WO2000047601A1

WO2000047601A1 - Polynucleotides a chaine raccourcie et procede de preparation correspondant

Info

Publication number: WO2000047601A1
Application number: PCT/JP2000/000778
Authority: WO
Inventors: Shinji Matsuyama; Kouichi Ishiyama; Junzo Seki; Tadaaki Ohgi
Original assignee: Nippon Shinyaku Co. Ltd.
Priority date: 1999-02-15
Filing date: 2000-02-14
Publication date: 2000-08-17
Also published as: ATE299885T1; RU2238279C2; ID29546A; EP1153931A1; NO20013941L; US6780429B1; CN1340055A; EP1153931B1; US20040235044A1; CN1194002C; BR0008227A; US7223857B2; KR20020013500A; CA2359674A1; KR100455814B1; NO20013941D0; ZA200106701B; DE60021354D1; DE60021354T2; AU2460900A

Description

明細書

短鎖化ポリヌクレオチド及びその製法技術分野

本発明は、特に医薬として有用な短鎖化ポリヌクレオチド、及びその製法に関するものである。詳細には、本発明は、短鎖化された合成ポリヌクレオチド又はその塩において、 2' -5' リン酸ジエステル結合が全リン酸ジエステル結合の 3 %以下、即ち、全リン酸ジェステル結合のリン酸基に対して、 3'位から 2'位に.転位したリン酸基の割合（リン酸転位率）が 3 %以下であることを特徴とする短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩、及びそれらの製法に関するものであ背景技術

ポリイノシン酸 · ポリシチジル酸、即ち、 po l y ( I ) ' poly (C) に代表されるポリヌクレオチドは、当業者において周知の化合物であり、インタ一フロン誘導作用、免疫賦活作用等を有することから、肝炎治療剤や癌治療剤としての可能性が検討されてきた。

かかるポリヌクレオチドの薬理作用は、その鎖長と高い相関があり、鎖長が長くなればなるほどインターフエ口ン誘導作用等が強くなる。しかし、その反面、鎖長が長くなればなるほど毒性が強く現れる。

最近、ポリヌクレオチドを加水分解によって短鎖化した比較的短い合成ボリヌクレオチドをカチォニック · リボソームのような、薬物を細胞内へ移入するのに有効な担体に封入するといった手法により、ポリヌクレオチドの有用な薬理作用を保持しつつ、毒性を軽減する試みがなされている（例えば、 PCT W099/20283号、 PCT 099/ 48531 号） o

ところで、上記のようにポリヌクレオチドを加水分解によって短鎖化すると、短鎖化と同時にシユードローテーションという機構を介して、一部のリン酸基が 3'位から 2'位へ分子内転位することが知られている（例えば、「蛋白質核酸酵素」 Voし 40, No.10, pp. 1323-1332 (1995)参照）。その結果、短鎖化ポリヌクレオチド分子内の 3' _ 5' リン酸ジエステル結合の一部が、 2' - 5' リン酸ジエステル結合に置き換わることになる。このようなリン酸基の転位現象が薬理作用にどのような影響を及ぼすのかは知られていない。

発明の開示

本発明の目的は、第一に、医薬としてより有効でより安全な短鎖化ポリヌクレオチド及びその塩、並びにその二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド及びその塩を提供することにある。

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、主に短鎖化反応の際に生ずる 2' -5' リン酸ジエステル結合を一定割合以下しか有しない短鎖化ボリヌクレオチド及びその塩が上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。

本発明の一つは、従って、短鎖化されたボリヌクレオチド又はその塩において、 2' -5' リン酸ジエステル結合が全リン酸ジエステル結合の 3 %以下、好ましくは 2 %以下であることを特徴とする短鎖化ボリヌクレオチド又はその塩である。

また、上記 2' -5' リン酸ジエステル結合が全リン酸ジエステル結 778

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合の 3 %以下、好ましくは 2 %以下の短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩において、二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩から形成される二本鎮短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩も本発明として挙げることができる。さらには、薬物を紬胞内へ移入するのに有効な担体と、上記 2' -5' リン酸ジエステル結合が全リン酸ジエステル結合の 3 %以下の短鎖化ポリヌクレオチド若しくはその塩、又はその二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレォチド若しくはその塩から形成される二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド若しくはその塩とを必須構成成分として形成される複合体を含有する組成物も本発明として挙げることができる。

本発明に係るポリヌクレオチドは、各々のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を介して直鎖状に重合した化合物で、重合するヌクレオチドの数がおよそ 20個以上のものをいい、合成又は天然のものを挙げることができる。具体例としては、ポリイノシン酸（即ち、 po l y ( I ) ) 若しくはそのアナログ、ポリシチジル酸（即ち、

po l y (C) ) 若しくはそのアナログ、ポリアデニル酸（即ち、

po l y (A) ) 若しくはそのアナ口グ、又はポリゥリジル酸（即ち、 po l y (U) ) 若しくはそのアナログを挙げることができる。

ポリイノシン酸アナ口グは、ィノシン酸の全部又は一部が化学修飾されたホモポリマーか、イノシン酸と他のヌクレオチドとのコポリマーであり、例えば、ポリ（7-デァザイノシン酸）、ポリ（2' - アジドイノシン酸）を挙げることができる。ポリシチジル酸アナ口グは、シチジル酸の全部又は一部が化学修飾されたホモポリマーか、シチジル酸と他のヌクレオチドとのコポリマーであり、例えば、ポリ（5-プロモシチジル酸）、ポリ（2-チオシチジル酸）、ポリ（シチジン- 5' -チォリン酸）、ポリ（シチジル酸、ゥリジン酸）、ポリ (シチジル酸、 4-チォゥリジン酸）、ポリ（1-ビニルシチジル酸）を挙げることができる。ポリアデニル酸アナログ、ポリゥリジル酸アナログも同様である。これらの中、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸が本発明において適当である。

本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチドの平均鎖長としては、 0.1k bases〜 1 k bases (base: 塩基数、 Ik basesは 1000塩基数、以下 rbase(s) 」を単に「b 」という）が適当であり、好ましくは 200 b 〜800 b であり、更に好ましくは 300 b 〜600 b である。当該平均鎖長は、例えば、後述する試験例 5 のような、ゲルパ一ミエーシヨンクロマ卜グラフィ一法 ( gel permeation chromatography 、以下「 G P C法」という）により容易に決定することができる。

本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチドは、リン酸転位率が 3 %以下であるが、好ましくは 2 %以下又は 0.1 %〜2 %、さらに好ましくは 1 %以下又は 0.1 %〜 1 %である。

ポリヌクレオチドのリン酸基の 3'位から 2'位への転位は、例えば後述する試験例 6のような方法により、容易に確認することができる。即ち、 3' -5' リン酸ジエステル結合を特異的に加水分解するヌクレア一ゼ酵素によりポリヌクレオチドをヌクレオシド、ヌクレォチド及びォリゴヌクレオチドレベルまで分解した後、末端のリン酸基を特異的に加水分解するァルカリホスファ夕一ゼ酵素で処理することにより全ヌクレオチドをヌクレオシドに変換する。一方、ヌクレアーゼ！酵素により分解されない 2' -5' リン酸ジエステル結合を有するォリゴヌクレオチドは、アルカリホスファターゼ酵素で処理しても、分子内の 2' - 5 ' リン酸ジエステル結合が加水分解されないのでヌクレオシドにまで分解されない。液体クロマトグラフィー等を用いて、ヌクレオシドとオリゴヌクレオチド（大部分は二量体 ) を定量することにより、リン酸転位率を求めることができる。本発明における二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチドとしては、例えば、ポリイノシン酸とポリシチジル酸、ポリアデニル酸とポリゥリジル酸、ポリイノシン酸アナログとポリシチジル酸、ポリイノシン酸とポリシチジル酸アナ口グ、ボリイノシン酸ァナログとポリシチジル酸アナログ、ポリアデニル酸アナログとポリゥリジル酸、ポリアデニル酸とポリゥリジル酸アナログ、ポリアデニル酸アナログとボリゥリジル酸アナログを挙げることができる。従って、二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチドから形成される二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドとしては、例えば、ポリィノシン酸 · ポリシチジル酸、ポリアデニル酸 . ポリウリジル酸、ポリイノシン酸アナログ · ポリシチジル酸、ポリイノシン酸 ' ポリシチジル酸アナログ、ポリイノシン酸アナログ ' ポリシチジル酸アナ口グ、ポリアデニル酸アナ口グ · ポリゥリジル酸、ポリァデニル酸

• ポリゥリジル酸アナログ、ポリアデニル酸アナログ . ポリウリジル酸アナログを挙げることができる。これらの中、ポリイノシン酸

■ ボリシチジル酸が本発明において適当な二本鎖短鎖化ポリヌクレォチドとして挙げることができる。

上記二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドの平均鎖長は、全短鎖化ポリヌクレオチドの平均鎖長と考えるのが適当であり、この平均鎖長を /JP00/00778

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二本鎖短鎖化ボリヌクレオチドの見掛け上の平均鎖長として塩基対数で表現することができる。従って、上記二本鎖短鎖化ポリヌクレォチドの平均鎖長として、 0. Ik bp 〜 1 k bp (bp: 塩基対数、 Ik b p は 1000塩基対数）を挙げることができ、 200 bp~800 bpが好ましく、 300 bp〜600 bpがより好ましい。

本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチドの塩、及び二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドの塩としては、医薬上許容される塩なら特に制限はなく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩を挙げることができる。薬物を細胞内へ移入するのに有効な担体としては、例えば、正電荷を有する担体を挙げることができ、その具体例としては、ポリ -し- リジンのようなカチオン性ポリマーやリボフヱクチン（登録商標），リボフヱクトァミン（登録商標）、リボフヱクトエース（登録商標 ) 、 D RIE-C (登録商標）等のカチォニック · リボソーム、またその一種と考えられ、 PCT W094/19314号公報に開示されている、例えば、下記構造式〔 I 〕を有する 2- 0-(2- ジェチルアミノエチル）力ルバモイル -1, 3-0- ジォレオイルグリセロールとリン脂質（例えば, ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加リン脂質）とを必須構成成分として形成される薬物担体を挙げることができる。

CH₂— 0-CO-(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃-cis

CH ~0-CO-NHCH₂CH₂N<cn²Qn⁸ C I )

CH₂— 0- CO- (CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃-cis 上記カチォニック · リボソームは、正電荷を有し、負電荷を有するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと静電的な複合体を形成し、それが細胞膜と融合するとともに、ポリヌクレオチド又はォリゴヌクレオチドが細胞内に移入されると考えられている。このような複合体は、リポプレックスと呼ばれることがある。

本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチドの製造方法について詳述する。本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチドは、例えば、出発物質であるポリヌクレオチド溶液を、適当な pH範囲、適当な温度範囲で加熱加水分解することにより製造することができる。その際の水溶液の pHは、 pH 7以上の塩基性が適当であり、 pH 7〜1 0が好ましい。また、短鎖化反応の速度及び塩基部分の安定性を考慮すれば、 PH 8〜 9がより好ましい。一方、反応温度は、塩基の安定性から 20〜 1 10 °Cの範囲内が適当であり、 40〜100 °Cの範囲内が好ましい。しかし、十分な加水分解速度と塩基部分の安定性を考慮すれば、 50〜90 °Cの範囲内がより好ましい。

より具体的には、例えば、ボリヌクレオチドに水（注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水など）を加え撹拌溶解し、緩衝剤や PH調節剤を用いて pH 8〜 9 に調整する。そして反応温度 50〜90°Cの範囲内において、平均鎖長とリン酸転位率をモニタリングしながら、 0. 5 〜60時間、加熱加水分解することにより、リン酸転位の少ない 0. 1 kb〜l kbの平均鎖長を有する短鎖化ポリヌクレオチドを製造することができる。

pHの調整には、医薬上許容される添加剤、例えば緩衝剤や pH 調節剤を使用しても良い。具体的にはァミノ酢酸（別名、グリシン）、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン（別名、卜リス）、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム（別名、重曹）、水酸化ナトリゥム、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン等の緩衝剤や pH調節剤を挙げることができる。これらの種類、組み合わせ及び濃度等は何ら限定されない。

反応液を透析処理や活性炭処理等すれば、モノマ—や不要な塩、不純物、短鎖化により生成した反応副生成物などを系外に除去することができる。

また、本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチドは、例えば、出発物質であるポリヌクレオチド溶液を、適当な p H範囲、適当な温度範囲で、ホスホジエステラーゼを用いて製造することもできる。その際の反応液の p Hは、 p H 4〜 9が適当であり、 p H 5〜 8が好ましい。また、反応時のリン酸転位を考慮すれば、 p H 6〜 7がより好ましい。一方、反応温度は、酵素の性質を考慮すれば 20〜60°Cの範囲内が適当であり、 25〜50°Cの範囲が好ましい。しかし、十分な加水分解速度が得られること、酵素反応以外の熱による加水分解の影響が少ないこと、かつリン酸基の転位が起こらないことなどを考慮すれば、 30〜40°Cの範囲内がより好ましい。

より具体的には、例えば、ポリヌクレオチドに水（注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水など）を加え攪拌溶解する。必要ならば緩衝剤ゃ P H調整剤を加えて p Hを調整する。この液を例えばヌクレァーゼ P i のようなホスホジエステラーゼを加え、反応温度 30〜40 °Cの範囲内において、平均鎖長とリン酸転位率をモニタリングしながら短鎖化することによりリン酸転位の少ない 0. 1 kb〜l kbの平均鎖長を有する短鎖化ポリヌクレオチドを製造することができる。酵素の濃度や反応条件等は何ら限定されない。

反応液をエタノール沈殿、透析処理、活性炭処理などすれば、酵素やモノマー、不要な塩、不純物、短鎖化により生成した反応副生成物などを系外に除去することができる。

短鎖化したポリヌクレオチドは、適当な膜分離により精製することができる。本発明に係る 0. 1 kb〜l kbの平均鎖長の範囲を分画する目的としては、例えば、限外ろ過メンブラン等が適当である。当 . 該メンブランの材質や孔径等は何ら限定されない。

出発原料であるポリヌクレオチドは、天然、合成の起源、塩の種類、鎖長を問わない。天然のポリヌクレオチドとしては、例えば、 t R N Aやポリアデニル酸を挙げることができる。一方、合成ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドホスホリラ一ゼに代表される R N A合成酵素やその固定化酵素から製造することができる。また、ィンターフェロン誘導試薬として市販されているポリイノシン酸ナトリウム塩やポリシチジル酸ナトリゥム塩等を出発原料とすることもできる。

本発明に係る二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドは、上記のようにして得られたリン酸転位の少ない短鎖化ポリヌクレオチドの中、二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチドを、適当な溶液（例、 0. 15M NaC l含有 10mMトリス—塩酸緩衝液（pH7) ) 中で混合することにより得ることができ、また常法に従ってアニーリングすることにより得ることができる。アニーリングの方法としては、例えば、二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチドを含む溶液を 70〜 80。Cまで昇温し、徐冷する方法を挙げることができる。

上記のようにして得られたリン酸転位の少ない短鎖化ポリヌクレォチド又は二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドは、凍結乾燥処理することができ、そうすることにより長期保存可能な凍結乾燥品を調製することができる。凍結乾燥処理は常法により行うことができる。例えば、上記条件にて得られた短鎖化ポリヌクレオチド溶液をろ過滅菌後、ろ液を乾熱滅菌処理した金属バットに注ぎ、 - 40 〜- 20 の棚温度で予備凍結を 1 〜 4時間程度行い、一次乾燥後、棚温度 15〜 30 °C減圧下で二次乾燥（1 0〜50時間程度）して凍結乾燥品を得ることができる。かかる凍結乾燥品は、一般には任意の適当な溶液（注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水、マルト—ス溶液、グルコース溶液等）の添加により再溶解し使用することができる。

本発明に係る組成物、即ち、薬物を細胞内へ移入するのに有効な担体と、 2' -5 ' リン酸ジエステル結合が全リン酸ジエステル結合の 3 %以下の短鎖化ポリヌクレオチドであって、二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチド、又はその二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチドから形成される二本鎖短鎖化ポリヌクレォチドとを必須構成成分として形成される複合体（以下「本復合体」という）を含有する組成物は、リボソームの一般的な製造方法と同様にして製造することができる。具体的には、薬物を細胞内へ移入するのに有効な担体、例えば、カチォニック · リボソーム又はその原料（例、 2-0- (2- ジェチルアミノエチル）力ルバモイル - 1 , 3-0- ジォレオイルグリセロール等のグリセ口一ル誘導体及びリン脂質）に、水（注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等）を加えこれらを撹拌混合し、この混合物を適当な分散機、例えば、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散機、超音波ホモジナイザー、高圧乳化分散機、マイクロフルイタイザ一（商品名）、ナノマイザ一（商品名）、 D e B e e 2000 (商品名）、アルティマイザ一（商品名）、マントン一ガウリン型高圧ホモジナイザ一を用いて分散処理し、この脂質分散液に本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチド又は二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドを加え、再度適当な分散機で分散処理して本複合体を得た後、ろ過滅菌等の滅菌処理を行うことにより注射剤としての本発明組成物を製造することができる。その他の任意の添加剤は、製造時の適当な工程において添加することができ特に制限はなレ、。また、薬物を細胞内へ移入するのに有効な担体、例えば、カチォニック . リボソーム又はその原料（例、 2- 0 - (2- ジェチルァミノェチル）力ルバモイル - 1 , 3-0- ジォレオイルグリセロール等のグリセロール誘導体及びリン脂質）、及び本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチド又は二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドを予め混合し、この混合物に水を加えて、同時に分散処理して本複合体を含有する本発明組成物を製造することもできる。また、上記各製法において、適当な粗分散工程を経て製造することもできる。

得られた本発明組成物は、凍結乾燥処理することができる。凍結乾燥処理することにより長期保存可能な本発明組成物の凍結乾燥製剤を調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記分散処理後、ろ過滅菌処理して得られた本発明組成物を、所定量をバイアル瓶に分注する。約- 40 〜- 20 での条件で予備凍結を約 2〜 3時間程度行い、約 0〜1 0 °Cで減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約 15〜25 °Cで減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。そして、一般的にはバイアル瓶内部を窒素ガス等の不活性ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。

本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液の添加によつて再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、注射甩蒸留水、生理食塩水、マルトース溶液、グルコース溶液、その他一般的な輸液等をあげることができる。

本発明組成物、及びその凍結乾燥製剤は、薬剤として用いることができる。薬剤としての本発明組成物、及びその凍結乾燥製剤は、ポリヌクレオチドが有する薬理作用を発揮することができる。従つて、当該薬剤の具体例としては、例えば、インターフニロン誘導化剤、免疫賦活剤、細胞内ヌクレアーゼ活性化剤、癌治療剤もしくは予防剤、又は肝炎治療剤もしくは予防剤を挙げることができる。

発明を実施するための最良の形態

本発明を実施例及び試験例を挙げて更に詳しく説明する。本発明はこれらの実施例及び試験例によって何ら限定されるものではない。参考例 1

イノシン -5' -二リン酸三ナトリゥム塩 8 g及び塩化マグネシウム 1 gに、 0. 1 Mグリシン -水酸化ナトリウム緩衝液 500 mLを加え、撹拌溶解した。 6 N水酸化ナトリウムを加え pH 9. 3に調整した後、 38 °Cで 1 時間静置した。更にポリヌクレオチドホスホリラ一ゼ溶液 l mしを添加し、 38°Cで 18 時間反応した。かかる反応液に 0. 2 Mェチレンジアミン四酢酸 25mLを加えて反応を停止し、飽和食塩水 10mL 及び無水ェ夕ノール 500mL を加えてポリイノシン酸（ 1 973 b) を沈殿させた。

参考例 2

シチジン -5 ' -二リン酸三ナトリゥム塩 1 0 g及び塩化マンガン 3 g に、 0. 2 M炭酸水素ナトリゥム一水酸化ナトリゥ厶緩衝液約 1 Lを加え、撹拌溶解した。 6 N水酸化ナトリウムを加え pH 9. 8に調整した後、 36°Cで約 I 時間静置した。更に精製したポリヌクレオチドホスホリラーゼ溶液 2 mLを添加し、 36でで 24時間反応した。 0. 2 Mェチレンジアミン四酢酸 50mLを加えて反応を停止した。かかる反応液に飽和食塩水 20mL及び無水エタノール 1 Lを加えポリシチジル酸（ 3300 b) を沈殿させた。

実施例 1

参考例 1 で得たポリイノシン酸を遠心分離し、その沈殿物を注射用水 500 mLに再溶解して透析処理した。透析内液を活性炭処理し、ろ過操作により活性炭を除去した後、ろ液に 6 N水酸化ナトリウムを加え pH 8. 5に調整し、 70°Cで 8時間、加熱加水分解し当該ポリィノシン酸を短'鎖化した。かかる短鎖化ポリヌクレオチド溶液を活性炭処理し、ろ過操作により活性炭を除去した後、透析処理を行った _c 透析内液をろ過滅菌後、ろ液を常法により凍結乾燥処理し、リン酸転位の少ない本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチド（ポリイノシン酸のナトリウム塩）の凍結乾燥品 1 . 9 gを得た（リン酸転位率

0. 2 %、平均鎖長 360 b) 。

実施例 2

参考例 2で得たポリシチジル酸を遠心分離し、その沈殿物を注射用水 500mL に再溶解して透析処理した。透析内液を活性炭処理し、ろ過操作により活性炭を除去した後、ろ液に 6 N水酸化ナトリゥムを加え pH 9.0に調整し、 80°Cで 4時間、加熱加水分解し当該ポリシチジル酸を短鎖化した。かかる短鎖化ポリヌクレオチド溶液を活性炭処理し、ろ過操作により活性炭を除去した後、透析処理を行った。透析内液をろ過滅菌後、ろ液を常法により凍結乾燥処理し、リン酸転位の少ない本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチド（ポリシチジル酸のナトリウム塩〉の凍結乾燥品 2.7 gを得た（リン酸転位率

0.1%, 平均鎖長 318 b) 。

実施例 3

ポリアデ二ル酸ナトリゥム塩（Sa₂。. _w (沈降定数）： 7.2 、生化学工業（株）製） 1 gに、 0.1 Mトリスー塩酸緩衝液（pH 8.0) 200 mLを加えて撹拌溶解した。試験例 5記載の方法により平均鎖長をモニターしながら、 60°Cで 48時間、加熱加水分解することにより当該ポリアデ二ル酸を短鎖化した。かかる短鎮化ポリヌクレオチド溶液を透析処理した後、透析内液を常法により凍結乾燥処理し、リン酸転位の少ない本発明に係る短鎖化ポリヌクレオチド（ポリアデニル酸のナトリゥム塩）の凍結乾燥品 0.3gを得た（リン酸転位率

1.9%、平均鎖長 154 b) 。

実施例 4

ポリゥリジ.ル酸ナトリウム塩（S°₂。. w (沈降定数）： 6.5 、生化学工業（株）製） l gに、 0.2Mグリシン一水酸化ナトリウム緩衝液（pH 9.0) 200 mしを加えて撹拌溶解した。試験例 5記載の方法により平均鎖長をモニターしながら、 60°Cで 25時間、加熱加水分解することにより当該ポリゥリジル酸を短鎖化した。かかる短鎖化ポリヌクレオチド溶液を透析処理した後、透析内液を常法により凍結乾燥処理し、リン酸転位の少ない本発明に係る短鎖化ボリヌクレオチド（ポリウリジル酸のナトリウム塩）の凍結乾燥品 0.2gを得た（リン酸転位率 1, 2%、平均鎖長 108 b) 。

実施例 5

ポリイノシン酸ナトリウム塩（S。₂。， _w (沈降定数）： 8.8 、ャマサ醬油（株）製） 250 mgに、 50mし 0.1M トリス—塩酸緩衝液（ pH

8, 0) を加えて撹拌溶解した。かかる溶液を 50〜 120°Cの適当な短鎖化温度で加熱し、試験例 5記載の方法により平均鎖長をモニターしながら、任意の鎖長のボリイノシン酸をサンプリングした。その結果を表 1 に示す。得られたサンプル溶液はそれぞれ透析後、常法により凍結乾燥処理し各凍結乾燥品を得た。

表 1

実施例 6

ポリシチジル酸ナトリウム塩（S°_{2 Q}. _w (沈降定数）： 8.6 、ャマサ醬油（株）製） 250 mgに、 50mし 0.1M トリス—塩酸緩衝液（pH

9.0) を加えて撹拌溶解した。かかる溶液を 55〜 120°Cの適当な短鎖化温度で加熱し、試験例 5記載の方法により平均鎖長をモニター 77

16

しながら、任意の鎖長のポリシチジル酸をサンプリングした。その結果を表 2に示す。得られたサンプル溶液はそれぞれ透析後、常法により凍結乾燥処理し各凍結乾燥品を得た。

表 2

上記実施例 5及び 6 の結果から明らかなように、市販のポリイノシン酸ナトリゥム塩及びポリシチジル酸ナトリゥム塩を短鎮化する場合、短鎖化温度が 55°C以下では十分な加水分解がなされなかつた c そのため、短鎖化時間約 50時間後でも 1 を越えるような平均鎖長を示した。一方、短鎖化温度を 120^eCとしたサンプル及び短鎖化温度を 90 Cに設定したサンプルでは、加水分解の反応速度が大きすぎるため、短鎖化を制御することは困難であった。特に短鎖化温度が 120°Cの場合では、短鎖化 1〜 1.5時間でオリゴヌクレオチドに近い領域にまで短鎖化された。また、このサンプルではリン酸転位率も高く、塩基部分の分解も確認された。

実施例 7

ポリアデニル酸ナトリウム塩（S。₂。， _w (沈降定数）： 7.2 、生化学工業（株）製） lOOragに、 0.1M トリスー塩酸緩衝液（pH 7.0) 100 mしを加えて溶解した。この溶液にヌクレア一ゼ】（青カビ由来、生化学工業（株）製）を加え、試験例 5記載の方法により平均 00778

1 7

鎖長をモニタ一しながら、 25。Cで 3時間インキュベートし、当該ポリアデ二ル酸を短鎖化した（リン酸転位率 0. 1 %、平均鎖長 287 b 実施例 8

ゥリジン- 5' -ニリン酸三ナトリウム塩 1 g及び塩化マンガン 0. 3 gに、 0. 2 M炭酸水素ナトリウムー水酸化ナトリゥム緩衝液約 100 mLを加え、撹拌溶解した。 1 N水酸化ナトリウムを加え pH 9. 5に調整した後、ポリヌクレオチドホスホリラ一ゼ溶液 0. 2mしを添加し、試験例 5記載の方法により平均鎖長をモニタ一しながら、 25°Cで 1 0 時間反応した。かかる反応液に 0. 2 Mエチレンジアミン四酢酸 5 mL を加えて反応を停止し、飽和食塩水 2 inし及びエタノール 100mL を加えてポリウリジル酸（ 549b) を沈殿させた。当該ポリゥリジル酸を遠心分離し、その沈殿物を注射用水 50mLに再溶解して透析処理した。透析内液に 1 N水酸化ナトリゥムを加え PH8. 5 に調整し、 80でで 30 分間、加熱加水分解し当該ポリゥリジル酸の鎖長を調節した。かかる短鎖化ポリヌクレオチド溶液を限外ろ過膜を用いて膜分離し、鎖長分布を調整すると共に、不要な塩、短鎖化反応時の副生成物等を除去した（リン酸転位率 0. 1 %、平均鎖長 485 b ) 。

実施例 9

2-0- C2- ジェチルアミノエチル）力ルバモイル - 1 , 3-0- ジォレオィルグリセロール 1 g と精製卵黄レシチン 2 gに、 100 mしの注射用水に溶解したマルトース 40 gを加え撹拌混合し、ホモジナイザーを用いて 5分間分散処理してカチォニック ■ リボソーム（担体）の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験室用小型乳化分散機を用いて 1 時間分散処理し、カチォニック ' リポソーム溶液を得た。このカチォニック · リボソーム溶液に実施例 1及び 2で得られたリン酸転位の少ない短鎖化ポリイノシン酸ナトリゥム塩及びポリシチジル酸ナトリウ厶塩のそれぞれ 200 nigを含む約 50mLの水溶液を撹拌しながらゆっくりと添加し、更に 2時間実験室用小型乳化分散機を用いて分散処理し、最後に注射用水で 400 mLに定容し、本複合体を含有する組成物を得た。更にこの本複合体を含有する組成物をろ過滅菌後、 1 mLづっバイアル瓶に分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。この凍結乾燥製剤を 1 mLとなるように注射用水で復水したときの本複合体の平均粒子径は 1 33 nm (光子相関法による）であった。実施例 1 0

2-0- C2- ジェチルアミノエチル）力ルバ乇ィル - 1 , 3-0- ジォレオィルグリセロール 50 g と大豆レシチン 25 gに、 3 Lの注射用水に溶解したスクロース 1 kgを加え撹拌混合し、マントン—ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて 30分間分散処理し、注射用水で 5 Lに定容してカチォニック · リボソーム（担体）の分散液を得た。かかる担体分散液に実施例 1 及び 2で得られたリン酸転位の少ない短鎖化ポリイノシン酸ナトリゥム塩及びポリシチジル酸ナトリゥム塩のそれぞれ 1 gを含む約 2 Lの水溶液を撹拌しながらゆっくりと添加し、 1 N塩酸を用いて pH 5. 5に調整した後、さらに 1 時間、マントン— ガウリン型高圧ホ乇ジナイザーを用いて分散処理し、最後に注射用水で 10 Lに定容し、本複合体を含有する組成物を得た。更にこの本複合体を含有する組成物を 20mしづつバイァル瓶に分注した後、常法に従って凍結乾燥製剤とした。この凍結乾燥製剤を 20 inしとなるように注射用水で復水したときの本複合体の平均粒子径は 1 58 nm (光子相関法による）であった。

実施例 1 1

2- 0 - C2- ジェチルアミノエチル）力ルバモイル- 1 , 3-0 - ジォレオィルグリセロール 1 g と卵黄ホスファチド 2 gに、 100 raLの注射用水に溶解したブドウ糖 40 gを加え撹拌混合し、ホモジナイザ一を用いて 5分間分散処理した後、 500 mLに定容しカチォニック ' リポソーム（担体）の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験室用小型乳化分散機を用いて 1 時間分散処理し、カチォニック · リポソ一ム溶液を得た。かかる溶液を 1 0mしづつバイアル瓶に分注し常法に従つて凍結乾燥した。かかる凍結乾燥品に、実施例 1 、 2若しくは 5、 6で得られたリン酸転位の少ない短鎖化ポリィノシン酸ナトリゥム塩及びポリシチジル酸ナトリウム塩、及び市販のポリイノシン酸ナトリウム塩（S 。， _w (沈降定数）： 8. 8 、ャマサ醤油（株）製）及びポリシチジル酸ナトリウム塩（S ^fl ₂。. w (沈降定数）： 6 、ャマサ醬油（株）製）のそれぞれ 5 mgを含む 1 0mしの水溶液を加え、プローブ型超音波分散機で 1 0分間分散処理し、本複合体を含有する組成物を得た。

実施例 1 2

実施例 3及び 4で得られたリン酸転位の少ない短鎖化ポリアデ二ル酸ナトリゥム塩及びポリゥリジル酸ナトリゥム塩のそれぞれ 1 00 gを含む 1 mしの水溶液と、市販のリボフヱクチン（商品名） 2 rag を含む水溶液 2 mLを撹拌しながら混合し、プローブ型超音波分散機を用いて 15分間分散処理し、本複合体を含有する組成物を得た。 P T/JP00/00778

20

実施例 1 3

ポリイノシン酸ナトリウム塩（S° ₂₀. w (沈降定数）： 8.8 、ャマサ醬油（株）製）約 200 ragに、 0.2 M酢酸一酢酸ナトリゥム緩衝液 (pH 5.2) を加え、撹拌溶解した後、 80°Cに加熱し、試験例 6記載の方法にてリン酸転位率をモニタ一しながら、任意のリン酸転位率のポリイノシン酸をサンプリングし、次いで各リン酸転位率のポリィノシン酸をホウ酸緩衝液（pH 8.5) 中にて 60°Cに加熱し、試験例 5記載の方法で鎖長をモニタ一しながら平均鎖長が 200±50 bとなるよう短鎖化した。その結果を表 3に示す。得られた短鎖化ポリイノシン酸溶液は、それぞれ透析処理した後、常法にて凍結乾燥処理し凍結乾燥品を得た。

表 3

実施例 1 4

ポリシチジル酸ナトリウム塩（S。_2fl， _w (沈降定数）： 8.6 、ャマサ醬油（株）製）約 200 mgに、 0.2 M酢酸—酢酸ナトリゥム緩衝液 (pH 5.2) を加え、撹拌溶解した後、 80°Cに加熱し、試験例 6記載の方法にてリン酸転位率をモニタ一しながら、任意のリン酸転位率のポリシチジル酸をサンプリングし、次いで各リン酸転位率のポリシチジル酸をホウ酸緩衝液（pH 8.5) 中にて 70でに加熱し、試験例 5記載の方法で鎖長をモニターしながら平均鎖長が 200±50 bとなるように短鎖化した。その結果を表 4 に示す。得られた短鎖化ポリシチジル酸溶液は、それぞれ透析処理した後、常法にて凍結乾燥処理し凍結乾燥品を得た。

表 4

実施例 1 5 二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド

実施例 1、 2、 1 3及び 1 4で得られたリン酸転位率が 0.7%のボリイノシン酸とリン酸転位率が 1.2 %のポリシチジル酸とを組み合わせた二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド（二本鎖 RN A) 、リン酸転位率が 2.0 %のポリイノシン酸とリン酸転位率が 1.9%のポリシチジル酸とを組み合わせた二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド（二本鎖 RNA) , リン酸転位率が 2.8 %のポリイノシン酸とリン酸転位率が 2.7%のポリシチジル酸とを組み合わせた二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド（二本鎖 R NA) を各々調製した。各二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドは、各ポリィノシン酸ナトリゥム塩とポリシチジル酸ナトリゥム塩とをトリス—塩酸緩衝液（pH 7、 0.15M塩化ナトリウム含有）に溶解し、 80でで 5分間加熱した後、徐冷することにより得た。比較例 1 (実施例 1 に対応する従来法による製造- 1 )

ポリイノシン酸ナトリゥム塩（S。₂。. w (沈降定数）： 8.8 、ャマサ醬油（株）製） 5 mgに注射用水 10mLを加え撹拌溶解した。かかる溶液にホルムアミドを lOmL加え、 80°Cで 5時間加熱した（リン酸転位率 8.9%、平均鎖長 628 b) 。

比較例 2 (実施例 2に対応する従来法による製造 - 1 )

ポリシチジル酸ナトリウム塩（S° ₂。， _w (沈降定数）： 8.6 、ャマサ醬油（株）製） 5 mgに注射用水 10mLを加え撹拌溶解した。かかる溶液にホルムアミドを 10mL加え、 80°Cで 5時間加熱した（リン酸転位率 4.2%、平均鎖長 751 ) 。

比較例 3 (実施例 1 に対応する従来法による製造— 2 )

ポリイノシン酸ナトリウム塩（S°₂。. _w (沈降定数）： 8.8 、ャマサ醬油（株）製） 5 mgに注射用水 10mLを加え撹拌溶解した。かかる溶液を 90ⁿCで 8時間加熱した（リン酸転位率 7.1%、平均鎖長 213 b)

比較例 4 (実施例 2 に対応する従来法による製造一 2 )

ポリシチジル酸ナトリゥム塩（S。₂。， _w (沈降定数）： 8.6 、ャマサ醬油（株）製） 5 mgに注射用水 lOmLを加え撹拌溶解した。かかる溶液を 90^eCで 12時間加熱した（リン酸転位率 4,2%、平均鎖長 289 b)

比較例 5

実施例 1 3及び 1 4で得られたリン酸転位率が 4.2%のポリイノシン酸とリン酸転位率が 3.8 %のポリシチジル酸とを組み合わせた二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド（二本鎖 R NA) を調製した。当該二本鎖短鎖化ポリヌクレオチドは、ポリイノシン酸ナトリゥム塩とポリシチジル酸ナトリゥム塩とをポリヌクレオチドをトリス一塩酸緩衝液（pH 7、 0. 1.5M塩化ナトリゥム含有）に溶解し、 80でで 5分間加熱した後、徐冷することにより得た。

試験例 1 薬理活性に対する平均鎖長の及ぼす影響

実施例 9 に係る組成物の薬理活性は HeLa S3 癌細胞に対する細胞増殖抑制作用 ( i n v i t r o) により評価した。実験は、 He S3 癌細胞を 96 穴のプレートに 10⁴細胞 /穴の密度でまき、 24時間以上培養して細胞が十分にプレートに接着したことを確認後、当該組成物 ¾添加し培養を続けた。 3 日間 C0₂ インキュベーター内で培養した後、生細胞数を MTT法で測定した。細胞増殖阻害率を次式より算出した。その結果を表 5 に示す。複合体処理群の吸光度値

細胞増殖阻害率（％) = 100 コント口一ルの吸光度値

表 5

^<a> ポリイノシン酸ナトリウム塩（ャマサ醬油（株）製）

C^h) ポリシチジル酸ナトリウム塩（ャマサ醬油（株）製）表 5から明らかなように、癌細胞株である HeLa S3に対する各組成物の細胞増殖抑制作用は、平均鎖長との間に強い相関があつた。表 5では、一般的にィンターフェ口ン誘導剤として用いられる 1000 b以上の長鎖長ポリイノシン酸 . ボリシチジル酸で最も強い増殖抑制作用を示すが、本発明による平均鎖長の範囲が 0.1kb l kbのリン酸転位の少ない短鎖化ポリイノシン酸 · ポリシチジル酸でも、やや劣るもののなお十分に強い増殖抑制作用を保持していた。また、かかる増殖抑制作用は 100 未満のものでは急激に低下し、オリゴヌクレオチド領域に近いものではほとんど活性を示さなかった。試験例 2 骨髄細胞に対する影響

毒性評価として、骨髄毒性を検討した。 ddY マウス（雄、 8週齢 ) に、市販のポリイノシン酸ナトリウム塩（S ° ₂。， _w (沈降定数）： 8. 8 、ャマサ醤油（株）製）及びポリシチジル酸ナトリウム塩 ( S ° _{2 0} . w (沈降定数。： 8. 6 、ャマサ醬油（株）製）と実施例 5及び 6 に係る、リン酸転位の少ないポリイノシン酸、ポリシチジル酸のうち平均鎮長がそれぞれ 982 b 及び 907 b のものを静脈内投与し, 翌日大腿骨より骨髄細胞を得た。細胞をニューメチレンブル一及びギムザ染色し、網状赤血球と成熟赤血球の数を測定した。その結果を表 6 に示す。表 6 の骨髄毒性は全赤血球数に対する網状赤血球数の比であり、次式により定義される。また、 * 印は有意水準 pく 0. 0 1 で、ポリヌクレオチドなしの媒体のみの静脈内投与から得られたコントロール群と有意差（ダネットの多重比較法による）があることを意味している。網状赤血球数

骨髄毒性

網状赤血球数十成熟赤血球数表 6

( α ) ポリイノシン酸ナトリウム塩 (ャマサ醤油（株）製）

ポリシチジル酸ナトリウム塩 (ャマサ醤油（株）製）表 6から明らかなように、一般的にインタ一フヱロン誘導剤として用いられる 1000 bを超える長鎖長のポリイノシン酸 ' ポリシチジル酸では、 1 mg/kg の投与量でもコントロールに対する変化が 39% に達したにもかかわらず、本発明に係る、平均鎖長の範囲が 0.1 kb 〜 1 kbのリン酸転位の少ない短鎖化ポリイノシン酸 ' ポリシチジル酸では、その 25倍の投与量でもコント口一ルに対して有意な差がなかった。この結果からポリイノシン酸 ' ポリシチジル酸の毒性は薬理活性と同様、平均鎖長と極めて相関が強いことがわかった。かかる毒性が、本発明に係る短鎖化ボリヌクレオチドによって飛躍的に改善されたことは全く意外であった。

試験例 3 A431癌細胞に対する細胞増殖抑制作用 (in vitro) (平均鎖長 200土 50b)

実施例 1 3及び 1 4 に係るリン酸転位率が 0.7〜 4.2%のポリィノシン酸とリン酸転位率が 1.2〜 3.8%のポリシチジル酸、実施例 1 及び 2に係る短鎖化ポリイノシン酸及びポリシチジル酸を用い、実施例 1 1 と同様に操作して組成物を調製した。 A431癌細胞を 96穴のプレートに 10 細胞 /穴の密度でまき、 5時間以上培養して細胞が十分にプレートに接着したことを確認後、当該組成物を添加し培養を続けた。各組成物添加後、 3 日間 C0₂インキュベーター内で培養した後、生細胞数を MTT法で測定した。細胞増殖阻害率を式 1 から求め、かかる細胞増殖阻害率から 50%細胞増殖阻害率に相当するポリイノシン酸ナトリゥム塩とポリシチジル酸ナトリゥム塩の合計濃度（ICSQ値）を算出した。その結果を表 7に示す。表 7

表 7から明らかなように、癌細胞である A431に対する当該組成物の細胞増殖抑制作用は、リン酸転位率との間に強い相関があった。即ち、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸に拘わらずリン酸基の 3'位から 2'位への転位が多いものほど、増殖抑制作用が弱くなる傾向を示した。注目される点は、本発明に係るリン酸転位の少ない短鎖化ポリイノシン酸、短鎖化ポリシチジル酸（リン酸転位率 3 %以下、特に 2 %以下）の組み合わせでは、増殖抑制作用が飛躍的に強かつた。また、リン酸転位率が 3 %、特に 2 %を超えるボリイノシン酸、ポリシチジル酸の組み合わせでは相乗的に作用が弱くなる傾向があつた。例えば表 7で、リン酸基の転位率が 2.0%及び 1.9%のポリイノシン酸、ポリシチジル酸の組み合わせは、同じく 2.8%及び 2.7%若しくは 4.2%及び 3.8%のポリイノシン酸、ポリシチジル酸の組み合わせに比べ IC₅。の比が 12倍若しくは 47倍も向上した。リン酸基の 3'位から 2'位への転位率が 3 %、特に 2 %を境界として、薬理活性がこのように急激に向上することは、極めて意外であつた。試験例 4 リン酸転位による融解温度（Tm) 及び薬理活性の変化二本鎖 R NAは温度を上げていくと特定の温度のところで、一本鎖 RNAに解離する。この温度は R NAに含まれる塩基の種類により特定の値を示すことから、この温'度を二本鎖 R N Aの融解温度とし、一般には Tm値と呼んでいる。このような Tm値の測定には様々な方法があるが、本試験例では最も一般的な吸光光度法を用い、実施例 1 5及び比較例 5 に係る二本鎖 R NAの Tm値を測定した。その結果を表 8 に示す。表 8 に併記した IC₆。値は、試験例 3 による結果である。

表 8

リン酸転位率がおよそ 0〜 4 %のポリイノシン酸 . ポリシチジル酸で Tm値を測定した結果、各組み合わせにおいて顕著な差は見られなかった（一股にィンターフェロン誘導剤として用いられるような長鎖長のポリイノシン酸 · ボリシチジル酸の Tm値は 61°Cである）。即ち、リン酸転位率がおよそ 0〜 4 %のポリイノシン酸 · ポリシチジル酸は、二本鎖 R N Aの特徵である二重らせん構造をとり得ることが明らかとなった。しかしながら、試験例 3 から、リン酸転位率が 2 %ないしは 3 %を境として薬理活性が 4倍〜 50倍以上も異なることから、ポリイノシン酸 · ポリシチジル酸の主薬効である免疫賦活作用ゃ抗癌作用は、二本鎖 R N Aの二重らせん構造のみに影饗す 0 0778

29 るのではなく、リン酸基の転位率も影響することがわかった。しかもその薬理活性は、リン酸基の 3'位から 2'位への転位が 2 %ないしは 3 %を境にして急激に向上することがわかり、全く意外なことであった。

試験例 5 短鎖化ポリヌクレオチドの平均鎖長の測定（ G P C法） 1 mg/mL のポリヌクレオチド水溶液を用いて、下記のゲルろ過ク口マトグラフィ一（ G P C ) 操作条件で試験し、平均鎖長を求めた G P C操作条件

検出波長 UV 260nm

カラム東ソー TSKgel G5000PWXし 7.8mm 0 x 300mm

移動相 7M尿素を含む 50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5) 流速 0. bmL/min.

サイズマ-力- RNA Ladder (1770 b, 1520 b, 1280 b, 780 b,

530 b, 400 b, 280 b, 155 b) (ギブコ BRL 社製）試験例 6 リン酸転位率の測定

1 mg/mL のポリヌクレオチド水溶液 1 しに、 500U/niL のヌクレア —ゼ (青カビ由来、生化学工業社製）水溶液 3.2mL を加え、さらに水を加えて 5 mしに希釈した。かかる水溶液を 37°Cの湯浴上で 1 時間反応させた後、水を加えて 10mLとした。かかる反応液から 3.2mしをとり、 0. lU/mしアルカリホスファターゼ（仔牛小腸由来、生化学工業社製）水溶液 0.8πιしを加えた後、 37 Cの湯浴上で 30分間反応させた。この溶液を適当に希釈し、下記の液体クロマトグラフィー操作条件により試験を行い、 2' -5' リン酸ジエステル結合を有する二量体を定量し、リン酸転位率を測定した。液体ク口マトグラフィ一操作条件

検出波長 UV 260ηπι

カラム資生堂カブセルバック d 8 UG120 5 Ά 4.6mm ø x 250mm 移動相 5 mM硫酸水素 ίトラブチル了ンモニゥムを含む 50mMリン酸緩衝液

(pH8)とメタノ-ルの混液 (95:5)

流速 1 mし/ min.

Claims

請求の範囲

1 . 短鎖化されたポリヌクレオチド又はその塩において、 2' -5' リン酸ジエステル結合が全リン酸ジエステル結合の 3 %以下であることを特徴とする短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩。

2 . ポリヌクレオチドが、ポリイノシン酸若しくはそのアナログ、ポリシチジル酸若しくはそのアナログ、ポリアデニル酸若しくはそのアナログ、又はポリゥリジル酸若しくはそのアナログである、請求項 1 記載の短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩。

3 . 平均鎖長が 0. I k bas e s〜 1 k bas e s の範囲内にある、請求項 1 又は 2記載の短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩。

4 . 請求項 1 〜 3のいずれかに記載の短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩において、二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩から形成される二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩。

5 . 二本鎖を形成しうる 2つの短鎖化ポリヌクレオチドが、ポリイノシン酸とポリシチジル酸、ポリアデニル酸とポリゥリジル酸、ポリイノシン酸アナログとポリシチジル酸、ポリイノシン酸とポリシチジル酸アナログ、ポリイノシン酸アナログとポリシチジル酸ァナ口グ、ポリ了デニル酸アナログとボリウリジル酸、ポリァデニル酸とポリゥリジル酸アナログ及びポリアデニル酸アナログとポリウリジル酸アナ口グからなる群から選択される、請求項 4記載の二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩。

6 . ポリヌクレオチド又はその塩を、 pH 7〜 1 0の溶液中、 20〜 1 1 0°Cの温度条件下で短鎖化することを特徵とする、請求項 1 〜 3 のいずれかに記載の短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩の製法。

7 . ポリヌクレオチド又はその塩を、ホスホジエステラーゼで短鎖化することを特徴とする、請求項 1 〜 3のいずれかに記載の短鎖化ポリヌクレオチド又はその塩。

8 . 薬物を細胞内へ移入するのに有効な担体と、請求項〗〜 3のいずれかに記載の短鎖化ポリヌクレオチド若しくはその塩、又は請求項 4〜 5のいずれかに記載の二本鎖短鎖化ポリヌクレオチド若しくはその塩とを必須構成成分として形成される複合体を含有する組成物。

9 . 薬物を細胞内へ移入するのに有効な担体が、正電荷を有する担体である、請求項 8記載の組成物。

1 0 . 正電荷を有する担体が、カチォニック · リボソームである、請求項 9記載の組成物。

1 1 . 薬物を細胞内へ移入するのに有効な担体が、 2 —〇一（ 2 一ジェチル了ミノエチル）力ルバモイル一 1 , 3 —〇一ジォレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体である、請求項 8記載の組成物。

1 2 . 組成物が薬剤である請求項 8〜 1 1 のいずれかに記載の組成物。

1 3 . 薬剤が、インターフェロン誘導化剤、免疫陚活剤、細胞内ヌクレアーゼ活性化剤、癌治療剤もしくは予防剤、又は肝炎治療剤もしくは予防剤である請求項 1 2記載の組成物。