KR100490362B1 - 올리고라이신 수송 도메인, 올리고라이신-화물분자 복합체및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다수의 라이신 잔기로 구성되어 유기화합물과 공유결합함으로써 유기화합물의 세포 침투를 가능하게 하는 올리고라이신 수송 도메인, 올리고라이신 벡터, 세포 내 침투 가능하고 세포 내에서 활성을 나타내는 올리고라이신 융합단백질, 그 융합단백질을 발현시키는 발현벡터 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화물 분자의 세포내 전달은 수개 내지 십수개의 라이신 잔기로 이루어진 올리고라이신 수송 도메인을 통하여 수행된다. 구체적으로, 본 발명은 신규의 올리고라이신 수송 도메인, 올리고라이신 수송 도메인-화물 분자 복합체, 올리고라이신 수송 도메인-화물 분자 복합체를 포함하는 치료, 예방 및 진단목적의 약학 조성물, 화장료 조성물 등에 관한 것이다.

Description

올리고라이신 수송 도메인, 올리고라이신-화물분자 복합체 및 그 용도{Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof}

본 발명은 다수의 라이신 잔기로 구성된 올리고라이신 수송 도메인, 올리고라이신 벡터, 올리고라이신-화물 분자 복합체, 그 복합체의 발현벡터 및 그 복합체를 세포 내로 도입시키는 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

최근에는 다양한 인체의 질환이 세포 단백질의 비정상적 활성에 기인한다는 사실이 알려짐에 따라 이들 단백질의 활성을 조절함으로써 치명적인 인체질환을 치료할 수 있는 약제의 개발이 전세계적으로 관심의 대상이 되고 있다. 또한 생체질환의 치료제 개발은 세포내 특정 생리활성을 매우 특이적으로 조절할 수 있는 효소 및 단백질-단백질 상호작용의 구조에 기초하여 펩타이드성 혹은 단백질 형태의 조절 물질이 빠르게 개발되고 있다. 그러나 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 다른 화합물에 비하여 특정 생리작용에 대한 선택성 및 효능성이 탁월함에도 불구하고 그 크기나 여러 생화학적 성질로 인하여 세포막을 통과하기가 매우 힘들어 세포 내부로 직접 전달될 수 없는 약점 때문에 효과적인 치료제 및 기초 연구 수단으로서의 실용화가 현실적으로 어려운 실정이다. 일반적으로 분자량 600 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다(Schwartze et al., 1999; Van de Waterbeemd et al., 1998).

단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 세포내로 전달하기 위하여 많은 방법이 시도되어 왔다. 이들 방법에는 다음과 같은 방법이 포함된다. 물리적인 처리 방법 (즉, 마이크로인젝션(microinjection), 스크레이프 로딩(scrape loading), 전기천공(electroporation)과 바이오리스틱(biolistics)), 화학적이나 생물학적으로 세포에 포어(pore)를 형성시키는 방법 (디지토닌(digitonin), 포어 형성 단백질(pore-forming proteins)과 ATP 처리), 변형된 단백질이나 단백질 운반체(carriers)를 이용한 방법(지방이 결합된 단백질(lipidated proteins)과 이뮤노톡신 및 관련 바이오콘쥬게이트(immunotoxins/related bioconjugates)) 그리고 입자 흡입이나 융합 방법(리포조옴(liposomes), 세포-세포 융합(cell-cell fusion), 바이러스 유사체(virus mimics)와 유도된 피노사이토시스(induced pinocytosis)) 등이 포함된다(Fernandez and Bayley, 1998). 위에서 언급한 방법들은 다음의 문제점들이 있다. 예를 들어 마이크로인젝션(microinjection)은 하나의 세포나 소수의 세포를 연구할 때에만 효율적이고, 이뮤노톡신(immunotoxins)은 보통 단백질을 높은 농도로 세포에 전달하지 못할 뿐만 아니라, 치명적인 활성을 가진 단백질이 이용될 때 목표세포를 죽이기도 한다. 또한 이 방법들은 단백질의 세포내 전달 효율, 세포의 손상 여부, 목표 단백질의 도달 여부, 재현성의 여부 등의 문제점을 안고 있다.

근래에 인체 면역결핍 바이러스 (Hunan Immunodeficiency Virus type-1; 본 명세서에서 "HIV-1"과 혼용함)가 발현하는 단백질의 하나인 Tat(transactivator of transcription) 단백질이 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 및 세포핵 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다 (Frankel and Pabo, 1988; Green and Loewenstein, 1988). 최근 오브알부민(ovalbumin), β-갈락토시다아제(galactosidase), 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 같은 이종단백질을 HIV-1 Tat 단백질과 융합시켜 투여하였을 때 생체 각 조직 및 배양된 세포 내로 직접 운반된다는 것을 보여주었다 (Fawell et al., 1994; Schwartze et al., 1999). 이러한 기능은 Tat 단백질의 중간부위에 위치하는 염기성 영역에 의하여 이루어지는 것으로 밝혀졌고 단백질 세포전달 영역(Protein Transduction Domain)으로 알려졌다(Nagahara et al., 1998; Vives et al, 1997). HIV-1 Tat 이외에도 안테나피디아 호메오도메인 (Anntennapedia Homeodomain)에서 유래된 펩타이드 등도 단백질을 세포 내로 전달시킬 수 있다고 보고되었다(Derossi et al., 1996). 이들에 의한 단백질 세포전달 기전은 정확히 알려지지 않았지만 단백질의 세포막 투과에는 특정 수용체나 운반체가 관여하지 않는 것으로 보이며 단백질 세포전달 부위가 직접 세포막의 지질 층과 작용함으로써 일어나는 것으로 이해하고 있다.

위에서 언급한 단백질 세포전달 능력을 가진 펩타이드들은 일반적으로 10~16개의 아미노산 잔기를 갖고 있고 펩타이드들의 아미노산 구성을 살펴보면 양성전하를 갖는 아르기닌이나 라이신 잔기가 풍부하다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명자는 수개 내지 십수개의 라이신 잔기를 단백질에 공유결합시켜 단백질의 세포 내 전달 능력을 확인하였다.

전통적으로 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 전달체로 수십 개 내지 수백 개의 라이신 잔기를 중합시킨 폴리라이신이 이용되어 왔다. 그러나, 수십개 이상의 잔기로 구성되는 종래의 폴리라이신은 핵산과 공유결합 상태로 존재하는 것이 아니라 핵산의 세포막 통과를 저해하는 음전하를 코팅하는 형식으로 결합하는 것이었다.

이러한 이유로 본 발명의 발명자들은 세포 내부로 단백질의 자발적 운반이 가능하도록 하는 기술을 개발하고자 노력하여, 세포 전달 능력이 있는 수개 내지 십수개의 라이신 잔기를 부착시킨 융합단백질을 발현하는 벡터를 제조하고 이 벡터를 이용하여 발현시킨 올리고라이신 융합단백질이 세포 내로 효율적으로 전달되고 세포 내에서 활성을 유지하고 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 다양한 생체 기능 단백질들에 세포 전달 능력이 있는 다수의 라이신 잔기로 구성된 올리고라이신 수송 도메인을 공유결합시켜 융합 단백질로 발현시키고 올리고라이신 융합 단백질을 세포 내로 운반하려는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 올리고라이신 융합 단백질을 유효성분으로 하는 약제 조성물 및 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

본 발명은 표적 세포 또는 세포 핵에 침투가 용이하지 않거나 또는 본래 유용한 속도로 표적 세포에 투입할 수 없는 생물학적으로 활성인 단백질, 핵산 및 기타 분자를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 화물 분자의 세포내 전달은 수개 내지 십수개의 라이신 잔기로 이루어진 올리고라이신 수송 도메인을 통하여 수행된다. 구체적으로, 본 발명은 신규의 올리고라이신 수송 도메인, 이의 제조방법, 올리고라이신 수송 도메인-화물 분자 복합체, 올리고라이신 수송 도메인-화물 분자 복합체를 포함하는 치료, 예방 및 진단목적의 약학 조성물, 화장료 조성물 등에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"화물 분자(cargo molecule)"란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는, 수송 도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송 도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체이거나 수송 도메인-화물 분자 복합체의 화물 분자 부분을 의미한다. 화물 분자로서는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 및 다당류, 기타 유기화합물 등을 포함한다. 본 발명의 용도 또는 응용에 있어서 "화물 분자"는 예컨대 약물 또는 수용체 등을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 "화물 분자"는 "목표 단백질(target protein)" 등과 동일, 유사한 의미로 사용되었다.

"올리고라이신(수송 도메인)-화물 분자 복합체(oligolysine-cargo molecule complex)"란 수송 도메인 및 1개 이상의 화물 분자 부분을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체(complex)를 의미한다.

또한, 상기 "유전적 융합(genetic fusion)"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.또한, "융합단백질(fusion protein)"이란 유전적 또는 화학적 방법에 의하여 수송도메인(transducing domain)과 융합(fusion)된 상태, 좀더 구체적으로는 수송도메인과 선형 공유결합된 상태의 펩타이드나 단백질을 의미한다.

또한, "표적세포(target cell)"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 명세서의 "올리고라이신 수송 도메인(oligolysine transducing domain)"은 운반시키고자 하는 펩타이드 또는 단백질(이하, 본 명세서에서 "단백질"이라 함은 단백질과 펩타이드를 포괄하는 의미로도 사용한다.)과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 단백질(펩타이드 포함)들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 수개 내지 십수개의 라이신 잔기로 구성된 것을 말한다.

본 명세서의 "화물 단백질(cargo protein)" 또는 "목표 단백질(target protein)"은 상기 올리고라이신 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 치료 분자, 예방 분자 및 진단 분자 등을 의미하며, 실제로는 순수한 단백질에만 한정되는 것이 아니라, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당류와 결합된 당단백질, 펩티도글리칸 등을 통칭하는 표현으로 사용한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 세포 내에서 기능할 수 있는 다양한 고분자 및 저분자 유기화합물 즉, 펩타이드와 단백질들을 포함하는 화물 분자를 표적세포 내로 운반하고 세포 내에서 활성을 가지도록 하기 위하여 다수의 라이신 잔기로 이루어진 올리고라이신(본 명세서 및 도면에서 "올리고K", "올리고Lys"와 혼용함) 수송 도메인 및 이를 포함하는 벡터, 이 벡터를 이용하여 생산한 올리고라이신 융합단백질을 포함하는 올리고라이신-화물 분자 복합체, 이를 세포 내로 도입시키는 방법 및 그 용도를 제공한다.

이하 발명의 상세한 설명에서는 화물 분자로서 임의의 "단백질"을 선택하여 세포 내로 도입하는 올리고라이신-화물 분자 복합체 등에 관하여 설명한다. 그러나, 이것은 발명의 설명의 편의를 위한 것일 뿐 화물 분자가 "단백질"에만 한정되거나, 본 발명의 범위가 올리고라이신 융합 단백질 등에만 한정되는 것이 아님을 밝혀 둔다.

본 발명자들은 특정 기능을 가진 단백질 또는 펩타이드 등의 화물 분자를 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 표적세포 내로 화물 분자 또는 목표 단백질을 전달할 수 있는 수송 도메인-화물 분자 복합체 발현벡터인 pLys를 제조하였다. 신규 제조된 벡터는 아미노 말단부터 6개의 히스티딘, 3∼12개의 라이신 잔기와 화물 분자로서의 목표 단백질을 융합 단백질 형태로 발현시킬 수 있도록 고안되었다. 올리고라이신 부분이 단백질 등의 화물 분자를 세포 내로 전달할 수 있는 능력을 용이하게 분석할 수 있도록 하기 위하여 GFP(Green Fluorescence Protein: 녹색형광단백질)를 목표단백질로 선택하여 GFP의 염기서열에 해당하는 DNA 절편을 pLys 벡터에 삽입시켜 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터인 pLys-GFP 융합 단백질을 제조하였다.

본 발명자들은 세포 내의 투과능력을 상호 비교하기 위하여 변성상태(denaturing condition)와 변성시키지 않은 자연상태(native condition)에서 올리고라이신-GFP 융합단백질을 각각 정제하였다. 부분적으로 변성시킨 융합단백질(partially denatured fusion protein)을 얻기 위하여 세포를 6M 우레아가 함유된 용액에서 초음파 처리하고 6개 히스티딘 잔기를 이용하여 Ni-니트릴로삼아세트산 세파로즈(nitrilotriactic acid sepharose) 컬럼으로 간단히 정제하였으며, 염분을 제거하였다.

위 정제된 변성상태 및 자연상태의 올리고라이신-GFP 융합단백질의 세포 내 전달효과를 알아 보기 위하여 변성 상태와 자연상태에서 정제한 각각의 올리고라이신-GFP 융합 단백질을 0.5μM 농도로 2시간 동안 세포배양액 내에 처리하여 보았다. 그 결과, 변성상태의 올리고라이신-GFP 융합 단백질은 자연 상태에서 정제한 올리고라이신-GFP 융합 단백질에 비해 높은 효율로 세포 내로 전달되는 것을 웨스턴 블랏 통해 관찰할 수 있었고 대조 단백질로 사용한 대조군 GFP는 전혀 세포막을 투과하지 못하였다.

또한, 본 발명자들은 목표세포에 융합 단백질을 전달하고자 할 때 전달되는 세포의 비율이 얼마나 되는지, 또 세포 내로 투과된 융합단백질이 그 고유한 활성을 유지하고 있는지를 분석하였다. 변성된 올리고라이신-GFP 융합 단백질을 처리한 HeLa 세포에서 GFP가 나타내는 형광도를 형광현미경으로 관찰하였다. 변성된 올리고라이신-GFP 융합 단백질은 거의 100%에 달하는 HeLa 세포에 전달되었고 HeLa 세포 투과 이후 세포질 내에서 GFP 단백질 활성이 회복됨을 관찰하였다.

올리고라이신 부착 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈, 글리신 중 1종 이상), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 중 1종 이상)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀루로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 중 1종 이상)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.0001~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 올리고라이신 융합 단백질을 주요성분으로 하는 화장료 조성물은 크림, 연고, 젤, 로션, 화장수 등으로 제형화되어 사용될 수 있으며, 어떤 제형으로 제조하여 사용하는가는 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자에 의해 극히 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 올리고라이신-SOD(superoxide dismutase) 등의 올리고라이신 융합단백질을 유효성분으로 하는 로션, 젤, 에센스, 크림, 화장수 등은 각각 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있으며, 기초 화장품 등에 편리하게 첨가하여 피부노화방지, 개선제 등의 용도로서 사용될 수 있다.

일례로서 크림을 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 올리고라이신-SOD 융합단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

본 발명자들은 올리고라이신 융합 단백질의 일례로서 올리고라이신-SOD 융합 단백질을 랫트의 피부에 침투실험한 결과 표피, 진피, 피하지방층까지 원활하게 침투하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 올리고라이신 융합 단백질을 약제 조성물 또는 화장료 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.

본 발명은 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등의 화물 분자와 공유결합되어 유기화합물을 세포 내로 침투 가능하도록 하는 다수, 바람직하게는 3∼12개, 더욱 바람직하게는 6∼9개의 라이신 잔기로 이루어진 올리고라이신 수송 도메인에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 올리고라이신 수송 도메인과 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등의 화물 분자가 공유결합되어 표적세포 내로 침투 가능하고 세포 내에서 화물 분자의 활성을 나타내는 올리고라이신-화물 분자 복합체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 아미노 말단 측의 다수, 바람직하게는 3∼12개, 더욱 바람직하게는 6∼9개의 라이신 잔기로 구성된 올리고라이신 수송 도메인과 카르복시 말단 측의 화물 단백질이 공유결합되어 세포 내로 침투 가능하고 세포 내에서 활성을 나타내는 올리고라이신 융합단백질에 관한 것이다.

또한, 상기 화물 분자 또는 화물 단백질은 치료 분자, 예방 분자 및 진단 분자로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화물 단백질이 녹색형광단백질 또는 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈인 것을 특징으로 하는 올리고라이신 융합단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 올리고라이신 융합단백질을 포함하는 올리고라이신-화물 분자 복합체의 약학적으로 유효한 양을 포함하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 예컨대 서열번호 1, 서열번호 3 또는 이들의 어닐링(annealing) 산물과 같이 다수개, 바람직하게는 3∼12개, 더욱 바람직하게는 6∼9개의 라이신 잔기를 발현할 수 있는 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드를 삽입하여 상기 올리고라이신-화물 분자 복합체를 생산할 수 있는 올리고라이신 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 올리고라이신-화물 분자 복합체를 발현시키기 위하여 상기 올리고라이신 벡터에 화물 분자 cDNA를 삽입하여 화물 분자의 일측에 올리고라이신 수송 도메인이 융합된 올리고라이신 융합 단백질을 비롯한 올리고라이신-화물 분자 복합체를 생산하는 발현벡터(예컨대 도 1B에 도시된 것과 같은 발현벡터)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화물 분자가 치료 분자, 예방 분자 및 진단 분자로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고라이신 융합 단백질을 비롯한 올리고라이신-화물 분자 복합체를 생산하는 발현벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화물 분자가 GFP 또는 SOD인 것을 특징으로 하는 올리고라이신 융합단백질을 비롯한 올리고라이신-화물 분자 복합체를 생산하는 발현벡터에 관한 것이다.

나아가 본 발명은 상기 올리고라이신-화물 분자 복합체 생산 발현벡터를 미생물에서 발현시키는 단계; 발현된 올리고라이신-화물 분자 복합체를 4∼6M 우레아 등을 이용하여 변성상태로 정제하거나 변성시키지 않은 상태로 정제하는 단계; 정제된 올리고라이신-화물 분자 복합체를 세포에 가하는 단계;로 구성되는 올리고라이신-화물 분자 복합체를 세포 내로 도입시키는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 올리고라이신 융합단백질 생산 발현벡터를 미생물에서 발현시키는 단계; 발현된 올리고라이신 융합 단백질을 4∼6M 우레아 등을 이용하여 변성상태로 정제하거나 변성시키지 않은 상태로 정제하는 단계; 정제된 올리고라이신 융합 단백질을 세포에 가하는 단계;로 구성되는 올리고라이신 융합 단백질을 세포 내로 도입시키는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 올리고라이신-화물 분자 복합체 또는 이를 생산하는 발현벡터를 이용하여 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 올리고라이신 융합단백질 또는 올리고라이신 융합단백질을 생산하는 발현벡터를 이용하여 질환, 예컨대 사구체신염, 맥관염, 자기면역성 질환, 졸중, 심근경색, 부정맥, 협심증, 특발성 헤모크로마토시스, 방사선 치료에 의한 질병, 조로증, 질병관련 노화, 겸상적혈구증, 말라리아, 폐기종, 심근증, 자기면역 신증후군, 베텔넷-관련 구강암, 고압산소증, 알쯔하이머병, 퍼킨슨병, 백내장인 등의 SOD 의존성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 올리고라이신 융합단백질을 비롯한 올리고라이신-화물 분자 복합체를 유효성분으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 올리고라이신-SOD 융합단백질을 유효성분으로 하고 활성산소종을 제거하는 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형인 올리고라이신-SOD 융합 단백질을 유효성분으로 하고 활성산소종을 제거하는 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

재료

제한 효소와 T4 DNA 리가아제(ligase)는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 중합효소(polymerase)는 stratagene(USA)에서 구입하였다. 실험에 이용된 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer (USA)에서 합성하였다. IPTG(Isopropylthiogalactopyranoside: 이하 "IPTG"라 함)는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로삼아세트산 세파로즈 수퍼플로우(nitrilotriactic acid sepharose superflow)는 Qiagen(Germany)에서 구입하였다. 정제한 단백질의 염분을 제거하기 위해 사용된 컬럼 PD-10은 Amersham Pharmacia에서 구입하였다. SDS를 위한 시약들은 Sigma에서 구입했고, 킷트는 BIO-RAD 것을 사용했다. 세포 배양에 사용된 배양액 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)와 Antobiotics-Antimicotic, FBS(fetal bovine serum), NCS(newborn calf serum) 등은 GIBCO BRL에서 구입한 것을 사용했으며, 세포 내 GFP 단백질의 분포와 형광 유무를 관찰하기 위해 올림푸스 형광현미경(Olympus epifluorescence microscope)을 이용하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였으며 특별한 언급이 없는 한 Sigma 시약회사에서 구입한 것이다.

<실시예 1> 올리고라이신 융합 단백질 발현 벡터 제조

기능을 가진 단백질/펩타이드를 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포내로 목표단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터인 pLys를 제조하였다. 9의 라이신 잔기가 단백질을 세포 내로 전달할 수 있는 능력을 용이하게 분석할 수 있도록 하기 위하여 GFP를 목표단백질로 선택하여 GFP의 염기서열에 해당하는 DNA 절편을 pLys 벡터에 삽입시켜 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터인 pLys-GFP 융합 단백질을 제조하였다 (제 1-B도). 올리고Lys-GFP 융합 단백질에 대한 대조 단백질인 GFP를 과대 발현시키기 위하여 9개의 라이신만 포함되지 않고 나머지 부위는 동일한 pGFP 발현 벡터를 개발하였다.

9개의 라이신을 발현할 수 있는 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드, 정방향 개시체(forward primer): 5'-TAAGAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAGC-3'; 역방향 개시체(reverse primer): 5'-TCGAGC TTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTCT-3' 두 개를 100℃에서 5분 동안 어닐링(annealing)시켜서 만든 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드를 NdeI과 XhoI 제한효소로 절단된 pET-15b 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 삽입시켜 9개의 라이신을 발현시킬 수 있는 벡터인 pLys를 제조하였다. 따라서 신규 제조된 벡터는 아미노 말단부터 6개의 히스티딘, 9의 라이신 잔기와 목표단백질을 융합단백질 형태로 발현시킬 수 있도록 고안되었다(도 1A).

다음으로 목표단백질을 녹색형광 단백질(Green Fluorescence Protein; 본 명세서에서 "GFP"라 약칭함)로 선택하여 GFP의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 2종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 개시체는 5'-CTCGAGGTGAGCAAGGGCG AGGAGCTG-3' 로 Xho I 제한효소 분해자리를 지니고 있으며 역방향 개시체의 서열은 5'-GGATCCTTACTTGT ACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' 로 BamH I 제한효소 분해자리를 갖고 있다.

합성된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 pEGFP-C2 (Clontech)로부터 다음과 같이 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 GFP 염기서열을 가진 DNA 절편을 준비하였다. PCR은 thermal cycler(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였으며, 반응 혼합액을 50 ㎕ 실리콘 튜브(siliconized reaction tube)에 넣고 94℃에서 3분간 가열하였다. PCR 반응은 94℃에서 30초간 30회의 연장(extension)반응, 51℃에서 45초간 변성(denaturation), 70℃에서 1분 30초간 어닐링(annealing), 그리고 72℃에서 10분, 20℃에서 5분간 최종 연장(final extension)반응을 유도하였다.

PCR 수행 후 아가로즈 젤 전기이동(agarose gel electrophoresis)으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 pGEM-T 벡터(Promega, USA)에 삽입하였다. 이어 이 벡터를 적절한 세포(competent cell)에 형질전환 시키고 형질 전환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균 방법(alkaline lysis method; Sambrook et al., 1989)으로 분리하였다. GFP cDNA가 포함된 pGEM-T 벡터를 Xho I 과 BamH I로 절단한 다음 pET-15b 및 pLys 발현 벡터에 삽입하였다. 여기서 얻어진 벡터를 pGFP 및 pLys-GFP로 각각 명명하였다(도 1).

<실시예 2> 융합단백질의 발현 및 확인

IPTG로 융합단백질의 과대 발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파처리로 파쇄한 다음, 원심 분리하여 상층액에 있는 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기이동(polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용하여 분리하였다.

pGFP 및 pLys-GFP로 형질전환된 E. coli BL21(DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 50 ml LB 배지에 접종하고 IPTG (0.5 mM)를 배지 내에 첨가하여 융합단백질의 과대 발현을 유도시킨 후 세포 추출물을 준비하였다. 재조합된 GFP 및 올리고Lys-GFP 융합 단백질의 과대 발현을 유도하였다. 세포 추출물에 존재하는 과대 발현된 GFP 및 올리고Lys-GFP 융합 단백질은 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기이동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)과 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

도 2-B는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 단백질 밴드를 나타내고 있다. 젤의 레인 2는 대조군인 레인 1 (pET-15b vector)과 비교하여 매우 높은 농도의 융합단백질이 과대 발현되었음을 보여주고 있다.

<실시예 3> 융합단백질의 정제

세포 내의 투과능력을 상호 비교하기 위하여 변성상태(denaturing condition)와 변성시키지 않은 자연상태(native condition)에서 융합단백질을 각각 정제하였다. 부분적으로 변성시킨 융합단백질 (partially denatured fusion protein)을 얻기 위하여 세포를 6M 우레아가 함유된 용액 내에서 초음파처리로 파쇄시켜 얻은 용균액(lysate)을 Ni-NTA 컬럼(Ni2+-니트릴로삼아세트산 세파로즈 컬럼(nitrilotriacetic acid sepharose column)을 통해 정제하였고, 염분을 제거하기 위해 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 이용하였다 (도 2-A).

융합단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography)를 이용하여 융합단백질을 순수하게(순도 >90%) 정제하였다(도 2-B). 이러한 과정에 의하여 얻은 산물은 제 2-C도에 나타난 바와 같이 올리고Lys-GFP 융합 단백질과 대조군 GFP의 분자량 각각 27kDa, 26kDa를 GFP 폴리클론 항체를 탐침으로 한 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다.

본 연구에서는 다음과 같은 방법에 따라 과발현시킨 9 라이신 잔기를 갖고 있는 융합 단백질을 자연 상태나 변성시킨 상태로 순수 정제하여 표적세포의 침투실험에 사용하고자 하였다. pLys-GFP 벡터로 형질전환된 E. coli BL21을 앰피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 250rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D600 = 0.6∼1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM 되게 한 다음 3시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5ml 결합완충용액(binding buffer; 5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파처리(sonication)하였다. 재조합 올리고Lys-GFP 융합단백질은 두 가지의 조건하에서 즉, 변성상태(denaturing condition)와 변성시키지 않은 자연상태(native condition)에서 각각 정제하였다. 10g의 박테리아 펠렛(bacterial pellet)을 40ml 완충액 A(buffer A; 6M 우레아, 20mM HEPES, pH 8.0, 100mM NaCl)에 넣고 초음파처리하여 세포를 파쇄시킨 다음 원심분리를 2회(16,500rpm×30min, 40,000rpm×30 min, 4℃) 연속 수행하여 불용성의 세포 파편(cell debris)을 제거하였다.

원심분리하여 얻은 상층액을 즉시 완충액 B(buffer B; 6M 우레아, 20mM HEPES, pH 8.0, 100mM NaCl, 20mM 이미다졸)로 평형을 유지시킨 2.5ml Ni2+-니트릴로삼아세트산 세파로즈 컬럼(nitrilotriacetic acid sepharose column; Quagen, USA)에 부하하고 10배 부피의 결합 완충액과 6배 부피의 세척 완충액(washing buffer; 60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 세척한 다음 용출 완충액(elution buffer; 1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 용출하였다. 이어 올리고Lys-GFP 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 세파덱스(Sephadex) G-25M을 함유한 PD-10 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다.

분획의 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다(Bradford, 1976).

<실시예 4> 융합단백질의 세포 내 전달 실험

우선 변성상태와 자연상태에서 정제한 올리고Lys-GFP 융합 단백질의 HeLa 세포 내 전달 효과를 측정하였다.

HeLa 세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO₂를 공급해 주며 20mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5mM NaHCO3, 10% 우태혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 항생제(100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.

올리고Lys-GFP 융합 단백질의 세포내 투과를 관찰하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함된 1 ml의 신선한 배양액으로 교체하고 여러 농도의 재조합 Lys-GFP를 배양액 내에 처리하였다. 1시간 뒤, 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline;PBS)로 충분히 세척하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 올리고Lys-GFP 융합 단백질의 양을 웨스턴 블랏 분석 및 면역형광 현미경법(immunofluorescence microscopy)로 측정하였다.

변성 상태와 자연상태에서 정제한 각각의 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 0.5μM 농도로 2시간 동안 세포배양액 내에 처리한 결과, 변성상태의 올리고Lys-GFP 융합 단백질은 자연 상태에서 정제한 올리고Lys-GFP 융합 단백질에 비해 높은 효율로 세포 내로 전달되는 것을 웨스턴 블랏 통해 관찰할 수 있었고 대조 단백질로 사용한 대조군 GFP는 전혀 세포막을 투과하지 못하였다(도 3). 이러한 결과는 단백질이 세포 내로 전달될 때 변성된 올리고Lys-GFP 융합 단백질이 변성되지 않은 올리고Lys-GFP 융합 단백질보다 침투 효율이 더 높다는 사실을 나타낸다. 이러한 변성된 올리고Lys-GFP 융합 단백질이 더 높은 단백질 침투 효율을 지니는 이유는 에너지론적으로 볼 때, 변성되어 풀어진 구조의 단백질 형태가 3차 또는 4차 구조를 지닌 단백질 보다 세포막을 통과하기가 용이하기 때문이라 생각된다.

변성상태의 올리고Lys-GFP 융합단백질의 HeLa 세포 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 제 4도에 나타낸 바와 같이 변성상태의 올리고Lys-GFP 융합 단백질은 시간 및 농도 의존적으로 HeLa 세포 내로 이동하였다. 변성상태의 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 2시간 동안 0.1μM에서 1.5μM로 점차적으로 농도를 증가시켜 HeLa 세포에 처리한 결과, 제 4-A도에서 보는 바와 같이 농도가 증가함에 따라 세포 내로 침투되는 양이 지속적으로 증가된다는 것을 확인하였다. 또한 0.5μM의 올리고Lys-GFP 융합 단백질의 세포 내 투과 정도를 시간별로 관찰한 결과, 투여 5분만에 융합단백질이 세포 내로 침투하여 1시간 처리하였을 때 거의 최고치를 나타내었고 6시간 처리하였을 때도 같은 결과를 확인할 수 있었다 (도 4-B).

<실시예 5> 웨스턴 블랏 분석

세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기이동(polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 5% 분유(dry milk)와 3% 트윈 20(Tween 20)으로 블랏팅(blotting)하고, 이어 GFP에 대한 폴리클론 항체(polyclonal antibody; Clontech, USA, 1:1,000)로 1시간 처리하였다. 세척후 멤브레인을 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 결합된 고우트 항-래빗 (goat anti-rabbit) IgG 항체(Sigma, 1:10,000 희석)와 1시간동안 반응시켰다. 최종적으로 알칼린 포스파타아제 결합 기질 킷트(alkaline phosphatase conjugate substrate kit; Bio-Rad, USA)를 처리하여 GFP 폴리클론 항체에 반응하는 단백질 밴드를 확인하였다.

<실시예 6> 면역형광 분석(immunofluorescence microscopy)

목표세포에 융합 단백질을 전달하고자 할 때 전달되는 세포의 비율이 얼마나 되는지가 중요하다. 또한 세포 내로 투과된 융합단백질이 그 고유한 활성을 유지해야만 이러한 단백질 전달 기술이 응용될 수 있다. 따라서 본 실험에서 올리고Lys-GFP 융합 단백질이 전달되는 세포의 비율이나 전달된 융합단백질의 활성 유무를 분석하였다. 변성된 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 처리한 HeLa 세포에서 GFP가 나타내는 형광도를 형광현미경으로 관찰하였다.

커버 글래스(cover glass)를 미리 넣어 둔 24 웰 플레이트에 HeLa 세포를 각각 5×10⁵이 되게 배양한다. 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 HeLa 세포에 처리하기 전에 배양 배지를 버리고 PBS(pH 7.4)로 세척한 후, 각 웰에 FBS가 첨가된 1㎖의 새로운 완전배지(complete medium)를 넣고 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 시간별, 농도별로 처리하였다. 2시간후 배지를 버리고 PBS(pH 7.4)로 한두번 세척한 다음 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 식염수(PBS)로 1-2번 세척하였다. 세포를 고정시키기 위해 3.7% 포름알데히드(formaldehyde)를 이용하였고, 핀셋으로 커버 글래스를 집어내어 2차 증류수에 잠시 담근 후 꺼내어 상온에서 충분히 말렸다. 슬라이드 글래스에 마운팅 용액(mounting solution; 90% 글리세롤, 0.1% 페닐렌디아민이 포함된 인산완충액 식염수(PBS))을 처리한 다음, 위에서 준비한 커버 글래스를 덮어 올림푸스 형광 현미경(Olypus epifluorescence microscope)을 이용하여 세포 내 형광 유무를 관찰, 단백질의 세포 내 분포를 분석하였다(Eric et al., 1997).

변성된 올리고Lys-GFP 융합 단백질은 거의 100%에 달하는 HeLa 세포에 전달되었고 HeLa 세포 투과 이후 세포질 내에서 GFP 단백질 활성이 회복됨을 관찰하였다(도 5). 변성상태의 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 처리한 HeLa 세포 내의 형광도는 웨스턴 블랏 데이터와 마찬가지로 농도 의존적으로 증가되는 것으로 나타났다. 한편, 올리고Lys-GFP 융합 단백질을 저농도로 처리하였을 때는 대부분이 세포질에 축적되었고, 농도를 점차적으로 증가시킴에 따라 핵과 세포질에 축적되는 것을 관찰하였다. 융합단백질을 투여하지 않은 세포에서의 형광도는 매우 낮아 대조군의 수준과 비슷한 것으로 관찰되었다. 이러한 결과들은 올리고Lys-GFP 융합 단백질이 성공적으로 거의 모든 세포 내로 침투하였으며, 침투한 단백질들이 완전한 활성도를 지니고 있다는 것을 보여주고 있다. 또한 변성상태의 올리고Lys-GFP 융합 단백질의 구조가 HeLa 세포 내에서 원래의 상태로 다시 회복됨을 암시하고 있다. 이러한 단백질 접힘 현상에 대한 이유를 정확히 알지는 못하지만, 아마도 HSP90 같은 샤페론(chaperones)이 관여하리라 추정된다 (Schneider et al., 1996, Fink, 1999, Mayer and Bukau, 1999).

<실시예 7> 3∼9개의 라이신 잔기로 구성된 올리고K-GFP 융합 단백질 발현 벡터의 제조 및 올리고K 융합단백질의 생산과 정제

올리고라이신(명세서 및 도면에서 "올리고K", "올리고Lys"와 혼용함)-GFP 융합단백질 발현 벡터는 3개부터 9개의 라이신을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 합성하여 NdeI과 XhoI으로 절단한 pET15b-GFP에 각각 연결(ligation)함으로써 제조하였고 서열결정(sequencing)으로 삽입된 염기서열을 확인하였다(도 6). 이 융합단백질들은 아미노말단부터 히스티딘 태그(his tag)-올리고라이신(oligoK)-GFP의 순으로 융합되어 있다. 여기에서 GFP는 아쿠에아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래 단백질을 사용하였다. 대조군으로는 S2 세포에서 세포 투과성이 입증된 Tat-GFP 융합단백질을 사용하였다.

상기 올리고라이신-GFP 융합단백질을 과대발현시키기 위하여 상기 pET-올리고K-GFP 발현벡터를 IPTG로 과대 발현을 유도하였고, 이와 같이 처리된 이 콜리 세포를 6M 우레아가 함우된 용액에서 초음파처리로 파쇄한 다음 정제하였다.

위에서 제조한 플라스미드를 이 콜리(E. coli) BL21에 형질전환(transformation)하여 히스티딘 태그가 붙은 융합단백질을 발현시킨 다음 Novagen에서 제시한 방법대로 변성 조건에서 세포를 깬 후 Ni 컬럼으로 순도 95% 이상으로 거의 순수하게 정제하였다(도 7). 용출한 단백질은 같은 부피의 글리세롤과 잘 섞은 다음 -70℃ 딥 프리저(deep freezer)에 보관하였다. 정제한 단백질의 농도는 브래드포드 어세이(Bradford assay)로 측정하였으며 SDS-PAGE로 확인하였다.

<실시예 8> 플루오로미터(Fluorometer)를 사용한 올리고K-GFP 융합 단백질의 세포 침투활성 비교

드로소필라(Drosophila) S2 세포 배양과 PTD-GFP 융합단백질의 세포침투 활성 측정은 기존의 방법을 따랐다(Han, 1996; Han et al, 2000). 스플리팅(splitting)이 필요한 S2 세포와 4배 부피의 M3 배양액(Sigma)을 잘 섞은 다음 세포현탁액 0.5ml씩을 24웰 컬처 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 정제된 융합 단백질 수㎕(50nM,100nM, 200nM)를 한 농도당 두 개 웰의 배양액에 넣은 다음 잘 섞어주었다. 세포를 컬처 플레이트에 옮긴 다음 단백질을 넣어 줄 때까지의 시간은 즉시부터 약 12시간까지 별 차이가 없었다. 보통 두 시간 후에 단백질을 처리하고 다시 한시간 후에 배양액을 100㎕의 EDTA 없는 트립신(Gibco)으로 바꾸어준 후 25℃에서 15분간 배양하였다. 400㎕의 PBS를 첨가한 후 마이크로피펫을 사용하여 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)로 옮겼으며 이때 같은 농도의 두 웰의 세포현탁액을 합쳤다. 2,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 침전된 세포를 500㎕의 PBS로 세 번 씻어주었다. GFP 융합단백질의 정량은 플루오로미터로 수행하였다(excitation : 488 nm, emission : 507 nm).

올리고K-GFP 융합단백질의 침투효율은 농도에 비례하였고, 또한, 라이신 잔기가 3∼9개인 경우 잔기의 갯수가 많아짐에 따라 비례하여 높아졌다(도 8).

<실시예 9> 웨스턴 블랏팅

올리고K-GFP 융합단백질의 침투효율 및 세포 내에서의 안정성을 비교하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

융합단백질의 세포내 침투는 위와 같은 방법으로 수행하되 스케일을 10배 증가시켰다. 즉 60mm 배양접시와 5ml의 세포현탁액을 사용하였으며, 융합단백질은 최종농도가 300nM이 되도록 첨가하였다. 단백질 처리 1시간 후 세포를 1ml의 트립신으로 처리하고 PBS로 여러 번 씻은 후 20㎕의 CLR(cell lysis reagent, Promega) 로 세포를 깼다. 5㎕의 5X 로딩 완충액(loading buffer)과 혼합하여 5분간 끓인 후 10분간 원심분리하였다. 브래드포드 어세이로 단백질의 농도를 측정한 후 같은 양의 단백질이 되도록 각 세포추출물의 부피를 조정하여 상층액을 10% SDS 폴리아크릴아미드 젤에 로딩한 후 전기영동하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로스 멤브레인(Amersham, UK)으로 옮긴 후 5% BSA가 포함된 PBS로 블로킹하였다. 폴리클론날 항-GFP 항체(Polyclonal anti-GFP antibody)로 상온에서 1시간 처리하고 세척한 후 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 고우트-항 마우스 IgG 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody)와 상온에서 한 시간 반응시켰다. GFP 단백질의 위치는 Amersham에서 제공한 방법을 적용하여 ECL 키트 (Amersham)로 찾았다.

GFP 단백질은 웨스턴 블랏에서 단백질 밴드가 전혀 관찰되지 않는 것으로 보아 전혀 투과성이 없었다. 반면, 모든 올리고K-GFP 융합단백질들은 예측된 분자량 지점에서 플루오로미터로 측정한 결과와 유사한 패턴으로 단백질 밴드를 형성하였다(도 9). 또한, 라이신의 갯수가 6개 이상 9개 이하일 때 Tat-GFP에 비하여 침투효율이 높음을 발견하였다.

<실시예 10> 올리고Lys-SOD의 동물 피부세포 투과

실험동물로서 체중 200g 내외의 수컷 SD 랫트를 사용하였다. 실험동물은 대조군(SOD 도포) 10마리와 실험군 (올리고Lys-SOD 도포) 15마리를 각각 사용하였다.

각 실험동물을 24시간 절식시킨 후, 질소와 산소가 7:3으로 혼합된 개스에 3% 이소플루란(isoflurane)으로 전신마취를 유도한 후에 동일한 개스에 2.5% 이소플루란으로 마취를 유지하면서 복부 피부에 SOD(superoxide dismutase: 본 명세서, 도면, 청구범위에서 "SOD"라 함) 및 올리고Lys-SOD를 각각 0.3mg씩 도포하였다.

정상군과 각 실험군은 도포 2시간 후 케타민(ketamine)(30 mg/㎏)을 복강내 주사하여 전신마취시킨 후 도살하여 도포부위의 피부를 절취한 후 통상적인 방법으로 10 ㎛ 냉동조직절편을 제작하였다.

제작된 조직절편은 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분간 고정한 후 0.1M 인산완충용액 식염수(phosphate buffered saline:PBS, pH 7.4)로 10분동안 3회 수세하여 조직 내에 있던 고정액을 제거하였다. 그 후 비특이적 면역반응 (nonspecific immunoreactivity)을 방지하기 위하여 0.1M PBS(pH 7.4)에 0.3% Triton X-100, 10% normal goat serum이 희석된 용액으로 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후 1차항체인 래빗 항-히스티딘 Ig(9rabbit anti-histindine IgG)를 1:500으로 희석하여 실온에서 24시간 반응시켰다. 이후 0.1M PBS로 10분간 3회 세척하여 조직절편 속의 1차항체를 제거한 후 2차항체인 바이오타이닐레이션된 고우트 항-래빗 IgG(biotinylated goat anti-rabbit IgG)(Vector Laboratories, USA)를 0.1M PBS로 1:200으로 희석시켜 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 조직을 0.1M PBS로 10분씩 3회 세척한 후 퍼옥시다아제-결합된 스트렙타비딘(peroxydase-conjugated streptavidin)(Vector Laboratories, USA)을 1:300 (in 0.1M PBS)으로 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다.

면역반응이 끝난 조직절편은 기질액(40㎎ 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)/0.045% H₂O₂ in 100 ㎖ PBS)으로 3분간 발색시켰다. 과도한 발색을 피하기 위하여 광학현미경 하에서 발색 정도를 지속적으로 확인하였다. 발색을 마친 조직 절편을 슬라이드에 부착시킨 다음 증류수와 0.1M PB로 여러 차례 세척하였으며, 통상적인 방법으로 탈수를 거쳐 영구표본으로 작성하였다.

실시예 결과 SOD 도포군의 경우 히스티딘 면역반응은 거의 관찰되지 않았으나(도 10의 A와 C), 올리고Lys-SOD 도포군의 경우 표피층, 진피층 및 피하조직 전층에 걸쳐 강한 히스티딘 면역반응이 관찰되었다(도 10의 B와 D). 올리고Lys-SOD 도포군에서 관찰된 히스티딘 면역반응은 주로 세포핵(nucleus)에서 관찰되었으며 이러한 면역반응이 관찰된 세포는 표피세포, 섬유모세포 및 모낭 및 그 주위의 세포 등에서 고루 관찰되었다.

<실시예 11> 올리고Lys-SOD 및 Tat-SOD의 HeLa 세포내 침투효율 실험

올리고Lys-SOD와 Tat-SOD의 HeLa 세포내 침투효율을 비교하기 위하여 상기 실시예 4, 5의 방법과 동일하게 실험하였다. 도 11의 레인 1, 2, 3은 각각 올리고Lys-SOD, Tat-SOD를 0.2μM, 0.5μM, 1μM씩 가하여 HeLa 세포 내로의 침투정도를 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

그 결과, 도 11과 같이 올리고Lys-SOD의 경우가 Tat-SOD보다 세포침투효율이 매우 높은 것으로 나타났다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 핵산, 단백질, 다당류 등의 화물 분자와 공유결합하여 세포 내로 이들 화합물을 직접 도입시킬 수 있는 올리고라이신 수송 도메인을 제공한다.

또한, 본 발명은 올리고라이신-화물 분자 복합체 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이 복합체의 발현 벡터를 제공하고 생리 활성 단백질을 포함하는 올리고라이신 융합 단백질 및 단백질을 세포 내로 도입하는 방법, 그리고 이를 이용한 치료·예방용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SOD 등 활성물질을 올리고라이신과 융합시킨 올리고라이신 융합단백질을 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 세포 내로 투과된 올리고라이신-GFP는 형광활성을 유지하는 것으로 보아 정상적인 3차 구조를 유지할 뿐만 아니라 투과된 GFP 단백질은 안정한 상태로 세포 내에 존재한다.

본 발명에서 기술한 올리고라이신 수송 도메인 및 올리고라이신-화물 분자 복합체, 올리고라이신 융합 단백질, 그 발현 벡터 등은 정제된 올리고라이신-화물분자 복합체가 세포 내로 효율적으로 전달되고 전달된 화물 분자의 활성이 유지됨을 확인하였으므로, 효과적인 생리활성 물질의 세포내 전달체 및 도입방법으로 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 올리고라이신이 부착된 융합 단백질 발현벡터를 나타낸 그림이다. 이 벡터는 6개의 히스티딘, 9개의 라이신 잔기(이하 도면에 "9K"로 표시함)와 목표단백질을 융합단백질 형태로 발현시킬 수 있다. 즉, 아미노 말단부터 6개의 히스티딘, 9개의 라이신 잔기와 목표단백질 순서로 융합단백질을 발현시킬 수 있다. 6개의 히스티딘 잔기는 융합단백질의 용이한 분리를 가능하게 하여 주고, 9개의 라이신 잔기는 단백질의 세포내 전달을 효율적으로 증진시켜 주는 기능을 수행한다.

도 2는 제 1도에서 설명한 융합단백질 발현 벡터에서 생산된 단백질을 분석한 그림이다. 융합 단백질은 대장균(E.coli)에서 발현되었으며, Ni-NTA 컬럼과 세파덱스(Sephadex) G-25M을 함유한 PD-10 크로마토그래피에 의해 정제되었다. (A)는 올리고라이신-GFP(Green fluorescence protein: 이하 "GFP"로 약칭하거나 "녹색형광단백질"과 혼용함) 융합 단백질을 부분적인 변성 상태로 정제하는 과정을 나타낸 모식도이고, (B)는 올리고라이신-GFP 융합 단백질과 대조군(control) GFP를 SDS-PAGE(sodiem dodesyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; 이하 "SDS-PAGE")를 통해 분석한 그림이다. (C)는 정제한 올리고라이신-GFP 융합 단백질과 대조군 GFP을 웨스턴 블랏으로 분석한 그림이다.

도 3은 변성시킨 상태(danaturing condotion)와 변성시키지 않은 상태(native condition)로 각각 정제한 올리고라이신-GFP 융합 단백질의 세포 내 전달 효과를 비교한 그림이다. 레인 1은 대조군 GFP, 레인 2는 변성시키지 않은 상태의 올리고라이신-GFP 융합 단백질이고, 레인 3은 변성시킨 상태의 올리고라이신-GFP 융합 단백질이다. 각각의 단백질들은 0.5μM의 농도로 2시간 동안 HeLa 세포에 처리되었다.

도 4는 융합 단백질이 진핵 세포에 전달되는 효율을 단백질 농도별, 처리 시간별로 비교 분석한 그림이다. (A)는 정제한 올리고라이신-GFP 융합 단백질을 점차적으로 증가시킨 농도로 HeLa 세포에 처리한 후 2시간 후에 웨스턴 블랏으로 분석한 것이고, (B)는 0.5μM 농도의 올리고라이신-GFP 융합 단백질을 시간별로 각각 HeLa 세포에 처리한 것이다.

도 5는 세포 내로 전달된 융합단백질의 활성을 측정한 것으로, 정제한 올리고라이신-GFP 융합 단백질과 대조군 GFP를 HeLa 세포에 처리한 후, 형광 현미경에 의해 올리고Lys-GFP 융합 단백질의 형광도를 분석한 그림이다.

도 6은 올리고라이신-GFP 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.

도 7은 정제한 올리고라이신-녹색형광 단백질(GFP) 융합 단백질을 SDS-PAGE한 것이다.

도 8은 올리고라이신-GFP 융합단백질의 농도에 따른 전달효율을 형광분석한 그래프이다.

도 9는 올리고라이신-GFP 융합단백질의 전달효율을 웨스턴 블랏 분석한 것이다.

도 10은 랫트 피부세포 투과실험 결과를 촬영한 것이다. A와 B는 각각 대조군과 실험군의 표피와 진피 부위이고, C와 D는 각각 대조군과 실험군의 피하지방조직 부위를 나타낸 것이다. 사진의 화살표는 발색부위를 나타내는 것이다.

도 11은 올리고라이신-SOD 및 HIV-1(Hunan Immunodeficiency Virus type-1) Tat(transactivator of transcription)(49-57)아미노산 잔기-SOD(superoxide dismutase)를 농도별로 HeLa 세포내 침투효율 실험한 결과를 웨스턴 블랏팅한 결과이다.

<110> CHOI, SOO YOUNG HAN, KYU-HYUNG PARK, JIN-SEO <120> Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof <130> WJTJ-SHK-9K3 <150> KR10-2000-43022 <151> 2000-07-26 <150> KR10-2001-6178 <151> 2001-02-08 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding 9 lysine residues <400> 1 taagaagaaa aagaaaaaga aaaagaag 28 <210> 2 <211> 757 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant polynucleotide fused polynucleotide coding 9 lysine residues and polynucleotide coding Green Fluorescence Protein <400> 2 taagaagaaa aagaaaaaga aaaagaagct cgaggtgagc aagggcgagg agctgttcac 60 cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt 120 gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac 180 caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca 240 gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc 300 cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg 360 cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga 420 cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa 480 cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca 540 caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg 600 cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa 660 agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat 720 cactctcggc atggacgagc tgtacaagta aggatcc 757 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer polynucleotide sequence coding nine lysine residues <400> 3 tcgagcttct ttttcttttt ctttttcttc t 31 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 4 ctcgaggtga gcaagggcga ggagctg 27 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 5 ggatccttac ttgtacagct cgtccatgcc gag 33 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9 residues oligolysine <400> 6 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5

Claims (34)

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4. 6∼9개의 라이신 잔기로 구성되며, 생물학적 활성을 지닌 단백질과 공유결합되어 상기 단백질을 세포 내로 도입시키는 용도의 올리고라이신 수송 도메인.
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8. 6∼9개의 라이신 잔기로 구성된 올리고라이신 수송 도메인과 단백질 화물 분자가 공유결합된 올리고라이신-화물분자 복합체(oligolysine-cargo molecule complex).
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11. 아미노 말단 측의 6∼9개의 라이신 잔기로 구성된 올리고라이신 수송 도메인과 카르복시 말단 측의 화물 단백질이 공유결합된 올리고라이신 융합단백질.
12. 제11항에 있어서, 화물 단백질은 녹색형광단백질(GFP) 또는 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(SOD)인 것을 특징으로 하는 올리고라이신 융합단백질.
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32. 상기 제8항의 올리고라이신-화물분자 복합체 또는 제11항의 올리고라이신 융합단백질을 유효성분으로 하는 화장료 조성물.
33. 제32항에 있어서, 상기 올리고라이신-화물분자 복합체는 올리고라이신-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(SOD) 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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