WO2019098691A9 - 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물의 동결건조 조성물 및 방법 - Google Patents

음이온성 약물 함유 약제학적 조성물의 동결건조 조성물 및 방법 Download PDF

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    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to lyophilized compositions and methods of anionic drug-containing pharmaceutical compositions, and more particularly, to compositions and methods for lyophilization of anionic drug delivery compositions such as nucleic acids, and lyophilisates thereof. .
  • Drugs are usually finished into dry preparations.
  • conventional drying methods such as reduced pressure drying, spray drying, and freeze drying may be used.
  • the freeze-drying method is a method of freezing the material and drying by sublimation, which directly turns ice into steam by lowering the partial pressure of water vapor. In such lyophilization, a preservative is often used.
  • additives refer to substances that are added to enhance the usefulness of stability, safety, and quality when formulating pharmaceuticals.In the case of formulation, these additives are used to control the quality of pharmaceuticals, and in general, they are often used in large quantities. Safety should also be established.
  • 2017-0032858 discloses an anionic drug as an active ingredient; Cationic compounds; Amphiphilic block copolymers; And polylactic acid salt, wherein the anionic drug forms a complex by electrostatic interaction with the cationic compound, and the complex is encapsulated inside a nanoparticle structure formed by an amphiphilic block copolymer and polylactic acid salt.
  • an anionic drug delivery composition Disclosed is an anionic drug delivery composition.
  • anionic drugs of the nucleic acid type may exhibit structural changes during freezing or lyophilization, and may cause structural changes of non-viral carriers.
  • an object of the present invention is to provide a composition for lyophilization, which can exhibit excellent stability and safety, and excellent efficacy in lyophilization and reconstruction of an anionic drug delivery composition.
  • Another object of the present invention is to provide a lyophilization method, which can exhibit excellent stability and safety, and excellent efficacy during lyophilization and reconstruction of the composition for anionic drug delivery.
  • Still another object of the present invention is to provide a lyophilized composition of an anionic drug delivery composition which can exhibit excellent stability and safety and excellent efficacy in lyophilization and reconstruction of an anionic drug delivery composition.
  • One aspect of the present invention is an anionic drug as an active ingredient; Cationic compounds; Amphiphilic block copolymers; And, polylactic acid salt, wherein the anionic drug forms a complex by electrostatic interaction with the cationic compound, and the complex is formed inside a nanoparticle structure formed by an amphiphilic block copolymer and polylactic acid salt.
  • a composition for lyophilization of an anionic drug delivery composition comprising an enclosed composition for anionic drug delivery, and sorbitol as a lyophilized preservative.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for lyophilizing a composition for anionic drug delivery, comprising: performing lyophilization using the composition.
  • Another aspect of the present invention relates to a lyophilised composition of the composition for anionic drug delivery, lyophilized by the above method.
  • the inventors of the present invention have performed lyophilization and reconstruction by adding various lyophilized preservatives to the composition for anionic drug delivery according to Korean Patent Application No. 2017-0032858 filed by the applicant, and unexpectedly excellent when using sorbitol It was confirmed to exhibit stability and safety, and good efficacy. That is, even with the addition of sorbitol, low unsealed drug (e.g. siRNA) content and low drug (e.g. siRNA) content during lyophilization and reconstitution, compared with other preservatives such as trehalose, mannitol, sucrose or glucose For the first time, it has been shown that it can simultaneously exhibit low toxicity and high efficacy.
  • sorbitol low unsealed drug
  • siRNA low drug
  • siRNA drug
  • the present invention is characterized in that sorbitol is used as a lyophilized preservative in lyophilization of an anionic drug delivery composition.
  • sorbitol is preferably used in an amount of 1 to 5,000 parts by weight relative to 1 part by weight of the anionic drug. More preferably 1 to 4,000 parts by weight, even more preferably 5 to 3,000 parts by weight, most preferably 5 to 2,000 parts by weight. This is because low unpacked drug content, low drug abundance, low toxicity and high efficacy can be obtained in the above weight range.
  • the anionic drug and the cationic compound are encapsulated inside the nanoparticle structure formed by the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid salt.
  • the schematic structure of the polymer nanoparticle carrier in which the complex is encapsulated is shown in FIG. 1.
  • anionic drugs bind to each other through an electrostatic interaction with a cationic compound to form an anionic drug and a cationic compound complex.
  • the anionic drug and cationic compound complex formed are encapsulated in a nanoparticle structure formed by an amphiphilic block copolymer and a polylactic acid salt.
  • a nanoparticle structure formed by an amphiphilic block copolymer and a polylactic acid salt the hydrophilic portion of the amphiphilic block copolymer in an aqueous environment forms the outer wall of the nanoparticle and the hydrophobicity of the amphiphilic block copolymer
  • the polylactic acid salt contained in the part and the amphiphilic block copolymer as a separate component forms the inner wall of the nanoparticles, and the anionic drug and the cationic compound complex are enclosed in the formed nanoparticles.
  • the anionic drug and the cationic compound complex is maintained in the nanoparticle structure formed by the amphiphilic block copolymer and polylactic acid salt to improve the stability in the blood or body fluids.
  • the particle size of the nanoparticles 10 to 200 nm, more preferably 10 to 150 nm.
  • the standard charge of the nanoparticle particles is -20 to 20 mV, more preferably -10 to 10 mV. The particle size and standard charge are most preferred in terms of stability of the nanoparticle structure and content of constituents, absorption of anionic drugs in the body, and convenience of sterilization as pharmaceutical compositions.
  • the anionic drug included as an active ingredient in the composition according to the present invention is a concept including all substances having a pharmacological activity with a negative charge in the molecule in an aqueous solution.
  • the anionicity may be imparted from one or more functional groups selected from the group consisting of carboxyl groups, phosphate groups and sulfate groups.
  • the anionic drug may be a polyanionic drug or nucleic acid such as peptide, protein or heparin.
  • the nucleic acid may be a nucleic acid drug such as deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid or backbone, sugar or base chemically modified or modified polynucleotide derivative, and more specifically RNA, DNA, siRNA (short interfering) RNA, aptamer, antisense oligodeoxynucleotide (ODN), antisense RNA (antisense RNA), ribozyme (ribozyme) and DNAzyme (DNAzyme) may be one or more nucleic acids selected from the group consisting of.
  • the nucleic acid may be chemically modified or modified at its backbone, sugar or base for the purpose of increasing blood stability or weakening the immune response.
  • a portion of the phosphodiester bond of the nucleic acid is replaced by a phosphorothioate or boranophosphate bond, or a methyl group or a methoxyethyl group at the 2'-OH position of some ribose bases.
  • one or more modified nucleotides into which various functional groups such as fluorine are introduced are introduced.
  • one or more termini of the nucleic acid may be modified with one or more selected from the group consisting of cholesterol, tocopherol and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms.
  • siRNA can be modified at the 5 'end, or 3' end, or both ends of the sense and / or antisense strand, and preferably at the end of the sense strand.
  • the cholesterol, tocopherol and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms include each analog, derivative, and metabolite of cholesterol, tocopherol and fatty acids.
  • the siRNA when present in the same cell as the target gene, mediates degradation of the mRNA complementary to the siRNA sequence, thereby reducing or inhibiting expression of the target gene, or duplex RNA (duplex RNA), or single strand
  • duplex RNA duplex RNA
  • single strand refers to single-stranded RNA in the form of double strands within RNA. Bonding between the double strands is via hydrogen bonding between the nucleotides, and not all nucleotides within the double strand must complementarily bind to each other, and both strands may or may not be separated.
  • the length of the siRNA is about 15 to 60 (the number of single nucleotides of the double-stranded RNA, that is, the number of base pairs, and in the case of single-stranded RNA, the length of the double-stranded inside the single-stranded RNA Nucleotides, specifically, about 15 to 30 nucleotides, and more specifically, about 19 to 25 nucleotides.
  • the double-stranded siRNA may have an overhang of 1-5 nucleotides at either the 3 'or 5' end, at either end, or at both ends.
  • both ends may have a blunt form without protrusions.
  • siRNA disclosed in US Patent Publication No. 2002-0086356 and US Patent No. 7,056,704, which are incorporated herein by reference.
  • the siRNA may have a symmetrical structure having the same length of two strands, or an asymmetric double stranded structure in which one strand is shorter than the other strand.
  • the anionic drug is preferably included in 0.001 to 10% by weight, specifically 0.01 to 8% by weight based on the total weight of the composition.
  • the amount of the carrier used may be too high compared to the drug, which may cause side effects due to the carrier.
  • the amount of the anionic drug exceeds 10% by weight, the size of the nanoparticle may be too large to stabilize the nanoparticle. There is a risk of lowering and increasing the loss rate during filter sterilization.
  • the cationic compound is bonded by an electrostatic interaction with the anionic drug to form a complex, the complex is encapsulated inside the nanoparticle structure of the amphiphilic block copolymer.
  • the cationic compound includes all types of compounds capable of forming a complex by electrostatic interaction with the anionic drug, and may be, for example, a lipid and a polymer type.
  • Cationic lipids include N, N-dioleyl-N, N-dimethylammonium chloride (DODAC), N, N-distearyl-N, N-dimethylammonium bromide (DDAB), N- (1- (2, 3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N, N-dimethyl- (2,3-dioleoyloxy) propylamine (DODMA), N, N, N- Trimethyl- (2,3-dioleoyloxy) propylamine (DOTMA), 1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane (TAP), 1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane (DAP ), 3beta- [N- (N ', N', N'-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (TC-cholesterol), 3beta- [N- (N
  • Beta- [N- (N ', N', N'-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (TC-cholesterol), 3beta [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol ( DC-cholesterol), 3beta [N- (N'-monomethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (MC-cholesterol), 3beta [N- (aminoethane) carbamoyl] cholesterol (AC-cholesterol), N- (1- (2,3-dioleoyljade ) Propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N, N-dimethyl- (2,3-dioleoyloxy) propylamine (DODMA), and N, N, N-trimethyl- (2, It may be one or more selected from the group consisting of 3-dioleoyloxy) propylamine (DOTMA
  • cationic polymers include chitosan, glycol chitosan, protamine, polylysine, polyarginine, polyamidoamine (PAMAM), polyethylenimine, Dextran, hyaluronic acid, albumin (albumin), polymer polyethyleneimine (PEI), polyamine and polyvinylamine (PVAm), characterized in that it is selected from the group consisting of high molecular polyethyleneimine (PEI), polyamine and polyvinylamine (PVA) may be one or more selected from the group consisting of.
  • the cationic lipid may be a cationic lipid of Formula 7:
  • n and m are 0 to 12, respectively, 2 ⁇ n + m ⁇ 12, a and b are each 1 to 6, and R 1 and R 2 are each independently a group consisting of saturated or unsaturated hydrocarbons having 11 to 25 carbon atoms Is selected.
  • n and m are independently 1 to 9, and may be 2 ⁇ n + m ⁇ 10.
  • a and b may be 2 to 4.
  • R 1 and R 2 are each independently lauryl, myristyl, palmityl, stearyl, arachidyl, behenyl , Lignoceryl, cerotyl, myristoleyl, palmitoleyl, sapienyl, oleyl, linoleyl, araki It may be selected from the group consisting of adonyl (arachidonyl), eicosapentaenyl, erucyl, docosahexaenyl, and serrotyl.
  • adonyl arachidonyl
  • eicosapentaenyl erucyl
  • docosahexaenyl and serrotyl.
  • cationic lipids include 1,6-dioleoyltriethylenetetramide, 1,8-dilinoleylyltetraethylenepentamide, 1,4-dimyristoleoyldiethylenetriamide, 1,10-dis At least one selected from the group consisting of thearoylpentaethylene hexamide and 1,10-dioleoylpentaethylenehexamide.
  • Cationic compounds used in the present invention may be included in 0.01 to 50% by weight, specifically 0.1 to 10% by weight.
  • the content of the cationic lipid is less than 0.01% by weight, the amount of the cationic lipid may not be sufficient to form a complex with the anionic drug.
  • the amount of the cationic lipid is more than 50% by weight, the size of the nanoparticles may be too large to reduce the stability of the nanoparticles and the filter. There is a risk that the loss rate during sterilization increases.
  • the ratio (N / P; cationic charge ratio of the cationic compound to the anionic charge of the anionic drug) of the charge amount of the anionic drug (P) and the cationic compound (N) is 0.1 to 128 Specifically, it is 0.5 to 64, more specifically 1 to 32, and even more specifically 1 to 24, most preferably 6 to 24. If the ratio (N / P) is less than 0.1, it is difficult to form a complex containing a sufficient amount of anionic drugs, it is advantageous to form a complex containing a sufficient amount of anionic drugs at 0.1 or more. On the other hand, when the ratio (N / P) is more than 128, there is a fear of causing toxicity, so it is better to set it to 128 or less.
  • the amphiphilic block copolymer may be an A-B type block copolymer including a hydrophilic A block and a hydrophobic B block.
  • the A-B type block copolymer forms core-shell type polymer nanoparticles in which an hydrophobic B block forms a core (inner wall) and a hydrophilic A block forms a shell (outer wall) in an aqueous solution.
  • the hydrophilic A block may be at least one selected from the group consisting of polyalkylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide and derivatives thereof. More specifically, the hydrophilic A block may be at least one selected from the group consisting of monomethoxy polyethylene glycol, monoacetoxy polyethylene glycol, polyethylene glycol, copolymers of polyethylene and propylene glycol, and polyvinylpyrrolidone.
  • the hydrophilic A block may have a number average molecular weight of 200 to 50,000 Daltons, more specifically 1,000 to 20,000 Daltons, even more specifically 1,000 to 5,000 Daltons.
  • the amphiphilic block copolymer and polylactic acid salt may be formed by chemically bonding a functional group, a ligand, or a functional group capable of promoting intracellular delivery to the end of the hydrophilic A block.
  • the distribution of the polymer nanoparticle transporter may be adjusted in the body or the efficiency of delivering the nanoparticle transporter into the cell may be increased.
  • the functional group or ligand may be one or more selected from the group consisting of monosaccharides, polysaccharides, vitamins, peptides, proteins and antibodies to cell surface receptors.
  • the functional group or ligand is an anamide (anisamide), vitamin B9 (folic acid), vitamin B12, vitamin A, galactose, lactose, mannose, hyaluronic acid, RGD peptide, NGR peptide, transferrin, antibodies to the transferrin receptor It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the hydrophobic B block is a biocompatible biodegradable polymer, and in one embodiment, may be one or more selected from the group consisting of polyesters, polyanhydrides, polyamino acids, polyorthoesters, and polyphosphazines. More specifically, the hydrophobic B block includes polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, polydioxan-2-one, a copolymer of polylactide and glycolide, polylactide and polydioxane-2- It may be one or more selected from the group consisting of a copolymer of one, a copolymer of polylactide and polycaprolactone and a copolymer of polyglycolide and polycaprolactone.
  • the hydrophobic B block may have a number average molecular weight of 50 to 50,000 Daltons, more specifically 200 to 20,000 Daltons, even more specifically 5,00 to 5,000 Daltons.
  • tocopherol, cholesterol, or fatty acids having 10 to 24 carbon atoms may be chemically bonded to the hydroxyl group at the end of the hydrophobic block in order to increase the hydrophobicity of the hydrophobic block to improve the stability of the nanoparticles.
  • the content of the amphiphilic block copolymer including the hydrophilic block (A) and the hydrophobic block (B) is 40 to 99.98% by weight, specifically 50 to 99.8% by weight, more specifically based on the total dry weight of the composition. It is preferably 60 to 90% by weight. If the content of the amphiphilic block copolymer is less than 40% by weight, the size of the nanoparticles is too large to reduce the stability of the nanoparticles and the loss rate during filter sterilization, there is a risk that the content exceeds 99.98% by weight can be incorporated The content of anionic drugs becomes too small.
  • the composition ratio of the hydrophilic block (A) and the hydrophobic block (B) is 40 to 70% by weight of the hydrophilic block (A), based on the copolymer weight, Specifically, it may range from 50 to 60% by weight. If the proportion of the hydrophilic block (A) is less than 40% by weight, the polymer has a low solubility in water and is difficult to form nanoparticles, so that the copolymer has a solubility in water sufficient to form the nanoparticles.
  • the ratio of A) is 40% by weight or more, but when it exceeds 70% by weight, the hydrophilicity is so high that the stability of the polymer nanoparticles is low, making it difficult to use as a solubilizing composition of the anionic drug / cationic lipid complex.
  • the ratio of the hydrophilic block (A) is preferably 70% by weight or less.
  • the amphiphilic block copolymer encapsulates the anionic drug and the cationic lipid complex inside the nanoparticle structure in an aqueous solution, wherein the anionic drug and the cationic agent are compared to the weight (b) of the amphiphilic block copolymer.
  • the weight (a) ratio of the lipid complex [a / b X 100; (anionic drug weight + cationic lipid weight) / amphiphilic block copolymer weight X 100] is 0.001 to 100% by weight, specifically 0.01 to 50 Wt%, more specifically 0.1-20 wt%.
  • the content of the anionic drug and the cationic lipid complex is too low to satisfy an effective content for the anionic drug to act effectively, on the contrary, when the content exceeds 100% by weight, the amphiphilic block copolymer Considering the molecular weight of and the amount of anionic drugs and lipid complexes, they do not form nanoparticle structures of the appropriate size.
  • Nanoparticle structure of the composition according to the invention is characterized in that it comprises a polylactic acid salt (PLANa).
  • the polylactic acid salt is distributed in the core (inner wall) of the nanoparticles, thereby enhancing the hydrophobicity of the core to stabilize the nanoparticles and at the same time effectively avoiding the reticulum endothelial system (RES) in the body.
  • RES reticulum endothelial system
  • the carboxylic acid anion of polylactic acid is more effectively combined with the cationic complex than polylactic acid to reduce the surface potential of the polymer nanoparticles, thereby reducing the positive charge of the surface potential compared to the polymer nanoparticles containing no polylactic acid. It is less captured by the endothelial system, and thus has an advantage of excellent delivery efficiency to a desired site (eg, cancer cells, inflammatory cells, etc.).
  • the polylactic acid salt contained as an inner wall component of the nanoparticles as a separate component from the amphiphilic block copolymer may have a number average molecular weight of 500 to 50,000 Daltons, specifically 1,000 to 10,000 Daltons. If the molecular weight is less than 500 Daltons, the hydrophobicity is too low to be present in the core (inner wall) of the nanoparticles, and if the molecular weight exceeds 50,000 Daltons, there is a problem that the particles of the polymer nanoparticles become large.
  • the polylactic acid salt may be used in an amount of 1 to 200 parts by weight, specifically 1 to 100 parts by weight, and more specifically 10 to 60 parts by weight, based on 100 parts by weight of the amphiphilic block copolymer.
  • the content of the polylactic acid salt exceeds 200 parts by weight relative to 100 parts by weight of the amphiphilic block copolymer, the size of the nanoparticles increases, making it difficult to filter using a sterile membrane, and when the content is less than 1 part by weight, the desired effect cannot be sufficiently obtained.
  • it can contain 10 to 1,000 parts by weight of the amphiphilic block copolymer relative to 1 part by weight of anionic drug, and 5 to 500 parts by weight of polylactic acid salt.
  • the amphiphilic block copolymer may be contained in an amount of 50 to 800 parts by weight, more preferably 100 to 500 parts by weight.
  • the polylactic acid salt may be contained in an amount of 5 to 300 parts by weight, more preferably 10 to 100 parts by weight.
  • the terminal opposite to sodium carboxylate in the terminal of the polylactic acid salt is selected from the group consisting of hydroxy, acetoxy, benzoyloxy, decanoyloxy, palmitoyloxy and alkoxy having 1 to 2 carbon atoms. Can be substituted.
  • the polylactic acid salt of the present invention may be at least one selected from the group consisting of compounds represented by the following formulas (1) to (6).
  • A is -COO-CHZ-;
  • B is -COO-CHY-, -COO-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -or -COO-CH 2 CH 2 OCH 2- ;
  • R is a hydrogen atom or an acetyl, benzoyl, decanoyl, palmitoyl, methyl, or ethyl group;
  • Z and Y are each a hydrogen atom or a methyl or phenyl group;
  • M is Na, K, or Li;
  • n is an integer from 1 to 30;
  • m is an integer of 0-20.
  • X is a methyl group
  • Y ' is a hydrogen atom or a phenyl group
  • p is an integer from 0 to 25
  • q is an integer from 0 to 25, provided that p + q is an integer from 5 to 25
  • R is a hydrogen atom or an acetyl, benzoyl, decanoyl, palmitoyl, methyl or ethyl group
  • M is Na, K, or Li
  • Z is a hydrogen atom, a methyl or a phenyl group.
  • W-M ' is or ego
  • PAD is D, L-polylactic acid, D-polylactic acid, polymandelic acid, copolymer of D, L-lactic acid and glycolic acid, copolymer of D, L-lactic acid and mandelic acid, D, L-lactic acid and One selected from the group consisting of a copolymer of caprolactone and a copolymer of D, L-lactic acid and 1,4-dioxan-2-one
  • R is a hydrogen atom or an acetyl, benzoyl, decanoyl, palmitoyl, methyl or ethyl group
  • M is independently Na, K, or Li.
  • S is ego;
  • L is -NR 1 - or -O- and, wherein R 1 is a hydrogen atom or a C 1- 10 alkyl;
  • Q is CH 3 , CH 2 CH 3 , CH 2 CH 2 CH 3 , CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 , or CH 2 C 6 H 5 ;
  • a is an integer from 0 to 4;
  • b is an integer from 1 to 10;
  • M is Na, K, or Li;
  • PAD is D, L-polylactic acid, D-polylactic acid, polymandelic acid, copolymer of D, L-lactic acid and glycolic acid, copolymer of D, L-lactic acid and mandelic acid, D, L-lactic acid and At least one selected from the group consisting of a copolymer of caprolactone and a copolymer of D, L-lactic acid and 1,4-dioxan-2-one.
  • R ' is -PAD-OC (O) -CH 2 CH 2 -C (O) -OM
  • PAD is D, L-polylactic acid, D-polylactic acid, polymandelic acid, D , Copolymer of L-lactic acid and glycolic acid, copolymer of D, L-lactic acid and mandelic acid, copolymer of D, L-lactic acid and caprolactone, D, L-lactic acid and 1,4-dioxane-2 -One selected from the group consisting of copolymers, M is Na, K, or Li; a is an integer of 1-4.
  • X and X ' are independently hydrogen, alkyl having 1 to 10 carbon atoms or aryl having 6 to 20 carbon atoms; Y and Z are independently Na, K, or Li; m and n are independently integers from 0 to 95, with 5 ⁇ m + n ⁇ 100; a and b are independently an integer from 1 to 6; R is-(CH 2 ) k- , divalent alkenyl having 2 to 10 carbon atoms, divalent aryl having 6 to 20 carbon atoms, or a combination thereof, wherein k is 0 to 10 Is an integer.
  • the polylactic acid salt is preferably a compound of Formula 1 or Formula 2.
  • compositions of the present invention further comprise from 0.01 to 50% by weight, in particular from 0.1 to 10% by weight, of the fusion lipids based on the weight of the total composition to increase the intracellular delivery efficiency of the anionic drug. It may include.
  • the fusion lipids When the fusion lipids are mixed with a complex of an anionic drug and a cationic lipid, the fusion lipids are combined in a hydrophobic interaction to form a complex of an anionic drug, a cationic lipid and a fusion lipid, and the complex including the fusion lipid is It is encapsulated inside the nanoparticle structure of the amphiphilic block copolymer.
  • the fusion lipid may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of phospholipids, cholesterol, and tocopherols.
  • the phospholipid may be at least one selected from the group consisting of phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylcholine (PC), and phosphatidic acid.
  • the phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC) and phosphatidic acid may be combined with one or two C10-24 fatty acids.
  • the cholesterol and tocopherols include respective analogs, derivatives, and metabolites of cholesterol and tocopherols.
  • the fusion lipid may include dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, and distearoyl phosphatidyl ethanolamine.
  • the fusion lipid is dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE), dipalmitoleoyl phosphocholine (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), diol Leoylphosphocholine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), dipalmitoleoylphosphoethanolamine (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE), etc. It may be one or more selected from the group consisting of.
  • DOPE dioleoyl phosphatidylethanolamine
  • the anionic drug-cationic compound complex-containing composition encapsulated in the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid nanoparticle structure according to the present invention is a blood vessel, muscle, subcutaneous, oral, bone, transdermal or topical tissue, etc. It can be administered via the route of administration of, and can be formulated into a variety of oral or parenteral formulations to suit this route of administration.
  • the oral dosage formulations may include tablets, capsules, powder preparations, liquids, and the like, and parenteral dosage preparations may include various preparations, such as eye drops and injections.
  • the composition may be an injection preparation.
  • the lyophilisate of the composition according to the invention may be reconstituted with injectable distilled water, 0.9% physiological saline, 5% dextrose aqueous solution or the like in the form of an injectable preparation.
  • the present invention it is possible to provide a lyophilized composition and method for maintaining excellent stability, safety, and efficacy with respect to the composition for anionic drug delivery.
  • FIG. 1 is a view showing a schematic structure of a polymer nanoparticle carrier encapsulated with a complex of an anionic drug and a cationic compound according to the present invention.
  • KRAS siRNA 5 ⁇ g was dissolved in 94.52 ⁇ l of distilled water, and 94.52 ⁇ g of dio-TETA was dissolved in 94.52 ⁇ l of 20 mM acetate buffer (pH 4.6) and mixed drop by drop in the ultrasonic grinding state. The mixture was lyophilized to a powdery state, and the powder was dissolved in 10 ⁇ l of ethyl acetate.
  • the prepared emulsion was placed in a 1-neck round flask and distilled under reduced pressure in a rotary evaporator to selectively remove ethyl acetate, thereby siRNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetraamide (dio-TETA) / mPEG-PLA-tocopherol / PLANA / DOPE containing polymer nanoparticles were prepared.
  • siRNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetraamide (dio-TETA) / mPEG-PLA-tocopherol / PLANA / DOPE containing polymer nanoparticles were prepared.
  • Lyophilized preservative contains siRNA / dioTETA / mPEG-PLA-tocopherol / PLANa / DOPE / sucrose Polymer nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 1.
  • the size of the polymer nanoparticles with different lyophilized preservatives was confirmed. Particle size was measured using a dynamic light scattering (DLS) method. Specifically, He-Ne laser was used as a light source, and MALVERN's Zetasizer Nano ZS90 instrument was operated according to the manual.
  • DLS dynamic light scattering
  • heparin competition assay was performed to confirm the in vitro stability of the polymer nanoparticles according to the lyophilized preservatives.
  • 10 ⁇ l of the formulation 300 ng of siRNA
  • 40 ⁇ g of heparin 40 ⁇ g of heparin
  • the disintegrated siRNA was measured by electrophoresis. The lower the siRNA dissolution rate, the better the formulation.
  • only the formulation itself was electrophoresed to measure the unsealed siRNA in the formulation.
  • the unsealed siRNA content was increased with trehalose or mannitol, and with high siRNA with sucrose, trehalose, mannitol and sucrose were not suitable lyophilized preservatives. I could confirm it.
  • siRNA / dioTETA / mPEG-PLA-tocopherol / PLANa / DOPE / freeze preservative polymer nanoparticles prepared in Preparation Example 2 were confirmed at the mRNA level of siRNA in the lung cancer cell line A549. Dispense 5000 cells per well into a 96-well cell culture plate, and after 24 hours, ensure that cells in each well have grown evenly by 50-60%, remove the medium in the wells, and contain new serum containing 10% of the final volume. 90 ⁇ l of medium was added.
  • Preparation Example and Examples 2 to 4 and Comparative Examples 1 and 6 were added to the cell culture medium to contain siRNA at concentrations of 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 5 nM, 0.5 nM and 0.05 nM. Each was added. After incubation for 48 hours in a 37% 5% CO 2 incubator, the culture medium was removed, and 100 ⁇ l of cell lysis mixture was added and reacted at 50 ° C. for 1 hour.
  • branched DNA assay (bDNA, Quantigene 2.0 Assay kit, Panomics, QS0009) was used to confirm mRNA expression. Then, the substrate was added according to the protocol and reacted at room temperature for 5 minutes, followed by a microplate fluorescence reader (Bio-Tek, Synergy HT). ) was used to measure the amount of fluorescence expression.
  • Cell Titer-Glo luminescent cell viability assay (Promega, G7571) was used for the analysis of intracellular toxicity, and the assay sample (100 ⁇ l) and the cell titer assay reagent (100 ⁇ l) were added to the cell plate at room temperature according to the protocol. After reacting for 30 minutes, the value was measured using a microplate fluorescence reader (Bio-Tek, Synergy HT). Cell line efficacy toxicity evaluation results are shown in Table 10.
  • the LC 50 increased and the IC 50 decreased before and after lyophilization, indicating a decrease in toxicity and an increase in efficacy.
  • the results of LC 50 / IC 50 showed good efficacy in the order of 2.5 mg of sorbitol> 5 mg of sorbitol> 10 mg of sorbitol> 2.5 mg of glucose> 2.5 mg of trehalose.

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Abstract

음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조 및 재건 시 우수한 안정성 및 안전성, 및 효능을 나타낼 수 있도록 하는, 동결건조를 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

음이온성 약물 함유 약제학적 조성물의 동결건조 조성물 및 방법
본 발명은 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물의 동결건조 조성물 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 핵산 등의 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물 및 방법, 및 그의 동결건조물에 관한 것이다.
의약품은 건조제제로 완제품화되는 것이 보통이다. 이를 위하여 감압건조, 분무건조, 동결건조 등의 통상적인 건조 방법을 이용할 수 있다. 이 중 동결건조 방법은 물질을 동결시키고, 수증기(water vapor)의 부분압을 낮춤으로써 얼음을 직접 증기로 만드는 승화에 의해 건조하는 방법이다. 이와 같은 동결건조 시 보존제를 사용하는 경우가 많다.
'의약품 첨가제 가이드라인(2015년 12월)'에 따르면, 의약품 제제는 일반적으로 첨가제를 가하여 제제의 안정성, 안전성 또는 균질성을 유지하면서 품질과 경제성을 높이고자 한다. 즉 첨가제는 의약품을 제제화할 때 안정성, 안전성 및 품질 등의 유용성을 높이기 위하여 추가 사용하는 물질을 말하며, 제제화할 때 이들 첨가제를 사용하여 의약품의 품질을 조절하며 일반적으로 다량 사용하는 경우가 많으므로 특별히 안전성도 확립되어야 한다.
음이온성 약물, 특히 핵산은 유전자 치료에 있어서, 그 효능이 검증되었다. 이에 따라 안전하고 효율적인 약물 전달기술이 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 최근에는 비바이러스성 전달체가 활발히 개발되는 중이며, 이러한 비바이러스성 전달체는 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다. 특히, 한국 공개특허 제2017-0032858호는 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 화합물; 양친성 블록 공중합체; 및 폴리락트산염을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물을 개시하고 있다.
상기한 바와 같이, 음이온성 약물의 생체 내, 생체 외로의 전달 효율, 치료 효과 검증 등에 대해서는 연구가 많이 이루어졌지만, 동결건조 보존제에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다. 특히 핵산 종류의 음이온성 약물은 동결 혹은 동결건조 시 구조적인 변화를 나타낼 수 있고, 비바이러스성 전달체의 구조 변화를 야기할 수 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명은 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조 및 재건 시 우수한 안정성 및 안전성, 및 우수한 효능을 나타낼 수 있도록 하는, 동결건조를 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조 및 재건 시 우수한 안정성 및 안전성, 및 우수한 효능을 나타낼 수 있도록 하는, 동결건조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조 및 재건 시 우수한 안정성 및 안전성, 및 우수한 효능을 나타낼 수 있는 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 면은 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 화합물; 양친성 블록 공중합체; 및, 폴리락트산염을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 음이온성 약물 전달용 조성물, 및 동결건조 보존제로서 소비톨(sorbitol)을 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 면은 상기 조성물을 이용하여 동결건조를 수행하는 단계:를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은 상기 방법에 의해 동결건조된, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 본 출원인에 의해 출원된 한국 공개특허 제2017-0032858호에 따른 음이온성 약물 전달용 조성물에 다양한 동결건조 보존제를 첨가하여 동결건조 및 재건을 수행해본 결과, 소비톨을 사용한 경우 예기치 않게 우수한 안정성 및 안전성, 및 우수한 효능을 나타냄을 확인하였다. 즉, 소비톨 첨가 시 다른 보존제, 예를 들어, 트레할로스, 만니톨, 수크로스 또는 글루코스 첨가 시에 비해 동결건조 및 재건 시 낮은 미봉입 약물(예: siRNA) 함량, 낮은 약물(예: siRNA) 와해도, 낮은 독성 및 높은 효능을 동시에 나타낼 수 있음을 최초로 확인하였다.
따라서, 본 발명은 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조에 있어서 동결건조 보존제로서 소비톨을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태에서, 소비톨은 음이온성 약물 1 중량부 대비 1 내지 5,000 중량부로 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 1 내지 4,000 중량부, 보다 더 바람직하게는 5 내지 3,000 중량부, 가장 바람직하게는 5 내지 2,000 중량부로 사용할 수 있다. 상기 중량 범위에서 낮은 미봉입 약물 함량, 낮은 약물 와해도, 낮은 독성 및 높은 효능을 얻을 수 있기 때문이다.
음이온성 약물 전달용 조성물의 구성성분 중, 상기 음이온성 약물과 양이온성 화합물은, 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산염에 의하여 형성된 나노입자 구조 내부에 봉입되고, 이러한 음이온성 약물 및 양이온성 화합물의 복합체가 봉입된 고분자 나노입자 전달체의 대략적인 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하면, 음이온성 약물은 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용을 통해 서로 결합하여, 음이온성 약물과 양이온성 화합물 복합체를 형성한다. 형성된 음이온성 약물과 양이온성 화합물 복합체는, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조 내에 봉입된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조체는 수성 환경에서 양친성 블록 공중합체의 친수성 부분이 나노입자의 외벽을 형성하고 양친성 블록 공중합체의 소수성 부분과 상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 함유된 폴리락트산염이 나노입자의 내벽을 형성하고, 그 형성된 나노입자의 내부에 음이온성 약물과 양이온성 화합물 복합체가 봉입된 구조이다.
상기 음이온성 약물과 양이온성 화합물 복합체는 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조체 내에 봉입된 상태를 유지하여 혈중 또는 체액 내에서의 안정성이 향상된다. 일 실시예에서, 상기 나노입자의 입자 크기는, 10 내지 200 ㎚이며, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 ㎚인 것이 좋다. 또한, 상기 나노입자 입자의 표준 전하는 -20 내지 20 mV이며, 더욱 구체적으로 -10 내지 10 mV인 것이 좋다. 상기 입자 크기 및 표준 전하는, 나노입자 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 음이온성 약물의 흡수도 및 약제학적 조성물로서 멸균의 편의성면에서 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물에 유효성분으로 포함되는 음이온성 약물은 수용액 중에서 분자 내에 음전하를 띄는 약리학적 활성을 가진 모든 물질을 포함하는 개념이다. 구체적인 일 양태로서, 상기 음이온성은, 카르복시기, 포스페이트기 및 설페이트기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기로부터 부여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 양태로서 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 또는 헤파린 등의 다중 음이온성 약물 또는 핵산일 수 있다.
상기 핵산은, 디옥시리보핵산, 리보핵산 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산 약물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme) 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산일 수 있다. 나아가, 상기 핵산은 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식될 수 있다. 구체적으로, 핵산의 포스포다이에스테르(phosphodiester) 결합의 일부를 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 대체하거나, 일부 리보오스 염기의 2'-OH 위치에 메틸기, 메톡시에틸기, 불소 등의 다양한 작용기가 도입된 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다.
또한, 상기 핵산의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 예를 들어, siRNA의 경우 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 또는 3' 말단, 또는 양 말단에 수식될 수 있으며, 바람직하게 센스 가닥의 말단에 수식될 수 있다.
상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
상기 siRNA는, 표적 유전자와 동일한 세포에 존재하는 경우에 siRNA의 서열에 상보적인 mRNA의 분해를 매개함으로써, 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 이중가닥 RNA(duplex RNA), 또는 단일가닥 RNA 내부에서 이중가닥의 형태를 띄는 단일가닥 RNA를 지칭한다. 이중가닥 사이의 결합은, 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지며, 이중가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 서로 결합해야 하는 것은 아니며, 상기 양 가닥은 분리되어 있거나(separate) 분리되어 있지 않을 수 있다. 일 양태로서, 상기 siRNA의 길이는 약 15 내지 60개의(이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다) 뉴클레오티드이며, 구체적으로는, 약 15 내지 30개의 뉴클레오티드이고, 보다 구체적으로는 약 19 내지 25개의 뉴클레오티드인 siRNA를 포함한다.
일 양태로서, 이중가닥 siRNA는 3' 또는 5' 말단에 1-5 뉴클레오티드의 돌출부(overhang)를 한쪽 말단에, 또는 양쪽 말단에 가질 수 있다. 또 다른 예에서는 양 말단이 돌출부를 갖지 않는 블런트(blunt) 형태일 수 있다. 구체적으로는 미국특허공개 제2002-0086356호, 미국특허 제7,056,704호에 개시된 siRNA일 수 있다(상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다).
또한, 상기 siRNA는 두 가닥의 길이가 동일한 대칭적인 구조를 갖거나, 한 가닥이 다른 가닥보다 짧은 비대칭적인 이중가닥 구조일 수 있다. 구체적으로, 19 내지 21 뉴클레오티드(nucleotide, nt)의 안티센스(antisense); 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15 내지 19nt의 센스(sense);로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5' 방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)이고 안티센스의 3' 말단에 1-5 뉴클레오타이드 돌출부(overhang)를 갖는 비대칭 siRNA일 수 있다. 구체적으로 국제특허공개 제09/078685호에 개시된 siRNA일 수 있다.
본 발명에서, 음이온성 약물은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 8 중량%로 포함되는 것이 좋다. 상기 음이온성 약물의 함량이 0.001 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
구체적인 일 양태에서, 상기 양이온성 화합물은, 음이온성 약물과 정전기적 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입된다. 따라서, 상기 양이온성 화합물은, 음이온성 약물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 형태의 화합물을 포함하며, 예를 들어, 지질과 고분자 종류일 수 있다. 양이온성 지질은, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타-[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민(COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다. 이러한 양이온성 지질을 사용하는 경우, 양이온성 지질로부터 유발되는 독성을 감소시키기 위하여 분자 내의 양이온 밀도가 높은 폴리양이온성 지질을 적게 사용하는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 분자당 수용액 상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나일 수 있다. 이에 따라, 보다 바람직한 일 양태에서, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'- 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 한편, 양이온성 고분자는 키토산(chitosan), 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 프로타민(protamine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리아미도아민(PAMAM), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 덱스트란(dextran), 히알루론산(hyaluronic acid), 알부민(albumin), 고분자폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVAm)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 고분자폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.
구체적인 일 양태에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 7의 양이온성 지질일 수 있다:
[화학식 7]
Figure PCTKR2018013964-appb-I000001
상기 식에서,
n과 m은 각각 0 내지 12이되, 2 ≤ n + m ≤ 12이며, a와 b는 각각 1 내지 6이며, R1과 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
바람직하게는, n과 m은 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n + m ≤ 10일 수 있다.
바람직하게는, a와 b가 2 내지 4일 수 있다.
바람직하게는, R1과 R2는, 각각 독립적으로, 라우릴(lauryl), 미리스틸(myristyl), 팔미틸(palmityl), 스테아릴(stearyl), 아라키딜(arachidyl), 베헨닐(behenyl), 리그노세릴(lignoceryl), 세로틸(cerotyl), 미리스트올레일(myristoleyl), 팔미트올레일(palmitoleyl), 사피에닐(sapienyl), 올레일(oleyl), 리놀레일(linoleyl), 아라키도닐(arachidonyl), 에이코사펜타에닐(eicosapentaenyl), 에루실(erucyl), 도코사헥사에닐(docosahexaenyl), 및 세로틸(cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
양이온성 지질의 구체적인 예는 1,6-디올레오일트리에틸렌테트라마이드, 1,8-디리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 1,4-디미리스톨레오일디에틸렌트리아마이드, 1,10-디스테아로일펜타에틸렌헥사마이드 및 1,10-디올레오일펜타에틸렌헥사마이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 양이온성 화합물은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.01 내지 50 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 10 중량% 포함될 수 있다. 상기 양이온성 지질의 함량이 0.01 중량% 미만이면 음이온성 약물과 복합체를 형성할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50 중량%를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 화합물과 음이온성 약물은, 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 복합체를 형성한다. 구체적인 일 양태로서, 상기 음이온성 약물(P)과 양이온성 화합물(N)의 전하량의 비율(N/P; 음이온성 약물의 음이온 전하에 대한 양이온성 화합물의 양이온 전하 비율)은, 0.1 내지 128이며, 구체적으로는 0.5 내지 64, 더 구체적으로는 1 내지 32이고, 보다 더 구체적으로는 1 내지 24, 가장 구체적으로는 6 내지 24인 것이 좋다. 상기 비율(N/P)이 0.1 미만인 경우에는 충분한 양의 음이온성 약물을 포함하는 복합체를 형성하기 어렵기 때문에, 0.1 이상이어야 충분한 양의 음이온 약물을 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 비율(N/P)이 128 초과시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로, 128 이하로 하는 것이 좋다.
구체적인 일 양태에서, 상기 양친성 블록 공중합체는, 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는, 수용액 상에서, 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 나노입자를 형성한다.
이와 관련하여, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50,000 달톤, 보다 구체적으로는 1,000 내지 20,000 달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000 달톤인 것일 수 있다.
또한, 필요에 따라 친수성 A 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기, 리간드, 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산염으로 형성된 고분자 나노입자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 나노입자 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드(anisamide), 비타민 B9(엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일 실시예에서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50,000 달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000 달톤, 보다 더 구체적으로는 5,00 내지 5,000 달톤인 것일 수 있다. 또한, 소수성 블록의 소수성을 증가시켜 나노입자의 안정성을 향상시키기 위하여 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 소수성 블록 말단의 히드록시기에 화학적으로 결합시킬 수 있다.
상기 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은, 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 40 내지 99.98 중량%이며, 구체적으로는 50 내지 99.8 중량%, 더 구체적으로는 60 내지 90 중량%인 것이 좋다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 40 중량% 미만이면 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고, 함량이 99.98 중량%를 초과하면 함입할 수 있는 음이온성 약물의 함량이 너무 적어지게 된다.
또 다른 일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 40 내지 70 중량%, 구체적으로는 50 내지 60 중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 40 중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 나노입자를 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 나노입자를 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 40 중량% 이상인 것이 좋은 한편, 70 중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아 고분자 나노입자의 안정성이 낮아져서 음이온성 약물/양이온성 지질 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 나노입자 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 70 중량% 이하인 것이 좋다.
구체적인 일 양태에서, 상기 양친성 블록 공중합체는 수용액 상에서 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 나노입자 구조 내부에 봉입시키는데, 이 때 양친성 블록 공중합체의 중량(b) 대비 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 중량(a) 비율[a/b X 100;(음이온성 약물 중량+양이온성 지질 중량)/양친성 블록 공중합체 중량 X 100]은, 0.001 내지 100 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 50 중량%, 보다 구체적으로는 0.1 내지 20 중량%일 수 있다. 상기 중량 비율이, 0.001 중량% 미만인 경우에는 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 함량이 지나치게 낮아져서 음이온성 약물이 효과적으로 작용할 수 있는 유효 함량을 충족시키기 어려우며, 반대로 100 중량% 초과시에는 양친성 블록 공중합체의 분자량과 음이온성 약물 및 지질 복합체의 양을 고려할 때 적절한 크기의 나노입자 구조를 형성하지 못하기 때문이다.
본 발명에 따른 조성물 중 나노입자 구조체는 폴리락트산염(PLANa)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 폴리락트산염은 나노입자의 코어(내벽)에 분포하여 코어의 소수성을 강화시켜 나노입자를 안정시킴과 동시에 체내에서 세망내피계(RES)를 효과적으로 회피하는 역할을 한다. 즉, 폴리락트산염의 카르복실산 음이온이 폴리락트산보다 효과적으로 양이온성 복합체와 결합하여 고분자 나노입자의 표면전위를 감소시켜 폴리락트산염을 포함하지 않는 고분자 나노입자에 비해 표면전위의 양성 전하가 감소하여 세망내피계에 의해 덜 포획되고, 이로 인하여 목적하는 부위(예컨대, 암세포, 염증세포 등)로의 전달 효율이 우수하다는 장점이 있다.
상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 나노입자 내벽 성분으로 포함되는 폴리락트산염은 수평균분자량이 500 내지 50,000 달톤, 구체적으로 1,000 내지 10,000 달톤인 것이 좋다. 분자량이 500 달톤 미만이면 소수성이 너무 낮아 나노입자의 코어(내벽)에 존재하기 어렵고, 분자량이 50,000 달톤을 초과하면 고분자 나노입자의 입자가 커지는 문제가 있다.
상기 폴리락트산염은 양친성 블록 공중합체 100 중량부에 대하여 1 내지 200 중량부, 구체적으로 1 내지 100 중량부, 더 구체적으로 10 내지 60 중량부로 사용될 수 있다. 폴리락트산염의 함량이 양친성 블록 공중합체 100 중량부 대비 200 중량부를 초과하면 나노입자의 크기가 증가하여, 멸균막을 사용한 여과가 어렵게 되고, 1 중량부 미만이면 목적하는 효과를 충분히 얻을 수 없다.
일 구체예에서, 음이온성 약물 1 중량부 대비 양친성 블록 공중합체를 10 내지 1,000 중량부, 폴리락트산염을 5 내지 500 중량부로 함유할 수 있다. 바람직하게는 양친성 블록 공중합체를 50 내지 800 중량부, 보다 바람직하게는 100 내지 500 중량부로 함유할 수 있다. 바람직하게는, 폴리락트산염을 5 내지 300 중량부, 보다 바람직하게는 10 내지 100 중량부로 함유할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 폴리락트산염의 말단 중 카르복실산나트륨의 반대편의 말단은, 히드록시, 아세톡시, 벤조일옥시, 데카노일옥시, 팔미토일옥시 및 탄소수 1 내지 2개의 알콕시로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나로 치환될 수 있다.
바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 폴리락트산염은 하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018013964-appb-I000002
상기 식 1에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2-이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2018013964-appb-I000003
상기 식 2에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2018013964-appb-I000004
상기 식 3에서, W-M'는
Figure PCTKR2018013964-appb-I000005
또는
Figure PCTKR2018013964-appb-I000006
이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2018013964-appb-I000007
상기 식 4에서, S는
Figure PCTKR2018013964-appb-I000008
이고; L은 -NR1- 또는 -0-이며, 여기서 R1은 수소원자 또는 C1- 10알킬이고; Q는 CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, 또는 CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2018013964-appb-I000009
또는
Figure PCTKR2018013964-appb-I000010
상기 식 5에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이다.
[화학식 6]
Figure PCTKR2018013964-appb-I000011
상기 식 6에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
상기 폴리락트산염은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물인 것인 바람직하다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 음이온성 약물의 세포 내 전달 효율을 증가시키기 위하여 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.01 내지 50 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 10 중량%의 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 융합성 지질은 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체에 혼합시, 소수성 상호작용으로 결합하여 음이온성 약물, 양이온성 지질 및 융합성 지질의 복합체를 형성하고, 상기 융합성 지질을 포함하는 복합체는 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입된다. 일 구체예에서, 상기 융합성 지질은 인지질, 콜레스테롤, 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
구체적으로, 상기 인지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산(phosphatidic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산은 하나 또는 2개의 C10-24 지방산과 결합된 형태일 수 있다. 상기 콜레스테롤 및 토코페롤에는 콜레스테롤 및 토코페롤의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
구체적으로는 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 융합성 지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디팔미토올레오일포스포콜린(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 디팔미토올레오일포스포에탄올아민(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적인 일 양태로서, 본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염 나노입자 구조체에 봉입된 음이온 약물-양이온성 화합물 복합체 함유 조성물은, 혈관, 근육, 피하, 경구, 뼈, 경피 또는 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있고, 이러한 투여 경로에 적합하게, 다양한 경구 또는 비경구 투여 제제로 제형화될 수 있다. 상기 경구 투여 제제로는 정제, 캡슐, 분체 제제, 액제 등, 비경구 투여 제제로는 점안제, 주사제 등 다양한 제제를 예시할 수 있는데, 바람직한 일 양태로서, 상기 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물의 동결건조물을 주사용 증류수, 0.9% 생리식염수 및 5% 덱스트로스 수용액 등으로 재건하여 주사용 제제 형태로 제조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 음이온성 약물 전달용 조성물에 대해 우수한 안정성 및 안전성, 및 효능을 유지하도록 하는 동결건조 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 음이온성 약물 및 양이온성 화합물의 복합체가 봉입된 고분자 나노입자 전달체의 개략적인 구조를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
[ 제조예 ] KRAS siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA )/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE 함유 고분자 나노입자 제조
KRAS siRNA 5 ㎍은 증류수 94.52 ㎕에 녹이고, dio-TETA 94.52 ㎍은 94.52 ㎕의 20 mM 아세테이트 버퍼(pH 4.6)에 녹인 후 초음파 분쇄 상태에서 한 방울씩 섞어주었다. 이 혼합물을 동결건조시켜 분말 상태로 만들어 준 후 에틸아세테이트 10 ㎕로 분말을 녹여주었다. 여기에 PLANa 300 ㎍을 에틸아세테이트 15 ㎕에 녹인 용액, DOPE 104.2 ㎍을 에틸아세테이트 5.2 ㎕에 녹인 용액, mPEG-PLA-토코페롤 1000 ㎍을 에틸아세테이트 20 ㎕에 녹인 용액을 차례로 넣어준 후 섞어 주었다. 본 혼합액을 증류수 100 ㎕에 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에틸아세테이트를 선택적으로 제거하여 siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드(dio-TETA)/mPEG-PLA-토코페롤 /PLANA/DOPE 함유 고분자 나노입자를 제조하였다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000001
[ 실시예 1-4] KRAS siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio -TETA)/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE/소비톨 함유 고분자 나노입자 동결건조 제제 제조
제조예에서 제조한 고분자 나노입자의 농도를 siRNA 100 ng/㎕로 고정한 후 소비톨을 넣고 초저온냉동고에서 얼린 후 동결건조를 실시하였다. 동결건조 조건은 아래의 표 2에 나타낸 바와 같다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000002
동결건조가 완료된 분말에 상온의 멸균증류수를 넣고 흔들어 녹임으로써 siRNA/dio-TETA/mPEG-PLA-토코페롤/DOPE/소비톨 함유 조성물을 제조하였다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000003
[ 비교예 1-4] KRAS siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio -TETA)/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE/트레할로스 함유 고분자 나노입자 동결건조 제제 제조
동결건조 보존제로 트레할로스를 포함하는 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE/트레할로스 함유 고분자 나노입자를 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000004
[ 비교예 5] KRAS siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio -TETA)/mPEG-PLA-토코페롤 / PLANa /DOPE/만니톨 함유 고분자 나노입자 동결건조 제제 제조
동결건조 보존제로 만니톨을 포함하는 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE/만니톨 함유 고분자 나노입자를 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000005
[ 비교예 6] KRAS siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio -TETA)/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE/수크로스 함유 고분자 나노입자 동결건조 제제 제조
동결건조 보존제로 수크로스를 포함하는 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE/수크로스 함유 고분자 나노입자를 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000006
[ 비교예 7] KRAS siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio -TETA)/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE/글루코스 함유 고분자 나노입자 동결건조 제제 제조
동결건조 보존제로 글루코스를 포함하는 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 /PLANa/DOPE/글루코스 함유 고분자 나노입자를 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000007
[ 실험예 1] siRNA / dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤/ PLANa /DOPE/동결건조 보존제 함유 고분자 나노입자의 사이즈 측정과 안정성 비교(헤파린 경쟁 분석법)
동결건조 보존제 종류를 달리한 고분자 나노입자의 사이즈를 확인하였다. 동적 광산란(DLS: dynamic light scattering) 방법을 이용하여 입자의 크기를 측정하였다. 구체적으로, He-Ne 레이져를 광원으로 사용하였으며, MALVERN사의 Zetasizer Nano ZS90 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다.
또한, 동결건조 보존제 종류에 따른 고분자 나노입자의 in vitro 안정성을 확인하기 위해 헤파린 경쟁분석법을 실시하였다. 제형 10 ㎕(siRNA 300 ng)에 헤파린 40 ㎍을 처리하여 10분간 상온에 반응시킨 후 전기영동을 통해 와해된 siRNA를 측량하였다. siRNA 와해도가 낮을수록 안정성이 우수한 제형이다. 더불어 제형 자체만을 전기영동하여 제형 내 미봉입된 siRNA 또한 측량하였다.
동결건조 보존제 종류를 달리한 실시예 2와 비교예 1, 4 내지 6의 미봉입 siRNA, 입자 크기, siRNA 와해도 결과를 아래의 표 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000008
표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 트레할로스나 만니톨을 사용한 경우 미봉입 siRNA 함량이 증가하고, 수크로스를 사용한 경우 siRNA 와해도가 높은 것으로 나타나, 트레할로스, 만니톨 및 수크로스는 적절한 동결건조 보존제가 아님을 확인할 수 있었다.
동결건조 보존제 중 소비톨과 트레할로스의 함량을 달리한 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 분석결과를 아래 표 9에 나타내었다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000009
표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 트레할로스를 사용한 경우 미봉입 siRNA 함량이 증가하고, 트레할로스 양이 증가할수록 siRNA 와해도도 증가하는 것으로 나타나, 트레할로스는 적절한 동결건조 보존제가 아님을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 2] siRNA / dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤/ PLANa /DOPE/동결건조 보존제 함유 고분자 나노입자의 세포 효능 및 독성 비교
제조예와 실시예 2에서 제조된 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤/PLANa/DOPE/동결보존제 고분자 나노입자에 대해 폐암 세포주인 A549에서 siRNA의 전달효능을 mRNA 수준에서 확인하였다. 96웰 세포 배양판에 웰당 5000개의 세포를 분주하고 24시간 후 각 웰의 세포가 50~60% 정도 균일하게 성장한 것을 확인한 후, 웰 안에 배지를 제거하고 최종 부피의 10%의 혈청을 함유하는 새 배지를 90 ㎕씩 첨가하였다. 제조예와 실시예 2 내지 4와 비교예 1 및 6의 조성물을 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 5 nM, 0.5 nM, 0.05 nM의 농도로 siRNA가 함유되도록 상기의 세포 배양 배지에 각각 가하였다. 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양 후 배양액을 제거하고 cell lysis mixture 100 ㎕를 넣어 50 ℃에서 1시간 동안 반응시켜 주었다. 그 후 mRNA 발현 확인을 위해 Branched DNA assay(bDNA, Quantigene 2.0 Assay kit, Panomics, QS0009)을 이용하였고, 프로토콜에 따라 2.0 substrate를 넣고 상온에서 5분간 반응시킨 후 microplate fluorescence reader(Bio-Tek, Synergy HT)를 이용하여 형광 발현양을 측정하였다. 또한, 세포 내 독성 분석을 위해 Cell Titer-Glo luminescent cell viability assay(Promega, G7571)을 이용하였고 프로토콜에 따라 상온화시킨 cell plate에 분석샘플(100 ㎕)과 cell titer assay reagent(100 ㎕)를 넣고 30분간 반응시켜준 후 microplate fluorescence reader(Bio-Tek, Synergy HT)기를 이용하여 값을 측정하였다. 세포주 효능 독성 평가 결과는 표 10에 나타내었다.
Figure PCTKR2018013964-appb-T000010
표 10에서 명시된 바와 같이, 동결건조 전보다 후에서 LC50이 증가하고 IC50이 감소한 것으로 보아 독성은 감소되고 효능은 증가하는 경향을 보였다. LC50/IC50의 결과, 소비톨 2.5 ㎎ > 소비톨 5 ㎎ > 소비톨 10 ㎎ > 글루코스 2.5 ㎎ > 트레할로스 2.5 ㎎ 순서대로 우수한 효능을 보였다.

Claims (13)

  1. 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 화합물; 양친성 블록 공중합체; 및 하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 폴리락트산염을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 음이온성 약물 전달용 조성물, 및 동결건조 보존제로서 소비톨을 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000012
    상기 식 1에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2-이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000013
    상기 식 2에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이다.
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000014
    상기 식 3에서, W-M'는
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000015
    또는
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000016
    이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이다.
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000017
    상기 식 4에서, S는
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000018
    이고; L은 -NR1- 또는 -0-이며, 여기서 R1은 수소원자 또는 C1- 10알킬이고; Q는 CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, 또는 CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다.
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000019
    또는
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000020
    상기 식 5에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이다.
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000021
    상기 식 6에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 음이온성 약물 100 중량부 대비 소비톨을 1 ~ 5,000 중량부로 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 약물은 핵산인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 화합물은 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC 콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민(COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 하기 화학식 7의 양이온성 지질인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물:
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2018013964-appb-I000022
    상기 식에서, n과 m은 각각 0 내지 12이되, 2 ≤ n + m ≤ 12이며, a와 b는 각각 1 내지 6이며, R1과 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
  7. 제6항에 있어서, R1과 R2는, 각각 독립적으로, 라우릴(lauryl), 미리스틸(myristyl), 팔미틸(palmityl), 스테아릴(stearyl), 아라키딜(arachidyl), 베헨닐(behenyl), 리그노세릴(lignoceryl), 세로틸(cerotyl), 미리스트올레일(myristoleyl), 팔미트올레일(palmitoleyl), 사피에닐(sapienyl), 올레일(oleyl), 리놀레일(linoleyl), 아라키도닐(arachidonyl), 에이코사펜타에닐(eicosapentaenyl), 에루실(erucyl), 도코사헥사에닐(docosahexaenyl), 및 세로틸(cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 A-B 형 이중 블록 공중합체이며, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 소수성 B 블록의 말단 히드록시기는 콜레스테롤, 토코페롤, 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 융합성 지질(fusogenic lipid)을 추가로 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤, 및 토코페롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조를 위한 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용하여 동결건조를 수행하는 단계:
    를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조 방법.
  13. 제12항에 따른 방법에 의해 동결건조된, 음이온성 약물 전달용 조성물의 동결건조물.
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