KR101694220B1 - 세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체 - Google Patents

세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체 Download PDF

Info

Publication number
KR101694220B1
KR101694220B1 KR1020150018723A KR20150018723A KR101694220B1 KR 101694220 B1 KR101694220 B1 KR 101694220B1 KR 1020150018723 A KR1020150018723 A KR 1020150018723A KR 20150018723 A KR20150018723 A KR 20150018723A KR 101694220 B1 KR101694220 B1 KR 101694220B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pep
sirna
peptide
cancer
conjugate
Prior art date
Application number
KR1020150018723A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160096971A (ko
Inventor
김병현
박정우
Original Assignee
포항공과대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포항공과대학교 산학협력단 filed Critical 포항공과대학교 산학협력단
Priority to KR1020150018723A priority Critical patent/KR101694220B1/ko
Publication of KR20160096971A publication Critical patent/KR20160096971A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101694220B1 publication Critical patent/KR101694220B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 세포내 전달능이 증진된 암표적 siRNA 접합체 (small interfeing RNA conjugates), 및 상기 접합체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 암표적 siRNA 접합체를 이용하여, 우수한 세포내 전달능 증진효과 및 표적 유전자 발현 억제효과를 확인하였는바, 암의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체 {small interfering RNA conjugates having enhanced intracellular delivery}
본 발명은 세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체, 및 상기 접합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
RNAi (RNA interference)는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. RNAi 는 처음에 선충에서 발견되었지만, 현재는 효모, 곤충, 식물, 인간 등 각종 동식물에서 매우 잘 보존이 되어 있는 생명현상으로 관찰되고 있다.
한편, siRNA(small interference RNA)는 RNAi를 유도하는 물질로서, 약 20 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성된 짧은 RNA 이중나선 가닥을 말하며, siRNA를 세포 내로 주입시켜 상기 siRNA와 염기서열이 상보적인 mRNA를 표적으로 삼아 유전자 발현을 억제하게 된다. 따라서, siRNA는 유전자 치료를 통한 질병 치료 효과를 가지며, 쉬운 제조법 및 높은 표적 선택성 등으로 인해 표적이 되는 단백질 발현 프로세스를 조절할 수 있는 효과적인 수단으로 각광을 받고 있다. 현재 siRNA를 이용하여 치료할 수 있는 질환으로, 암, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환 등이 연구되고 있으며, 임상적 시도로서 노인성 황반변성, 호흡기 신시치아 바이러스 감염증에 대한 치료제로서의 가능성이 보고된 바 있다.
그러나, siRNA는 안정성이 낮아 생체 내에서 단시간에 분해되며, siRNA의 음이온성으로 인하여 같은 음전하를 띄는 세포막을 쉽게 투과하기 힘들어 세포 내로의 전달성이 떨어진다는 문제가 있으므로 질병의 치료 용도로 이용함에 있어서 어려움을 겪고 있는 실정이다.
기존의 siRNA 전달체로, siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 사용되거나, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 또는 리포좀에 기반한 전달체가 주로 사용되었다. 그러나, 바이러스성 전달체의 경우 전달하려는 유전자의 크기에 제한을 받게 되고, 바이러스 벡터의 표면 단백질의 면역원성으로 인한 면역 부작용을 일으켜 체내 안정성이 보장되지 못하는 문제가 지적되었다. 또한, 양이온성 분자 또는 합성 고분자를 이용한 전달체의 경우 세포 내로의 수송 효율이 낮으며 세포 내로의 유전자 전달과정에서 유발될 수 있는 세포 독성에 대한 문제가 있다.
따라서, 상기의 문제점들을 극복하고자 세포내 전달능이 향상된 새로운 siRNA 전달체의 개발이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에, 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2014-0021395), 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체, 및 콜레스테롤이 도입된 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체에서의 세포내 유입 촉진 및 표적 유전자의 발현 억제를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 표적화 펩타이드 및 siRNA (small interfeing RNA)를 포함하되, 상기 표적화 펩타이드와 siRNA는 이황화 결합에 의해 연결(Conjugation)된 것을 특징으로 하는, 세포 전달능이 증진된 siRNA 접합체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 siRNA 접합체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적화 펩타이드 및 siRNA (small interfeing RNA)를 포함하되, 상기 표적화 펩타이드와 siRNA는 이황화 결합에 의해 연결(Conjugation)된 것을 특징으로 하는, 세포 전달능이 증진된 siRNA 접합체을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 접합체는 상기 표적화 펩타이드에 결합된 콜레스테롤을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 siRNA (small interfeing RNA)는 VEGF (Vascular Endothelial Cell Growth Factor)를 표적으로 하며, 서열번호 1로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 표적화 펩타이드는 암표적 펩타이드이며, 서열번호 3로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 표적화 펩타이드는 소수성잔기로 이루어진 간세포암 표적화 펩타이드이며, 서열번호 5로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 암표적 siRNA 접합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 siRNA 접합체를 포함하는 조성물의 암의 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 siRNA 접합체 (small interfeing RNA conjugates)는 표적화 펩타이드와 연결(Conjugation)시킴으로써, 펩타이드의 물리적 특성의 제한 없이 세포전달능을 증진시킬 수 있다. 또한, 암표적 펩타이드와 연결된 siRNA 접합체에 콜레스테롤(cholesterol)을 추가적으로 도입함으로써, 더욱 우수한 세포전달능 및 표적 유전자 발현 억제 효과를 확인하였는바, 암의 예방 또는 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 세포전달능이 증진된 펩타이드 siRNA 접합체는 세포독성이 매우 낮아 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 (a) CREKA 펩타이드 및 (b) chol-CREKA 펩타이드 합성 과정에 대한 개략적인 모식도이다.
도 2는 CREKA 또는 chol-CREKA와 VEGF siRNA간 이황화 결합을 통한 siP 및 siCP 합성 과정에 대한 개략적인 모식도이다.
도 3은 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (PEP-C-J, PEP-H-J, 및 PEP-A-J)의 합성과정에 대한 개략적인 모식도 이다.
도 4는 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (PEP-C-J)의 MALDI-TOF mass spectrometry 결과이다.
도 5는 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (PEP-H-J)의 MALDI-TOF mass spectrometry 결과이다.
도 6은 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (PEP-A-J)의 MALDI-TOF mass spectrometry 결과이다.
도 7은 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (siP)의 MALDI-TOF mass spectrometry 결과이다.
도 8은 콜레스테롤이 도입된 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (siCP)의 MALDI-TOF mass spectrometry 결과이다.
도 9는 양이온성 펩타이드(PEP-C), 소수성 펩타이드(PEP-H), 및 양친매성 펩타이드(PEP-A)와 siRNA간 복합체 형성여부를 agarose gel retardation assay로 확인한 결과이다 (A : PEP-C; B : PEP-H; C : PEP-A; D : PEP-C 및 PEP-H; E : PEP-C).
도 10은 다양한 molar ratio(16, 32, 64)의 PEP-C-X, PEP-H-X, PEP-A-X에 의한 세포 활성도 변화를 비교한 결과이다.
도 11은 다양한 농도(10nM, 50nM, 100nM)의 PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J에 의한 세포 활성도 변화를 비교한 결과이다.
도 12는 fluorescein로 표지된 PEP-C-X, PEP-H-X, 및 PEP-A-X의 세포 내 유입 여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 확인한 결과이다 (A, B : fluorescein로 표지된 siRNA; C, D: fluorescein로 표지된 PEP-C-X; E, F: fluorescein로 표지된 PEP-H-X; G, H : fluorescein로 표지된 PEP-H-X).
도 13은 fluorescein로 표지된 PEP-C-J, PEP-H-J, 및 PEP-A-J의 세포 내 유입 여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 확인한 결과이다 (I, J : fluorescein로 표지된 siRNA; K, L: fluorescein로 표지된 PEP-C-J; M, N: fluorescein로 표지된 PEP-H-J; O, P : fluorescein로 표지된 PEP-H-J).
도 14는 다양한 molar ratio(16, 32, 64)의 PEP-C-X, PEP-H-X, PEP-A-X에 의한 VEGF 발현억제를 비교한 결과이다.
도 15는 다양한 농도(10nM, 50nM, 100nM)의 PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J에 의한 VEGF 발현억제를 비교한 결과이다.
도 16은 콜레스테롤이 도입된 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (siCP)의 구성 및 세포내 유입에 대한 개략적인 모식도이다.
도 17은 siN과 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J)의 CD spectra 결과이다.
도 18은 siN과 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (siC, siP, siCP)의 CD spectra 결과이다.
도 19는 siN, sPEP-C-J, PEP-H-J, 및 PEP-A-J의 온도변화에 따른 흡광도 변화를 나타낸 결과이다.
도 20은 siN, siC, siP, 및 siCP의 온도변화에 따른 흡광도 변화를 나타낸 결과이다.
도 21은 다양한 농도(10nM, 50nM, 100nM)의 siN, siC, siP, 및 siCP에 의한 세포 활성도 변화를 비교한 결과이다.
도 22는 luorescein로 표지된 siN의 세포 내 유입여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 확인한 결과이다.
도 23은 fluorescein로 표지된 siC의 세포 내 유입여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 확인한 결과이다.
도 24는 luorescein로 표지된 siP의 세포 내 유입여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 확인한 결과이다.
도 25는 fluorescein로 표지된 siCP의 세포 내 유입여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 확인한 결과이다.
도 26은 fluorescein로 표지된 siN, siC, siP, 및 siCP에 의한 fluorescein의 형광세기를 비교한 결과이다.
도 27은 다양한 농도(10nM, 50nM, 100nM)의 siN, siC, siP, 및 siCP에 의한 VEGF 발현억제를 비교한 결과이다.
본 발명자들은, 기존의 siRNA 전달체가 가지는 문제점을 개선하여 세포 내 전달능이 향상된 새로운 siRNA 전달체를 개발하고자 노력한 결과, 콜레스테롤 (cholesterol), 및 암표적 펩타이드를 포함하는, 암표적 siRNA 접합체를 고안하였으며, 상기 siRNA 접합체의 우수한 세포내 유입 촉진 및 표적 유전자 발현 억제효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표적화 펩타이드 및 siRNA (small interfeing RNA)를 포함하되, 상기 표적화 펩타이드와 siRNA는 이황화 결합에 의해 연결(Conjugation)된 것을 특징으로 하는, 세포 전달능이 증진된 siRNA 접합체를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA(small interfeing RNA)"는 약 20 내지 30개의 base pair로 구성되어 있는 핵산을 말하며, 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA를 표적으로 하여 유전자 발현을 억제하는 역할을 한다. 최근, 상기와 같은 siRNA의 기능을 이용한 유전자 치료(gene therapy)에 대한 관심이 집중되고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "접합체(Conjugation)"는 5′에 thiol이 도입된 siRNA를 이용하여, 표적화 펩타이드와 이황화 결합에 의해 연결된 것으로서, 단순한 혼합에 의해 합성된 복합체(Complex)와는 다른 성질을 가진다. 보다 구체적으로 복합체의 경우, 펩타이드의 물리적 성질에 따라 복합체 의 형성 또는 세포 전달능의 차이를 보이는 반면, 접합체는 상기의 제한없이 세포 전달능을 향상시킬 수 있다는 점에서 우수한 효과를 가지고 있다.
한편, 본 발명에서 표적으로 하는 혈관 상피세포 성장인자 (VEGF, Vascular Endothelial Cell Growth Factor)는 암세포에서 다량 분비되는 물질로서, 그 수용체인 VEGFR(VEGF Receptor)과 결합하여 암세포의 성장에 필요한 양분을 공급을 위한 혈관신생(angiogenesis)를 일으키는 역할을 하므로, 상기 siRNA를 이용하여 VEGF의 발현을 억제시킴으로써, 암의 예방 또는 치료에 이용하고자 하였다. 상기 siRNA는 바람직하게는 서열번호 1로 이루어 질 수 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 siRNA는 음이온성으로 인하여 양이온성 물질과 혼합체를 형성하여도 안정성이 확보되지 않으므로 DNA 전달과 유사한 방법으로 세포내로의 전달이 어려울 뿐만 아니라, 같은 음전하를 띄는 세포막을 쉽게 투과하기 힘들어 세포 내로의 전달성이 떨어진다는 문제점이 존재하였다. 이에, 본 발명자들은 콜레스테롤이 도입된 siRNA를 고안하였으며, 이와 함께 siRNA의 표적 특이성을 증진시키기 위하여, 암표적 펩타이드 및 콜레스테롤을 포함하는 siRNA 접합체를 고안하였다.
상기 암표적 펩타이드는 바람직하게 서열번호 3로 이루어 질 수 있으나, 이로서 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 우선, 펩타이드의 물리적 성상에 따른 siRNA 복합체 형성의 차이를 확인하였으며, siRNA 복합체와 접합체의 세포활성도를 비교평가하였다 (실시예 1 및 2). 또한, siRNA 복합체와 비교하여, siRNA 접합체의 펩타이드의 성질에 제한되지 않는 우수한 세포 내 유입 촉진 효과 및 VEGF 유전자 발현 억제 효과를 확인하였다(실시예 3 및 4). 더 나아가, 본 발명자는 콜레스테롤, 및 암표적 펩타이드를 포함하는 siRNA 접합체를 제조하여 상기 siRNA 접합체의 구조적 및 열적 안정성을 확인하였으며, 더욱 우수한 세포 활성도, 세포 유입 촉진 효과, 및 유의적인 VEGF 유전자의 발현 억제효과를 확인하였는바, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 4 내지 8 ).
이에, 본 발명은 상기 표적화 siRNA 접합체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제 시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "암(cancer)" 은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 발명에서 암의 종류로는 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 자궁암, 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니고, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 얄려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01mg 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. 세포배양 및 형질전환
MCF-7 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, HyClone)에서 배양하였으며, 10% fetal bovine serum (HyClone), streptomycin (100μg/ml), 및 penicillin (100UmL-1)을 첨가하여, 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 이 후, confluent한 상태로 자란 세포를 Trypsin/EDTA 처리하여 split하였다. Huh-7 세포는 well 당 2.50 × 104 밀도가 되도록 씨딩하였으며, 상기 well은 10% FBS가 첨가된 DMEM (2.00ml)를 포함하며, 4시간 동안 배양하였다.
MCF-7 세포는 혈청이 없는 조건에서, siN, siC, siP, siCP, 및 Lipofectamine™ 2000로 형질전환 하였다. 상기 세포는 37℃, CO2 배양기에서 6시간 동안 배양하였으며, 10% FBS가 첨가된 DMEM (2.00ml)로 바꾸어 주었다. 18시간 동안 추가적으로 배양시키고, 세포 배지를 수거한 후, VEGF ELISA kit (QIA51 VEGF ELISA Kit, Human, Calbiochem)를 이용하여, VEGF의 발현 정도를 분석하였다.
2. 펩타이드의 합성
본 발명에서는, 양이온성 펩타이드(PEP-C, CRRRKK; 서열번호 4), 소수성 펩타이드(PEP-H, CPFVYLI; 서열번호 5), 양친매성 펩타이드(PEP-A, CRRRKKPFVYLI; 서열번호 6), 암표적 펩타이드(CREKA; 서열번호 3), 및 콜레스테롤이 도입된 암표적 펩타이드(Chol-CREKA)를 합성하였다.
각각의 펩타이드 고상 합성법(Solid phase synthesis)을 통하여 합성하였으며, 우선, 고체상 지지체인 Rink amide AM resin(100mg, 0.068 mmol, 200-400 mesh, novabiochem)에서 C 말단이 아마이드화된 펩타이드를 합성하였다. Fmoc로 보호된 아미노산의 커플링 시약으로 1-hydroxybenzotriazole (HOBT, 27.6 mg, 0.204 mmol), O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N´,N´-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU, 65.5mg, 0.204mmol), 및 N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 71.3 μL, 0.408 mmol)을 이용하였으며, 실온 조건에서, 1.00mL의 DMF 존재 하, 단계적인 반응을 수행하였다. 또한, 콜레스테롤이 도입된 암표적 펩타이드(Chol-CREKA) 합성을 위하여, 상기 방법에서, 마지막 단계를 Fmoc로 보호된 아미노산 대신, cholesterylchloroformate (183mg, 0.408mmol)를 도입하였다.
모든 반응은 polypropylene syringes내에서 진행되었으며, 무수용매가 이용되었다. IKAVibrax-KS 130 Basic orbital shaker를 통해 밤새도록 교반하였고, trifluoroacetic acid (TFA), CH2Cl2, triethylsilane(60:38:2)를 두시간 동안 처리하여 Cleavage와 Deprtection하였으며, 수지(resin)는 여과를 통해 제거되었다.
펩타이드는 저온의 Et2O를 첨가함으로써 침전시켰으며, 상기 침전물을 저온의 Et2O로 세척한 후, t-BuOH/H2O (3:1,1.50mL)을 이용하여 동결건조시켰다. 이 후, reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)와 semi-preparative Vydac C-18 column (Cat. 218TP510, buffer A, 0.1% TFA ; buffer B, MeCN)을 이용하여, 상기 펩타이드를 정제하였으며, 2.50mL/min의 유량 (flow rate)에서 buffer B의 농도를 5% (0 min), 98 % (25min), 5% (30min)로 변화시킴으로써, 농도 기울기에 따라 용출하였다.
펩타이드는 220nm에서 확인하였으며, 각각의 펩타이드는 실온에서 물/DMF, 1시간 동안 2,2´-dipyridyldisulfide (Aldrich, 20 equiv.)과 반응시키고 상기 용액을 동결건조시켰으며, 상기 동일한 조건에서 RP-HPLC을 통해 정제되었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, MALDI-TOF mass spectrometry를 이용하여 합성된 펩타이드를 확인하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112015013035383-pat00001
3. VEGF siRNA 의 합성
VEGF를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여, CPG 고체 지지체(1.00μmol scale, 1000 Å pore size) 상에서 자동화 DNA 합성기(automated Expedite 8909 synthesizer)를 사용하는 포스포라미다이드 합성법을 도입하여 합성하였다.
모든 단위체 또는 3´ 또는 5´-fluorescein phosphoramidite (Glen Research, 10-5901-90)와 같이 수정된 단위체를 MeCN에 용해시켜 70.0mM의 용액을 제조하였다. 각 사이클의 커플링 시간은 natural monomer의 경우 3분, modifiers의 경우는 15분이었다. 활성화제(activator)는 무수 MeCN에서의 0.50M 5-ethylthiotetrazole을 이용하였다. 고체상으로부터 합성된 올리고뉴클레오티드의 분리를 위하여 41% 수용성 MeNH2 (Fluka, 65580)과 33% ethanolic MeNH2 (Fluka,65590)을 3:1로 혼합한 용액으로 실온에서 4-5시간 동안 처리하였다. 상기 용액은 동결건조시키고, 65℃, 2시간 동안 1-methyl-2-pyrrolidone (Fluka, 69120; 120μL), anhydrous Et3N (60.0μL), 및 Et3N·3HF (Aldrich, 344648; 80.0μL)와 연속적으로 반응시켜, 2번 위치의 silyl groups을 제거하였다. 상기 용액을 3 M NaOAc (pH 5.4, 26.0μL)로 퀀치하였으며, 300μL씩 3번에 걸쳐서 1-butanol을 첨가하였다.
-20℃에서 밤새도록 둔 후, 상기 용액을 3500rpm, 15분, 4℃에서 원심분리하고, EtOH로 세척하였으며, 이를 건조시켰다. 상층액을 버린 후, 남아 있는 RNA pellets을 1.00 mL의 증류수에 다시 용해시켰으며, NAP-10 column (GE Healthcare, 17-0854-02)을 이용하여 염을 제거한 후, 동결 건조 시켰다. 상기 올리고뉴클레오티드는 C-18 column (kromasil, 10 × 250 mm)를 이용한 RP-HPL을 통하여 정제하였다.
5´-thiol이 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성은 상기와 같은 방법과 마찬가지로 제조하였다. 다만, NAP-10 colum을 처리하기 전에, 1.00mL의 50.0mM triethylammonium acetate (TEAA) buffer (pH 8)에서 dithiothreitol (DTT, 3.10mg, 20.0μmol)을 실온에서 2시간 동안 교반 처리하였다. 이 후 상기용액은 NAP-10 colum을 통해 탈염화시킨 후, 동결 건조시켰다. 5´ thiol기가 포함된 올리고뉴클레오티드는 연속적으로 동일한 HPLC 조건에서 C-18 칼럼을 이용하여 RP-HPLC를 통해 정제되었다.
확인된 센스 및 안티센스 가닥들을 어닐링 버퍼(anealing buffer, 100mM KOAc, 30mM HEPES-KOH, 2mM Mg(OAc)2; pH 7.4)에 용해시키고, 90℃에서 5분간 열처리한 후, 서서히 37℃까지 식혀주었다. 이 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. natural VEGF siRNA (siN); 안티센스 가닥 ((서열번호 2), 상기 서열번호 2의 "d"는 DNA monomer T(dT)를 의미함.), m/z 6603.9 (calcd. 6603.8); 센스 가닥 ((서열번호 1), 상기 서열번호 1의 "d"는 DNA monomer T(dT)를 의미함.), m/z 6708.2 (calcd. 6709.7); 5´-fluorescein 표지된 VEGF siRNA 안티 센스 가닥 (Fluorescein-GAUCUCAUCAGGGUACUCCUdT-3´), m/z 7141.7 (calcd. 7141.4); 5´-fluorescein 표지된 VEGF siRNA 센스 가닥[5´-SH-(CH2)6-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT], m/z 6903.5 (calcd. 6904.1); 5´-cholesterol이 도입된 센스 가닥 (siC) [5´-Chol-GGAGUACCCUGAUGAGA UCdTdT], m/z 7162.9 (calcd. 7157.6)을 합성하였다. 또한, MALDI-TOF mass spectrometry를 이용하여 합성된 올리고뉴클레오티드를 확인하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.
Figure 112015013035383-pat00002
4. 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 복합체의 합성
우선, 펩타이드(PEP-C, PEP-H, PEP-A)는 저장 용액(stock solution)을 만들기 위해 물에 용해시켰다. 적당량의 siRNA와 펩타이드/siRNA molar raito에 따라 펩타이드를 혼합한 후, 상기 용액을 실온에서 20 분간 둠으로써, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체(PEP-C-X, PEP-H-X, PEP-A-X)를 합성하였다. siRNA의 농도는 5.00 pmol이었다.
5. 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 접합체의 합성
우선 실온 조건의 0.1 M의 phosphate buffer (pH 7)에서 5´-Thiol-modified siRNA 센스 가닥(30.0 nmol)과 PEP-C PEP-H, 및 PEP-A(90.0 nmol)를 결합을 시켰다. 상기 혼합물은 NAP-10 칼럼 (GE Healthcare, 17-0854-02)을 통하여 정제한 후, 동결 건조시켰다. 건조된 혼합물은 Xterra MS C-18 칼럼 (2.5μm); buffer A: 0.1 M TEAA buffer 용액 (pH 7.0); buffer B, MeCN을 이용한 RP-HPLC를 통하여 정제하였다. 2.50mL/min의 유량(flow rate)에서 buffer B의 농도를 5% (0 min), 98 % (25min), 5% (30min)로 변화시킴으로서, 농도 기울기에 따라 용출하였다. 올리고뉴클레오티드는 254nm-1에서 관찰하였으며, 상기 펩타이드-siRNA 센스 또는 안티센스가닥은 상기와 동일한 방법으로 어닐링되었다.
상기 CREKA 또는 chol-CREKA와 VEGF siRNA(서열번호 1)간 disulfied 결합을 통하여 siP 및 siCP를 합성하였다. 또한, 양성 대조군으로 VEGF siRNA에 콜레스테롤만 도입되어 있는 siC를 제조하였다.
실온 조건의 0.1 M의 phosphate buffer (pH 7)에서 5´-Thiol-modified siRNA 센스 가닥(30.0 nmol)과 CREKA 또는 Chol-CREKA (90.0 nmol)를 결합을 시켰다. 상기 혼합물은 NAP-10 칼럼 (GE Healthcare, 17-0854-02)을 통하여 정제한 후, 동결건조시켰다. 건조된 혼합물은 Xterra MS C-18 칼럼 (2.5μm); buffer A: 0.1 M TEAA buffer 용액 (pH 7.0); buffer B, MeCN을 이용한 RP-HPLC를 통하여 정제하였다. 2.50mL/min의 유량(flow rate)에서 buffer B의 농도를 5% (0min), 98 % (25min), 5% (30min)로 변화시킴으로서, 농도 기울기에 따라 용출하였다. 올리고뉴클레오티드는 254nm-1에서 관찰하였으며, 상기 펩타이드-siRNA 센스 또는 안티센스가닥은 상기와 동일한 방법으로 어닐링되었다. MALDI-TOF mass spectrometry를 이용하여 합성된 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체(PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J) 및 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (siC, siCP)를 확인하였으며, 그 결과는 도 3 내지 도 9, 및 표 3에 나타내었다.
Figure 112015013035383-pat00003
또한, 하기 표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체(Peptide-oligonucleotide conjugations)를 최종적으로 제조하였다.
Figure 112015013035383-pat00004
Figure 112015013035383-pat00005
실시예 1. 펩타이드와 올리고 뉴클레오티드간 복합체 형성여부 평가
물리적 특성이 각각 상이한 양이온성 펩타이드(PEP-C), 소수성 펩타이드(PEP-H), 또는 양친매성 펩타이드(PEP-A)와 siRNA간 복합체 형성을 확인하기 위하여, agarose gel retardation assay를 실시하였다 .
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, PEP-C의 경우, molar ratio가 120에 이르기까지 겔에서의 이동속도가 감소하고, 밴드가 넓어지는 경향성을 보였고, wall에서 밴드가 관찰되지 않았으며, molar ratio가 160-360에서는 부분적으로 밴드가 형성되었다. 이를 통해, PEP-C와 siRNA간 복합체의 형성이 쉽지 않음을 확인하였다. 또한, PEP-H도 마찬가지로, PEP-H와 siRNA간 복합체의 형성이 관찰되지 않았으며, 다만 펩타이드의 molar ratio 증가는 겔에서의 이동속도에 영향을 미치지 않았다. 끝으로, PEP-A에서는, molar ratio가 32이상인 경우에는 PEP-A와 siRNA간 복합체를 형성함을 확인하였다.
상기 결과는 복합체의 형성에 있어서, 양이온성(cationic) 및 소수성(hydrophobic) 모이어티를 모두 가지고 있어야 함을 의미한다. 즉, 양이온성 부분은 siRNA와 정전기성 상호작용을 하고, 소수성 부분은 소수성 상호작용을 통하여 복합체를 보다 compact한 구조로 만드는 역할을 함을 의미한다.
실시예 2. 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 복합체 및 접합체의 세포 독성 평가
표적 유전자에 상기 접합체를 전달함에 있어서, 낮은 세포독성은 필수 불가결한 요소이다. 이에, 본 발명자들은 Huh-7 세포에서, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체(PEP-C-X, PEP-H-X, PEP-A-X) 및 접합체(PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J)의 세포 독성여부를 WST-1 assay를 통하여 확인였다. 각각 molar ratio(16, 32, 64)의 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체 및 다른 농도 (10nM, 50nM, 100nM)의 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 Huh-7 세포에 48시간 동안 노출시킨 후, 세포활성도를 평가하였다.
보다 구체적으로, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 Huh-7 세포에 직접적으로 첨가하였다. 상기 세포를 5% CO2 , 37℃, 24시간 동안 배양시킨 후, 배지를 제거하고, DPBS 버퍼 (100㎕)로 3회 세척하였다. 그 후, WST-1 시약 (phenol red free 배지에 용해된 WST-1(1㎎/㎖), Roche; 100㎕)을 각 well에 첨가하였다. 상기 혼합물을 다시 37℃, 2시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 리더 (microplate reader(Asys))를 이용하여, 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 활성도를 백분율로 수치화하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체 및 접합체에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한, 각각의 샘플들은 Lipofectamine™ 2000를 처리한 경우 (cell viability; 80%) 보다 높은 세포 활성도를 가짐을 확인하였다. 상기 결과는, 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드를 생체에 적용할 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 복합체 및 접합체의 세포 내 유입 촉진효과 확인
펩타이드와의 복합체 또는 접합체 형성에 의한에 의한 si-RNA의 세포내 유입 촉진 효과를 확인하고자 하였다. 이에, 본 발명자들은 Huh-7 세포에서, fluorescein로 표지된 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체 및 접합체의 세포 내 유입여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 확인하였다. 모든 샘플은 transfection agent인 Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen)가 없는 조건에서 관찰되었으며, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체 및 접합체에 표지된 fluorescein에 의해서 녹색 형광을, DAPI에 의해 염색된 핵은 푸른색 형광을 띄도록 하였다.
보다 구체적으로, 우선, 6 well plate에 커버 글레스 (1.13 cm2, Deckglaser)로 씌운 후, well 당 1.5 × 105 밀도가 되도록 Huh-7 세포를 씨딩하였다. 각각의 well은 10% FBS가 첨가되어 있는 DMEM(2.00ml)를 포함하며, 12시간 동안 배양하였다. 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체 실험에서, Huh-7 세포는 혈청이 없는 조건에서, fluorescein으로 표지된 VEGf siRNA와 PEP-C, PEP-H, PEP-A (molar raio 64)간 복합체로 형질전환하거나, Transfect reagaent을 이용하지 않았다.
펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 실험에서는 Huh-7 세포는 혈청이 없는 상태에서 Transfect reagaent를 이용하지 않고, FITC로 태그된 VEGF siRNA(PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J)로 형질전환하였다. 상기 세포는 37℃, CO2 배양기에서 4시간 동안 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 존재하에서 배양한 후, 10% FBS를 포함하는 DMEM(2.00 ml)로 바꾸어 주었다. 형질전환 4시간 후, 상기 세포는 DPBS로 3회 세척하였다. 이 후 세포의 핵은 DAPI로 염색하였고, PBS로 3회 세척한 후, 플레이트에서 커버 글래스를 제거하여, 슬라이드 글래스로 옮겼으며, 공초점 현미경 이미지는 Olympus FluoView™ FV1000 confocal microscope (Olympus Optical, Tokyo)를 이용하여 획득하였다.
그 결과. 도 12에 나타낸 바와 같이, PEP-C-X, 및 PEP-A-X에서는, fluorescein에 의한 형광 강력한 형광이 관찰된 반면, PEP-H-X에서는, 약한 형광이 관찰되었다. 이는 PEP-A의 양전하가 siRNA의 음전하에 의해 완전히 중성화되어, 우수한 세포내 유입을 나타냄을 의미하며, PEP-H의 경우에는 세포 유입이 매우 낮음을 의미한다. 다만, 특이점으로는, PEP-C는 복합체 형성이 쉽지 않았음에도 불구하고, 우수한 세포내 유입을 나타내었으며, 이는 PEP-C의 양전하가 siRNA의 음전하에 의하여 완전히 중성화됨에 따라 세포내 유입이 촉진되었음을 의미한다.
반면, 도 13에 나타낸 바와 같이, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체(PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J)에서는 모두 우수한 세포내 유입 효과를 확인하였다. 특히 짧은 소수성 펩타이드 PEP-H의 경우 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체 (PEP-H-X)로는 세포전달능력이 없었으나 공유결합으로 연결된 펩타이드-올리고뉴클레오티드 결합체 (PEP-H-J)에서는 효과적인 세포내 유입효과를 확인하였다.
실시예 4. 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 복합체 및 접합체에 의한 발현 억제 효과 확인
Huh-7 세포에서, 펩타이드와의 복합체 또는 접합체 형성에 의한 si-RNA의 VEGF의 발현 억제를 enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs)를 통하여 확인하였다.
구체적으로, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체 실험에서, 50nM siRNA와 다양한 molar ratio (16, 32, 및 64) 조건에서 형성된 복합체(PEP-C-X, PEP-H-X, 및 PEP-A-X), 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 실험에서, 다양한 농도(5.00, 25.0, 및 50.0 nM)에서의 접합체(PEP-C-J, PEP-H-J, 및 PEP-A-J)에 의한 VEGF의 발현 억제여부를 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체에서는 molar ratio가 증가함에 따라, 유전자의 하향조절(gene down regulation) 효율이 증가함을 확인하였으며, 복합체 형성 및 세포내 유입이 우수한, PEP-A-X의 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 특히, 64 mloar raio의 PEP-A-X, 및 PEP-C-X에서는 80% 이상 발현이 억제된 반면, PEP-H-X에서는 발현 억제 효과가 거의 관찰되지 않았다.
또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체에서 역시 농도가 증가함에 따라, 유전자의 하향조절(gene down regulation) 효율이 증가함을 확인하였으며, 모든 접합체에서 우수한 유전자의 하향조절 효과를 확인하였다. 상기 결과는 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 통하여, 펩타이드의 물리적 특성에 의한 제한 없이 세포내 유입을 촉진하여 세포내 유전자 발현을 하향 조절할 수 있음을 의미한다.
실시예 5. 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 접합체 및 암표적 펩타이드 -올리고 뉴클레오티드 접합체의 열적 안정성 평가
Natural form인 siN, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J), 및 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 (siC, siP, siCP)의 화학적 특성을 CD spectra와 Tm 값을 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 17 및 도 18에 나타낸 바와 같이, 265nm에서 강한 positive 밴드, 210nm에서 negative 밴드가 관찰되었으며, 이로써, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 및 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체의 2차 구조는 A 형 RNA임을 확인하였다.
또한, 도 19, 도 20, 및 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, siN과 비교하여 PEP-C-J, PEP-H-J, PEP-A-J, siP 및 siCP에서, 각각의 Tm 값이 6.1℃, 2.1℃, 1.2℃, 2.9℃, 및 2.6℃씩 증가하였으며, 열적 안정성이 증가하였다. 아울러, 본 세포 실험이 수행되는 37℃에서도 안정적으로 siRNA 이중 가닥을 형성함을 확인하였다. 또한, 콜레스테롤 모이어티 및 결합된 펩타이드는 RNA 이중가닥 형성을 방해하지 않을 뿐 아니라, siRNA 이중가닥을 안정화시킬 수 있음을 확인하였다.
Figure 112015013035383-pat00006
실시예 6. 암표적 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 접합체의 세포 독성 평가
실시예 2의 방법과 마찬가지로 siC, siP, siCP의 세포 독성여부를 WST-1 assay를 통하여 확인였다. 각기 다른 농도 (10nM, 50nM, 100nM)의 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 MCF 세포에 48시간 동안 노출시킨 후, 세포활성도를 평가하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 모든 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한, 각각의 샘플들은 Lipofectamine™ 2000를 처리한 경우(cell viability; 80%) 보다 높은 세포 활성도를 가짐을 확인하였다. 상기 결과는, 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드를 생체에 적용할 수 있음을 의미한다.
실시예 7. 암표적 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 접합체의 세포 내 유입 촉진 효과 확인
　콜레스테롤의 추가적인 도입에 의한 si-RNA의 세포내 유입 촉진 효과를 확인하고자 하였다. 이에, 본 발명자들은 MCF-7 세포에서, fluorescein로 표지된 siN, siC, siP, 및 siCP의 세포 내 유입여부를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 확인하였다. 모든 샘플은 transfection agent인 Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen)가 없는 조건에서 관찰되었으며, 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체에 표지된 fluorescein에 의해서 녹색 형광을, DAPI에 의해 염색된 핵은 푸른색 형광을 띄도록 하였다.
보다 구체적으로, 우선, 6 well plate에 커버 글레스 (1.13 cm2, Deckglaser)로 씌운 후, well 당 1.5 × 105 밀도가 되도록 MCF-7 세포를 씨딩하였다. 각각의 well은 10% FBS가 첨가되어 있는 DMEM (2.00ml)를 포함하며, 12시간 동안 배양하였다. MCF-7 세포는 혈청이 없는 상태에서 Transfect reagaent를 이용하지 않고, FITC로 태그된 VEGF siRNA(siN, siC, siP, siCP, 1.0μM)로 형질전환하였다. 상기 세포는 37℃, CO2 배양기에서 4시간 동안 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 존재하에서 배양한 후, 10% FBS를 포함하는 DMEM(2.00 ml)로 바꾸어 주었다. 형질전환 4시간 후, 상기 세포는 DPBS로 3회 세척하였다. 이 후 세포의 핵은 DAPI로 염색하였고, PBS로 3회 세척한 후, 플레이트에서 커버 글래스를 제거하여, 슬라이드 글래스로 옮겼으며, 공초점 현미경 이미지는 Olympus FluoView™ FV1000 confocal microscope (Olympus Optical, Tokyo)를 이용하여 획득하였다. 또한, MCF-7 세포에서의 세포 내 유입의 정도를 정량화하기 위하여, siN, siC, siP, 및 siCP에 의한 fluorescein의 형광세기를 측정하였다.
그 결과, 도 22 내지 25에 나타낸 바와 같이, siN에서는 fluorescein에 의한 형광이 관찰되지 않은 반면, siCP에서는 양성 대조군인 siC와 비교하여, 강력한 형광이 세포질에서 관찰되었다. 비록 암표적 펩타이드(CREKA)가 표적 특이성을 증진시킴에도 불구하고, siC 및 siCP와 비교하여 siP의 세포내 유입은 상대적으로 적은 것으로 확인되었다.
또한, 도 26에 나타낸 바와 같이, siN은 세포 내에 거의 존재하지 않은 반면, siC, siP, 및 siCP는 세포 내에서 검출되었다. 특히, 암세포 표적 펩타이드만 siRNA에 결합되어 있는 siP는 상대적으로 소량 검출되었으며, 암표적 펩타이드와 콜레스테롤이 함께 siRNA에 접합되어 있는 siCP는 양성 대조군인 siC와 비교하여, 세포 내 존재량이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.
실시예 8. 암표적 펩타이드 -올리고뉴클레오티드 접합체에 의한 발현 억제효 과 확인
MCF 세포에서, 다양한 농도의 암표적 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 처리에 의한 VEGF의 발현 억제를 enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs)를 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, siC, siP 및 siCP의 농도가 증가함에 따라, 유전자의 하향조절(gene down regulation) 효율이 증가함을 확인하였다. siP는 표적 특이성을 부여하는 CREKA 펩타이드가 있음에도 불구하고, 세포 내 유입이 용이하지 않아 하양조절 효율이 높지 않았다. 다만, 콜레스테롤이 추가적으로 도입된 siCP의 경우, siP와 비교하여 약 18~22% 가량 세포내 유입을 증신시킴을 확인하였다. 상기 결과는 추가적으로 도입된 콜레스테롤의 모이어티에 의해 세포내 유입을 촉진됨을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> small interfering RNA conjugates having enhanced intracellular delivery <130> P2014339-01-KR_PB14-12422 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-siRNA sense strand <400> 1 ggaguacccu gaugagaucu d 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-siRNA antisense strand <400> 2 gaucucauca ggguacuccu d 21 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-homing peptide <400> 3 Cys Arg Glu Lys Ala 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP-C <400> 4 Cys Arg Arg Arg Lys Lys 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP-H <400> 5 Cys Pro Phe Val Tyr Leu Ile 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP-A <400> 6 Cys Arg Arg Arg Lys Lys Pro Phe Val Tyr Leu Ile 1 5 10

Claims (5)

  1. 서열번호 3의 표적화 펩타이드 및 siRNA (small interfeing RNA)를 포함하되, 상기 표적화 펩타이드와 siRNA는 이황화 결합에 의해 연결된 것을 특징으로 하는, 세포 전달능이 증진된 siRNA 접합체로서, 상기 접합체는 상기 표적화 펩타이드에 결합된 콜레스테롤을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, siRNA 접합체.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 siRNA (small interfeing RNA)는 VEGF (Vascular Endothelial Cell Growth Factor)를 표적으로 하며, 서열번호 1로 이루어지는 것을 특징으로 하는, siRNA 접합체.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 따른 siRNA 접합체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020150018723A 2015-02-06 2015-02-06 세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체 KR101694220B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150018723A KR101694220B1 (ko) 2015-02-06 2015-02-06 세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150018723A KR101694220B1 (ko) 2015-02-06 2015-02-06 세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160096971A KR20160096971A (ko) 2016-08-17
KR101694220B1 true KR101694220B1 (ko) 2017-01-09

Family

ID=56873685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150018723A KR101694220B1 (ko) 2015-02-06 2015-02-06 세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101694220B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102259513B1 (ko) * 2017-11-16 2021-06-02 주식회사 삼양홀딩스 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물의 동결건조 조성물 및 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090074828A1 (en) * 2007-04-04 2009-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Poly(amino acid) targeting moieties

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101336552B1 (ko) * 2011-08-26 2013-12-03 포항공과대학교 산학협력단 전립선암 특이적 ｓｉＲＮＡ 전달체
KR101430232B1 (ko) * 2012-08-10 2014-08-18 한국과학기술연구원 ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 ｐ19-ＹＳＡ 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090074828A1 (en) * 2007-04-04 2009-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Poly(amino acid) targeting moieties

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jong Woo Park 등. Organic and Biomolecular Chemistry. Vol 10, No. 1, 페이지 96-102 (2012.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160096971A (ko) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101963885B1 (ko) 세포투과성이 향상된 펩티드 핵산 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
CN112135907A (zh) 具有内含体逃逸能力的肽核酸复合物及其用途
KR20130040811A (ko) 신규한 단독 화학 물질 및 올리고뉴클레오티드의 전달 방법
AU2008202734A1 (en) Circular dumbell decoy oligodeoxynucleotides (CDODN) containing dna bindings sites of transcription
JP2014526238A (ja) ペプチド
JP6574175B2 (ja) 細胞透過性ペプチド、及びそれを含むコンジュゲート
EP2694529A2 (en) Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
CN112543809A (zh) 包含C/EBPα saRNA的组合疗法
CN114585384A (zh) 使用C/EBPα saRNA的组合物和方法
WO2013179910A1 (ja) 抗癌剤に起因する末梢性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療剤
TW200836762A (en) Polymeric short interfering RNA conjugates
EP2864345B1 (en) Particle-nucleic acid conjugates and therapeutic uses related thereto
Ru et al. A cell penetrating peptide-integrated and enediyne-energized fusion protein shows potent antitumor activity
KR101694220B1 (ko) 세포내 전달능이 증진된 siRNA 접합체
US20160230171A1 (en) Methods for inducing glucose uptake
JP6932506B2 (ja) 細胞透過組成物およびそれを用いる方法
CN114585633A (zh) 寡核苷酸缀合物组合物和使用方法
KR101430232B1 (ko) ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 ｐ19-ＹＳＡ 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물
US20220054645A1 (en) Targeted Delivery of Therapeutic Molecules
KR102274876B1 (ko) 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
KR100490362B1 (ko) 올리고라이신 수송 도메인, 올리고라이신-화물분자 복합체및 그 용도
Doh et al. Prevention of CCl4-induced liver cirrhosis by ribbon antisense to transforming growth factor-β1
KR102274877B1 (ko) 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
WO2022111637A1 (zh) 结合yb-1蛋白的核酸分子
KR102603739B1 (ko) 암 특이적 핵산 분자 전달용 조성물 및 그 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200102

Year of fee payment: 4