
PCT/CA2014/000525 WO2014205551A1 (en) | 2013-06-28 | 2014-06-25 | Inhibition of microrna for treatment of sepsis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105555279A CN105555279A (zh) | 2016-05-04 |
CN105555279B true CN105555279B (zh) | 2019-12-06 |
Family
ID=52140705
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480047629.XA Expired - Fee Related CN105555279B (zh) | 2013-06-28 | 2014-06-25 | 用于治疗脓毒症的MicroRNA抑制 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9758782B2 (zh) |
CN (1) | CN105555279B (zh) |
CA (1) | CA2916989A1 (zh) |
WO (1) | WO2014205551A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2013262709A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-01-22 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating MECP2 expression |
US10837014B2 (en) | 2012-05-16 | 2020-11-17 | Translate Bio Ma, Inc. | Compositions and methods for modulating SMN gene family expression |
WO2017066594A1 (en) * | 2015-10-16 | 2017-04-20 | Rana Therapeutics, Inc. | Methods for identifying and targeting non-coding rna scaffolds |
CN114588174A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-06-07 | 南开大学 | 一种用于治疗脓毒症的miRNAs组合物及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8697672B2 (en) * | 2007-05-16 | 2014-04-15 | California Institute Of Technology | Microrna inhibition for the treatment of inflammation and myeloproliferative disorders |
KR20100099158A (ko) * | 2007-11-09 | 2010-09-10 | 보드 오브 리전츠 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 심근세포 생존과 심장 회복을 제어하는 MIR-15 집단의 마이크로RNAs |
WO2011017697A1 (en) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | New York University | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
US9315812B2 (en) * | 2011-11-03 | 2016-04-19 | Kaohsiung Medical University | Methods of using microRNA 195 in providing neuroprotection |
-
2014
- 2014-06-25 CA CA2916989A patent/CA2916989A1/en not_active Abandoned
- 2014-06-25 WO PCT/CA2014/000525 patent/WO2014205551A1/en active Application Filing
- 2014-06-25 US US14/901,549 patent/US9758782B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-06-25 CN CN201480047629.XA patent/CN105555279B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
《micro RNA-195 promotes palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes by down-regulating sirt 1.》;ZHU,H. et al;《Cardiovascular Research》;20111001;第92卷(第1期);摘要 * |
《Targeting of micro RNA-142-3P in dendritic cells regulates endotoxin-induced mortality》;SUN,Y. et al;《BLOOD》;20110609;第117卷(第23期);摘要 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2916989A1 (en) | 2014-12-31 |
US20160145616A1 (en) | 2016-05-26 |
CN105555279A (zh) | 2016-05-04 |
WO2014205551A1 (en) | 2014-12-31 |
US9758782B2 (en) | 2017-09-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2020202827B2 (en) | Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response | |
CN111107853B (zh) | 用于抑制载脂蛋白C-III (APOC3)的表达的RNAi试剂和组合物 | |
JP6457645B2 (ja) | GST−π遺伝子を調節するためのRNA干渉剤 | |
US11085044B2 (en) | miRNA for treatment of breast cancer | |
US9241950B2 (en) | MiR-33 inhibitors and uses thereof to decrease inflammation | |
JP5524189B2 (ja) | 耳障害治療のための組成物および方法 | |
JP4623426B2 (ja) | オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物 | |
WO2016161388A1 (en) | Fully stabilized asymmetric sirna | |
EP3087988A2 (en) | Use of inhibitors of toll-like receptors in the prevention and treatment of hypercholesterolemia and hyperlipidemia and diseases related thereto | |
TWI752927B (zh) | 具高活性及減低脫靶之siRNA構造 | |
AU2019255370B2 (en) | Synthetic RIG-I-like receptor agonists | |
CN105555279B (zh) | 用于治疗脓毒症的MicroRNA抑制 | |
JP2021529173A (ja) | Rig−iアゴニストおよびそれを使用した処置 | |
AU2016382055B2 (en) | Single-stranded nucleic acid molecule inhibiting expression of prorenin gene or prorenin receptor gene, and use thereof | |
WO2023051822A1 (zh) | 用于治疗与pcsk9相关疾病的靶向寡核苷酸 | |
KR101970034B1 (ko) | 신경보호를 위한 방법 및 조성물 | |
JP2024515800A (ja) | 骨髄増殖性障害の処置のためのTMPRSS6を標的とするsiRNA | |
TWI715594B (zh) | 用於麩胱甘肽S轉移酶Pi(GST-π)基因調控之RNA干擾劑 | |
JP7427227B2 (ja) | 腫瘍細胞の生存を低下させるkrasアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途 | |
JP6978561B2 (ja) | GST−π遺伝子を調節するためのRNA干渉剤 | |
JP2024508069A (ja) | ミトコンドリアアミドキシム還元成分1(marc1)発現を阻害するための組成物および方法 | |
CN118043462A (zh) | 用于避免脱靶效应的方法和组合物 | |
JP2020198784A (ja) | 免疫機能を調節する核酸分子およびその用途 | |
AU2017201838A1 (en) | Organic compositions to treat Beta-ENac-related diseases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20191206 Termination date: 20210625 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |