JP2024508069A - ミトコンドリアアミドキシム還元成分１（ｍａｒｃ１）発現を阻害するための組成物および方法 - Google Patents

ミトコンドリアアミドキシム還元成分１（ｍａｒｃ１）発現を阻害するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

ＭＡＲＣ１発現を阻害するオリゴヌクレオチドが本明細書に提供される。また、オリゴヌクレオチドを含む組成物およびその使用、特に、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、および／または状態を治療することに関する使用も提供される。

Description

肝臓は脂質の代謝において重要な役割を果たす。正常な肝臓脂質代謝の異常は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などの様々な肝疾患または障害の発症、その後の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および潜在的な他の進行した肝臓異常への悪化と関連している。
ＮＡＦＬＤは、世界中で有病率が増加している最も一般的な肝臓疾患の１つである（非特許文献１）。ＮＡＦＬＤは、単純な脂肪肝から非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維症、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、および肝不全に至るまでの臨床的および病理学的な重症度のスペクトルによって特徴付けられる（非特許文献２）。ＮＡＦＬＤは、大量のアルコール消費の非存在下での肝臓における脂肪の存在、および例えば、薬物療法、飢餓性衰弱、およびウイルス性疾患などの肝臓における脂肪の他の原因によって特徴付けられる（非特許文献３）。加えて、疾患がＮＡＳＨに進行すると、患者は、肝臓外合併症、特に心血管疾患（ＣＶＤ）を発症するリスクも増加し、これはこの患者集団において最も一般的な死因の１つである。ＮＡＦＬＤにつながる肝脂質代謝の異常は、上昇した血漿トリグリセリド（ＴＧ）、コレステロール、およびリポタンパク質粒子が動脈壁に浸潤し、続いてアテローム硬化性プラークを発症する、アテローム形成異常脂質血症の進行も駆動する（非特許文献１）。したがって、ＮＡＦＬＤの治療のための治療剤の開発および使用に対する満たされていないニーズが依然として存在する。
Ｌｏｏｍｂａ Ｒ．， ＆ Ｓａｎｙａｌ Ａ．Ｊ．（２０１３）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １０（１１）：６８６－９０ Ｂｅｓｓｏｎｅ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ７６（１）：９９－１２８ Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．），５５（６），２００５－２３
本発明は、部分的には、肝臓におけるＭＡＲＣ１（ミトコンドリアアミドキシム還元成分１）発現を低減させるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の発見に基づく。具体的には、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ内の標的配列を特定し、これらの標的配列と結合して、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ発現を阻害するオリゴヌクレオチドを生成した。本明細書に示されるように、オリゴヌクレオチドは、肝臓におけるヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＭＡＲＣ１発現を阻害した。
一態様では、本発明は、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、（ｉ）センス鎖は、１５～５０個、または１８～３６個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、３６個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、（ｉｉ）アンチセンス鎖は、１５～３０個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、２２個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、（ｉｉｉ）二本鎖領域は、少なくとも１９個のヌクレオチド、または少なくとも２０個のヌクレオチドの長さである。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを含み、（ｉ）Ｓ１は、Ｓ２と相補的であり、任意選択で、Ｓ１およびＳ２は、各々、１～１０個のヌクレオチドの長さであり、かつ同じ長さを有し、任意選択で、Ｓ１およびＳ２は、各々、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの長さであり、さらに任意選択で、Ｓ１およびＳ２は、６個のヌクレオチドの長さであり、（ｉｉ）Ｌは、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成し、任意選択で、Ｌは、トリループまたはテトラループであり、任意選択で、テトラループは、配列５’－ＧＡＡＡ－３’を含み、任意選択で、ステム－ループは、配列５’－ＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ－３’（配列番号１６８１）を含む。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、３’末端で１個以上のヌクレオチドの長さのオーバーハング配列を含み、任意選択で、オーバーハングは、プリンヌクレオチドを含み、任意選択で、オーバーハング配列は、２個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、オーバーハングは、ＡＡ、ＧＧ、ＡＧ、およびＧＡから選択され、任意選択で、オーバーハングは、ＧＧである。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされ、任意選択で、
（ａ）各標的化リガンドが、カーボハイドレート、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、もしくは脂質を含み、（ｂ）ステムループが、ステムループの１個以上のヌクレオチドとコンジュゲートされた１個以上の標的化リガンドを含み、（ｃ）１個以上の標的化リガンドが、ループの１個以上のヌクレオチドとコンジュゲートされ、任意選択で、ループが、５’から３’へ１～４と付番された４個のヌクレオチドを含み、２位、３位、および４位のヌクレオチドが、各々、１個以上の標的化リガンドを含み、標的化リガンドが、同一であるか、もしくは異なり、（ｄ）各標的化リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含み、任意選択で、ＧａｌＮＡｃ部分が、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、または四価ＧａｌＮＡｃ部分であり、および／または、（ｅ）ステム－ループのＬの最大４個のヌクレオチドが、各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、標的化リガンドは、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含み、ヒト肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）を標的とする。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１６０９および１６４５、
（ｂ）それぞれ、配列番号１６１０および１６４６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１６１１および１６４７、
（ｄ）それぞれ、配列番号１６１２および１６４８、
（ｅ）それぞれ、配列番号１６１３および１６４９、
（ｆ）それぞれ、配列番号１６１４および１６５０、
（ｇ）それぞれ、配列番号１６１５および１６５１、
（ｈ）それぞれ、配列番号１６１６および１６５２、
（ｉ）それぞれ、配列番号１６１７および１６５３、
（ｊ）それぞれ、配列番号１６１８および１６５４、
（ｋ）それぞれ、配列番号１６１９および１６５５、
（ｌ）それぞれ、配列番号１６２０および１６５６、
（ｍ）それぞれ、配列番号１６２１および１６５７、
（ｎ）それぞれ、配列番号１６２２および１６５８、
（ｏ）それぞれ、配列番号１６２３および１６５９、
（ｐ）それぞれ、配列番号１６２４および１６６０、
（ｑ）それぞれ、配列番号１６２５および１６６１、
（ｒ）それぞれ、配列番号１６２６および１６６２、
（ｓ）それぞれ、配列番号１６２７および１６６３、
（ｔ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６４、
（ｕ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６５、
（ｖ）それぞれ、配列番号１６３０および１６６６、
（ｗ）それぞれ、配列番号１６３１および１６６７、
（ｘ）それぞれ、配列番号１６３２および１６６８、
（ｙ）それぞれ、配列番号１６３３および１６６９、
（ｚ）それぞれ、配列番号１６３４および１６７０、
（ａａ）それぞれ、配列番号１６３５および１６７１、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１６３６および１６７２、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１６３７および１６７３、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１６３８および１６７４、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１６３９および１６７５、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１６４０および１６７６、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１６４１および１６７７、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１６４２および１６７８から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ＲＮＡ転写産物と相補性の領域を含み、センス鎖が、５’－ｍＧｓ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＧ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６１５）の配列およびすべての修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵｓ－ｆＡ－ｆＡ－ｍＣ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６５１）の配列およびすべての修飾を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’－Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）を提供する。
一実施形態では、ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ＲＮＡ転写産物と相補性の領域を含み、センス鎖が、５’－ｍＡｓ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＧ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６３２）の配列およびすべての修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＣｓ－ｆＣ－ｆＡ－ｍＵ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＡ－ｆＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｍＵｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６６８）の配列およびすべての修飾を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’－Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）を提供する。
一実施形態では、ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ＲＮＡ転写産物と相補性の領域を含み、センス鎖が、５’－ｍＡｓ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＣ－ｆＵ－ｆＡ－ｆＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６４０）の配列およびすべての修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵ－ｆＣ－ｍＡ－ｆＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６７６）の配列およびすべての修飾を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’－Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）を提供する。
一実施形態では、ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ＲＮＡ転写産物と相補性の領域を含み、センス鎖が、５’－ｍＵｓ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＵ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＵ－ｍＧ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６２５）の配列およびすべての修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＡｓ－ｆＧ－ｆＣ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＣ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＡｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６６１）の配列およびすべての修飾を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’－Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）を提供する。
理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１酵素が原因的役割を果たす疾患、障害、または状態の治療に有用である。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体、送達剤、または賦形剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
一態様では、本発明は、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象への投与のための、任意選択で、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、またはアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）の治療のための、本明細書に記載のＲＮＡｉ、任意選択で、薬学的に許容可能な担体、および指示を含む添付文書を含む、キットを提供する。
一態様では、本発明は、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態の治療のための、任意選択で、肝細胞におけるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患または状態の治療のための、任意選択で、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、またはＡＳＨの治療のための、任意選択で、第２の組成物または治療剤と組み合わせて使用するための、医薬品の製造における、本明細書に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
図１は、ＭＡＲＣ１遺伝子の様々な領域を標的化する１ｎＭのＤｓｉＲＮＡで２４時間処理した後の、ＭＴＡＲＣ１とも呼ばれるヒトＭＡＲＣ１を内因的に発現するＨｕｈ７細胞に残存するヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。３８４個のＤｓｉＲＮＡが設計され、スクリーニングされた。２つのプライマー対を使用してＭＡＲＣ１（配列番号１６８４～１６８７）が測定され、発現は、ＨＰＲＴハウスキーピング遺伝子（配列番号１６８８および１６８９）を使用して試料間で正規化された。 図２は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドで処理した後の、ヒトＭＡＲＣ１を外因的に発現するマウス（流体力学的注射モデル）の肝臓に残存するヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化された２ｍｇ／ｋｇの示されたＧａｌＮＡｃ－ＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与後３日目に、マウスにヒトＭＡＲＣ１をコードするＤＮＡプラスミドを流体力学的に注射（ＨＤＩ）した。ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡレベルは、１８時間後に採取された肝臓から決定された。矢印は、検証のために選択されたオリゴヌクレオチドを示す。 図３は、図２の結果に基づいて検証のために選択されたヒトＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドで処理した後の、ヒトＭＡＲＣ１を外因的に発現するマウス（流体力学的注射モデル）の肝臓に残存するヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供し、マウスに、ＰＢＳ中で製剤化された２ｍｇ／ｋｇの示されたＧａｌＮＡｃ－ＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与後３日目に、マウスにＭＡＲＣ１をコードするＤＮＡプラスミドをＨＤＩした。ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡレベルは、１８時間後に採取された肝臓から決定された。 図４は、ＮＨＰ研究のために選択されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドの用量応答を示すグラフを提供する。３用量（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇ）のヒトＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドで処理した後、ヒトＭＡＲＣ１を外因的に発現するマウス（流体力学的注射モデル）の肝臓に残存するヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡのパーセント（％）を測定した。投与後３日目に、マウスにＭＡＲＣ１をコードするＤＮＡプラスミドをＨＤＩした。ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡレベルは、１８時間後に採取された肝臓から決定された。 図５および図６は、ＤＩＯ－ＮＡＳＨ食または除脂肪固形飼料食を与え、示されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド（３ｍｇ／ｋｇ）または対照ＧＬＰ－１ペプチド（Ｊｅｓｐｅｒ Ｌａｕ ｅｔ ｌａ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１５）；５８，７３７０－８０、化合物２２）（ＧＬＰ－１「２２」）（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の８回の週用量で処置され、ＰＢＳで処置されたマウスと比較した、マウスから５６日目に採取した試料中の肝臓トリグリセリド（ＴＧ）および総コレステロール（ＴＣ）のレベルを示すグラフを提供する。相対（図５）および総（図６）ＴＧおよびＴＣレベルをＤＩＯ－ＮＡＳＨビヒクル対照と比較した。＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＝ｐ＜０．０５。 図５の説明を参照。 図７は、ＤＩＯ－ＮＡＳＨ食または除脂肪固形飼料食を与え、示されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド（３ｍｇ／ｋｇ）または対照としてのＧＬＰ－１「２２」（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の８回の週用量で処置され、ＰＢＳで処置されたマウスと比較した、マウスからの試料におけるＮＡＦＬＤ活性スコアを示すグラフを提供する。スコアは、研究の終了時のＮＡＦＬＤスコアに基づいて計算された。 図８は、ＤＩＯ－ＮＡＳＨ食または除脂肪固形飼料食を与え、示されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド（３ｍｇ／ｋｇ）またはＧＬＰ－１「２２」（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の８回の週用量で処置され、ＰＢＳで処置されたマウスと比較した、マウスからの試料における脂肪肝スコアを示すグラフを提供する。スコアは、研究の終了時の脂肪肝スコアに基づいて計算された。 図９Ａおよび９Ｂは、ＤＩＯ－ＮＡＳＨ食または除脂肪固形飼料食を与え、示されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）（３ｍｇ／ｋｇ）の８回の週用量またはＰＢＳで処置されたマウスからの脂肪肝画分（すなわち、特定の領域における脂肪肝のパーセント（％））（図９Ａ）および脂肪滴を有する肝細胞のパーセント（％）（図９Ｂ）を定量化するグラフを提供する。＊＊＊＝ｐ＜０．００１（ＤＩＯ－ＮＡＳＨビヒクル処理と比較）。 図９Ａの説明を参照。 図１０は、ＤＩＯ－ＮＡＳＨ食を与え、示されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド、（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＢＳで処置された、または除脂肪固形飼料食を与えたマウスからの肝臓試料におけるα－ＳＭＡレベルを示すグラフを提供する。＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＝ｐ＜０．０５（ＤＩＯ－ＮＡＳＨビヒクル処理と比較） 図１１は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドを使用する非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究のための投与および検体採取スケジュールを示す概略図を提供する。 図１２は、例示的なニックの入ったテトラループオリゴヌクレオチド構造の概略図である。
ＭＡＲＣ１（ミトコンドリアアミドキシム還元成分１、モリブデン補因子スルフラーゼ Ｃ末端ドメイン含有タンパク質１、ＭｏｃｏスルフラーゼＣ末端ドメイン含有タンパク質１、ＭＯＳＣ１、ＭＯＳＣドメイン含有タンパク質１、ＭＴＡＲＣ１）は、様々な代謝プロセスにおいてＮ－酸素化分子の還元を触媒するタンパク質である。ＭＡＲＣ１の生物学的機能および機序は未だ解明されていないが、肝硬変から対象を保護する一般的なミスセンスバリアントがＭＡＲＣ１で特定されている。このバリアントの保因者は、より低い血中コレステロール値、低減された肝臓脂肪も有しており、ＭＡＲＣ１が、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、およびＡＳＨの効果的な治療標的であり得ることを示している。ＭＡＲＣ１の遺伝子多型は、出生時からすべての身体組織にわたるＭＡＲＣ１の発現および／または機能性に影響を与え、ＭＡＲＣ１は異なる器官において広く様々なレベルで発現されることが理解されるべきである。本明細書に記載されるように、肝細胞において特異的にＭＡＲＣ１を標的化するオリゴヌクレオチドは、インビトロおよびインビボでＭＡＲＣ１発現を阻害するだけでなく、ＮＡＳＨのマウスモデルにおいても治療効果を提供する。具体的には、ＭＡＲＣ１発現の低減により、脂肪滴を含む肝細胞の数および脂肪肝画分が低減した。さらに、ＭＡＲＣ１阻害は、ＮＡＳＨモデルにおける肝線維症のいくつかの調節因子を低減させた。これらの様々な改善された疾患転帰は、特に肝細胞におけるＭＡＲＣ１阻害の治療有効性を示す。
まとめると、また理論に拘束されることなく、特に肝細胞におけるＭＡＲＣ１の拮抗／阻害（例えば、ＭＡＲＣ１を標的としたＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを介して）は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、およびアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）のリスクならびに重症度を減少させ得る。このアプローチは、ＭＡＲＣ１を発現する他の器官、組織、または細胞が本質的に影響を受けない一方で、肝臓におけるＭＡＲＣ１発現の特異的および標的とされた低減によって最も良好に管理され得る。この意味で、本発明は、肝臓におけるｍＲＮＡ産生を特異的に標的とすることを考えると、改善された治療様式を提供し得る。
いくつかの態様によれば、本発明は、肝臓におけるＭＡＲＣ１発現を低減させるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、肝臓におけるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患を治療するように設計される。いくつかの点で、本発明は、特定の細胞（例えば、肝細胞）または器官（例えば、肝臓）におけるＭＡＲＣ１発現を低減することによって、全体的なＭＡＲＣ１発現と関連する疾患を治療する方法を提供する。
ＭＡＲＣ１発現のオリゴヌクレオチド阻害剤
ＭＡＲＣ１標的配列
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを含む標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ配列内の標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ配列内の標的配列に対応する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその一部、断片、もしくは鎖（例えば、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）は、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを含む標的配列と結合またはアニールし、それによってＭＡＲＣ１発現を阻害する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、インビボでＭＡＲＣ１発現を阻害する目的でＭＡＲＣ１標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１標的配列を標的とするオリゴヌクレオチドによるＭＡＲＣ１発現の阻害の量または程度は、オリゴヌクレオチドの効力と相関する。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１標的配列を標的とするオリゴヌクレオチドによるＭＡＲＣ１発現の阻害の量または程度は、オリゴヌクレオチドで治療されるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、もしくは状態を有する対象または患者における治療効果の量または程度と相関する。
複数の異なる種（例えば、ヒト、カニクイザル、およびマウス；例えば、実施例２を参照されたい）のｍＲＮＡを含む、ＭＡＲＣ１をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列の検査を通じて、ならびにインビトロおよびインビボ試験の結果として（例えば、実施例２～５を参照されたい）、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの特定のヌクレオチド配列が、他のものよりもオリゴヌクレオチドに基づく阻害を受けやすく、したがって本明細書のオリゴヌクレオチドの標的配列として有用であることが発見された。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）のセンス鎖は、ＭＡＲＣ１標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）のセンス鎖の一部または領域は、ＭＡＲＣ１標的配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１標的配列は、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つの配列を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１標的配列は、配列番号２３４、２９８、３５６、または３７６に示される配列を含むか、またはそれから成る。
ＭＡＲＣ１標的化配列
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、細胞中のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的とし、ＭＡＲＣ１発現を阻害および／または低減する目的で、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡと相補性の領域（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの標的配列内）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、相補的な（ワトソン・クリック）塩基対形成によってＭＡＲＣ１標的配列と結合またはアニールする相補性の領域を有するＭＡＲＣ１標的化配列（例えば、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）を含む。相補性の標的配列または領域は、概して、ＭＡＲＣ１発現を阻害および／または低減する目的で、オリゴヌクレオチド（またはその鎖）のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡとの結合またはアニーリングを可能にするのに好適な長さおよび塩基含有量である。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、または少なくとも約３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、約１２～約３０個（例えば、１２～３０、１２～２２、１５～２５、１７～２１、１８～２７、１９～２７、または１５～３０個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つの配列と相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つの配列と相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つの配列と相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つの配列と相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つの配列と相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つの配列と相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つの配列と相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２４個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、ＭＡＲＣ１標的配列と完全に相補的である標的化配列または相補性の領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、ＭＡＲＣ１標的配列と部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１標的配列と完全に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１標的配列と部分的に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つの配列と完全に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２３４、２９８、３５６、もしくは３７６に示される配列と完全に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つの配列と部分的に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２３４、２９８、３５６、もしくは３７６に示される配列と部分的に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ内のヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、約１２～約３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２８、１２～２６、１２～２４、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１４～２２、１６～２０、１８～２０、または１８～１９個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ内のヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ内のヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ内のヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、２０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、任意選択で、ヌクレオチドの連続する配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２３４、２９８、３５６、または３７６のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１００２、１０６６、１１２４、および１１４４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、２０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の標的化配列または相補性の領域は、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的であり、アンチセンス鎖の全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの標的化配列または相補性の領域は、配列番号１～３８４のヌクレオチドの連続する配列と相補的であり、アンチセンス鎖の全長の一部分に及ぶ。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つに示される配列のヌクレオチド１～１９または１～２０に及ぶヌクレオチドの連続する区間と少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的である相補性の領域（例えば、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖上）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、対応するＭＡＲＣ１標的配列と１個以上の塩基対（ｂｐ）ミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡと結合もしくはアニーリングする標的化配列または相補性の領域の能力、および／あるいはＭＡＲＣ１発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力が維持されることを条件として、対応するＭＡＲＣ１標的配列と、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個などのミスマッチを有し得る。あるいは、標的化配列または相補性の領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡと結合もしくはアニーリングする標的化配列または相補性の領域の能力、および／あるいはＭＡＲＣ１発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力が維持されることを条件として、対応するＭＡＲＣ１標的配列と１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と１個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と２個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と３個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と４個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と５個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と１個を超えるミスマッチ（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上のミスマッチ）を有する標的化配列または相補性の領域を含み、ミスマッチの少なくとも２個（例えば、すべて）は、連続して位置するか（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上のミスマッチが並んでいる）、またはミスマッチは、標的化配列または相補性の領域全体にわたって散在する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と１個を超えるミスマッチ（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上のミスマッチ）を有する標的化配列または相補性の領域を含み、ミスマッチの少なくとも２個（例えば、すべて）は、連続して位置するか（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上のミスマッチが並んでいる）、または少なくとも１個以上の非ミスマッチ塩基対は、ミスマッチの間に位置するか、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、対応するＭＡＲＣ１標的配列と、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個などのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、対応するＭＡＲＣ１標的配列と１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２３４、２９８、３５６、もしくは３７６のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、対応するＭＡＲＣ１標的配列と、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個などのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２３４、２９８、３５６、もしくは３７６のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、対応するＭＡＲＣ１標的配列と１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のミスマッチを有し得る。
オリゴヌクレオチドの種類
様々なオリゴヌクレオチドの種類および／または構造は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍｉＲＮＡなどを含むがこれらに限定されない、本明細書の方法においてＭＡＲＣ１を標的化するために有用である。本明細書または他の場所に記載されるオリゴヌクレオチドタイプのいずれも、ＭＡＲＣ１発現を阻害する目的で本明細書にＭＡＲＣ１標的化配列を組み込むためのフレームワークとしての使用が企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ダイサー介入の上流または下流でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与することによってＭＡＲＣ１発現を阻害する。例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、各鎖が１～５個のヌクレオチドの少なくとも１個の３’－オーバーハングを有する約１９～２５個のヌクレオチドのサイズを有するように開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照されたい）。ダイサーによって処理されて、活性なＲＮＡｉ産物を生成する、より長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照されたい）。さらなる研究により、少なくとも１個の鎖の少なくとも１個の末端が、二本鎖標的化領域を超えて伸長され、鎖の１個が熱力学的に安定化するテトラループ構造を含む構造を含む、伸長ｄｓＲＮＡが産生された（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号および同第８，９２７，７０５号、ならびに国際特許出願公開第２０１０／０３３２２５号を参照されたい）。こうした構造は、一本鎖（ｓｓ）伸長（分子の一方または両側）ならびに二本鎖（ｄｓ）伸長を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ダイサーの介入（例えば、ダイサー切断）の下流でＲＮＡｉ経路と関与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ダイサー基質である。いくつかの実施形態では、内因性ダイサープロセシングにより、ＭＡＲＣ１発現を低減することができる１９～２３個のヌクレオチドの長さの二本鎖核酸が産生される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハング（例えば、１、２、または３個のヌクレオチドの長さ）を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスである２１個のヌクレオチドのガイド鎖と、相補的なパッセンジャー鎖と、を含み、両方の鎖がアニールして１９ｂｐの二本鎖、および３’末端のいずれかまたは両方で２個のヌクレオチドのオーバーハングを形成する。２３個のヌクレオチドのガイド鎖および２１個のヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有するオリゴヌクレオチドを含む、より長いオリゴヌクレオチド設計も利用可能であり、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）、分子の左側に２個のヌクレオチドの３’－ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）が存在する。こうした分子には、２１ｂｐの二本鎖領域が存在する。例えば、米国特許第９，０１２，１３８号、同第９，０１２，６２１号、および同第９，１９３，７５３号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、両方が約１７～３６個（例えば、１７～３６、２０～２５、または２１～２３個）のヌクレオチドの長さであるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称性二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、両方が約１９～２２個のヌクレオチドの長さであるセンスおよびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、等しい長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に３’オーバーハングが存在するように、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、両方が約２１～２３個のヌクレオチドの長さの範囲にあるセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するオリゴヌクレオチドについて、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方での３’オーバーハングは、１または２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドのガイド鎖および２０個のヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有し、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）、分子の左側に２個のヌクレオチドの３’－ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）が存在する。こうした分子には、２０ｂｐの二本鎖領域が存在する。
本明細書の組成物および方法で使用するための他のオリゴヌクレオチド設計には、１６－ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（ｅｄ．），ＲＯＹＡＬ ＳＯＣＩＥＴＹ ＯＦ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２００６を参照されたい）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐまたはそれより短いステムを有する；例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２９：１４１－１５８を参照されたい）、平滑ｓｉＲＮＡ（例えば、１９ｂｐの長さの；例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ ＆ Ｂａｋｅｒ（２００６）ＲＮＡ １２：１６３－１７６を参照されたい）、非対称的なｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ；例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１３７９－８２を参照されたい）、非対称性の短い二本鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：７２５－３２を参照されたい）、フォークｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ（２００４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５５７：１９３－９８を参照されたい）、ｓｓ ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ（２０１２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：１０６３）、ダンベル型環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１５１０８－０９を参照されたい）、および低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：５８８６－９７を参照されたい）が含まれる。ＭＡＲＣ１の発現を低減または阻害するためにいくつかの実施形態で使用され得るオリゴヌクレオチド構造のさらなる非限定的な例は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびショートｓｉＲＮＡである（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ Ｊ．２１：４６７１－７９を参照されたく、また、米国特許出願公開第２００９／００９９１１５号も参照されたい）。
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書のＭＡＲＣ１発現を低減または阻害するためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖（ｓｓ）である。そのような構造には、一本鎖ＲＮＡｉ分子が含まれるが、これに限定されない。近年の取り組みにより、ｓｓ ＲＮＡｉ分子の活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４：９４６－５５を参照されたい）。しかしながら、いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に記載され、特定の核酸の標的とされるセグメントの逆相補体を含み、細胞内でその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介切断を誘導するように（例えば、ギャップマーとして）、または細胞内で標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように（例えばミックスマーとして）好適に修飾される、核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用するためのＡＳＯは、例えば、米国特許第９，５６７，５８７号に示されているものを含む、当技術分野で公知の任意の好適な様式で修飾され得る（例えば、長さ、核酸塩基（ピリミジン、プリン）の糖部分、および核酸塩基の複素環部分の改変を含む）。さらに、ＡＳＯは、特定の標的遺伝子の発現を低減させるために数十年間使用されてきた（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：８１－１０５を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡと相補性の領域を共有する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＭ＿００１２５１９３５．１として識別されるヒトＭＡＲＣ１遺伝子の様々な領域を標的とする。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５～５０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５～２５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つと相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列から１、２、または３個のヌクレオチドが異なる。
二本鎖オリゴヌクレオチド
いくつかの態様では、本開示は、センス鎖（本明細書ではパッセンジャー鎖とも呼ばれる）およびアンチセンス鎖（本明細書ではガイド鎖とも呼ばれる）を含む、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的とし、ＭＡＲＣ１発現を（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）阻害するための二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、別個の鎖であり、共有結合していない。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、共有結合している。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、センス鎖およびアンチセンス鎖、またはその一部分は、相補的な様式で（例えば、ワトソン・クリック塩基対形成によって）互いに結合する。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、第１の領域（Ｒ１）および第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｒ２は、第１のサブ領域（Ｓ１）と、テトラループまたはトリループ（Ｌ）と、第２のサブ領域（Ｓ２）と、を含み、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に位置し、Ｓ１およびＳ２は、第２の二本鎖（Ｄ２）を形成する。Ｄ２は、様々な長さを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、約１～６ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、２～６、３～６、４～６、５～６、１～５、２～５、３～５、または４～５ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、１、２、３、４、５、または６ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、６ｂｐの長さである。
いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖のＲ１は、第１の二本鎖（Ｄ１）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、少なくとも約１５個（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、約１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１５～２２、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、少なくとも１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方の全長に及ぶ。特定の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つの配列を有するセンス鎖と、配列番号１１５３～１５３６から選択される相補的な配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つの配列を有するセンス鎖と、配列番号３８５～７６８から選択される相補的な配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、表４および６に配列されるような、配列番号１５３７～１５７０のうちのいずれか１つの配列を有するセンス鎖と、配列番号１５７３～１６０６から選択される相補的な配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から選択されるヌクレオチド配列を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１５４３の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１５７９の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１５６０の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１５９６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１５６８の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１６０４の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１５５３の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１５８９の配列を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）または他の核酸の構造を説明する際に、配列表に示される配列を参照することができることを理解されたい。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、指定された配列と本質的に同一または類似する相補的特性を保持しながら、指定された配列と比較した場合、１個以上の代替ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応物またはＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応物）、および／または１個以上の修飾ヌクレオチド、および／または１個以上の修飾ヌクレオチド間結合、および／または１個以上の他の修飾を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、２５個のヌクレオチドのセンス鎖と、２７個のヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を含み、ダイサー酵素によって作用されると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖をもたらす。いくつかの実施形態では、２５個のヌクレオチドのセンス鎖は、配列番号７６９～１１５２から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、２７個のヌクレオチドのアンチセンス鎖は、配列番号１１５３～１５３６から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２７個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２５個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、配列番号１５３７～１５７０から選択されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、２７個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、配列番号１５３７～１５７０から選択されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、２５個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチド）。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、他の５’末端と比較して熱力学的に低い安定性である１個の５’末端を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端を含み、アンチセンス鎖の３’末端に３’オーバーハングを含む非対称性オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖での３’オーバーハングは、約１～８個のヌクレオチドの長さ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に２個（２）のヌクレオチドを含むオーバーハングを有する。しかしながら、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６個のヌクレオチド、任意選択で、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６個のヌクレオチド、または１、２、３、４、５、もしくは６個のヌクレオチドの長さを含む、３’－オーバーハングである。しかしながら、いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６個のヌクレオチド、任意選択で、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６個のヌクレオチド、または１、２、３、４、５、もしくは６個のヌクレオチドの長さを含む、５’－オーバーハングである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的化配列または配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である相補性の領域と、１～６個のヌクレオチドの長さを含む５’オーバーハングと、を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１５３７～１５７０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドは、１～６個のヌクレオチドの長さを含む５’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１５７３～１６０６から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドは、１～６個のヌクレオチドの長さを含む５’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１５３７～１５７０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１５７３～１６０６から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含み、オリゴヌクレオチドは、１～６個のヌクレオチドの長さを含む５’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ）と相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、不対である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、不対ＧＧを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、ＧＧである。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドの各３’末端での２個（２）の末端ＧＧヌクレオチドの一方または両方は、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、本明細書のオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、不対ＧＧを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３８５～７６８から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、不対ＧＧを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１５３７～１５７０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１５７３～１６０６から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含み、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端での２個（２）の末端ヌクレオチドは、不対ＧＧを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含むセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１個以上（例えば、１、２、３、４、または５個）のミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に１個を超えるミスマッチが存在する場合、それらは連続して位置するか（例えば、２、３個、またはそれ以上が並んでいる）、または相補性の領域全体にわたって散在し得る。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、１個以上のミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、２個（２）のミスマッチは、センス鎖の３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端でのセグメントの塩基ミスマッチ、または不安定化は、オリゴヌクレオチドの効力を改善するか、または増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
センス鎖とアンチセンス鎖との間に１個以上（例えば、１、２、３、４、または５個）のミスマッチが存在する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から選択されるヌクレオチド配列を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖とアンチセンス鎖との間に１個以上（例えば、１、２、３、４、または５個）のミスマッチが存在する。
アンチセンス鎖
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）のアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる。例えば、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシングコンジュゲート体（ＲＩＳＣ）に関与し、Ａｇｏ２などのアルゴノートタンパク質と結合する、または１個以上の類似因子に関与もしくは結合し、標的遺伝子のサイレンシングを指示するため、アンチセンス鎖はガイド鎖と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ガイド鎖と相補的な領域を含むセンス鎖は、本明細書では「パッセンジャー鎖」と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、最大約５０個のヌクレオチドの長さ（例えば、最大５０、最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２個のヌクレオチドの長さ）のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも３８個のヌクレオチドの長さ）のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２～約４０個（例えば、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２２、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、または３２～４０個）のヌクレオチドの長さの範囲のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つのアンチセンス鎖は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のヌクレオチドの長さのものである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１を標的化するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１１５３～１５３６のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれから成るアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号１１５３～１５３６のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３個）の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１を標的化するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１５７３～１６０６のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれから成るアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号１５７３～１６０６のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３個）の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１を標的化するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１５７９、１５９６、１６０４、および１５８９のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれから成るアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号１５７９、１５９６、１６０４、および１５８９のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３個）の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号３８５～７６８から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号６１８、６８２、７４０、および７６０から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
センス鎖
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的化し、ＭＡＲＣ１発現を阻害するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つに示されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的化し、ＭＡＲＣ１発現を阻害するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つに示されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３個）の連続するヌクレオチドから構成されるセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９個）の連続するヌクレオチドから構成されるセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的化し、ＭＡＲＣ１発現を阻害するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１５３７～１５７０のうちのいずれか１つに示されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号１５３７～１５７０のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３個）の連続するヌクレオチドから構成されるセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的化し、ＭＡＲＣ１発現を阻害するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１５４３、１５６０、１５６８、および１５５３のうちのいずれか１つに示されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号１５４３、１５６０、１５６８、および１５５３のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３個）の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的化し、ＭＡＲＣ１発現を阻害するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２３４、２９８、３５６、および３７６のうちのいずれか１つに示されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号２３４、２９８、３５６、および３７６のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも約１２個（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９個）の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、最大約５０個のヌクレオチドの長さ（例えば、最大５０、最大４０、最大３６、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３６、または少なくとも３８個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、約１２～約５０個（例えば、１２～５０、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２１、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、または３２～４０個）のヌクレオチドの長さの範囲のセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、１８～３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の３’末端にステム－ループ構造を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループは、鎖内塩基対形成によって形成される。いくつかの実施形態では、センス鎖は、その５’末端にステム－ループ構造を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、２個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、３個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、４個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、５個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、６個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、７個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、８個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、９個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１０個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１１個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１２個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１３個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１４個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ステム－ループは、分解（例えば、酵素分解）に対するオリゴヌクレオチド保護を提供し、標的細胞、組織、もしくは器官（例えば、肝臓）への標的化および／または送達を促進または改善するか、あるいはその両方である。例えば、いくつかの実施形態では、ステム－ループのループは、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ）への標的化、標的遺伝子発現（例えば、ＭＡＲＣ１発現）の阻害、および／または標的細胞、組織、もしくは器官（例えば、肝臓）への送達、取り込み、および／または浸透、またはそれらの組み合わせを促進、改善、または増加させる１個以上の修飾を含むヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループ自体またはステム－ループへの修飾は、オリゴヌクレオチドの本質的な遺伝子発現阻害活性に影響を与えないか、または実質的に影響を与えないが、安定性（例えば、分解に対する保護を提供する）、および／または標的細胞、組織、もしくは器官（例えば、肝臓）へのオリゴヌクレオチドの送達、取り込み、および／または浸透を促進、改善、または増加させる。特定の実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを（例えば、その３’末端に）含むセンス鎖を含み、Ｓ１は、Ｓ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間で最大約１０個のヌクレオチドの長さ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの長さ）の連結ヌクレオチドの一本鎖ループを形成する。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、１０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、テトラループは、配列５’－ＧＡＡＡ－３’を含む。いくつかの実施形態では、ステムループは、配列５’－ＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ－３’（配列番号１６８１）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、オリゴヌクレオチドは、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを（例えば、その３’末端に）含むセンス鎖を含み、Ｓ１は、Ｓ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間で最大約１０個のヌクレオチドの長さ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの長さ）の一本鎖ループを形成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、オリゴヌクレオチドは、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを（例えば、その３’末端に）含むセンス鎖を含み、Ｓ１は、Ｓ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間で４個のヌクレオチドの長さの一本鎖ループを形成する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構造Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステム－ループのループ（Ｌ）は、トリループである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域と、トリループと、を含む。いくつかの実施形態では、トリループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、リガンド（例えば、送達リガンド）、およびそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、上記の構造Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステム－ループのループ（Ｌ）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１３１，９１２号に記載のテトラループである。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列と相補的である標的化配列または相補性の領域と、テトラループと、を含む。いくつかの実施形態では、テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、リガンド（例えば、送達リガンド）、およびそれらの組み合わせを含む。
二本鎖の長さ
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１２個（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～３０、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～３０、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～３０、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。
オリゴヌクレオチド末端
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の末端は、平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する非対称性二本鎖領域を形成する別個の鎖である、センスおよびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の末端は、１個以上のヌクレオチドを含むオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、オーバーハングを含む１個以上のヌクレオチドは、不対ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端は、平滑末端を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の３’末端は、１個以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、１個以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、約１（１）～１９（１９）、１（１）～１８（１８）、１（１）～１７（１７）、１（１）～１６（１６）、１（１）～１５（１５）、１（１）～１４（１４）、１（１）～１３（１３）、１（１）～１２（１２）、１（１）～１１（１１）、１（１）～１０（１０）、１（１）～９（９）、１（１）～８（８）、１（１）～７（７）、１（１）～６（６）、１（１）～５（５）、１（１）～４（４）、１（１）～３（３）、または約１（１）～２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、（１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、３（３）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、４（４）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、５（５）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、６（６）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、７（７）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、８（８）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、９（９）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１０（１０）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１１（１１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１２（１２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１３（１３）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１４（１４）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１５（１５）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１６（１６）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１７（１７）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１８（１８）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１９（１９）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２０（２０）個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、３’オーバーハングを含み、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖は、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）の３’オーバーハングを含み、任意選択で、３’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、３’オーバーハングを含み、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖は、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）の３’オーバーハングを含み、任意選択で、３’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の５’末端は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、約１（１）～１９（１９）、１（１）～１８（１８）、１（１）～１７（１７）、１（１）～１６（１６）、１（１）～１５（１５）、１（１）～１４（１４）、１（１）～１３（１３）、１（１）～１２（１２）、１（１）～１１（１１）、１（１）～１０（１０）、１（１）～９（９）、１（１）～８（８）、１（１）～７（７）、１（１）～６（６）、１（１）～５（５）、１（１）～４（４）、１（１）～３（３）、または約１（１）～２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、（１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、３（３）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、４（４）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、５（５）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、６（６）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、７（７）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、８（８）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、９（９）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１０（１０）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１１（１１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１２（１２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１３（１３）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１４（１４）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１５（１５）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１６（１６）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１７（１７）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１８（１８）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１９（１９）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、２０（２０）個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’オーバーハングを含み、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖は、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）の５’オーバーハングを含み、任意選択で、５’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’オーバーハングを含み、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖は、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）の５’オーバーハングを含み、任意選択で、５’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、センスおよび／もしくはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端を含む１個以上の（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上）のヌクレオチドは、修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１または２個の末端ヌクレオチドは、修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドは、それが２’修飾を含むか、またはそれが２’－Ｏ－メトキシエチルを含むように修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１または２個の末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１または２個のヌクレオチドは、標的と相補的ではない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端は、本明細書に記載のステップループを含み、アンチセンス鎖の３’末端は、本明細書に記載の３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、本明細書に記載のニックの入ったテトラループ構造を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端は、ステム－ループを含み、ループは、本明細書に記載のテトラループであり、アンチセンス鎖の３’末端は、本明細書に記載の３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングを含む２（２）個のヌクレオチドは、両方がグアニン（Ｇ）核酸塩基を含む。典型的には、アンチセンス鎖の３’オーバーハングを含むヌクレオチドの一方または両方は、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。例示的なニックの入ったテトラループが図１２に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、図１２に示されるニックの入ったテトラループ構造を含む。
オリゴヌクレオチド修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、修飾を含む。オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、特異性、安定性、送達、バイオアベイラビリティ、ヌクレアーゼ分解からの耐性、免疫原性、塩基対形成特性、ＲＮＡ分布および細胞取り込み、ならびに治療もしくは研究用途と関連する他の特徴を改善または制御するために、様々な方法で修飾され得る。
いくつかの実施形態では、修飾は、修飾糖である。いくつかの実施形態では、修飾は、５’末端リン酸基である。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオチド間結合である。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾塩基である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾のうちのいずれか１つまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖、５’末端リン酸基、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合、および少なくとも１個の修飾塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖、５’末端リン酸基、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合、および少なくとも１個の修飾塩基を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖、５’末端リン酸基、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合、および少なくとも１個の修飾塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖、５’末端リン酸基、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合、および少なくとも１個の修飾塩基を含む。
オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）での修飾の数、およびそれらのヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を与え得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または同様の担体とそれらをコンジュゲートさせるか、またはそれらを取り囲むことによってインビボで送達され得る。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰまたは同様の担体によって保護されていない場合、ヌクレオチドの少なくともいくつかが修飾されることが有利であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、半分を超えるヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、半分未満のヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを含むすべてのヌクレオチドの糖部分は、２’位で修飾される。修飾は、可逆的または不可逆的であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素分解からの保護、インビボ投与後の所望の細胞を標的とする能力、および／または熱力学的安定性）を引き起こすのに十分な数および種類の修飾ヌクレオチドを有する。
糖修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、修飾糖を含む。いくつかの実施形態では、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ばれる）は、例えば、糖の２’、３’、４’、および／または５’炭素位置で１個以上の修飾が生じる、修飾デオキシリボースまたはリボース部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾糖は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」；例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｎ ５４：３６０７－３０を参照されたい）、非ロックド核酸（「ＵＮＡ」；例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ－Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ２：ｅ１０３を参照されたい）、および架橋核酸（「ＢＮＡ」；例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ ＆ Ｏｂｉｋａ（２００２）Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ）２１：１６５３－５９を参照されたい）に存在するものなどの非天然の代替炭素構造も含み得る。
いくつかの実施形態では、糖におけるヌクレオチド修飾は、２’修飾を含む。いくつかの実施形態では、２’－修飾は、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、または２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｆ、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥである。いくつかの実施形態では、糖における修飾は、糖環の１個以上の炭素の修飾を含み得る、糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’－酸素が糖の１’－炭素もしくは４’－炭素と連結すること、あるいは２’－酸素が、エチレンもしくはメチレン架橋を介して１’－炭素または４’－炭素と連結することを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’炭素から３’炭素への結合を欠く非環式糖を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０個、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０個、またはそれ以上）を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド（すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方）が修飾される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾（例えば、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅ、２’－ＭＯＥ、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、異なる修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、実施例および配列表に示される修飾パターンを有するセンス鎖と、実施例および配列表に示される修飾パターンを有するアンチセンス鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、２’－Ｆで修飾されたヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたヌクレオチドを有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、約１０～１５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％の２’－フルオロ修飾を含むセンス鎖のヌクレオチドを有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、１１％のセンス鎖のヌクレオチドが、２－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％の２’－フルオロ修飾を含むアンチセンス鎖のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、３２％のアンチセンス鎖のヌクレオチドが、２－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１５～２５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％の２’－フルオロ修飾を含むそのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド中の約１９％のヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖の８位、９位、１０位、または１１位のうちの１個以上が、２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、８位、９位、１０位、１２位、１３位、および１７位のうちの１個以上が、２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位のうちの１個以上が、２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態では、２位、３位、４位、５位、７位、８位、１０位、１４位、１６位、および１９位のうちの１個以上が、２’－Ｆ基で修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖における１～７位および１２～２０位のヌクレオチドの各々での糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖における１～７位、１２～２７位、および３１～３６位のヌクレオチドの各々での糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖における６位、９位、１１～１３位、１５位、１７位、１８位、および２０～２２位のヌクレオチドの各々での糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
センス鎖の８位、９位、１０位、または１１位のうちの１つ以上が、２’－Ｆ基で修飾される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
センス鎖の８位、９位、１０位、または１１位のうちの１つ以上が、２’－Ｆ基で修飾される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２位、５位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の１位、２位、５位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２位、４位、５位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の１位、２位、３位、５位、７位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２位、３位、４位、５位、７位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の１位、２位、３位、５位、１０位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２位、３位、４位、５位、１０位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２位、３位、４位、５位、７位、８位、１０位、１４位、１６位、および１９位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分と、を有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位の糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－ＯＭｅで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位の糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位の糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された８位～１１位での糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された３位、８位、９位、１０位、１２位、１３位、および１７位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１位～７位および１２位～１７位または１２～２０位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１～７位、１２～２７位、および３１～３６位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたセンス鎖の１位～７位および１２位～１７位または１２位～２０位のヌクレオチドの各々の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１～２位、４～７位、１１位、１４～１６位、および１８～２０位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたセンス鎖の１～２位、４～７位、１１位、１４～１６位、および１８～２０位のヌクレオチドの各々の糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位の糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－ＯＭｅで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位の糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位の糖部分を有するセンス鎖を含む。
５’末端リン酸
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’末端リン酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの５’末端リン酸基は、Ａｇｏ２との相互作用を増強する。しかしながら、５’－リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼまたは他の酵素を介した分解の影響を受けやすく、それにより、インビボでそれらの性能および／またはバイオアベイラビリティが制限され得る。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性のある５’リン酸の類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネート、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然の５’リン酸基の静電特性および立体特性を模倣する化学的部分（「リン酸模倣物」）に付着している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドが、５’末端リン酸、任意選択で、５’末端リン酸類似体を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドが、５’末端リン酸、任意選択で、５’末端リン酸類似体を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、糖の４’炭素位置にリン酸類似体を有する（「４’リン酸類似体」と呼ばれる）。例えば、国際特許出願公開第２０１８／０４５３１７号を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’リン酸類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）またはその類似体と結合しているオキシメチルホスホネートである。他の実施形態では、４’－リン酸類似体は、チオメチルホスホネートまたはアミノメチルホスホネートであり、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子が、糖部分またはその類似体の４’－炭素と結合している。特定の実施形態では、４’－リン酸類似体は、オキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯ（ＯＨ）２、－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯ（ＯＲ）２、または－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯ（ＯＨ）（Ｒ）（式中、Ｒが、独立して、－Ｈ、－ＣＨ３、アルキル基、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、－ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、－ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択される）によって表される。特定の実施形態では、アルキル基は、ＣＨ２ＣＨ３である。より典型的には、Ｒは、独立して、－Ｈ、－ＣＨ３、または－ＣＨ２ＣＨ３から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒは、－ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、４’－リン酸類似体は、５’－メトキシホスホネート－４’－オキシである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’リン酸類似体を含むアンチセンス鎖を含み、５’末端ヌクレオチドは、以下の構造を含む：
５’－メトキシホスホネート－４’－オキシ－２’－Ｏ－メチルウリジンホスホロチオエート［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］。
修飾ヌクレオチド間結合
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、リン酸修飾または置換により、少なくとも約１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも５個）の修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドが得られる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つは、約１～約１０個（例えば、１～１０、２～８、４～６、３～１０、５～１０、１～５、１～３、または１～２個）の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオンアルキルホスホトリエステル結合、ホスホルアミダイト結合、ホスホネート結合またはボラノホスフェート結合であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つの少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、およびアンチセンス鎖の２１位と２２位のうちの１個以上との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、およびアンチセンス鎖の２１位と２２位の各々との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、およびアンチセンス鎖の２１位と２２位の各々との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合を含む。
塩基修飾
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、１個以上の修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に結合される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２７４４６２号を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（脱塩基）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、１個以上の修飾核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（脱塩基）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、１個以上の修飾核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位、またはヌクレオチド糖部分置換中の同等の位置に位置する複素環部分であり、二本鎖で存在する場合、二本鎖の構造を実質的に改変することなく、１個を超える種類の塩基の反対側に位置することができる。いくつかの実施形態では、標的核酸（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ）と完全に相補的な参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的な核酸で形成される二本鎖よりも低いＴｍを有する標的核酸と二本鎖を形成する。いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基が塩基で置換されて、単一のミスマッチを生成する参照一本鎖核酸と比較すると、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸で形成される二本鎖よりも高いＴｍを有する標的核酸と二本鎖を形成する。
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例には、イノシン、１－β－Ｄ－リボフラノシル－５－ニトロインドール、および／または１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－ニトロピロールが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２５４３６２号、Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４３６３－４３７０、Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２３６１－６６、およびＬｏａｋｅｓ ＆ Ｂｒｏｗｎ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４０３９－４３を参照されたい）。
標的化リガンド
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を、１個以上の細胞もしくは細胞型、組織、器官、または解剖学的領域もしくは区画に標的化することが望ましい。そのような戦略は、オリゴヌクレオチドまたはその効果（例えば、ＭＡＲＣ１発現の阻害または減少）から利益を受けないであろう細胞、組織、器官、または解剖学的領域もしくは区画への、治療される生物への望ましくない効果を回避する、および／またはオリゴヌクレオチドの過度の損失を回避するのに役立ち得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、特定の細胞もしくは細胞型、組織、器官、または解剖学的領域もしくは区画への標的化および／または送達を容易にするために（例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするために）修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチドとコンジュゲートされた標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチドとコンジュゲートされた標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、カーボハイドレート、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質の一部分（例えば、抗体または抗体断片）、または脂質を含む。特定の実施形態では、標的化リガンドは、少なくとも１個のＧａｌＮＡｃ部分を含むカーボハイドレートである。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のヌクレオチドは、各々、別個の標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの２～４個のヌクレオチドは、各々、別個の標的化リガンドとコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドが歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似ているように、標的化リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドとコンジュゲートされる（例えば、標的化リガンドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖の５’または３’末端での２～４個のヌクレオチドのオーバーハングまたは伸長部とコンジュゲートされる）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端または３’末端のいずれかにステム－ループを含み得、ステムのループの１、２、３、または４個のヌクレオチドは、個別に標的化リガンドとコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の３’末端にステム－ループを含み、ステム－ループのループは、トリループまたはテトラループを含み、それぞれ、トリループまたはテトラループを含む３または４個のヌクレオチドは、標的化リガンドと個別にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の３’末端にステム－ループを含み、ステム－ループのループは、テトラループを含み、テトラループの３個のヌクレオチドは、標的化リガンドと個別にコンジュゲートされる。
ＧａｌＮＡｃは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）の高親和性カーボハイドレートリガンドであり、これは主に肝細胞の表面上に発現し、末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基（アシアロ糖タンパク質）を含む循環糖タンパク質の結合、内在化、およびその後の除去に主要な役割を果たしている。本開示のオリゴヌクレオチドとのＧａｌＮＡｃ部分のコンジュゲーション（間接的または直接的のいずれか）を使用して、これらのオリゴヌクレオチドを細胞上に発現するＡＳＧＰＲに対して標的化することができる。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、少なくとも１個以上のＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされ、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドを、ヒト肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）上に発現するＡＳＧＰＲに対して標的化する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドを肝臓に対して標的化する。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、一価ＧａｌＮＡｃ部分と直接的または間接的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個を超える一価ＧａｌＮＡｃと直接的または間接的にコンジュゲートされる（すなわち、２、３、または４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされ、典型的には、３または４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個以上の二価ＧａｌＮＡｃ、三価ＧａｌＮＡｃ、または四価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、二価、三価、または四価ＧａｌＮＡｃ部分は、分岐リンカーを介してオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、一価ＧａｌＮＡｃ部分は、第１のヌクレオチドとコンジュゲートされ、二価、三価、または四価ＧａｌＮＡｃ部分は、分枝リンカーを介して第２のヌクレオチドとコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の１（１）個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のヌクレオチドは、各々、ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、テトラループの２（２）～４（４）個のヌクレオチドは、各々、別個のＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、トリループの１（１）～３（３）個のヌクレオチドは、各々、別個のＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似ているように、標的化リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの末端で２（２）～４（４）個のヌクレオチドとコンジュゲートされる（例えば、リガンドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖の５’または３’末端での２（２）～４（４）個のヌクレオチドのオーバーハングまたは伸長部とコンジュゲートされる）。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドとコンジュゲートされる。例えば、３（３）または４（４）個のＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のテトラループ内のヌクレオチドとコンジュゲートされ得、各ＧａｌＮＡｃ部分は、１（１）個のヌクレオチドとコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、テトラループを含み、テトラループ（Ｌ）は、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ヌクレオチドの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、テトラループ（Ｌ）は、以下に示すように（Ｘ＝ヘテロ原子）、本明細書に記載の任意のリンカーを介してテトラループの任意の１個以上のグアニン（Ｇ）ヌクレオチドと結合した一価ＧａｌＮＡｃ部分を含む：
いくつかの実施形態では、テトラループ（Ｌ）は、以下に示すように（Ｘ＝ヘテロ原子）、本明細書に記載の任意のリンカーを介してテトラループの任意の１個以上のアデニンヌクレオチドと結合した一価ＧａｌＮＡｃを有する：
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、以下に示すように、［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－グアニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれるグアニン（Ｇ）ヌクレオチドと結合した一価ＧａｌＮＡｃ部分を含む：
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、以下に示すように、［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、アデニンヌクレオチドと結合した一価ＧａｌＮＡｃ部分を含む：
そのようなコンジュゲートの例は、５’から３’へヌクレオチド配列ＧＡＡＡ（Ｌ＝リンカー、Ｘ＝ヘテロ原子）を含むループについて以下に示される。こうしたループは、例えば、本明細書に提供されるセンス鎖の２７位～３０位に存在し得る。化学式では、
は、オリゴヌクレオチド鎖との結合点を記述するために使用される。
適切な方法または化学（例えば、クリックケミストリ）を使用して、標的化リガンドをヌクレオチドと連結することができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを使用して、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含むヌクレオチドとコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、アセタール系リンカーを使用して、標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つのヌクレオチドとコンジュゲートする。アセタール系リンカーは、例えば、国際特許出願公開第２０１６／１００４０１号に開示されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、安定である。５’から３’へヌクレオチドＧＡＡＡを含むループの例が以下に示され、ＧａｌＮＡｃ部分は、アセタールリンカーを使用してループのヌクレオチドと結合される。こうしたループは、例えば、センス鎖のいずれか１個の２７位～３０位に存在し得る。化学式にでは、
は、オリゴヌクレオチド鎖との結合点である。
上述のように、様々な適切な方法または化学合成技術（例えば、クリックケミストリ）を使用して、標的化リガンドをヌクレオチドと連結することができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドとコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、アセタール系リンカーを使用して、標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つのヌクレオチドとコンジュゲートする。アセタール系リンカーは、例えば、国際特許出願公開第２０１６／１００４０１号に開示されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、安定リンカーである。
いくつかの実施形態では、標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）とオリゴヌクレオチドとの間に二本鎖伸長（例えば、最大３、４、５、または６ｂｐの長さ）が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、それとコンジュゲートされたＧａｌＮＡｃを有さない。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドとコンジュゲートされた少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドとコンジュゲートされた少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含む。
ＭＡＲＣ１発現を低減するための例示的なオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本発明よって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むすべてのヌクレオチドは、修飾されており、アンチセンス鎖は、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域は、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、５’－メトキシホスホネート－４’－オキシ－２’－Ｏ－メチルウリジン［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵ］を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、１個以上の２’－フルオロ（２’－Ｆ）および２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、ならびに少なくとも１個のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、４（４）個のホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、１（１）個のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、５（５）個のホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、１（１）個のホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号７６９～１１５２のうちのいずれか１つの配列を有するセンス鎖と、配列番号１１５３～１５３６から選択される相補的な配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１５３７～１５７０のうちのいずれか１つの配列を有するセンス鎖と、配列番号１５７３～１６０６から選択される相補的な配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号１６０９～１６４２のうちのいずれか１つの配列を有するセンス鎖と、配列番号１６４５～１６７８から選択される相補的な配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するための本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、およびＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、
８位～１１位の２’－Ｆ修飾ヌクレオチド、１位～７位、１２位～２７位、および３１位～３６位の２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、２８位、２９位、および３０位のＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチド、ならびに１位と２位との間のホスホロチオエート結合を含む、センス鎖、
２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位の２’－Ｆ修飾ヌクレオチド、１位、６位、８位、９位、１１位～１３位、および１５位～２２位の２’－ＯＭｅ、１位と２位、２位と３位、３位と４位、２０位と２１位、および２１位と２２位との間のホスホロチオエート結合、ならびに４’－リン酸類似体を含む１位での５’－末端ヌクレオチドを含む、アンチセンス鎖、を含み、任意選択で、５’末端ヌクレオチドは、５’－メトキシホスホネート－４’－オキシ－２’－Ｏ－メチルウリジン［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵ］を含み、アンチセンス鎖の１位～２０位は、センス鎖の１位～２０位と二本鎖領域を形成し、センス鎖の２１位～３６位は、ステム－ループを形成し、２７位～３０位は、ステム－ループのループを形成し、任意選択で、２７位～３０位は、テトラループを含み、アンチセンス鎖の２１位および２２位は、オーバーハングを含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、
８位～１１位の２’－Ｆ修飾ヌクレオチド、１位～７位、１２位～２７位、および３１位～３６位の２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、２８位、２９位、および３０位のＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチド、ならびに１位と２位との間のホスホロチオエート結合を含む、センス鎖、
２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位の２’－Ｆ修飾ヌクレオチド、１位、６位、８位、９位、１１位～１３位、および１５位～２２位の２’－ＯＭｅ、１位と２位、２位と３位、３位と４位、２０位と２１位、および２１位と２２位との間のホスホロチオエート結合、ならびに４’－リン酸類似体を含む１位での５’－末端ヌクレオチドを含む、アンチセンス鎖、を含み、任意選択で、５’末端ヌクレオチドは、５’－メトキシホスホネート－４’－オキシ－２’－Ｏ－メチルウリジン［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵ］を含み、アンチセンス鎖の１位～２０位は、センス鎖の１位～２０位と二本鎖領域を形成し、センス鎖の２１位～３６位は、ステム－ループを形成し、２７位～３０位は、ステム－ループのループを形成し、任意選択で、２７位～３０位は、テトラループを含み、アンチセンス鎖の２１位および２２位は、オーバーハングを含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、
（ａ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９から選択されるヌクレオチド配列を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号１５４３に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１５７９に示されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号１５６０に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１５９６に示されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号１５６８に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１６０４に示されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号１５５３に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１５８９に示されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号６１８に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号６８２に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号７４０に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号７６０に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号６１８に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域および３’末端でのステム－ループを含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、ステム－ループが、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号６８２に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域および３’末端でのステム－ループを含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、ステム－ループが、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号７４０に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域および３’末端でのステム－ループを含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、ステム－ループが、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号７６０に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域および３’末端でのステム－ループを含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、ステム－ループが、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号６１８に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と相補性の領域が、配列番号２３４に示される、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号６８２に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と相補性の領域が、配列番号２９８に示される、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号７４０に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と相補性の領域が、配列番号３５６に示される、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号７６０に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と相補性の領域が、配列番号３７６に示される、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号６１８に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域および３’末端でのステム－ループを含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と相補性の領域が、配列番号２３４に示され、ステム－ループが、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号６８２に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域および３’末端でのステム－ループを含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と相補性の領域が、配列番号２９８に示され、ステム－ループが、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号７４０に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域および３’末端でのステム－ループを含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と相補性の領域が、配列番号３５６に示され、ステム－ループが、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号７６０に示される、アンチセンス鎖と、（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域および３’末端でのステム－ループを含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と相補性の領域が、配列番号３７６に示され、ステム－ループが、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、センス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を提供し、オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズする、以下のようなセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖：５’－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－３’
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］－Ｓ－ｆＸ－Ｓ－ｆＸ－Ｓ－ｆＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－３’
ｍＸが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、ｆＸが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、－Ｓ－が、ホスホロチオエート結合であり、－が、ホスホジエステル結合、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］が、５’－メトキシホスホネート－４－オキシ修飾ヌクレオチドであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、アデニンヌクレオチドと結合したＧａｌＮＡｃである。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を提供し、オリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１６０９および１６４５、
（ｂ）それぞれ、配列番号１６１０および１６４６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１６１１および１６４７、
（ｄ）それぞれ、配列番号１６１２および１６４８、
（ｅ）それぞれ、配列番号１６１３および１６４９、
（ｆ）それぞれ、配列番号１６１４および１６５０、
（ｇ）それぞれ、配列番号１６１５および１６５１、
（ｈ）それぞれ、配列番号１６１６および１６５２、
（ｉ）それぞれ、配列番号１６１７および１６５３、
（ｊ）それぞれ、配列番号１６１８および１６５４、
（ｋ）それぞれ、配列番号１６１９および１６５５、
（ｌ）それぞれ、配列番号１６２０および１６５６、
（ｍ）それぞれ、配列番号１６２１および１６５７、
（ｎ）それぞれ、配列番号１６２２および１６５８、
（ｏ）それぞれ、配列番号１６２３および１６５９、
（ｐ）それぞれ、配列番号１６２４および１６６０、
（ｑ）それぞれ、配列番号１６２５および１６６１、
（ｒ）それぞれ、配列番号１６２６および１６６２、
（ｓ）それぞれ、配列番号１６２７および１６６３、
（ｔ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６４、
（ｕ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６５、
（ｖ）それぞれ、配列番号１６３０および１６６６、
（ｗ）それぞれ、配列番号１６３１および１６６７、
（ｘ）それぞれ、配列番号１６３２および１６６８、
（ｙ）それぞれ、配列番号１６３３および１６６９、
（ｚ）それぞれ、配列番号１６３４および１６７０、
（ａａ）それぞれ、配列番号１６３５および１６７１、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１６３６および１６７２、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１６３７および１６７３、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１６３８および１６７４、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１６３９および１６７５、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１６４０および１６７６、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１６４１および１６７７、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１６４２および１６７８から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号１６１５に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１６５１に示されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号１６３２に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１６６８に示されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号１６４０に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１６７６に示されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるＭＡＲＣ１発現を低減するためのＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドは、配列番号１６２５に示されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、配列番号１６６１に示されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含む。
製剤
様々な製剤（例えば、薬学的製剤）がオリゴヌクレオチドの使用のために開発されてきた。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、分解を最小限にするか、送達および／もしくは取り込みを促進するか、または製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象または細胞環境に送達することができる。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１の発現を低減させるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含む組成物が本明細書に提供される。そのような組成物は、対象に、標的細胞の直近の環境にまたは全身的に投与された場合のいずれかに、オリゴヌクレオチドの十分な部分が細胞に入り、ＭＡＲＣ１発現を低減させるように、好適に製剤化され得る。任意の様々な適切なオリゴヌクレオチド製剤が、本明細書に開示されるように、ＭＡＲＣ１の低減のためのオリゴヌクレオチドを送達するために使用することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＰＢＳなどの緩衝液、リポソーム、ミセル構造、およびカプシド中に製剤化される。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドはいずれも、核酸としてだけでなく、薬学的に許容可能な塩の形態で提供されてもよい。
カチオン性脂質を含むオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、オリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン）などのカチオン性脂質を使用することができる。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれ、これらはすべて製造業者の指示に従って使用することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、もしくはナノ粒子を含むか、またはそれを必要とする対象の細胞、組織、器官、もしくは身体への投与のために別様に製剤化されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２２版，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書の製剤は、賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、活性成分の改善された安定性、改善された吸収、改善された溶解度、および／または治療的増強を組成物に付与する。いくつかの実施形態では、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、または水酸化ナトリウム）またはビヒクル（例えば、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、または鉱油）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その保存寿命を延長するために凍結乾燥され、その後、使用前（例えば、対象への投与）に溶液にされる。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、またはポリビニルピロリドン）または崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、またはゼラチン）であり得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。
注射用の使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散体、および滅菌注射用溶液または分散体の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはＰＢＳが含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上に列挙した成分の１個または組み合わせを含む選択された溶媒に必要な量のオリゴヌクレオチドを組み込み、続いて、濾過滅菌することによって調製することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１％の治療剤（例えば、ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）またはそれ以上を含み得るが、活性成分のパーセンテージは、全組成物の重量または体積の約１％～約８０％以上であり得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品保存寿命などの要因、および他の薬理学的考慮事項は、かかる薬学的製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、様々な投与量および治療レジメンが望ましい場合がある。
使用方法
ＭＡＲＣ１発現を低減する
いくつかの実施形態では、本発明は、ＭＡＲＣ１発現を低減させるために、本明細書で提供される有効量のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を細胞もしくは細胞集団に接触または送達する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現の低減は、細胞におけるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ、ＭＡＲＣ１タンパク質、もしくはＭＡＲＣ１活性の量またはレベルの低減を測定することによって決定される。これらの方法は、本明細書に記載され、当業者に公知であるものを含む。
本明細書に提供される方法は、任意の適切な細胞型に有用である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを発現する任意の細胞（例えば、肝細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から取得された初代細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、細胞がその天然の表現型特性を実質的に維持するように限られた数の継代を受けている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、エクスビボまたはインビトロである（すなわち、培養中の細胞または細胞が常在する生物に送達することができる）。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、オリゴヌクレオチドを含む溶液の注射、オリゴヌクレオチドによって覆われた粒子による衝撃、オリゴヌクレオチドを含む溶液への細胞もしくは細胞集団の曝露、またはオリゴヌクレオチドの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の核酸送達方法を使用して、細胞または細胞集団に送達される。オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための当技術分野で公知の他の方法、例えば脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、およびリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどを使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現の低減は、ＭＡＲＣ１発現と関連する細胞もしくは細胞集団の１個以上の分子、特性、または特性を評価するアッセイまたは技術によって、あるいは細胞もしくは細胞集団におけるＭＡＲＣ１発現を直接的に示す分子を評価するアッセイまたは技術によって（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡまたはＭＡＲＣ１タンパク質）によって決定される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドがＭＡＲＣ１発現を低減させる程度は、オリゴヌクレオチドと接触させた細胞または細胞集団におけるＭＡＲＣ１発現を適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドと接触していない、もしくは対照オリゴヌクレオチドと接触している適切な細胞または細胞集団）と比較することによって評価される。いくつかの実施形態では、対照細胞または細胞集団におけるＭＡＲＣ１発現の対照量またはレベルは、アッセイまたは技術が実施されるすべての事例において対照量またはレベルを測定する必要がないように、予め決定される。予め決定されるレベルまたは値は、様々な形態を取ることができる。いくつかの実施形態では、予め決定されるレベルまたは値は、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を細胞もしくは細胞集団に接触または送達することは、オリゴヌクレオチドと接触していない、もしくは対照オリゴヌクレオチドと接触している細胞または細胞集団におけるＭＡＲＣ１発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現の低減は、ＭＡＲＣ１発現の対照量またはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現の対照量またはレベルは、本明細書のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞または細胞集団におけるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡおよび／またはＭＡＲＣ１タンパク質の量またはレベルである。いくつかの実施形態では、本明細書の方法による細胞または細胞集団への本明細書のオリゴヌクレオチドの送達の効果は、任意の有限期間または時間量（例えば、分、時間、日、週、月）の後に評価される。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現は、オリゴヌクレオチドを細胞もしくは細胞集団と接触または送達した後、少なくとも約４時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、または少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約２１日、約２８日、約３５日、約４２日、約４９日、約５６日、約６３日、約７０日、約７７日、もしくは約８４日以上で、細胞または細胞集団において決定される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現は、オリゴヌクレオチドを細胞もしくは細胞集団と接触または送達した後、少なくとも約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、もしくは約６ヶ月以上で、細胞または細胞集団において決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む鎖（例えば、そのセンス鎖およびアンチセンス鎖）を細胞内で発現するように操作された導入遺伝子の形態で送達される。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される任意のオリゴヌクレオチドを発現するように操作された導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルス）、または非ウイルスベクター（例えば、プラスミドまたは合成ｍＲＮＡ）を使用して送達され得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接的に注射され得る。
治療方法
本発明は、医薬として使用するため、特にＭＡＲＣ１の発現と関連する疾患、障害、および状態を治療するための方法で使用するための、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を提供する。本発明はまた、ＭＡＲＣ１発現を低減することから利益を受け得る対象（例えば、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有するヒト）を治療するために使用するための、または使用するために適合されたオリゴヌクレオチドも提供する。いくつかの点で、本発明は、ＭＡＲＣ１の発現と関連する疾患、障害、もしくは状態を有する対象を治療するために使用するための、または使用するために適合されたオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、もしくは状態を治療するための医薬または医薬組成物の製造における使用のための、または使用するために適合されたオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、使用するための、または使用するために適合されたオリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的とし、ＭＡＲＣ１発現を低減させる（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）。いくつかの実施形態では、使用するための、または使用するために適合されたオリゴヌクレオチドは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的とし、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ、ＭＡＲＣ１タンパク質、および／もしくはＭＡＲＣ１活性の量またはレベルを低減させる。
加えて、本明細書の方法のいくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、もしくは状態を有するか、またはその素因がある対象が、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）による治療のために選択される。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ、ＭＡＲＣ１タンパク質、またはそれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態のマーカー（例えば、バイオマーカー）を有する個体を選択することを含む。同様に、以下に詳述するように、本発明によって提供される方法のいくつかの実施形態は、例えば、ＭＡＲＣ１発現のマーカー（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ）のベースライン値を測定するまたは取得する工程と、次いで、そのように得られた値を、対象にオリゴヌクレオチドを投与した後に取得される１つ以上の他のベースライン値または値と比較して、治療の有効性を評価する工程と、を含む。
本発明はまた、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、もしくは状態を有する、有する疑いがある、または発症するリスクがある対象を、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドで治療する方法を提供する。いくつかの点で、本発明は、本明細書のオリゴヌクレオチドを使用して、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、もしくは状態の発症または進行を治療または軽減する方法を提供する。他の態様では、本発明は、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドを使用して、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象において１つ以上の治療的利益を達成する方法を提供する。本明細書の方法のいくつかの実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を投与することによって治療される。いくつかの実施形態では、治療は、ＭＡＲＣ１発現を低減することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、治療的に処置される。いくつかの実施形態では、対象は、予防的に処置される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書の１個以上のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、または１個以上のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＭＡＲＣ１発現が対象において低減され、それによって対象を治療するように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量またはレベルは、対象において低減される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１タンパク質の量またはレベルは、対象において低減される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１活性の量またはレベルは、対象において低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、１個以上のオリゴヌクレオチド、または医薬組成物の投与前のＭＡＲＣ１発現と比較して、ＭＡＲＣ１発現が、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて、対象において低減されるように、ＭＡＲＣ１と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現は、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチドもしくは複数の対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象におけるＭＡＲＣ１発現と比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、またはオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチドもしくは複数の対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象におけるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＭＡＲＣ１タンパク質の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＭＡＲＣ１タンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１タンパク質の量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチド、複数の対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象におけるＭＡＲＣ１タンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＭＡＲＣ１遺伝子活性／発現の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＭＡＲＣ１活性の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１活性の量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象におけるＭＡＲＣ１活性の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
ＭＡＲＣ１発現、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ、ＭＡＲＣ１タンパク質、ＭＡＲＣ１活性、もしくはＭＡＲＣ１発現の調節と関連するかまたは調節によって影響を受けるバイオマーカー（例えば、血漿バイオマーカー）の量またはレベルを、対象または対象からの試料において決定するための好適な方法は、当技術分野で公知である。さらに、本明細書に記載の実施例は、ＭＡＲＣ１発現を決定するための方法を例示する。
いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ、ＭＡＲＣ１タンパク質、ＭＡＲＣ１活性、もしくはＭＡＲＣ１発現の調節と関連するかまたは調節によって影響を受けるバイオマーカーの量またはレベル、あるいはそれらの任意の組み合わせは、対象から取得もしくは単離された細胞（例えば、肝細胞）、集団もしくは細胞群（例えば、オルガノイド）、器官（例えば、肝臓）、血液もしくはその分画（例えば、血漿）、組織（例えば、肝臓組織）、試料（例えば、肝臓生検試料）、または任意の他の適切な生物学的材料において低減される。いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣ１発現、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ、ＭＡＲＣ１タンパク質、ＭＡＲＣ１活性、もしくはＭＡＲＣ１発現の調節と関連するかまたは調節によって影響を受けるバイオマーカーの量またはレベル、あるいはそれらの任意の組み合わせは、１つを超える種類の細胞（例えば、肝細胞および１つ以上の他の種類の細胞）、１つを超える細胞群、１つを超える器官（例えば、肝臓および１つ以上の他の器官）、１つを超える血液の分画（例えば、血漿および１つ以上の他の血液分画）、１つを超える種類の組織（例えば、肝臓組織および１つ以上の他の種類の組織）、または１つを超える種類の試料（例えば、肝臓生検試料および１つ以上の他の種類の生検試料）において低減される。
それらの高い特異性のため、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、細胞および組織、または器官（例えば、肝臓で）の標的遺伝子（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ）のｍＲＮＡを特異的に標的とする。疾患の予防において、標的遺伝子は、疾患の開始もしくは維持に必要とされるもの、または疾患に罹患するリスクが高いことに関連するとして特定されたものであり得る。疾患の治療において、オリゴヌクレオチドは、疾患を示すか、もしくは媒介することに関与する細胞、組織、または器官（例えば、肝臓）と接触させることができる。例えば、ＭＡＲＣ１発現と関連する障害もしくは状態と関連する野生型（すなわち、天然の）または変異遺伝子のすべてまたは一部分と実質的に同一のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、肝細胞もしくは他の肝臓細胞などの目的の細胞または組織の種類と接触させるか、あるいはそれらに導入することができる。
ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態の例には、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、またはメタボリックシンドロームが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、疾患は、ＮＡＦＬＤである。いくつかの実施形態では、疾患は、ＮＡＳＨである。いくつかの実施形態では、疾患は、ＡＳＨである。
いくつかの実施形態では、脂肪肝の量またはレベルは、対象において低減する。いくつかの実施形態では、肝線維症の量またはレベルは、対象において低減する。いくつかの実施形態では、コレステロールの量またはレベルは、対象において低減する。いくつかの実施形態では、トリグリセリドの量またはレベルは、対象において低減する。いくつかの実施形態では、アラニンアミノトランスフェラーゼの量またはレベルは、対象において低減する。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの量またはレベルは、対象において低減する。いくつかの実施形態では、以下の任意の組み合わせは、対象において低減または変化される：ＭＡＲＣ１発現、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量もしくはレベル、ＭＡＲＣ１タンパク質の量もしくはレベル、ＭＡＲＣ１活性の量もしくはレベル、ＴＧの量もしくはレベル、コレステロールの量もしくはレベル、および／またはＨＤＬコレステロールに対する総コレステロールの比率、脂肪肝の量もしくはレベル、肝線維症の量もしくはレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼの量、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベルの量。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、肝線維症の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前の肝線維症の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、肝線維症の量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象における肝線維症の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、脂肪肝の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前の脂肪肝の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、脂肪肝の量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象における脂肪肝の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、アラニンアミノトランスフェラーゼの量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のアラニンアミノトランスフェラーゼの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、アラニンアミノトランスフェラーゼの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象におけるアラニンアミノトランスフェラーゼの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、トリグリセリドの量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のトリグリセリドの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、トリグリセリドの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象におけるトリグリセリドの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、コレステロール（例えば、総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール）の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のコレステロールの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、コレステロールの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていない、あるいは対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物または治療を受けた対象におけるコレステロールの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ヒト標的などの任意の哺乳動物由来の標的遺伝子であり得る。任意の標的遺伝子は、本明細書に記載される方法に従ってサイレンシングされてもよい。
本明細書に記載の方法は、典型的には、有効量の本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、すなわち、望ましい治療結果を産生するまたは生成する量を対象に投与することを伴う。治療的に許容可能な量は、疾患または障害を治療的に処置する量であり得る。任意の１つの対象に対する適切な用量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される組成物、組成物中の活性成分、投与の時間および経路、一般的な健康状態、ならびに同時投与される他の薬剤を含む、特定の因子に依存するであろう。
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書の組成物のうちのいずれか１つ（例えば、本明細書に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含む組成物）を、経腸的に（例えば、経口的に、胃栄養管によって、十二指腸栄養管によって、胃瘻造設を介して、または直腸に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射または注入、動脈内注射または注入、骨内注入、筋肉内注射、脳内注射、脳室内注射、髄腔内）、局所的に（例えば、経皮、吸入、点眼薬を介して、または粘膜を介して）、または標的器官（例えば、対象の肝臓）への直接注射によってのいずれかで投与される。典型的には、本明細書のオリゴヌクレオチドは、静脈内または皮下に投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、単独でまたは組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、同時に、連続して（任意の順序で）、または断続的に組み合わせて投与される。例えば、２つのオリゴヌクレオチドは、同時に共投与され得る。あるいは、１つのオリゴヌクレオチドが投与され、続いて任意の期間（例えば、１時間、１日、１週、または１ヶ月）後に、第２のオリゴヌクレオチドを投与することができる。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ヒトまたは非ヒト霊長類または他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象には、イヌおよびネコなどの家畜化動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜、ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの動物が含まれる。
キット
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）と、使用のための指示と、を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書のオリゴヌクレオチドと、キットおよび／またはその任意の構成要素の使用のための指示を含む添付文書と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、好適な容器内に、本明細書のオリゴヌクレオチド、１つ以上の対照、ならびに当技術分野で周知の様々な緩衝液、試薬、酵素、および他の標準成分を含む。いくつかの実施形態では、容器は、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはオリゴヌクレオチドが配置される他の容器手段を含み、一部の事例では、適切にアリコートされる。追加の構成要素が提供されるいくつかの実施形態では、キットは、この構成要素が配置される追加の容器を含む。キットはまた、オリゴヌクレオチドおよび任意の他の試薬を商業販売のために厳重に閉じるための手段を含むことができる。このような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形のプラスチック容器が含まれ得る。容器および／またはキットは、使用のための指示および／または警告を記載したラベルを含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、それを必要とする対象におけるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、もしくは状態を治療するか、またはそれらの進行を遅延させるためのオリゴヌクレオチドおよび指示を含む、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）および薬学的に許容可能な担体、または医薬組成物を含む。
定義
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的ｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的な配列、特にシード配列を有し、それによってｍＲＮＡと二本鎖を形成することができる、核酸系分子を包含する。したがって、本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、「相補的核酸系阻害剤」と呼ぶことができる。
本明細書で使用される「およそ」または「約」は、１つ以上の目的の値に適用される場合、記載された参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「約」は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれより小さい範囲内にある値の範囲を指す（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」などは、薬理学的に有用な方法で（例えば、対象の疾患、障害、または状態を治療するために）対象に物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を提供することを指す。
本明細書で使用される場合、「軽減する」、「軽減すること」、「軽減」などは、低減するまたは効果的に停止することを指す。非限定的な例として、１つ以上の本明細書の治療は、対象におけるＮＡＦＬＤもしくはＮＡＳＨの発症または進行を低減または効果的に停止させることができる。この軽減は、例えば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、もしくはＡＳＨの１つ以上の態様（例えば、症状、組織特性、および細胞性、炎症、または免疫活性など）の減少、脂肪肝疾患の１つ以上の態様の検出可能な進行（悪化）の欠如、またはそうでない場合、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、もしくはＡＳＨ）の検出可能な態様の欠如によって例示される。
本明細書で使用される場合、「相補的」とは、２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にする２つのヌクレオチド間の構造的関係（例えば、２つの対向する核酸上または単一の核酸鎖の対向する領域上）を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的である１つの核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することによって一緒に塩基対を形成し得る。いくつかの実施形態では、相補的なヌクレオチドは、ワトソン・クリック法または安定な二本鎖の形成を可能にする任意の他の方法で塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載されるように、互いに相補的であり、相補性の領域を形成する複数のヌクレオチドの領域を有し得る。
本明細書で使用される「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較した場合、そのペントース糖の２’位でヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、リン酸基、もしくは塩基中またはそれらの修飾あるいは置換を含む、２’位以外の原子の１つ以上の修飾または置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
本明細書で使用される「二本鎖オリゴヌクレオチド」または「ｄｓオリゴヌクレオチド」は、実質的に二本鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域の相補的な塩基対形成は、共有結合的に分離された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域の相補的な塩基対形成は、共有結合された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域の相補的な塩基対形成は、折り畳まれて（例えば、ヘアピンを介して）、一緒に塩基対形成するヌクレオチドの相補的な逆平行配列を提供する単一の核酸鎖から形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二本鎖化された２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖である（例えば、一方または両方の末端にオーバーハングを有する）２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であるヌクレオチドの逆平行配列を含み、したがって、内部ミスマッチまたは末端ミスマッチを含み得る１つ以上のミスマッチを有し得る。
本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して「二本鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の塩基対形成を通じて形成される構造を指す。
本明細書で使用される「賦形剤」は、例えば、所望の稠度もしくは安定化効果を提供または寄与するために、組成物に含まれ得る治療剤ではないものを指す。
本明細書で使用される場合、「肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）」または「肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。これらの細胞は、肝臓の質量の約７０％～８５％を構成し、血清アルブミン、ＦＢＮ、および凝固因子のプロトロンビン群（因子３および４を除く）を生産する。肝細胞系統細胞のマーカーには、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミン合成酵素（Ｇｌｕｌ）、肝細胞核因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、および肝細胞核因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）が含まれるが、これらに限定されない。成熟肝細胞のマーカーには、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（Ｆａｈ）、グルコース６－リン酸（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、およびＯＣ２－２Ｆ８が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｈｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ４９４：２４７－５０を参照されたい。
本明細書で使用される「肝毒性物質」は、それ自体が肝臓に対して毒性であるか、または処理されて肝臓に対して毒性である代謝産物を形成することができる化学的化合物、ウイルス、または他の物質を指す。肝毒性物質には、四塩化炭素（ＣＣｌ４）、アセトアミノフェン（パラセタモール）、塩化ビニル、ヒ素、クロロホルム、非ステロイド性抗炎症薬（アスピリンおよびフェニルブタゾンなど）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ＭＡＲＣ１」という用語は、ミトコンドリアアミドキシム還元成分１を指す。ＭＡＲＣ１は、分子の還元を触媒するタンパク質である。「ＭＡＲＣ１」はまた、タンパク質をコードする遺伝子を指し得る。
本明細書で使用される「不安定なリンカー」は、切断され得る（例えば、酸性ｐＨによって）リンカーを指す。「安定リンカー」とは、切断できないリンカーを指す。
本明細書で使用される「肝臓炎症」または「肝炎」とは、特に肝毒性物質への曝露によって引き起こされ得る損傷または感染の結果として、肝臓の腫大、機能不全、および／または疼痛を伴う身体的状態を指す。症状には、黄疸（皮膚または眼の黄変）、疲労、衰弱、吐き気、嘔吐、食欲減退、および体重減少が含まれ得る。肝臓炎症は、未治療のまま放置すると、線維症、肝硬変、肝不全、または肝癌に進行し得る。
本明細書で使用される「肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」、「肝線維症（Ｌｉｖｅｒ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」、または「肝臓の線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ）」とは、炎症および肝細胞死に起因するコラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶ）、ＦＢＮ、ウンズリン、エラスチン、ラミニン、ヒアルロナン、およびプロテオグリカンを含み得る細胞外マトリックスタンパク質の肝臓における過剰な蓄積を指す。肝線維症は、未治療のまま放置すると、肝硬変、肝不全、または肝癌に進行し得る。
本明細書で使用される「ループ」は、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、細胞内のリン酸緩衝液中）で、不対領域に隣接する２つの逆平行領域がハイブリダイズして二本鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成するように、互いに十分に相補的である核酸の２つの逆平行領域に隣接する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の不対領域を指す。
本明細書で使用される「修飾ヌクレオチド間結合」は、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合と比較した場合に、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しない結合である。典型的には、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチド間結合は、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低減などを改善し得る。
本明細書で使用される「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、およびチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較した場合に、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、および／またはリン酸基に１つ以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドとコンジュゲートされた１つ以上の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低減などを改善し得る。
本明細書で使用される「ニックの入ったテトラループ構造」は、センス鎖がアンチセンス鎖と相補的な領域を有し、鎖の少なくとも１つ、一般にはセンス鎖が、少なくとも１つの鎖内に形成された隣接するステム領域を安定化するように構成されたテトラループを有する、別個のセンス（パッセンジャー）およびアンチセンス（ガイド）鎖によって特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造を指す。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、短い核酸（例えば、約１００個未満のヌクレオチドの長さ）を指す。オリゴヌクレオチドは、一本鎖（ｓｓ）またはｄｓであり得る。オリゴヌクレオチドは、二本鎖領域を有していても有していなくてもよい。一連の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、またはｓｓ ｓｉＲＮＡであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される「オーバーハング」は、一方の鎖または領域が二本鎖を形成する相補鎖の末端を越えて延びる一方の鎖または領域から生じる末端非塩基対形成ヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端で二本鎖領域から延びる１つ以上の不対ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、オーバーハングは、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’－または５’－オーバーハングである。
本明細書で使用される「リン酸類似体」は、リン酸基の静電特性および／または立体特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、生物系におけるリン酸基の静電特性および／または立体特性を模倣する。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、酵素除去を受けやすいことが多い５’－リン酸の代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態では、５’リン酸類似体は、ホスファターゼ耐性結合を含む。リン酸類似体の例には、５’メチレンホスホネート（５’－ＭＰ）および５’－（Ｅ）－ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）などの５’ホスホネートが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’炭素位置にリン酸類似体（「４’リン酸類似体」と呼ばれる）を５’末端ヌクレオチドに有する。４’－リン酸類似体の例は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）またはその類似体と結合しているオキシメチルホスホネートである。例えば、米国特許公開２０１９－０１７７７２９を参照されたい。オリゴヌクレオチドの５’末端に対して他の修飾が開発されている（例えば、国際特許出願第２０１１／１３３８７１号、米国特許第８，９２７，５１３号、およびＰｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．４３：２９９３－３０１１を参照されたい）。
本明細書で使用される遺伝子（例えば、ＭＡＲＣ１）の「低減された発現」とは、適切な参照（例えば、参照細胞、参照細胞集団、参照試料、または参照対象）と比較した場合の、ＲＮＡ転写物（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ）もしくは遺伝子によってコードされるタンパク質の量またはレベルの減少、および／または細胞、細胞集団、試料、もしくは対象における遺伝子の活性の量またはレベルの減少を指す。例えば、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド）と細胞を接触させる行為は、オリゴヌクレオチドで治療されていない細胞と比較した場合、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ、タンパク質、および／もしくは活性の量またはレベルの減少をもたらし得る（例えば、ＲＮＡｉ経路によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの分解を介して）。同様に、本明細書で使用される「発現を低減する」とは、遺伝子（例えば、ＭＡＲＣ１）の発現の低減をもたらす作用を指す。
本明細書で使用される「ＭＡＲＣ１発現の低減」とは、適切な参照（例えば、参照細胞、参照細胞集団、参照試料、または参照対象）と比較した場合の、細胞、細胞集団、試料、もしくは対象におけるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ、ＭＡＲＣ１タンパク質、および／またはＭＡＲＣ１活性の量またはレベルの減少を指す。
本明細書で使用される「相補性の領域」は、ヌクレオチドの逆平行配列と十分に相補的であり、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、リン酸緩衝液中、細胞中など）でヌクレオチドの２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にする核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）のヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を有する標的化配列を含む。
本明細書で使用される「リボヌクレオチド」は、その２’位にヒドロキシル基を含む、そのペントース糖としてリボースを有するヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドは、リボース、リン酸基、もしくは塩基中またはそれらの修飾あるいは置換を含む、２’位以外の原子の１つ以上の修飾または置換を有するリボヌクレオチドである。
本明細書で使用される「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）およびアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖またはアンチセンス鎖の一部分が、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ）の切断においてＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼを使用する、二本鎖オリゴヌクレオチド、または（ｂ）単一のアンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖（またはそのアンチセンス鎖の一部分）が、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ）の切断においてＡｇｏ２エンドヌクレアーゼを使用する、一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
本明細書で使用される「鎖」は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合）を介して一緒に結合されたヌクレオチドの単一の連続する配列を指す。いくつかの実施形態では、鎖は、２つの自由末端（例えば、５’末端および３’末端）を有する。
本明細書で使用される場合、「対象」は、マウス、ウサギ、およびヒトを含む、任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒトまたはＮＨＰである。さらに、「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に使用され得る。
本明細書で使用される「合成」は、人工的に合成される（例えば、機械（例えば、固体核酸合成器）を使用する）か、もしくは通常の分子を産生する天然源（例えば、細胞または生物）に由来しない核酸または他の分子を指す。
本明細書で使用される「標的化リガンド」は、目的の組織または細胞の同族分子（例えば、受容体）と選択的に結合し、目的の組織または細胞と他の物質を標的化する目的で別の物質とコンジュゲート可能である分子（例えば、カーボハイドレート、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質）を指す。例えば、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、目的の特定の組織または細胞にオリゴヌクレオチドを標的化する目的で、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞表面受容体と選択的に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた場合、細胞の表面上に発現された受容体との選択的な結合、ならびにオリゴヌクレオチド、標的化リガンド、および受容体を含む複合体の細胞によるエンドソーム内在化を通じて、特定の細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドが細胞の標的化リガンドから放出されるように、細胞内部移行後または細胞内在化中に切断されるリンカーを介して、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含み、肝臓およびヒト肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）を標的とする。
本明細書で使用される場合、「テトラループ」は、ヌクレオチドの隣接する配列のハイブリダイゼーションによって形成される隣接する二本鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、ランダムに選択されたヌクレオチド配列から成る同等の長さのループのセットから、平均して、予想される隣接するステム二本鎖のＴｍよりも高い、隣接するステム二本鎖の融解温度（Ｔｍ）の増加として検出可能である。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対（ｂｐ）の長さの二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４中で少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７５℃のＴｍを付与することができる。いくつかの実施形態では、テトラループは、少なくとも２塩基対（ｂｐ）の長さの二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４中で少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７５℃のＴｍを付与することができる。いくつかの実施形態では、テトラループは、相互作用をスタッキングすることによって、隣接するステム二本鎖のｂｐを安定化することができる。さらに、テトラループ中のヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン・クリック塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用が含まれるが、これらに限定されない（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６：６８０－８２、Ｈｅｕｓ ＆ Ｐａｒｄｉ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１９１－９４）。いくつかの実施形態では、テトラループは、３～６個のヌクレオチドを含むかまたはそれらから成り、典型的には４～５個のヌクレオチドである。特定の実施形態では、テトラループは、修飾されていてもされていなくてもよい（例えば、標的化部分とコンジュゲートされていてもいなくてもよい）３、４、５、または６個のヌクレオチドを含むか、またはそれらから成る。一実施形態では、テトラループは、４個のヌクレオチドから成る。任意のヌクレオチドがテトラループに使用され得、このようなヌクレオチドの標準的なＩＵＰＡＣ－ＩＵＢシンボルは、Ｃｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３０２１－３０に記載されるように使用することができる。例えば、文字「Ｎ」は、任意の塩基がその位置にあり得ることを意味するために使用され得、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）またはＧ（グアニン）がその位置にあり得ることを示すために使用され得、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、またはＴ（チミン）がその位置にあり得ることを示すために使用され得る。テトラループの例には、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、ＣＵＵＧテトラループが含まれる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８４６７－７１、Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５９０１－０５）。ＤＮＡテトラループの例には、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、テトラループのｄ（ＧＴＴＡ）、ｄ（ＧＮＲＡ））ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、およびテトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が含まれる。例えば、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：１４２８１－９２、Ｓｈｉｎｊｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｇａｋｋａｉ Ｋｏｅｎ Ｙｏｋｏｓｈｕ ７８：７３１を参照されたい。いくつかの実施形態では、テトラループは、ニックの入ったテトラループ構造内に含まれる。
本明細書で使用される「治療する」または「治療すること」とは、既存の状態（例えば、疾患、障害）に関して対象の健康および／もしくは福利を改善するため、または状態の発生の可能性を予防もしくは減少させる目的で、例えば、対象に治療剤（例えば、本明細書のオリゴヌクレオチド）を投与することによって、それを必要とする対象にケアを提供する行為を指す。いくつかの実施形態では、治療は、対象が経験する状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、もしくは寄与因子の頻度または重症度を低減することを伴う。
本発明は、以下の実施例に示される特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、均等物を代用できることを当業者は理解すべきである。さらに、以下の実施例は、例示として提供され、本発明の範囲をいかなる方法でも制限することを意図するものではない。加えて、状況、材料、物質組成、プロセス、プロセス工程、または複数の工程に、本発明の目的、趣旨、および範囲に適合させるために、修正を加えることができる。こうしたすべての修飾は、本発明の範囲内であることが意図される。当技術分野で周知の標準的な技術、または以下に具体的に記載する技術を利用した。
実施例１：二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドの合成および精製
前述の実施例に記載の二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）オリゴヌクレオチドを、本明細書に記載の方法を使用して化学的に合成した。概して、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１９～２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡについて記載された固相オリゴヌクレオチド合成法を使用し（例えば、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３－５４４１、およびＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５－７８４５を参照されたく、さらに、米国特許第５，８０４，６８３号、同第５，８３１，０７１号、同５，９９８，２０３号、同第６，００８，４００号、同第６，１１１，０８６号、同第６，１１７，６５７号、同第６，３５３，０９８号、同第６，３６２，３２３号、同第６，４３７，１１７号、および同第６，４６９，１５８号も参照されたい）、加えて既知のホスホルアミダイト合成を使用して（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（２０１７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．９（１）：ａ０２３８１２；Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖ： Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ－Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８１）；２２：１８５９－１８６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０－４０３９（０１）９０４６１－７を参照されたい）合成した。１９ｍｅｒのコア配列を有するｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２５ｍｅｒのセンス鎖および２７ｍｅｒのアンチセンス鎖を有する構築物に構成され、ＲＮＡｉ機構によるプロセシングを可能にした。１９ｍｅｒのコア配列は、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの領域と相補的である。
個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣを標準的な方法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に従って精製した。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、固相ホスホラミダイト化学を使用して合成し、標準的な技術を使用してＮＡＰ－５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で脱保護および脱塩した（Ｄａｍｈａ ＆ Ｏｌｇｉｖｉｅ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：８１－１１４、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７－２６８４）。オリゴマーを、１５分間のステップ直線勾配を使用して、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＨＰＬＣ）を使用して精製した。勾配は、９０：１０緩衝液Ａ：Ｂから５２：４８緩衝液Ａ：Ｂまで変化し、緩衝液Ａは１００ｍＭトリスｐＨ８．５であり、緩衝液Ｂは１００ｍＭトリスｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌである。試料を２６０ｎｍでモニターし、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを収集し、プールして、ＮＡＰ－５カラムで脱塩し、凍結乾燥した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、凍結乾燥された、またはヌクレアーゼを含まない水中に－８０℃で保存した。
各オリゴマーの純度を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＡＣＥ ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。ＣＥキャピラリーの内径は１００μｍであり、ｓｓＤＮＡ １００Ｒ Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有する。典型的には、約０．６ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場で実行し、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出した。変性トリス－ボレート－７Ｍ－尿素ランニング緩衝液を、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。以下に記載する実験で使用するためのＣＥによって評価されるように、少なくとも９０％純粋であるオリゴリボヌクレオチドを得た。製造元の推奨プロトコルに従って、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ（商標）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ ＷｏｒｋＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析により、化合物同一性を確認した。すべてのオリゴマーの相対分子量を、多くの場合、予想される分子量の０．２％以内で取得した。
二本鎖の調製
一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５から成る二本鎖緩衝液中に再懸濁した（例えば、１００μＭ濃度で）。相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合して、例えば、５０μＭの二本鎖の最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ））中で５分間１００℃に加熱し、使用前に室温まで冷却させた。ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを、－２０℃で保存した。
実施例２：ＭＡＲＣ１標的化二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの生成
ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列の特定
ＭＡＲＣ１は、Ｎ－酸素化分子の触媒に関与する酵素である。ＭＡＲＣ１発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害剤を生成するために、コンピュータ系アルゴリズムを使用して、ＲＮＡｉ経路によるＭＡＲＣ１発現の阻害をアッセイするのに好適なＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列をコンピュータで特定した。アルゴリズムは、各々がヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの好適なＭＡＲＣ１標的配列（例えば、配列番号１６９２；表１）と相補性の領域を有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドガイド（アンチセンス）鎖配列を提供した。アルゴリズムによって特定したガイド鎖配列のいくつかは、サルのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの対応するＭＡＲＣ１標的配列（配列番号１６９３、表１）とも相補的であった。ヌクレオチド配列類似性を有する相同ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むＭＡＲＣ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、相同ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的とする能力を有すると予測される。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ＤｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしてフォーマットされた）を、インビトロでの評価のために実施例１に記載したように生成した。各ＤｓｉＲＮＡを同じ修飾パターンで生成し、各々が配列番号１～３８４によって識別されるＭＡＲＣ１標的配列と相補性の領域を有する固有のガイド鎖を備えていた。センスおよびアンチセンスＤｓｉＲＮＡについての修飾には、以下が含まれた（Ｘ＝任意のヌクレオチド、ｍ＝２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、ｒ＝リボシル修飾ヌクレオチド）：
センス鎖：
ｒＸｍＸｒＸｍＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｍＸｒＸｍＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸＸＸ
アンチセンス鎖：
ｍＸｍＸｍＸｍＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｍＸｒＸｍＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｍＸｒＸｍＸｍＸｍＸ
インビトロ細胞系アッセイ
表２の修飾ＤｓｉＲＮＡの各々がＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを低減させる能力を、インビトロ細胞系アッセイを使用して測定した。簡潔に述べると、内因性ヒトＭＡＲＣ１遺伝子を発現するヒト肝細胞（Ｈｕｈ７）に、マルチウェル細胞培養プレートの別々のウェルに１ｎＭで、表２に列挙したＤｓｉＲＮＡの各々をトランスフェクトした。細胞を、修飾ＤｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後２４時間維持し、次いで、トランスフェクトした細胞からの残存するＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）系ｑＰＣＲ アッセイを使用して決定した。２つのｑＰＣＲアッセイ、３’アッセイ（フォワード－（配列番号１６８４）、リバース－（配列番号１６８５）、プローブ－／５６－ＦＡＭ／ＡＡＡＧＧ ＴＧＣ Ｔ／Ｚｅｎ／ＣＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＴ／３ＩＡＢｋＦＱ（配列番号１６９４））、および５’アッセイ（フォワード－（配列番号１６８６）、リバース－（配列番号１６８７）、プローブ－／５６－ＦＡＭ／ＴＣＡＡＡＡＣＧＣ／ＺＥＮ／ＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡ／３ＩＡＢｋＦＱ（配列番号１６９５））を使用して、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）とコンジュゲートし、ＨＰＲＴハウスキーピング遺伝子に対して正規化されるＰＣＲプローブ（フォワード－（配列番号１６８８）、リバース－（配列番号：１６８９）、プローブ－５ＨＥＸ／ＡＴＧＧＴＣＡＡＧ／ＺＥＮ／ ＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴ／３１ＡＢｋＦＱ／－３’（配列番号１６９６）を使用して測定されるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡレベルを決定した。表２および図１に示すように、各プライマー対を残存するＲＮＡ％についてアッセイした。偽トランスフェクト細胞と比較して、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞に残存する１０％以下のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡをもたらすＤｓｉＲＮＡを、ＤｓｉＲＮＡが「ヒット」したとみなした。ＭＡＲＣ１発現を阻害する表２に列挙したＤｓｉＲＮＡの能力を評価するＨｕｈ７細胞系アッセイにより、いくつかの候補ＤｓｉＲＮＡを特定した。
まとめると、これらの結果は、ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的とするように設計したＤｓｉＲＮＡが、対照細胞と比較してＤｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞中のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量の低減によって決定される細胞におけるＭＡＲＣ１発現を阻害することを示す。これらの結果は、ＤｓｉＲＮＡを含むヌクレオチド配列が、ＭＡＲＣ１発現を阻害するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生成するのに有用であることを示す。さらに、これらの結果は、複数のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列が、ＭＡＲＣ１発現のＲＮＡｉ媒介性阻害に好適であることを示す。
実施例３：インビボでのＭＡＲＣ１のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害
実施例２のインビトロスクリーニングアッセイは、ＭＡＲＣ１標的化オリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡをノックダウンする能力を検証した。インビボでＭＡＲＣ１をノックダウンするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの能力を確認するために、ＨＤＩマウスモデルを使用した。実施例２で特定したＤｓｉＲＮＡのサブセットを使用して、３６ｍｅｒパッセンジャー鎖および２２ｍｅｒガイド鎖を有するニックの入ったテトラループＧａｌＮＡｃコンジュゲート構造（本明細書では「ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド」または「ＧａｌＮＡｃ－ＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）を含む対応する二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生成した（表４）。さらに、パッセンジャー鎖およびガイド鎖を含むヌクレオチド配列は、修飾ヌクレオチドおよびホスホロチオエート結合の異なるパターンを有する（センス鎖配列番号１６０９～１６４２；アンチセンス配列番号１６４５～１６７８）。テトラループを含むヌクレオチドのうちの３個は、各々、ＧａｌＮＡｃ部分（ＣＡＳ＃１４１３１－６０－３）とコンジュゲートされた。各鎖の修飾パターンを以下に示し、センス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズする：
センス鎖：５’－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ［－ｍＸ－］１６－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－３’
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］－Ｓ－ｆＸ－Ｓ－ｆＸ－Ｓ－ｆＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－３’
または以下のように表され、センス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズする：
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
表４のオリゴヌクレオチドを、マウス肝臓の肝細胞においてヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを一過性に発現するように操作されたマウスで評価した。簡潔に述べると、６～８週齢のメスのＣＤ－１マウス（ｎ＝４～５）に、ＰＢＳ中で製剤化された２ｍｇ／ｋｇの用量で、示されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドを皮下投与した。マウスの対照群（ｎ＝５）は、ＰＢＳのみを投与した。３日後（７２時間）、ユビキタスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列の制御下で、完全なヒトＭＡＲＣ１遺伝子（配列番号１６８２）をコードするＤＮＡプラスミド（２５μｇ）をマウスにＨＤＩした。ＤＮＡプラスミド導入の１日後、ＨＤＩマウスからの肝臓試料を採取した。これらのＨＤＩマウス由来の全ＲＮＡを、実施例２に記載のように、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析に供し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ｍＲＮＡレベルは、ヒトｍＲＮＡについて測定した。値は、ＤＮＡプラスミドに含まれるＮｅｏＲ遺伝子を使用して、トランスフェクション効率について正規化した。
図２の結果は、ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的とするように設計されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドが、ＰＢＳのみで処理した対照ＨＤＩマウスと比較して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドで処理したＨＤＩマウスからの肝臓試料におけるヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ発現の量の低減によって決定されるように、ＨＤＩ マウスにおけるヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ発現を阻害したことを示す。
図２で試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドのサブセットを、表４から選択したオリゴヌクレオチドを使用して、図３に示す反復アッセイでさらに検証した。アッセイは、各ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドのノックダウン効率を検証し、さらなる分析のために４個のオリゴヌクレオチドを選択した。
具体的には、４個のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド（ＭＡＲＣ１－０７３６、ＭＡＲＣ１－９６５，ＭＡＲＣ１－１９８３、およびＭＡＲＣ１－２０１６）を使用して、投与試験を実施した。マウスは、上述のようにＨＤＩであり、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドで処置した。１日後に肝臓を採取し、ＭＡＲＣ１の発現を測定して有効量を決定した（図４）。すべてのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドは、１ｍｇ／ｋｇの用量でＭＡＲＣ１の発現を低減させることができた。全体的に、ＨＤＩ研究では、肝臓におけるＭＡＲＣ１発現を阻害するための、いくつかの有望なＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドが特定された。
実施例４：ＤＩＯ－ＮＡＳＨ疾患モデルにおけるＭＡＲＣ１のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドのＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨなどの肝臓疾患に対する治療効果を調査するために、食事誘導性肥満（ＤＩＯ）－ＮＡＳＨモデルを使用した（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２０１６．ＷＪＨ．８（１６）：６７３－６８４）。このモデルは、ＮＡＳＨと同様の組織病理学的評価項目および臨床評価項目を示し、脂肪、フルクトース、およびコレステロールの高い食事を介して開始した。ノックダウンの異なるレベルを伴う２匹のマウス特異的代替ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド（表５Ｂ）を、このＮＡＳＨのマウスモデルで試験した。マウスには、除脂肪固形飼料食（１１％脂肪、２４％タンパク質、および６５％カーボハイドレート；Ａｌｔｒｏｍｉｎ １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、または４０％脂肪、２２％フルクトース、および２％コレステロールから成るＮＡＳＨ食（Ｄ０９１００３１０、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を３６週にわたって与えた（ＤＩＯ－ＮＡＳＨ）。オリゴヌクレオチドおよびＧＬＰ－１受容体アゴニストを用いた処置の前に、マウスをＣｏｌ１ａ１、すなわちコラーゲンのレベル（データは示さず）によって決定されるそれらの線維症状態によって、固形飼料対照、ＰＢＳ対照、ＧＬＰ－１「２２」、ＭＡＲＣ１－１１１３（配列番号１６４３および１６７９）、およびＭＡＲＣ１－１５７５（配列番号１６４４および１６８０）処置群に無作為化した。毎週の同時皮下投与を３６週目に開始し、マウスを、３ｍｇ／ｋｇのＭＡＲＣ１－１１１３、３ｍｇ／ｋｇのＭＡＲＣ１－１５７５、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ－１「２２」、またはＰＢＳ対照（「ＤＩＯ－ＮＡＳＨビヒクル」）で８週処理した。ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（ＧＬＰ－１「２２」）は長時間作用型のＧＬＰ－１受容体アゴニストであり、これらの研究のベンチマークとして使用した。注射は、研究開始後０、７、１４、２１、２８、３５、４２、および４９日目に行われた（すなわち、ＤＩＯ－ＮＡＳＨまたは除脂肪固形飼料食の３６週目）。ＤＩＯ－ＮＡＳＨビヒクル対照、ＭＡＲＣ１－１１１３、およびＭＡＲＣ１－１５７５マウスは、研究期間を通じて同様のペースでそれらの相対体重を増加させた（表５Ａ）。予想どおり、除脂肪固形飼料食は体重増加の速度が遅いことを示し、一方でＧＬＰ－１「２２」対照は、研究開始時に相対的な体重の減少を示した。
表５Ａは、マウスＭＡＲＣ１を標的化するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチド、または食事誘導性肥満（ＤＩＯ）－ＮＡＳＨモデルにおける疾患後退の陽性対照として使用される長時間作用型ＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１「２２」）による処置を通したマウスの体重を提供する。体重は、開始の体重と比較したものである。マウスに、ＤＩＯ－ＮＡＳＨ（ＡＭＬＮ食）または除脂肪固形飼料食を与えた。
投与８週目後、血漿を採取し、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、トリグリセリド（ＴＧ）、および総コレステロール（ＴＣ）について分析した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＴＣレベルを低減するＧＬＰ－１「２２」対照によって測定されるように、モデルは期待どおりに機能した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドによるＤＩＯ－ＮＡＳＨマウスの処置は、ＰＢＳ処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨマウスと比較して、血漿ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、またはＴＣレベルを変化させなかった（データは示さず）。肝臓組織を、８週目に採取し、計量し、分析のために処理した。予想どおり、ＧＬＰ－１「２２」で処理した除脂肪固形試料食マウスおよびＤＩＯ－ＮＡＳＨマウスの両方で、研究終了時にＮＡＳＨビヒクル群と比較して肝臓重量が低かった。しかしながら、ビヒクル対照またはＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドで処理したＤＩＯ－ＮＡＳＨマウスでは、肝臓重量に差異は観察されなかった（データは示さず）。肝臓では、ＴＧレベルは、ＤＩＯ－ＮＡＳＨ媒体対照と比較して、ＭＡＲＣ１－１１１３およびＭＡＲＣ１－１５７５処理マウスの両方で低減した（図５および６）。さらに、ＮＡＦＬＤ活性を測定した。ＮＡＦＬＤ活性スコアを、ＮＡＦＬＤの処理と同時に疾患の特徴の変化を測定するために使用し、肝臓試料を染色し、Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．４１：１３１３－１３２１）で概説されている臨床基準を使用してスコアを決定することによって測定した。ＭＡＲＣ１－１１１３オリゴヌクレオチドは、ＤＩＯ－ＮＡＳＨモデルにおいて改善されたＮＡＦＬＤスコアを示した（図７）。同様に、ＭＡＲＣ１－１１１３オリゴヌクレオチドでの処理は、Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．に記載される組織病理学的分析によって決定されるように、動物における脂肪肝（脂肪滴を有する肝細胞のパーセンテージとして計算）を低減させたが（図８）、風船様肝細胞または小葉の炎症の低減は観察されなかった（データは示さず）。低減された脂肪肝画分（すなわち、組織学試料における脂肪肝の領域画分で測定）および脂肪滴を含む肝細胞が、Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．に記載される方法を使用した組織病理学的分析の定量化によって決定されるように、ＭＡＲＣ１－１１１３処理マウスにおいて観察された（図９Ａおよび９Ｂ）。治療群間で炎症細胞、炎症病巣、ＣＤ４５、ＣＤｌｌｂ、線維症、門脈周囲線維症、類洞線維症、またはＣｏｌ１ａの数に差異が観察されなかったため、炎症および線維症は治療によって変化しないと考えられる（データは示さず）。しかしながら、肝線維症の初期指標である星状細胞活性化マーカーα－ＳＭＡは、ＭＡＲＣ１－１１１３処理によって低減され、全体的な線維症の低減は観察されなかったが、ＭＡＲＣ１－１１１３による処理は線維症の発症を低減させることを示した（図１０）。最後に、ＭＡＲＣ１発現、脂肪肝、コレステロール代謝、線維症、ホスファチジルコリン、および潜在的バイオマーカーと関連する遺伝子のパネルでｑＰＣＲを実施した（表５Ｂ）。低減された発現が、ＭＡＲＣ１－１１１３処理後、いくつかの脂肪肝関連遺伝子：Ｆａｓｎ、ＡｃａｃＡ、ＡｃａｃＢ、およびＡｐｏＢで観察された。加えて、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆｂ、Ｔｉｍｐ１、Ｍｍｐ９、Ｍｍｐ２、およびＦａｂｐ１を含む、線維症のいくつかの初期調節因子および潜在的なバイオマーカー遺伝子の低減も、ＭＡＲＣ１－１１１３治療後に低減した。これらの所見は、ＭＡＲＣ１阻害が脂肪肝および線維症の発症を調節する遺伝子を低減させることを示す。
結論として、ＤＩＯ－ＮＡＳＨ研究は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１ オリゴヌクレオチドを使用した肝臓ＭＡＲＣ１阻害の治療効果を示す。
実施例５ ＮＨＰにおけるＭＡＲＣ１発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害および研究
ＨＤＩマウス研究で特定した有効なＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドを、ＮＨＰにおける標的化効率についてアッセイした。具体的には、表６に列挙したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドを、非天然カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で評価した。この研究では、サルを、それらの平均体重（約２．５ｋｇ）が対照群と実験群との間で同等になるように群化した。各コホートは、すべてオス対象を含んだ。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドを、研究の０、２８、５４、および８６日目に１ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量で皮下投与した。図１１の研究スキームに示されるように、血液試料を、投与の２週前（－１４日）、投与日（１日目）、および投与後１５、２９、５７、および１１３日目に採取した。超音波誘導コア針肝臓生検を、研究－１３、２７、５５、および１１１日目に採取した。各時点で、肝臓生検試料に由来する全ＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲ分析に供し、同等の量のＰＢＳで処理したサルと比較して、オリゴヌクレオチドで処理したサルのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを測定した。データを正規化するために、参照遺伝子であるＰＰＩＢに対して測定を行った。ＩＤＴから購入した以下のＳＹＢＲアッセイを使用して、ＭＡＲＣ１遺伝子発現を評価した：フォワード－配列番号１６９０、リバース－配列番号１６９１。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した以下のＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲプローブを使用して、ＰＰＩＢ遺伝子発現を評価した：Ｒｈ０２８０２９８４＿ｍ１。表６に列挙したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドでＮＨＰを処理すると、ＰＢＳで処理したＮＨＰと比較して、オリゴヌクレオチド処理したＮＨＰからの肝臓試料中のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量の低減によって決定したように、肝臓におけるＭＡＲＣ１発現を阻害した（表７）。
表７は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドで処理した後に残存するＮＨＰ ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡのパーセント（％）を提供する。ＮＨＰは、図１１に示される投与スキームに従って、１ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇで示されたオリゴヌクレオチドの４つの用量で処理された。肝臓に残存するｍＲＮＡのパーセント（％）を、示された日（０、２８、５６、および１１２）に採取した肝臓で決定した。処置群間で体重に差異は観察されなかった。
ホスファチジルコリン代謝と関連する遺伝子発現（ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＭＴＴＰ、ＡＰＯＢ、ＣＨＫＡ、ＣＨＫＢ、ＰＣＹＴ１Ａ、ＣＥＰＴ１、ＰＥＭＴ、ＰＣＹＴ２、ＥＴＮＫ、ＦＭＯ３、ＡＣＣ２、ＦＡＳＮ、ＦＡＢＰ）を、２７、５５、および１１１日目に測定し、ＰＢＳとＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドで処理したＮＨＰとの間に変化は示されなかった（データは示さず）。循環脂質を１４、２９、５７、および１１３日目に測定し、ＴＧ、コレステロール、ＬＤＬｃ、ＨＤＬｃ、またはＡｐｏＢ１００において、ＰＢＳとＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドで処理したＮＨＰとの間で差異は観察されなかった（データは示さず）。同様に、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、またはガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）を含む肝臓酵素にも差異は観察されなかった（データは示さず）。
まとめると、これらの結果は、ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを標的とするように設計されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＭＡＲＣ１オリゴヌクレオチドが、肝臓におけるインビボでのＭＡＲＣ１発現を阻害することを示す（肝臓のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量の低減によって決定される）。
実施例６－インビトロでの脂質蓄積に対するＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを低減する効果
ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの低減を通した脂質蓄積に対する効果を、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を使用してインビトロで評価した。
簡潔に述べると、内因性ヒトＭＡＲＣ１遺伝子を発現するＰＨＨを、長期維持培地を使用して２７日間培養した（Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６４，３９９－４０２，２０１９）。合計で７個のＰＨＨドナーを、２５個の個々の実験にわたって使用した。
７日目に、３０ｎＭのＤｈａｒｍａｃｏｎオンターゲットプラスヒトＭＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１９３５８－０２－００１０）または非標的化ｓｉＲＮＡ（Ｄ－００１８１０－１０－２０）を用いてＰＨＨにトランスフェクトした。２４日目に、オレイン酸、リノール酸、アルファリノール酸、およびパルミチン酸から成る０または８００μＭのＢＳＡコンジュゲート遊離脂肪酸（ＦＦＡ）混合物で細胞を処理した。２７日目に、細胞をｍＲＮＡのために採取するか、４％ホルムアルデヒドで固定した。
ＭＡＲＣ１（ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現アッセイ＃４３３１１８２、Ｈｓ００２２４２２７＿ｍ１）およびハウスキーピング遺伝子ＴＢＰ（Ｈｓ００４２７６２０＿ｍ１）の発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した。ＭＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡは、非標的化ｓｉＲＮＡと比較して、０および８００μＭのＦＦＡ処理後にそれぞれ、平均１８％および１４％のＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの残存を伴って、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡを低減させた（表８）。
固定細胞を、ナイルレッドを使用して染色し、脂質蓄積を定量した（Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｎ ３９，８１９－８２４，２００８）。ナイルレッド比は、中性脂質蛍光（５４０～１５ｎｍ／６００～２０ｎｍ）をリン脂質蛍光（５４０～１５ｎｍ／６４０～２０ｎｍ）で割ったものとして計算さした。実験全体にわたってデータを正規化するために、非標的化ｓｉＲＮＡ値を、以下の式を使用して、０μＭのＦＦＡに対して０％、および８００μＭのＦＦＡ処理に対して１００％に設定した：脂質蓄積の％＝（（ナイルレッド比ｘ－ナイルレッド比非標的化０μＭのＦＦＡ）／（ナイルレッド比非標的化８００μＭのＦＦＡ－ナイルレッド比非標的化０μＭのＦＦＡ））×１００。
表８では、脂質蓄積およびＭＡＲＣ１ ＲＮＡは、ＭＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションおよび０または８００μＭのＦＦＡのいずれかを用いた処理後の、２５個の独立した実験にわたって、７個のＰＨＨドナーに残存する％を示した。０μＭでの非標的化対照値を０％に設定し、８００μＭでは１００％に設定した。二元配置ＡＮＯＶＡ分析は、有意な脂肪およびｓｉＲＮＡの主作用を示した。＊＊ｐ＜０．０１は、Ｓｉｄａｋの多重比較検定による脂肪処理内の非標的化ｓｉＲＮＡとの比較である。ｎ／ａは、ＲＮＡの単離が失敗したため、値を取得できない。
ＭＡＲＣ１ ｓｉＲＮＡは、非標的化ｓｉＲＮＡと比較して、脂質蓄積を０および８００μＭのＦＦＡでそれぞれ２７％および３５％有意に（ｐ＜０．０１）低減させた（表８）。ＭＡＲＣ１のノックダウンは、培養ＰＨＨにおける基底およびＦＦＡ誘導脂質蓄積の両方を有意に低下させると結論付けられた。
実施形態のリスト
１．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２．センス鎖が、１５～５０個のヌクレオチドの長さである、実施形態１に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３．センス鎖が、１８～３６個のヌクレオチドの長さである、実施形態１または２に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４．アンチセンス鎖が、１５～３０個のヌクレオチドの長さである、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５．アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さ、任意選択で、少なくとも２０個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を形成する、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６．相補性の領域が、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さ、任意選択で、少なくとも２０個のヌクレオチドの長さである、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７．センス鎖の３’末端が、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、実施形態１～６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
９．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖および１５～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１０．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、１９個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１１．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、１８～３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、１９個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１２．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、１８～３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖および２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１３．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、１８～３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖、および２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、センス鎖の３’末端が、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１４．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖、および２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、センス鎖の３’末端が、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１５．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖、および２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さ、任意選択で、２０個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を形成し、センス鎖の３’末端が、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１６．ＭＡＲＣ１発現を低減するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号３８５～７６８から選択される、アンチセンス鎖と、
（ｉｉ）アンチセンス鎖と相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称性二本鎖領域を形成する、別個の鎖である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１７．センス鎖の３’末端が、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、実施形態１６に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１８．Ｌが、トリループまたはテトラループである、実施形態７および１３～１７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
１９．Ｌが、テトラループである、実施形態１８に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２０．テトラループが、配列５’－ＧＡＡＡ－３’を含む、実施形態１９に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２１．Ｓ１およびＳ２が、１～１０個のヌクレオチドの長さであり、同じ長さを有する、実施形態１８～２０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２２．Ｓ１およびＳ２が、１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド、または１０個のヌクレオチドの長さである、実施形態２１に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２３．Ｓ１およびＳ２が、６個のヌクレオチドの長さである、実施形態２２に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２４．ステム－ループが、配列５’－ＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ－３’（配列番号１６８１）を含む、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２５．ニックの入ったテトラループ構造を含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２６．センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端との間にニックを含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２７．アンチセンス鎖およびセンス鎖が、共有結合していない、実施形態１～２６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２８．アンチセンス鎖が、３’末端に１個以上のヌクレオチドの長さのオーバーハング配列を含む、実施形態１～１５および１７～２７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
２９．オーバーハングが、プリンヌクレオチドを含む、実施形態１６～２８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３０．３’オーバーハング配列が、２個のヌクレオチドの長さである、実施形態２９に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３１．３’オーバーハングが、ＡＡ、ＧＧ、ＡＧ、およびＧＡから選択される、実施形態３０に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３２．オーバーハングが、ＧＧまたはＡＡである、実施形態３１に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３３．オーバーハングが、ＧＧである、実施形態３１に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３４．オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３５．修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、実施形態３４に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３６．２’－修飾が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である、実施形態３５に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３７．オリゴヌクレオチドを構成するすべてのヌクレオチドが、修飾されており、任意選択で、修飾が、２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチルから選択される２’－修飾である、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３８．センス鎖のヌクレオチドの約１０～１５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％が、２’－フルオロ修飾を含む、実施形態３４～３７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
３９．アンチセンス鎖のヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が、２’－フルオロ修飾を含む、実施形態３４～３８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４０．オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が、２’－フルオロ修飾を含む、実施形態３４～３９のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４１．センス鎖が、５’から３’へ１位～３６位を有する３６個のヌクレオチドを含み、８位～１１位が、２’－フルオロ修飾を含む、実施形態３４～４０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４２．アンチセンス鎖が、５’から３’へ１位～２２位を有する２２個のヌクレオチドを含み、２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位が、２’－フルオロ修飾を含む、実施形態３４～４１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４３．残りのヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、実施形態３４～４２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４４．オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４５．少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、実施形態４４に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４６．アンチセンス鎖が、（ｉ）１位と２位との間、および２位と３位との間、または（ｉｉ）１位と２位との間、２位と３位との間、および３位と４位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置が、５’から３’へ１～４と付番される、実施形態４５に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４７．アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖が、２０位と２１位との間、および２１位と２２位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置が、５’から３’へ１～２２と付番される、実施形態４５または６４に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４８．アンチセンス鎖が、５’末端にリン酸化ヌクレオチドを含み、リン酸化ヌクレオチドが、ウリジンおよびアデノシンから選択される、実施形態１～４７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
４９．リン酸化ヌクレオチドが、ウリジンである、実施形態４８に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５０．アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素が、リン酸類似体を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５１．リン酸類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートであり、任意選択で、リン酸類似体が、５’－メトキシホスホネート－４’－オキシを含む４’－リン酸類似体である、実施形態５０に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５２．オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドが、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされる、先行する実施形態のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５３．各標的化リガンドが、カーボハイドレート、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質を含む、実施形態４２に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５４．ステムループが、ステムループの１個以上のヌクレオチドとコンジュゲートされる１個以上の標的化リガンドを含む、実施形態１７～５３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５５．１個以上の標的化リガンドが、ループの１個以上のヌクレオチドとコンジュゲートされる、実施形態５４に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５６．ループが、５’から３’へ１～４と付番された４個のヌクレオチドを含み、２位、３位、および４位のヌクレオチドが、各々、１個以上の標的化リガンドを含み、標的化リガンドが、同一であるか、または異なる、実施形態５５に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５７．各標的化リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、実施形態５２～５６のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５８．ＧａｌＮＡｃ部分が、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、または四価ＧａｌＮＡｃ部分である、実施形態５７に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
５９．ステム－ループのＬの最大４個のヌクレオチドが、各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる、実施形態１７～５８いずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６０．相補性の領域が、アンチセンス鎖のヌクレオチド２位～８位でＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と完全に相補的であり、ヌクレオチド位置が、５’から３’へ付番される、実施形態１～５９のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６１．相補性の領域が、アンチセンス鎖のヌクレオチド２位～１１位でＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と完全に相補的であり、ヌクレオチド位置が、５’から３’へ付番される、実施形態１～５９のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６２．センス鎖が、配列番号１５３７～１５７０のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６３．アンチセンス鎖が、配列番号１５７３～１６０６のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６２のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６４．センス鎖およびアンチセンス鎖が、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６５．センス鎖が、配列番号１５４３に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１５７９に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６６．センス鎖が、配列番号１５６０に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１５９６に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６７．センス鎖が、配列番号１５６８に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１６０４に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６８．センス鎖が、配列番号１５５３に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１５８９に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６４のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
６９．アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドの長さである、実施形態１～６１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７０．アンチセンス鎖が、配列番号１５７９、１５９６、１６０４、および１５８９から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態６９に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７１．センス鎖が、配列番号２３４、２９８、３５６、および３７６から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～６１および６９～７０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７２．センス鎖が、３６個のヌクレオチドの長さである、実施形態１～６１および６９～７１のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７３．センス鎖が、配列番号１５４３、１５６０、１５６８、および１５５３から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態７２に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７４．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、センス鎖およびアンチセンス鎖を構成するすべてのヌクレオチドが、修飾されており、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７５．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、センス鎖およびアンチセンス鎖を構成するすべてのヌクレオチドが、修飾されており、アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素が、リン酸類似体を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７６．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、センス鎖およびアンチセンス鎖を構成するすべてのヌクレオチドが、修飾されており、アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素が、リン酸類似体を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７７．ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、センス鎖およびアンチセンス鎖を構成するすべてのヌクレオチドが、修飾されており、アンチセンス鎖およびセンス鎖が、１個以上の２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、ならびに少なくとも１個のホスホロチオエート結合を含み、アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素が、リン酸類似体を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７８．センス鎖が、配列番号１６０９～１６４２のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～７７のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
７９．アンチセンス鎖が、配列番号１６４５～１６７８のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～７８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８０．センス鎖およびアンチセンス鎖が、
（ａ）それぞれ、配列番号１６０９および１６４５、
（ｂ）それぞれ、配列番号１６１０および１６４６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１６１１および１６４７、
（ｄ）それぞれ、配列番号１６１２および１６４８、
（ｅ）それぞれ、配列番号１６１３および１６４９、
（ｆ）それぞれ、配列番号１６１４および１６５０、
（ｇ）それぞれ、配列番号１６１５および１６５１、
（ｈ）それぞれ、配列番号１６１６および１６５２、
（ｉ）それぞれ、配列番号１６１７および１６５３、
（ｊ）それぞれ、配列番号１６１８および１６５４、
（ｋ）それぞれ、配列番号１６１９および１６５５、
（ｌ）それぞれ、配列番号１６２０および１６５６、
（ｍ）それぞれ、配列番号１６２１および１６５７、
（ｎ）それぞれ、配列番号１６２２および１６５８、
（ｏ）それぞれ、配列番号１６２３および１６５９、
（ｐ）それぞれ、配列番号１６２４および１６６０、
（ｑ）それぞれ、配列番号１６２５および１６６１、
（ｒ）それぞれ、配列番号１６２６および１６６２、
（ｓ）それぞれ、配列番号１６２７および１６６３、
（ｔ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６４、
（ｕ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６５、
（ｖ）それぞれ、配列番号１６３０および１６６６、
（ｗ）それぞれ、配列番号１６３１および１６６７、
（ｘ）それぞれ、配列番号１６３２および１６６８、
（ｙ）それぞれ、配列番号１６３３および１６６９、
（ｚ）それぞれ、配列番号１６３４および１６７０、
（ａａ）それぞれ、配列番号１６３５および１６７１、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１６３６および１６７２、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１６３７および１６７３、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１６３８および１６７４、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１６３９および１６７５、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１６４０および１６７６、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１６４１および１６７７、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１６４２および１６７８から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～７９のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８１．センス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号１６１５および１６５１に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～８０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８２．センス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号１６３２および１６６８に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～８０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８３．センス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号１６４０および１６７６に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～８０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８４．センス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号１６２５および１６６１に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１～８０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８５．ＭＡＲＣ１の発現を阻害するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ＲＮＡ転写物と相補性の領域を含み、センス鎖が、５’－ｍＧｓ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＧ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６１５）の配列およびすべての修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵｓ－ｆＡ－ｆＡ－ｍＣ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６５１）の配列およびすべての修飾を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
である、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８６．ＭＡＲＣ１の発現を阻害するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ＲＮＡ転写物と相補性の領域を含み、センス鎖が、５’－ｍＡｓ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＧ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６３２）の配列およびすべての修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＣｓ－ｆＣ－ｆＡ－ｍＵ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＡ－ｆＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｍＵｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６６８）の配列およびすべての修飾を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
である、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８７．ＭＡＲＣ１の発現を阻害するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ＲＮＡ転写物と相補性の領域を含み、センス鎖が、５’－ｍＡｓ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＣ－ｆＵ－ｆＡ－ｆＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６４０）の配列およびすべての修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵ－ｆＣ－ｍＡ－ｆＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６７６）の配列およびすべての修飾を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
である、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
８８．ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ＲＮＡ転写物と相補性の領域を含み、センス鎖が、５’－ｍＵｓ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＵ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＵ－ｍＧ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６２５）の配列およびすべての修飾を含み、アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＡｓ－ｆＧ－ｆＣ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＣ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＡｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６６１）の配列およびすべての修飾を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）。
８９．オリゴヌクレオチドが、ダイサー基質である、実施形態１～８８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
９０．オリゴヌクレオチドが、内因性ダイサープロセシングの際に、哺乳動物細胞におけるＭＡＲＣ１発現を低下することができる１９～２３個のヌクレオチドの長さの二本鎖核酸を産生するダイサー基質である、実施形態１～８８のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
９１．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための方法であって、方法が、治療有効量の先行する実施形態のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を対象に投与し、それによって対象を治療することを含む、方法。
９２．実施形態１～９０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体、送達剤、または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
９３．対象にオリゴヌクレオチドを送達する方法であって、方法が、実施形態９２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
９４．細胞、細胞の集団、または対象におけるＭＡＲＣ１発現を低減する方法であって、方法が、
ｉ．細胞または細胞の集団を、実施形態１～９０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、もしくは実施形態９２に記載の医薬組成物と接触させる工程、または
ｉｉ．実施形態１～９０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または実施形態９２に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
９５．ＭＡＲＣ１発現を低減することが、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの量もしくはレベル、ＭＡＲＣ１タンパク質の量もしくはレベル、またはその両方を低減することを含む、実施形態９４に記載の方法。
９６．対象が、ＭＡＲＣ１発現、例えば、肝臓におけるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する、実施形態９４または９５に記載の方法。
９７．対象が、肝臓におけるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する、実施形態９６に記載の方法。
９８．対象が、肝細胞におけるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する、実施形態９７に記載の方法。
９９．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）である、実施形態９１または９６～９８に記載の方法。
１００．ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または医薬組成物が、第２の組成物または治療剤と組み合わせて投与される、実施形態９１および９４～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための方法であって、方法が、治療有効量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、方法。
１０２．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための方法であって、方法が、治療有効量の、表４もしくは表６に示される行から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその医薬組成物を対象に投与し、それによって対象を治療することを含む、方法。
１０３．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための方法であって、方法が、治療有効量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、
（ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
（ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
（ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
（ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
（ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
（ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
（ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
（ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
（ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
（ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
（ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
（ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
（ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
（ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
（ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
（ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
（ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
（ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
（ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
（ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
（ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
（ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
（ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
１０４．センス鎖が、配列番号１５４３に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１５７９に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．センス鎖が、配列番号１５６０に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１５９６に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１０３に記載の方法。
１０６．センス鎖が、配列番号１５６８に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１６０４に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１０３に記載の方法。
１０７．センス鎖が、配列番号１５５３に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１５８９に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１０３に記載の方法。
１０８．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための方法であって、方法が、治療有効量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、センス鎖およびアンチセンス鎖が、
（ａ）それぞれ、配列番号１６０９および１６４５、
（ｂ）それぞれ、配列番号１６１０および１６４６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１６１１および１６４７、
（ｄ）それぞれ、配列番号１６１２および１６４８、
（ｅ）それぞれ、配列番号１６１３および１６４９、
（ｆ）それぞれ、配列番号１６１４および１６５０、
（ｇ）それぞれ、配列番号１６１５および１６５１、
（ｈ）それぞれ、配列番号１６１６および１６５２、
（ｉ）それぞれ、配列番号１６１７および１６５３、
（ｊ）それぞれ、配列番号１６１８および１６５４、
（ｋ）それぞれ、配列番号１６１９および１６５５、
（ｌ）それぞれ、配列番号１６２０および１６５６、
（ｍ）それぞれ、配列番号１６２１および１６５７、
（ｎ）それぞれ、配列番号１６２２および１６５８、
（ｏ）それぞれ、配列番号１６２３および１６５９、
（ｐ）それぞれ、配列番号１６２４および１６６０、
（ｑ）それぞれ、配列番号１６２５および１６６１、
（ｒ）それぞれ、配列番号１６２６および１６６２、
（ｓ）それぞれ、配列番号１６２７および１６６３、
（ｔ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６４、
（ｕ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６５、
（ｖ）それぞれ、配列番号１６３０および１６６６、
（ｗ）それぞれ、配列番号１６３１および１６６７、
（ｘ）それぞれ、配列番号１６３２および１６６８、
（ｙ）それぞれ、配列番号１６３３および１６６９、
（ｚ）それぞれ、配列番号１６３４および１６７０、
（ａａ）それぞれ、配列番号１６３５および１６７１、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１６３６および１６７２、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１６３７および１６７３、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１６３８および１６７４、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１６３９および１６７５、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１６４０および１６７６、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１６４１および１６７７、ならびに
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１６４２および１６７８から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
１０９．センス鎖が、配列番号１６１５に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１６５１に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１０．センス鎖が、配列番号１６３２に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１６６８に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１１．センス鎖が、配列番号１６４０に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１６７６に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１２．センス鎖が、配列番号１６２５に示されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１６６１に示されるヌクレオチド配列を含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１３．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、またはアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）である、実施形態１０１～１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態の治療のための、任意選択で、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、またはアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）の治療のための医薬品の製造における、実施形態１～９０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または実施形態９２に記載の医薬組成物の使用。
１１５．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、もしくは状態の治療における使用のための、または使用に適合可能な、任意選択で、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、またはアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）の治療のための、実施形態１～９０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または実施形態９２に記載の医薬組成物。
１１６．肝臓におけるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、もしくは状態の治療における使用のための、または使用に適合可能な、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、またはアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）の治療のための、実施形態１～９０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または実施形態９２に記載の医薬組成物。
１１７．キットであって、ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態を有する対象への投与のための、実施形態１～９０のいずれか１つに記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、任意選択で、薬学的に許容可能な担体、および指示を含む添付文書を含む、キット。
１１８．ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、またはアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）である、実施形態１１４に記載の使用、実施形態１１５に記載の使用のための、もしくは使用に適合可能なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物、または実施形態１１６に記載のキット。

Claims (15)

  1. ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、前記ｄｓＲＮＡｉが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、５’－ｍＧｓ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＧ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６１５）のすべての修飾および配列を含み、前記アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵｓ－ｆＡ－ｆＡ－ｍＣ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６５１）のすべての修飾および配列を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
    である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）。
  2. ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、前記ｄｓＲＮＡｉが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、５’－ｍＡｓ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＧ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６３２）のすべての修飾および配列を含み、前記アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＣｓ－ｆＣ－ｆＡ－ｍＵ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＡ－ｆＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｍＵｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６６８）のすべての修飾および配列を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
    である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）。
  3. ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、前記ｄｓＲＮＡｉが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、５’－ｍＡｓ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｆＣ－ｆＵ－ｆＡ－ｆＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６４０）のすべての修飾および配列を含み、前記アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵｓ－ｆＵ－ｆＣ－ｍＡ－ｆＡ－ｍＧ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＧ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＵｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６７６）のすべての修飾および配列を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
    である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）。
  4. ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、前記ｄｓＲＮＡｉが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、５’－ｍＵｓ－ｍＧ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＵ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＡ－ｆＵ－ｍＧ－ｍＧ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＡ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＣ－ｍＧ－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＧ－ｍＧ－ｍＣ－ｍＵ－ｍＧ－ｍＣ－３’（配列番号１６２５）のすべての修飾および配列を含み、前記アンチセンス鎖が、５’－Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ－ｆＵｓ－ｆＡｓ－ｆＧ－ｆＣ－ｍＵ－ｆＵ－ｍＣ－ｍＣ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＵ－ｆＡ－ｍＵ－ｍＵ－ｍＣ－ｍＡ－ｍＣ－ｍＡｓ－ｍＧｓ－ｍＧ－３’（配列番号１６６１）のすべての修飾および配列を含み、ｍＣ、ｍＡ、ｍＧ、およびｍＵが、２’－ＯＭｅリボヌクレオシドであり、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ、およびｆＵが、２’Ｆリボヌクレオシドであり、ｓが、ホスホロチオエートであり、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃが、
    である、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）。
  5. ＭＡＲＣ１発現を低減するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖が、配列番号１～３８４のうちのいずれか１つのＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補的な領域を含み、前記相補的な領域が、前記ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と３個以下のヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
  6. （ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、前記アンチセンス鎖が、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ標的配列と相補的な領域を含むヌクレオチド配列を含み、前記相補的な領域が、配列番号３８５～７６８から選択される、アンチセンス鎖と、
    （ｉｉ）前記アンチセンス鎖と相補的な領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖と、を含み、前記アンチセンス鎖およびセンス鎖が、前記アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称性二本鎖領域を形成する、別個の鎖である、請求項５に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
  7. （ｉ）前記センス鎖が、１５～５０個または１８～３６個のヌクレオチドの長さ、任意選択で、３６個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、
    （ｉｉ）前記アンチセンス鎖が、１５～３０個のヌクレオチドの長さ、任意選択で、２２個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、
    （ｉｉｉ）前記二本鎖領域が、少なくとも１９個のヌクレオチドまたは少なくとも２０個のヌクレオチドの長さである、請求項５に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
  8. 前記センス鎖の３’末端が、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを含み、
    （ｉ）Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、任意選択で、Ｓ１およびＳ２が、各々、１～１０個のヌクレオチドの長さであり、かつ同じ長さを有し、任意選択で、Ｓ１およびＳ２が、各々、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの長さであり、さらに任意選択で、Ｓ１およびＳ２が、６個のヌクレオチドの長さであり、
    （ｉｉ）Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成し、任意選択で、Ｌが、トリループまたはテトラループであり、任意選択で、前記テトラループが、配列５’－ＧＡＡＡ－３’を含み、任意選択で、前記ステム－ループが、配列５’－ＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ－３’（配列番号１６８１）を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
  9. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドが、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされ、任意選択で、
    （ａ）各標的化リガンドが、カーボハイドレート、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、もしくは脂質を含み、
    （ｂ）前記ステムループが、前記ステムループの１個以上のヌクレオチドとコンジュゲートされた１個以上の標的化リガンドを含み、
    （ｃ）前記１個以上の標的化リガンドが、前記ループの１個以上のヌクレオチドとコンジュゲートされ、任意選択で、前記ループが、５’から３’へ１～４と付番された４個のヌクレオチドを含み、２位、３位、および４位のヌクレオチドが、各々、１個以上の標的化リガンドを含み、前記標的化リガンドが、同一であるか、もしくは異なり、
    （ｄ）前記標的化リガンドが、肝細胞標的化リガンドであり、各標的化リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含み、任意選択で、前記ＧａｌＮＡｃ部分が、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、もしくは四価ＧａｌＮＡｃ部分であり、ならびに／または
    （ｅ）前記標的化リガンドが、肝細胞標的化リガンドであり、前記ステム－ループのＬの最大４個のヌクレオチドが、各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされる、請求項５～８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
  10. （ｉ）前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で、前記修飾ヌクレオチドが、２’－修飾を含み、任意選択で、
    （ａ）前記２’－修飾が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾であり、任意選択で、前記修飾が、２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチルから選択され、任意選択で、前記オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが、修飾されており、前記修飾が、２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチルであり、
    （ｂ）前記センス鎖の前記ヌクレオチドの約１０～１５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、もしくは１５％が、２’－フルオロ修飾を含み、
    （ｃ）前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、もしくは３５％が、２’－フルオロ修飾を含み、
    （ｄ）前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、もしくは３５％が、２’－フルオロ修飾を含み、
    （ｅ）前記センス鎖が、５’から３’へ１位～３６位を有する３６個のヌクレオチドを含み、８位～１１位が、２’－フルオロ修飾を含み、
    （ｆ）前記アンチセンス鎖が、５’から３’へ１位～２２位を有する２２個のヌクレオチドを含み、２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位が、２’－フルオロ修飾を含み、および／または
    （ｇ）残りのヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含み、ならびに／あるいは
    （ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を含み、任意選択で、前記少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合であり、任意選択で、
    （ａ）前記アンチセンス鎖が、（ｉ）１位と２位との間、および２位と３位との間、もしくは（ｉｉ）１位と２位との間、２位と３位との間、および３位と４位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置が、５’から３’へ１～４と付番され、および／または
    （ｂ）前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドの長さであり、前記アンチセンス鎖が、２０位と２１位との間、および２１位と２２位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置が、５’から３’へ１～２２と付番され、ならびに／あるいは
    （ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖が、５’末端にリン酸化ヌクレオチドを含み、前記リン酸化ヌクレオチドが、ウリジンおよびアデノシンから選択され、任意選択で、前記リン酸化ヌクレオチドが、ウリジンであり、ならびに／あるいは
    （ｉｖ）前記アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素が、リン酸類似体を含み、任意選択で、前記リン酸類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートであり、任意選択で、前記リン酸類似体が、５’－メトキシホスホネート－４’－オキシを含む４’－リン酸類似体であり、ならびに／あるいは
    （ｖ）前記アンチセンス鎖が、３’末端に１個以上のヌクレオチドの長さのオーバーハング配列を含み、任意選択で、前記オーバーハングが、プリンヌクレオチドを含み、任意選択で、前記オーバーハング配列が、２個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記オーバーハングが、ＡＡ、ＧＧ、ＡＧ、およびＧＡから選択され、任意選択で、前記オーバーハングが、ＧＧである、請求項５～９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
  11. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号１５３７および１５７３、
    （ｂ）それぞれ、配列番号１５３８および１５７４、
    （ｃ）それぞれ、配列番号１５３９および１５７５、
    （ｄ）それぞれ、配列番号１５４０および１５７６、
    （ｅ）それぞれ、配列番号１５４１および１５７７、
    （ｆ）それぞれ、配列番号１５４２および１５７８、
    （ｇ）それぞれ、配列番号１５４３および１５７９、
    （ｈ）それぞれ、配列番号１５４４および１５８０、
    （ｉ）それぞれ、配列番号１５４５および１５８１、
    （ｊ）それぞれ、配列番号１５４６および１５８２、
    （ｋ）それぞれ、配列番号１５４７および１５８３、
    （ｌ）それぞれ、配列番号１５４８および１５８４、
    （ｍ）それぞれ、配列番号１５４９および１５８５、
    （ｎ）それぞれ、配列番号１５５０および１５８６、
    （ｏ）それぞれ、配列番号１５５１および１５８７、
    （ｐ）それぞれ、配列番号１５５２および１５８８、
    （ｑ）それぞれ、配列番号１５５３および１５８９、
    （ｒ）それぞれ、配列番号１５５４および１５９０、
    （ｓ）それぞれ、配列番号１５５５および１５９１、
    （ｔ）それぞれ、配列番号１５５６および１５９２、
    （ｕ）それぞれ、配列番号１５５７および１５９３、
    （ｖ）それぞれ、配列番号１５５８および１５９４、
    （ｗ）それぞれ、配列番号１５５９および１５９５、
    （ｘ）それぞれ、配列番号１５６０および１５９６、
    （ｙ）それぞれ、配列番号１５６１および１５９７、
    （ｚ）それぞれ、配列番号１５６２および１５９８、
    （ａａ）それぞれ、配列番号１５６３および１５９９、
    （ｂｂ）それぞれ、配列番号１５６４および１６００、
    （ｃｃ）それぞれ、配列番号１５６５および１６０１、
    （ｄｄ）それぞれ、配列番号１５６６および１６０２、
    （ｅｅ）それぞれ、配列番号１５６７および１６０３、
    （ｆｆ）それぞれ、配列番号１５６８および１６０４、
    （ｇｇ）それぞれ、配列番号１５６９および１６０５、ならびに
    （ｈｈ）それぞれ、配列番号１５７０および１６０６
    から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または
    前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号１６０９および１６４５、
    （ｂ）それぞれ、配列番号１６１０および１６４６、
    （ｃ）それぞれ、配列番号１６１１および１６４７、
    （ｄ）それぞれ、配列番号１６１２および１６４８、
    （ｅ）それぞれ、配列番号１６１３および１６４９、
    （ｆ）それぞれ、配列番号１６１４および１６５０、
    （ｇ）それぞれ、配列番号１６１５および１６５１、
    （ｈ）それぞれ、配列番号１６１６および１６５２、
    （ｉ）それぞれ、配列番号１６１７および１６５３、
    （ｊ）それぞれ、配列番号１６１８および１６５４、
    （ｋ）それぞれ、配列番号１６１９および１６５５、
    （ｌ）それぞれ、配列番号１６２０および１６５６、
    （ｍ）それぞれ、配列番号１６２１および１６５７、
    （ｎ）それぞれ、配列番号１６２２および１６５８、
    （ｏ）それぞれ、配列番号１６２３および１６５９、
    （ｐ）それぞれ、配列番号１６２４および１６６０、
    （ｑ）それぞれ、配列番号１６２５および１６６１、
    （ｒ）それぞれ、配列番号１６２６および１６６２、
    （ｓ）それぞれ、配列番号１６２７および１６６３、
    （ｔ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６４、
    （ｕ）それぞれ、配列番号１６２８および１６６５、
    （ｖ）それぞれ、配列番号１６３０および１６６６、
    （ｗ）それぞれ、配列番号１６３１および１６６７、
    （ｘ）それぞれ、配列番号１６３２および１６６８、
    （ｙ）それぞれ、配列番号１６３３および１６６９、
    （ｚ）それぞれ、配列番号１６３４および１６７０、
    （ａａ）それぞれ、配列番号１６３５および１６７１、
    （ｂｂ）それぞれ、配列番号１６３６および１６７２、
    （ｃｃ）それぞれ、配列番号１６３７および１６７３、
    （ｄｄ）それぞれ、配列番号１６３８および１６７４、
    （ｅｅ）それぞれ、配列番号１６３９および１６７５、
    （ｆｆ）それぞれ、配列番号１６４０および１６７６、
    （ｇｇ）それぞれ、配列番号１６４１および１６７７、ならびに
    （ｈｈ）それぞれ、配列番号１６４２および１６７８
    から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド。
  12. ＭＡＲＣ１の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）であって、前記ｄｓＲＮＡｉが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、
    （ｉ）前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号１６１５および１６５１に示されるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｉｉ）前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号１６３２および１６６８に示されるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｉｉｉ）前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号１６４０および１６７６に示されるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｉｖ）前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号１６２５および１６６１に示されるヌクレオチド配列を含む、二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｉ）。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体、送達剤、または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  14. ＭＡＲＣ１発現と関連する疾患、障害、または状態の治療のための、任意選択で、肝細胞におけるＭＡＲＣ１発現と関連する疾患または状態の治療のための医薬としての、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または請求項１３に記載の医薬組成物の使用。
  15. 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、およびアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）から成る群から選択される疾患の治療のための医薬としての、請求項１４に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの使用。
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