DE60318469T2

DE60318469T2 - Phospholipidderivat

Info

Publication number: DE60318469T2
Application number: DE60318469T
Authority: DE
Inventors: Syunsuke Kawasaki-shi OHHASHI; Kazuhiro Kawasaaki-shi KUBO; Chika Kawasaki-shi ITOH; Tohru Yokohama-shi Yasukohchi; H. Kikuchi; N. Suzuki; M. Haibara-gun TAKAHASHI; H. Takatsuki-shi YAMAUCHI
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; NOF Corp
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; NOF Corp
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2023-10-01
Also published as: EP1550675B1; EP1550675A4; US7531604B2; JP4808403B2; JPWO2004029104A1; EP1550675A1; US20060110436A1; AU2003266714A8; DE60318469D1; WO2004029104A1; AU2003266714A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Phospholipidderivat. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Phospholipidderivat, welches durch Umsetzung eines Copolymers aus Alkenylether und Maleinsäureanhydrid mit einem Phospholipid erhalten werden kann.
Technischer Hintergrund
Von Mikropartikel-Arzneistoffträgern, einschließlich liposomaler Arzneistoffe als typische Beispiele, sowie Polypeptiden, wie beispielsweise Protein-Arzneistoffe, ist bekannt, dass sie nur eine kurze Verweildauer (Retention) im Blut aufweisen und leicht vom retikuloendothelialen System (im Folgenden abgekürzt mit „RES"), wie beispielsweise der Leber oder der Milz, abgefangen werden, wenn sie intravenös verabreicht werden. Die Gegenwart des RES ist ein erhebliches Hindernis, wenn ein Mikropartikel-Arzneistoffträger als gezielt eingesetzte Zubereitung verwendet wird, welche ein Medikament in anderen Organen als dem RES freisetzt, und als Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, was es erlaubt, ein Medikament für eine lange Zeitdauer im Blut aufzunehmen, um die Freisetzung des Medikaments zu kontrollieren.
Bisher wurden Forschungen unternommen, um eine Mikrozirkulationseigenschaft der vorgenannten Zubereitungen bereitzustellen. Es wurden einige Vorschläge gemacht, einschließlich beispielsweise der Beibehaltung einer hohen Konzentration im Blut durch Verringerung der Größe von Liposomen mit Hinblick auf die jeweilige Leichtigkeit der Kontrolle der physikochemischen Eigenschaften von Lipiddoppelschichten von Liposomen (Biochimica et Biophysica Acta, 761, S. 142, 1983), Verwendung von Lecithin, welches eine hohe Phasentransfertemperatur aufweist (Biochemical Pharmacology, 32, S. 3381, 1983) oder Zusatz von Cholesterin als ein Membranbestandteil von Liposomen (Biochimica et Biophysica Acta, 761, S. 142, 1983).
Als ein anderer Lösungsansatz wurden Forschungen unternommen, um eine Mikrozirkulationseigenschaft und die Fähigkeit, dem RES zu entkommen, bereitzustellen durch Modifikation der Membranoberflächen von Liposomen mit einem Glykolipid, Glykoprotein, Aminosäurelipid, Polyethylenglykol-Lipid oder dergleichen. Zu den zur Modifikation verwendeten Substanzen, von welchen bisher berichtet wurde, gehören beispielsweise Glycophorin (The Pharmaceutical Society of Japan, 106^th Annual Meeting, Summaries of Symposia, S. 336, 1986), Gangliosid GM1 (FEBS Letters, 223, S. 42, 1987), Phosphatidylinositol (FEBS Letters, 223, S. 42, 1987), Glycophorin und Gangliosid GM3 (Ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 63-221837 ), Polyethylenglykolderivate (FEBS Letters, 268, S. 235, 1990), Glucuronsäurederivate (Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 38, S. 1663, 1990), Glutaminsäurederivate (Biochimica et Biophysica Acta, 1108, S. 257. 1992) und Polyglycerinphospholipid-Derivate (Ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-228012 ).
Bezüglich der Modifikation eines Polypeptids wurde berichtet von der Einführung zweier wasserlöslicher Polymermoleküle in ein Polypeptid unter Verwendung von Triazin, zum Zwecke der Verringerung der Zahl der Bindestellen des Polypeptids, wodurch die Restmenge an aktiven Gruppen, wie beispielsweise Lysinreste, im Polypeptid erhöht wurde. Bezüglich der Herstellung von Liposomen wurde außerdem berichtet über die Einführung von zwei wasserlöslichen Polymermolekülen in Triazin, um die Molmasse des wasserlöslichen Polymers zu erhöhen, sowie die Modifikation von Liposom-Oberflächen unter Verwendung des resultierenden Polymers. Jedoch können, wenn ein wasserlösliches Polymer durch Verwendung von Triazin eingeführt wird, nur zwei wasserlösliche Polymere in den Triazinring eingeführt werden. Daher ist es notwendig, eine große Menge einer Verbindung zuzusetzen, welche zwei in Triazin eingeführte wasser lösliche Polymere enthält, um die Anzahl der wasserlöslichen Polymerketten auf Liposom-Oberflächen zu erhöhen.
Jedoch tritt bei dem obigen Ansatz ein Problem von der Art auf, dass reaktive Stellen, welche in erster Linie mit einem Medikament reagieren sollen, verbraucht werden aufgrund des Zusatzes einer großen Menge der Verbindung, und dementsprechend ist die Art der gewünschten pharmazeutischen Zubereitung beschränkt.
Offenbarung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Phospholipidderivat bereitzustellen, welches zur Modifikation von Liposomen verwendet werden kann. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten verschiedene Untersuchungen durch, um ein neuartiges Phospholipidderivat durch Umsetzung eines Copolymers aus Alkenylether und Maleinsäureanhydrid mit einem Phospholipid bereitzustellen, und stellten erfolgreich das folgende Phospholipid bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Phospholipidderivat bereit, welches ein Copolymer ist, als wesentliche Monomereinheiten enthaltend:

(A) eine Monomereinheit A, repräsentiert durch die folgende Formel (1),
(B) eine Monomereinheit B, repräsentiert durch die folgende Formel (2a) und/oder die folgende Formel (2B), und
(C) eine Monomereinheit C, repräsentiert durch die folgende Formel (3):

¹

²

¹

²

³

⁴

⁵

⁶

⁷

Nach bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung bereit: das vorgenannte Phospholipidderivat, wobei die Gesamtzahl der im Copolymer enthaltenen Monomereinheit(en) A, der Monomereinheit(en) B und der Monomereinheit(en) C 3 oder mehr und 150 oder weniger beträgt; das vorgenannte Phospholipidderivat, wobei die Gesamtzahl der im Copolymer enthaltenen Monomereinheit(en) A, der Monomereinheit(en) B und der Monomereinheit(en) C 5 oder mehr und 50 oder weniger beträgt; das vorgenannte Phospholipidderivat, wobei R¹ und R² Wasserstoffatome repräsentieren; und das vorgenannte Phospholipidderivat, wobei R⁷ eine Ethylengruppe repräsentiert.
Nach anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung ein Tensid bereit, umfassend das vorgenannte Phospholipidderivat; einen Lösungsvermittler, umfassend das vorgenannte Phospholipidderivat; ein Dispergiermittel, vorzugsweise ein Dispergiermittel für Kosmetika, umfassend das vorgenannte Phospholipidderivat; und eine Lipidmembran-Struktur, vorzugsweise ein Liposom, enthaltend das vorgenannte Phospholipidderivat. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die vorgenannte Lipidmembran-Struktur oder das ein Medikament aufnehmende Liposom bereit, und, als bevorzugte Ausführungsform derselben, die vorgenannte Lipidmembran-Struktur oder das ein Antitumormittel aufnehmende Liposom.
Nach einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des vorgenannten Phospholipidderivats bereit, welches den Schritt der Umsetzung eines die Monomereinheit (A) und die Monomereinheit (B) ent haltenden Copolymers bei einem Molverhältnis von 7/3 bis 3/7 umfasst, mit einer Verbindung, welche repräsentiert wird durch die folgende Formel (4):
wobei R⁵CO, R⁶CO, R⁷ und Y die gleichen Bedeutungen haben wie oben definiert.
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es ein Copolymer ist, enthaltend die Monomereinheit A, repräsentiert durch die Formel (1), abgeleitet von einem Alkenylether, und die Monomereinheit B, repräsentiert durch die Formel (2A) und/oder die Formel (2B), abgeleitet von Maleinsäure oder einem Salz davon oder von Maleinsäureanhydrid, und ferner enthaltend die Monomereinheit C, repräsentiert durch die Formel (3), welche einen Rest einer Phospholipidverbindung aufweist.
R¹ und R² repräsentieren unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, sofern R¹ und R² nicht beide zugleich eine Methylgruppe repräsentieren. Es wird bevorzugt, dass R¹ ein Wasserstoffatom repräsentiert, R² ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe repräsentiert, und R³ eine Methylengruppe repräsentiert. R³ repräsentiert eine zweiwertige Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, und zu den speziellen Beispiele dafür zählen Kohlenwasserstoffgruppen aus -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH(CH₃)CH₂- und -CH₂CH₂CH₂-. Unter diesen ist -CH₂- (Methylengruppe) bevorzugt.
Die durch AO repräsentierte Oxyalkylengruppe ist eine Oxyalkylengruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, und zu den Beispielen dafür zählen Oxyethylengruppen, Oxypropylengruppen, Oxytrimethylengruppen, Oxybutylengruppen und Oxytetramethylengruppen. Unter diesen sind die Oxyethylengruppe und die Oxypropylengruppe bevorzugt, und die Oxyethylengruppe ist besonders bevorzugt. Die durch AO repräsentierte Oxyalkylengruppe, mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, von welcher eine durchschnittliche Anzahl von zugefügten Molen „m" beträgt, kann aus einer oder mehreren Arten von Oxyalkylengruppen bestehen. Wenn zwei oder mehr Arten von Oxyalkylengruppen enthalten sind, sind Kombination derselben nicht beschränkt, und die Polyoxyalkylengruppe kann ein Block- oder ein statistisches Copolymer sein. Die Monomereinheit A enthält vorzugsweise die Oxyethylengruppe als die durch AO repräsentierte Oxyalkylengruppe, und ein Anteil der Oxyethylengruppe unter den Oxyalkylengruppen kann vorzugsweise mehr als 50 bis 100 Massenprozent betragen, besonders bevorzugt 70 bis 100 Massenprozent, ferner vorzugsweise 100 Massenprozent. Wenn ein Anteil der Oxyethylengruppe kleiner als 50 Massenprozent ist, ist die Lipophilie des Phospholipidderivats erhöht, und somit können die emulgierenden und dispergierenden Eigenschaften des Copolymers mitunter vermindert sein.
Das Symbol „m" ist eine durchschnittliche Molzahl an zugefügten Oxyalkylengruppen, und m kann eine Zahl von 4 bis 100 sein, vorzugsweise von 6 bis 46. Wenn m kleiner ist als 4, wird die Länge der Polyoxyalkylenkette relativ kurz im Vergleich zur Größe des Copolymers, was eine Verringerung der Wasserlöslichkeit des Copolymers zur Folge hat, was mitunter in einer Verringerung der Wirkung des Phospholipidderivats resultiert, wenn dieses als System zur Freisetzung von Medikamenten verwendet wird. Ferner, wenn m größer ist als 100, wird die Zahl der Polyalkylenglykol-Ketten, umfassend die Oxyalkylengruppen, relativ klein, was mitunter eine Verringerung der Vorteile des Phospholipidderivats zur Folge haben kann, wenn dieses als System zur Freisetzung von Medikamenten verwendet wird.
R⁴ repräsentiert ein Wasserstoffatom oder eine Kohlenwasserstoffgruppe oder eine Acylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen. Beispiele der Kohlenwasserstoffgruppe schließen eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und eine aromatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ein. Beispiele für aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen schließen ein: Methylgruppe, Ethylgruppe, Propylgruppe, Isopropylgruppe, Butylgruppe, Isobutylgruppe, tert-Butylgruppe, Pentylgruppe, Isopentylgruppe, Hexylgruppe, Isoheptylgruppe, 2-Ethylhexylgruppe, Octylgruppe, Isononylgruppe, Decylgruppe, Dodecylgruppe, Isotridecylgruppe, Tetradecylgruppe, Hexadecylgruppe, Isocetylgruppe, Octadecylgruppe, Isostearylgruppe, Octadecenylgruppe, Octyldodecylgruppe, Docosylgruppe und Decyltetradecylgruppe. Beispiele für die aromatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen schließen ein: Benzylgruppe, Tolylgruppe, Butylphenylgruppe, Dibutylphenylgruppe, Octylphenylgruppe, Nonylphenylgruppe, Dodecylphenylgruppe, Dioctylphenylgruppe und Dinonylphenylgruppe.
Beispiele für die Acylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen schließen eine Acylgruppe ein, welche abgeleitet ist von: Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Caprylsäure, 2-Ethylhexansäure, Isononansäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Isopalmitinsäure, Stearinsäure, Isostearinsäure, Arachinsäure, Behensäure, Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Erucasäure, Benzoesäure, Hydroxybenzoesäure, Zimtsäure und Gallussäure. R⁴ repräsentiert vorzugsweise eine Kohlenwasserstoffgruppe oder Acylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, und eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist besonders bevorzugt. Die R⁴-Gruppen in der Monomereinheit A, repräsentiert durch die Formel (1), sind voneinander unabhängig und können aus einer oder mehreren Arten von Gruppen bestehen.
Die Monomereinheiten, welche durch die Formel (2A), (2B) und (3) repräsentiert werden, sind Monomereinheiten, welche abgeleitet sind von Maleinsäure oder einem Salz davon oder von Maleinsäureanhydrid. Beispiele des Salzes schlie ßen Salze von Alkalimetallatomen, Ammonium oder ein organisches Ammonium ein, beispielsweise ein Salz eines Alkalimetalls wie Natrium und Kalium, ein Salz eines Erdalkalimetalls wie Calcium und Magnesium, ein Ammoniumsalz, abgeleitet von Ammonium, ein Salz eines organischen Ammoniumsalzes, abgeleitet von Triethylamin, Pyridin oder Dimethylaminopyridin. Maleinsäure oder Salze davon oder Maleinsäureanhydrid können ohne Vorbehandlung copolymerisiert werden, oder Maleinsäure kann copolymerisiert werden und anschließend in ein Salz umgewandelt werden.
R⁵CO und R⁶CO repräsentieren unabhängig voneinander eine Acylgruppe mit 8 bis 24 Kohlenstoffatomen. Als diese Acylgruppe kann eine Acylgruppe verwendet werden, welche abgeleitet wurde von einer gewöhnlichen Fettsäure. Beispiele für R⁵CO und R⁶CO schließen eine Acylgruppe ein, abgeleitet von einer gesättigten oder ungesättigten linearen oder verzweigten Fettsäure wie Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure, Isostearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Arachinsäure, Behensäure, Erucasäure und Lignocerinsäure. R⁵CO und R⁶CO, welche in einer Monomereinheit enthalten sind, können gleich oder unterschiedlich sein. Ferner sind R⁵CO und R⁶CO in der jeweiligen Monomereinheit unabhängig voneinander ausgewählt und können aus einer oder mehreren Arten von Gruppen bestehen. R⁵CO und R⁶CO repräsentieren vorzugsweise eine Acylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen. Wenn die Zahl der Kohlenstoffatome 24 übersteigt, kann sich die Reaktivität mitunter verringern aufgrund schlechter Dispergierung in einer wässrigen Phase. Wenn die Zahl der Kohlenstoffatome weniger als 8 beträgt, kann mitunter die Reinheit vermindert sein aufgrund schlechter Kristallierungseigenschaften während eines Reinigungsvorgangs.
X repräsentiert ein Wasserstoffatom oder ein Salz eines Alkalimetallatoms, Ammonium oder ein organisches Ammonium, und Beispiele schließen beispielsweise ein: ein Salz eines Alkalimetalls wie Natrium und Kalium, ein Salz eines Erdalkalimetalls wie Calcium und Magnesium, ein Ammoniumsalz, abgeleitet von Ammonium, ein organisches Ammoniumsalz, abgeleitet von Triethylamin, Pyridin oder Dimethylaminopyridin. Y repräsentiert ein Wasserstoffatom, ein Alkalimetallatom, Ammonium oder ein organisches Ammonium, vorzugsweise ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetallatom. Insbesondere schließen Beispiele von Alkalimetallatomen Natrium und Kalium ein, und Beispiele für das organische Ammonium schließen organisches Ammonium ein, welches abgeleitet wurde von Triethylamin. R⁷ repräsentiert eine zweiwertige Kohlenwasserstoffgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Insbesondere zählen zu den Beispielen dafür Kohlenwasserstoffgruppen aus -CH₂CH₂-, -CH(CH₃)CH₂-, -CH₂CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂CH₂-, -CH(CH₃)CH₂CH₂-, -CH₂CH(CH₃)CH₂-, -OH₂OH(OH₃)OH₂- und -CH(CH₂CH₃)CH₂-, und die Ethylengruppe, repräsentiert durch -CH₂CH₂-, ist bevorzugt.
Bei dem Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung beträgt die Gesamtzahl der im Copolymer enthaltenen Monomereinheit(en) A, repräsentiert durch die Formel (1), der Monomereinheit(en) B, repräsentiert durch die Formel (2A) und/oder die Formel (2B) (die Monomereinheiten B können einzig aus Monomereinheit(en), repräsentiert durch die Formel (2A) oder (2B), bestehen, oder können beide Monomereinheiten enthalten, repräsentiert durch die Formel (2A) und die Formel (2B)), und der Monomereinheit(en) C, repräsentiert durch die Formel (3), 3 oder mehr und 150 oder weniger. Wenn die Molzahl der Monomereinheit A durch k^I repräsentiert wird, die Molzahl der Monomereinheit B durch k^II repräsentiert wird und die Molzahl der Monomereinheit C durch kann repräsentiert wird, sollten k^I, k^II und k^III den folgenden Beziehungen genügen: 1 k^III 5, 3 k^I + k^II + k^III 150, k^I/(k^II + k^III) = 7/3 bis 3/7, vorzugsweise den folgenden Beziehungen: 1 k^III 4, 5 k^I + k^II + k^III 100, k^I/(k^II + k^III) = 6/4 bis 4/6, besonders bevorzugt den folgenden Beziehungen: 1 k^III 2, 5 k^I + k^II + k^III 100, k^I/(k^II + k^III) = 6/4 bis 4/6. Das Ende des Moleküls des Phospholipidderivats der vorliegenden Erfindung ist ein Wasserstoffatom oder ein Rest, welcher an das Ende des Copolymers durch Polymerisationsinitiierung oder durch Kettenübertragung bindet. Es wird bevorzugt, dass die Monomereinheiten C im Molekül auf statistische Weise verteilt vorhanden sind.
Das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung kann Monomereinheiten enthalten, welche abgeleitet sind von anderen Monomeren, welche mit den Monomereinheiten A, B und C, zusätzlich zu diesen Monomereinheiten, copolymerisierbar sind. Beispiele für copolymerisierbare Monomere schließen ein: Styrol, Vinylacetat, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrylamid, Methacrylamid, Acrylsäure, Methacrylsäure, Methylacrylat und Methylmethacrylat. Ein Anteil der von anderen copolymerisierbaren Monomeren abgeleiteten Monomereinheiten beträgt, bezogen auf Monomereinheit A, vorzugsweise 10 Mol-% oder weniger.
Das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch Umsetzung einer Phospholipidverbindung, repräsentiert durch die vorgenannte Formel (4), mit einem Copolymer, enthaltend die Monomereinheit A und die Monomereinheit B. Das Copolymer, welches die Monomereinheit A und die Monomereinheit B enthält, ist ein bekanntes Polymer und kann durch ein bekanntes Verfahren hergestellt werden (beispielsweise die Verfahren, welche beschrieben werden in den Ungeprüften japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 2 163108 und 9 255740 ). Das Copolymer kann beispielsweise hergestellt werden mittels Durchführung einer Lösungspolymerisation eines geeigneten Monomers, bei welcher die Monomereinheit A und Maleinsäure oder ein Salz davon oder Maleinsäureanhydrid in einem organischen Lösungsmittel oder in wässriger Lösung vorgelegt werden, oder einer Substanzpolymerisation davon, ohne ein Lösungsmittel zu verwenden. Lösungspolymerisation in einem organischen Lösungsmittel und Substanzpolymerisation ohne Verwendung eines Lösungsmittels sind bevorzugt, und Substanzpolymerisation ohne Verwendung eines Lösungsmittels ist besonders bevorzugt. Im Copolymer, obwohl die durch die Formel (I) repräsentierte Monomereinheiten A im Polymer entweder blockweise oder statistisch verteilt vorhanden sein können, sind diese vorzugsweise statistisch verteilt vorhanden. Ferner, obwohl die durch die Formel (2A) und/oder Formel (2B) repräsentierten Monomereinheiten ebenso im Polymer statistisch verteilt oder blockweise vorhanden sein können, sind diese vorzugsweise statistisch verteilt vorhanden.
Wenn die Monomereinheit B von Maleinsäureanhydrid abgeleitet ist und eine Polymerisation unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels oder eine Substanzpolymerisation ohne Verwendung eines Lösungsmittels durchgeführt wird, kann die Monomereinheit B im Copolymer erhalten werden als Monomereinheit, welche durch die Formel (2B) repräsentiert wird. Wenn die Polymerisation in einem wässrigen Lösungsmittel durchgeführt wird, kann die Monomereinheit B erhalten werden als eine Monomereinheit, welche abgeleitet ist von Maleinsäure oder einem Salz davon (die durch die Formel (2A) repräsentierte Monomereinheit). In der vorgenannten Reaktion, wenn die Monomereinheit B entweder aus einem Anhydrid oder einer Carbonsäure oder einem Salz davon besteht, kann das Phospholipid eingeführt werden.
Beispiele für einen bei der Polymerisationsreaktion verwendeten Polymerisationsinitiator schließen einen Peroxid-Initiator wie Benzoylperoxid oder einen Azo-Initiator wie 2,2'-Azobisisobutyronitril ein. Eine vorzulegende Menge kann normalerweise 0,001 bis 0,1 Mol-%, vorzugsweise 0,005 bis 0,1 Mol-%, betragen, bezogen auf die insgesamt vorgelegte Menge an Monomeren. Ferner kann die Polymerisation durchgeführt werden in Kombination mit der Verwendung eines Kettenübertragungsmittels, falls erforderlich. Was die Reaktionsbedingungen betrifft, so wird die Reaktion gewöhnlich bei einer Reaktionstemperatur von 0 bis 120°C für eine Reaktionszeit von 1 bis 50 Stunden durchgeführt, vorzugsweise bei einer Reaktionstemperatur von 20 bis 100° für eine Reaktionszeit von 2 bis 25 Stunden. Ein Molverhältnis von Monomereinheit A zu der Monomereinheit B, welche das Copolymer aufbauen, beträgt 7/3 bis 3/7, vorzugsweise 6/4 bis 4/6, besonders bevorzugt 5/5. Ferner beträgt ein massenmittleres Molekulargewicht des Copolymers 10.000 bis 1.000.000, vorzugsweise 10.000 bis 200.000.
Wenn ein die Monomereinheit A und die Monomereinheit B enthaltendes Copolymer umgesetzt wird mit einer durch die vorgenannte Formel (4) repräsentierten Phospholipidverbindung, wird die Reaktion vorzugsweise durchgeführt in Gegenwart eines basischen Katalysators oder eines Dehydratisierungs-Kondensationskatalysators. Ferner wird außerdem bevorzugt, die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel durchzuführen. Die Art des basischen Katalysators ist nicht besonders beschränkt, und Beispiele davon schließen ein: eine stickstoffhaltige Substanz, wie beispielsweise Triethylamin, Pyridin, Dimethylaminopyridin und Ammonium und Ammoniumacetat, und ein anorganisches Salz, wie beispielsweise Natriumphosphat, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Natriumborat und Natriumacetat. Ferner schließen Beispiele für den Dehydratisierungs-Kondensationskatalysator ein: Dicyclohexyldicarbodiimid (DCC) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid. Eine Menge des Katalysators beträgt beispielsweise 0,5 bis 10 mol, vorzugsweise 1 bis 5 mol, je Mol der vorgenannten Phospholipidverbindung. Eine Reaktionstemperatur beträgt üblicherweise 20 bis 90°C, vorzugsweise 40 bis 80°C. Eine Reaktionszeit beträgt 1 Stunde oder mehr, vorzugsweise 2 bis 8 Stunden. Falls die Reaktionstemperatur geringer ist als 20°C kann die Reaktionsgeschwindigkeit mitunter klein sein. Falls die Reaktionstemperatur höher ist als 90°C kann die Acylgruppe der für die Reaktion verwendeten Phospholipidverbindung, welche repräsentiert wird durch die Formel (4), mitunter hydrolysiert werden.
Eine Zugabemenge an der durch die Formel (4) repräsentierten Phospholipidverbindung beträgt 1 bis 5 mol, vorzugsweise 1 bis 4 mol, besonders bevorzugt 1 bis 2 mol, bezogen auf das mittlere Molekulargewicht des die Monomereinheit A und die Monomereinheit B umfassenden Copolymers (CP). Falls die Zugabemenge der Phospholipidverbindung zu groß ist, kann sich die Herstellung der Liposomen mitunter schwierig gestalten aufgrund einer Zunahme an Phospholipid, welches an das Copolymer bindet, und die Herstellung von Mizellen kann sich mitunter schwierig gestalten, wenn als Tensid verwendet. Ferner, falls die Zugabemenge an Phospholipidverbindung zu gering ist, wird ein Anteil lipophiler Gruppen zu klein für ein Tensid, und somit kann die Herstellung von Mizellen durch eine Wirkung als ein Tensid nicht erwartet werden.
Als ein Tensid ermöglicht das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung die Solubilisierung, Emulgierung oder Dispergierung fettlöslicher Substanzen oder kann als ein Tensid im Kosmetikbereich verwendet werden, und kann außerdem als ein Phospholipid zur Formulierung einer Lipidmembran-Struktur verwendet werden. Die Lipidmembran-Struktur wird vorzugsweise als Liposom verwendet. Die fettlösliche Substanz, welche solubilisiert werden kann, ist nicht besonders beschränkt, und Beispiele dafür schließen höhere Alkohole, Esteröl, Triglycerin, Tocopherol und höhere Fettsäuren ein. Die Verwendung als Dispergiermittel im Bereich der Kosmetik ist außerdem nicht besonders beschränkt. Wenn beispielsweise eine wasserlösliche Substanz wie Ascorbinsäure in eine Lipiddoppelschicht aufgenommen ist, kann die Zielsubstanz in einer wässrigen Lösung stabiler dispergiert werden durch Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung als Lipidmembran-Struktur ausbildendes Mittel. Wenn die Verbindung als Tensid oder als Dispergiermittel verwendet wird, ist zur Solubilisierung, Dispergierung oder Emulgierung eine Menge von 0,1 bis 20 Massenprozent zuzusetzen, vorzugsweise 0,5 bis 7 Massenprozent, besonders bevorzugt 0,5 bis 5 Massenprozent, bezogen auf die Gesamtmasse einer Zielsubstanz.
Ferner kann das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung als pH-sensitives Phospholipid verwendet werden, beispielsweise als ein Dispergiermittel. Wenn eine kationische Substanz, beispielsweise eine physiologisch aktive kationische Substanz oder eine basische Substanz, in Wasser dispergiert ist, so kann diese in Wasser stabil dispergiert werden, beispielsweise durch Überziehen der Oberflächen von Mikropartikeln oder dergleichen, welche die kationische Substanz oder die basische Substanz enthalten, mit der vorgenannten Verbindung. Das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung besitzt polyanioni sche Gruppen, wodurch eine stabile Dispersion durch ionische Bindungen ermöglicht wird.
Eine Menge des Phospholipidderivats der vorliegenden Erfindung, welche zu einer Lipidmembran-Struktur gegeben wird, kann eine Menge sein, welche ausreichend ist, um die Wirksamkeit eines Medikaments in vivo auf effektive Weise zu unterstützen und ist nicht besonders beschränkt. Die Menge kann in geeigneter Weise ausgewählt werden, in Abhängigkeit von beispielsweise der Art des von der Lipidmembran-Struktur aufzunehmenden Medikaments, dem Zweck der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung, und der Form der Lipidmembran-Struktur. Die Art eines Medikaments, welches von der Lipidmembran-Struktur, bereitgestellt von der vorliegenden Erfindung, aufgenommen wird, ist nicht besonders beschränkt. Beispielsweise sind Verbindungen bevorzugt, welche als Antitumormittel verwendet werden. Beispiele derartiger Verbindungen schließen zum Beispiel ein: Camptothecin-Derivate, wie beispielsweise Irinotecanhydrochlorid, Nogitecanhydrochlorid, Exatecan, RFS-2000, Lurtotecan, BNP-1350, Bay-383441, PNU-166148, IDEC-132, BN-80915, DB-38, DB-81, DB-90, DB-91, CKD-620, T-0128, ST-1480, ST-1481, DRF-1042 und DE-310, Taxan-Derivate wie beispielsweise Docetaxelhydrat, Paclitaxel, IND-5109, BMS-184476, BMS-188797, T-3782, TAX-1011, SB-RA-31012, SBT-1514 und DJ-927, Ifosfamid, Nimustinhydrochlorid, Carboquon, Cyclophosphamid, Dacarbazin, Thiotepa, Busulfan, Melphalan, Ranimustin, Estramustinphosphat-Natrium, 6-Mercaptopurinribosid, Enocitabin, Gemcitabinhydrochlorid, Carmofur, Cytarabin, Cytarabine-Ocphosphat, Tegafur, Doxifluridin, Hydroxycarbamid, Fluorouracil, Methotrexat, Mercaptopurin, Fludarabinphosphat, Actinomycin D, Aclarubicinhydrochlorid, Idarubicinhydrochlorid, Epirubicinhydrochlorid, Daunorubicinhydrochlorid, Doxorubicinhydrochloride, Pirarubicinhydrochlorid, Bleomycinhydrochlorid, Zinostatin Stimalamer, Neocarzinostatin, Mytomycin C, Bleomycinsulfat, Peplomycinsulfat, Etoposid, Vinorelbintartrat, Vincristinsulfat, Vindesinsulfat, Vinblastinsulfat, Amrubicinhydrochlorid, Gefitinib, Exemestan, Capecitabin, TNP-470, TAK-165, KW-2401, KW-2170, KW-2871, KT-5555, KT-8391, TZT- 1027, S-3304, CS-682, YM-511, YM-598, TAT-59, TAS-101, TAS-102, TA-106, FK-228, FK-317, E7070, E7389, KRN-700, KRN-5500, J-107088, HMN-214, SM-11355 und ZD-0473.
Ferner kann ein Gen in die Lipidmembran-Struktur der vorliegenden Erfindung eingekapselt werden. Das Gen kann ein Oligonukleotid, DNS und RNS sein, und insbesondere zählen zu den Beispielen dafür Gene zum Gentransfer in vitro, wie beispielsweise Transfektion, sowie ein Gen, welches auf die in-vivo-Expression wirkt, beispielsweise ein Gen für die Gentherapie, Gene, welche bei der Züchtung von industriellen Tieren verwendet werden, wie zum Beispiel Labortiere oder Nutzvieh. Beispiele der Gene für die Gentherapie schließen ein: Antisense-Oligonukleotide, Antisense-DNS, Antisense-RNS sowie Gene, welche für physiologisch aktive Substanzen wie Enzyme und Zytokine kodieren.
Die vorgenannte Lipidmembran-Struktur kann ferner Phospholipide und ein Sterin wie Cholesterin und Cholestanol enthalten, eine andere Fettsäure mit einer gesättigten oder ungesättigten Acylgruppe mit 8 bis 24 Kohlenstoffatomen, und ein Antioxidans wie α-Tocopherol. Zu den Beispielen für das Phospholipid gehören Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerin, Cardiolipin, Sphingomyelin, Ceramidphosphorylethanolamin, Ceramidphosphorylglycerin, Ceramidphosphorylglycerinphosphat, 1,2-Dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholin, Plasmalogen und Phosphatidinsäure, und diese können alleine verwendet werden oder es können zwei oder mehr von diesen in Kombination verwendet werden. Die Fettsäurereste dieser Phospholipide sind nicht besonders beschränkt, und Beispiele dafür schließen gesättigte oder ungesättigte Fettsäurereste mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen ein. Zu den speziellen Beispielen gehört eine Acylgruppe, abgeleitet von einer Fettsäure wie Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure und Linolsäure. Ferner können außerdem Phospholipide verwendet werden, welche von Naturprodukten wie Ei-Lecithin und Sojalecithin stammen.
Die Form der Lipidmembran-Struktur der vorliegenden Erfindung und das Herstellungsverfahren derselben sind nicht besonders beschränkt, und zu den Beispielen für die Formen, in denen selbige vorliegt, zählt beispielsweise eine Form als getrocknete Lipidmischung, eine Form als Dispersion in einem wässrigen Lösungsmittel, und die vorangegangene Form in getrockneter oder gefrorener Form. Die Lipidmembran-Struktur in Form einer getrockneten Lipidmischung kann beispielsweise hergestellt werden, indem die zu verwendenden Lipidkomponenten zunächst in einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform gelöst werden und die Lösung dann unter vermindertem Druck getrocknet wird mittels Verwendung eines Verdampfers oder durch Sprühtrocknung mittels Verwendung eines Sprühtrockners. Zu den Beispielen der Form der Lipidmembran-Struktur, welche in einem wässrigen Lösungsmittel dispergiert ist, gehören unilamellare Liposomen, multilamellare Liposomen, Ö/W-Emulsionen, W/Ö/W-Emulsionen, kugelförmige Mizellen, stäbchenförmige Mizellen und unregelmäßige Schichtstrukturen, und von diesen sind Liposomen bevorzugt. Eine Größe der Lipidmembran-Struktur im dispergierten Zustand ist nicht besonders beschränkt. Beispielsweise beträgt der Partikeldurchmesser der Liposomen oder Partikel in einer Emulsion 50 nm bis 5 μm, und der Partikeldurchmesser kugelförmiger Mizellen beträgt 5 bis 100 nm. Wenn eine stäbchenförmige Mizelle oder eine unregelmäßige Schichtstruktur ausgebildet wird, dann kann davon ausgegangen werden, dass die Dicke einer Schicht selbiger 5 bis 10 nm beträgt, und derartige Schichten bilden eine einzelne Schicht.
Die Zusammensetzung des wässrigen Lösungsmittels (Dispersionsmedium) ist außerdem nicht besonders beschränkt, und die wässrige Lösung kann zum Beispiel ein Puffer sein, wie beispielsweise ein Phosphatpuffer, Citratpuffer und eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, eine physiologische Kochsalzlösung oder ein Medium für die Zellkultur. Die Lipidmembran-Struktur kann in diesen wässrigen Lösungsmitteln stabil dispergiert sein. Eine wässrige Lösung eines Zuckers wie Glucose, Lactose und Saccharose und eine wässrige Lösung eines Polyols wie Glycerin und Propylenglykol können ferner zugesetzt werden.
Um die in einem derartigen wässrigen Lösungsmittel dispergierte Lipidmembran-Struktur über eine lange Zeitdauer stabil zu lagern, ist es wünschenswert, die Elektrolyte in dem wässrigen Lösungsmittel mit Hinblick auf physikalische Stabilität, wie beispielsweise Verhinderung von Aggregation, zu minimieren. Ferner ist es mit Hinblick auf die chemische Stabilität von Lipiden wünschenswert, den pH-Wert des wässrigen Lösungsmittels derart zu kontrollieren, dass dieser in einem Bereich von einem schwach sauren pH bis etwa einem neutralen pH (pH 3,0 bis 8,0) liegt, sowie gelösten Sauerstoff durch Sprudeln mit Stickstoff zu entfernen. Ferner, wenn beispielsweise ein gefriergetrocknetes oder sprühgetrocknetes Produkt gelagert wird, kann die Verwendung einer wässrigen Zuckerlösung oder einer wässrigen Polyol-Lösung eine effektive Lagerung bei Gefriertrocknung und die Lagerung einer wässrigen Zuckerlösung ermöglichen. Die Konzentration dieser wässrigen Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt. Wenn beispielsweise eine wässrige Lösung verwendet wird, beträgt die Konzentration vorzugsweise 2 bis 20% (M/V), besonders bevorzugt 5 bis 10% (M/V), und wenn eine wässrige Polyol-Lösung verwendet wird, beträgt die Konzentration vorzugsweise 1 bis 5% (M/V), besonders bevorzugt 2 bis 2,5% (M/V). In einem Puffer beträgt eine Konzentration des Pufferungsmittels vorzugsweise 5 bis 50 mM, besonders bevorzugt 10 bis 20 mM. Eine Konzentration der Lipidmembran-Struktur in einem wässrigen Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt. Eine Konzentration der Gesamtmenge an Lipiden in der Lipidmembran-Struktur beträgt vorzugsweise 0,1 bis 500 mM, besonders bevorzugt 1 bis 100 mM.
Die Form der in einem wässrigen Lösungsmittel dispergierten Lipidmembran-Struktur kann hergestellt werden durch Zugabe der vorgenannten getrockneten Lipidmischung zu einem wässrigen Lösungsmittel und Emulgieren der Mischung unter Verwendung eines Emulgierers, wie beispielsweise eines Homogenisators, eines Ultraschall-Emulgierers oder eines Hochdruckstrahl-Emulgierers. Ferner kann die vorgenannte Form auch hergestellt werden durch ein Verfahren, welches als Verfahren zur Herstellung von Liposomen bekannt ist, beispielsweise das Reverse-Phase-Verdampfungsverfahren, und das Verfahren zur Herstellung der Dispersion ist nicht besonders beschränkt. Wenn gewünscht wird, die Größe der Lipidmembran-Struktur zu kontrollieren, kann eine Extrusion (Extrusionsfiltration) unter hohem Druck durchgeführt werden unter Verwendung eines Membranfilters mit gleichmäßiger Porengröße.
Beispiele des Verfahrens zur Trocknung der vorgenannten Lipidmembran-Struktur, welche in einem wässrigen Lösungsmittel dispergiert ist, schließen gewöhnliche Gefriertrocknung und Sprühtrocknung ein. Als wässriges Lösungsmittel, welches für diese Verfahren verwendet wird, kann eine wässrige Zuckerlösung, vorzugsweise eine wässrige Saccharoselösung oder eine wässrige Lactoselösung, wie oben beschrieben verwendet werden. Wenn eine in dem wässrigen Lösungsmittel dispergierte Lipidmembran-Struktur zunächst hergestellt und anschließend getrocknet wird, wird es möglich, die Lipidmembran-Struktur für eine lange Zeitdauer zu lagern. Zusätzlich wird, wenn eine wässrige Lösung eines Medikaments zu der getrockneten Lipidmembran-Struktur gegeben wird, die Lipidmischung effizient hydratisiert und das Medikament kann effizient in die Lipidmembran-Struktur aufgenommen werden, was eine vorteilhafte Wirkung zur Folge hat. So kann beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung zubereitet werden, indem der Lipidmembran-Struktur ein Medikament zugesetzt wird, womit die Lipidmembran-Struktur als pharmazeutische Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung und/oder zur Krankheitsprävention verwendet werden kann. Wenn das Medikament ein Gen ist, kann die Zusammensetzung außerdem als ein Werkzeug zum Gentransfer verwendet werden.
Bezüglich der Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann diese Form die ein Medikament aufnehmenden Lipidmembran-Strukturen sein, und ebenso eine Mischung aus einem Medikament und der Lipidmembran-Strukturen. Der hier verwendete Begriff „aufnehmen" bedeutet, dass ein Medikament im Inneren der Membranen der Lipidmembran-Strukturen, an der Membranoberfläche, in den Lipidschichten und/oder an den Oberflächen der Lipidschichten vorliegt. Eine verfügbare Form der pharmazeutischen Zusammensetzung und ein Verfah ren zur Zubereitung derselben sind nicht besonders beschränkt, auf gleiche Weise wie die Lipidmembran-Strukturen. Bezüglich der verfügbaren Form zählen zu den Beispielen eine Form einer getrockneten Mischung, eine Form einer Dispersion in einem wässrigen Lösungsmittel sowie Formen, welche ferner erhalten werden können durch Trocknen oder Gefrieren dieser Formen.
Eine getrocknete Mischung aus Lipiden und einem Medikament kann beispielsweise hergestellt werden, indem zum einen Lipidkomponenten und ein zu verwendendes Medikament in einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform gelöst werden und anschließend die resultierende Lösung unter vermindertem Druck verfestigt wird mittels Verwendung eines Verdampfers oder durch Sprühtrocknung unter Verwendung eines Sprühtrockners. Zu den Beispielen einer Form, bei welcher eine Mischung aus Lipidmembran-Strukturen und einem Medikament in einer wässrigen Lösung dispergiert ist, gehören, jedoch nicht besonders darauf beschränkt, multilamellare Liposomen, unilamellare Liposomen, Ö/W-Emulsionen, W/Ö/W-Emulsionen, kugelförmige Mizellen, Fasermizellen und Schichtstrukturen von unregelmäßiger Gestalt. Die Partikelgröße (Partikeldurchmesser) der Mischung und die Zusammensetzung des wässrigen Lösungsmittels sind nicht besonders beschränkt. Beispielsweise können Liposomen eine Größe von 50 nm bis 2 μm aufweisen, kugelförmige Mizellen können eine Größe von 5 bis 100 nm aufweisen, und Emulsionen können einen Partikeldurchmesser von 50 nm bis 5 μm besitzen. Die Konzentration der Mischung im wässrigen Lösungsmittel ist ebenso nicht besonders beschränkt. Mehrere Verfahren sind als Verfahren zur Zubereitung einer Mischung aus Lipidmembran-Struktur und einem Medikament in Form einer Dispersion in einem wässrigen Lösungsmittel bekannt. Es ist erforderlich, ein geeignetes Verfahren zweckmäßigerweise in Abhängigkeit von einer verfügbaren Form der Mischung aus Lipidmembran-Strukturen und einem Medikament zu wählen.
Herstellungsverfahren 1
Herstellungsverfahren 1 ist ein Verfahren zur Zugabe eines wässrigen Lösungsmittels zu der vorgenannten getrockneten Mischung aus Lipiden und einem Medikament, sowie zur Emulgierung der Mischung unter Verwendung eines Emulgierers, wie beispielsweise eines Homogenisators, eines Ultraschall-Emulgierers oder eines Hochdruck-Einspritzemulgierers. Wenn gewünscht wird, die Größe (Partikeldurchmesser) zu kontrollieren, kann ferner eine Extrusion (Extrusionsfiltration) unter hohem Druck unter Verwendung eines Membranfilters mit einheitlicher Porengröße durchgeführt werden. Um zunächst eine getrocknete Mischung aus Lipiden und einem Medikament zuzubereiten, ist es bei diesem Verfahren erforderlich, das Medikament in einem organischen Lösungsmittel aufzulösen, und das Verfahren besitzt den Vorteil, dass es die Interaktionen zwischen dem Medikament und den Lipidmembran-Strukturen am besten ausnutzt. Auch wenn die Lipidmembran-Strukturen eine Schichtstruktur aufweisen, kann ein Medikament in das Innere der Vielzahl an Schichten eindringen, und somit bietet die Anwendung dieses Verfahrens im Allgemeinen eine höhere Retentionsgeschwindigkeit des Medikaments in den Lipidmembran-Strukturen.
Herstellungsverfahren 2
Herstellungsverfahren 2 ist ein Verfahren zur Zugabe eines wässrigen Lösungsmittels, welches ein Medikament enthält, zu getrockneten Lipidkomponenten, welche erhalten wurden durch Auflösen der Lipidkomponenten in einem organischen Lösungsmittel und Verdampfen des organischen Lösungsmittels und Emulgieren der Mischung. Wenn es erwünscht ist, die Größe (Partikeldurchmesser) zu kontrollieren, kann ferner eine Extrusion (Extrusionsfiltration) unter hohem Druck unter Verwendung eines Membranfilters mit einheitlicher Porengröße durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann für ein Medikament angewendet werden, welches in einem organischen Lösungsmittel schwerlöslich ist, jedoch in einem wässrigen Lösungsmittel gelöst werden kann. Wenn die Lipidmembran-Strukturen Liposomen sind, dann besitzen diese den Vorteil, dass sie ein Medikament auch im Bereich der inneren wässrigen Phase aufnehmen können.
Herstellungsverfahren 3
Herstellungsverfahren 3 ist ein Verfahren, um ferner ein wässriges Lösungsmittel, enthaltend ein Medikament, Lipidmembran-Strukturen zuzufügen, wie beispielsweise Liposomen, Emulsionen, Mizellen oder Schichtstrukturen, welche bereits in einem wässrigen Lösungsmittel dispergiert sind. Dieses Verfahren ist beschränkt auf die Anwendung auf ein wasserlösliches Medikament. Die Zugabe eines Medikaments zu bereits hergestellten Lipidmembran-Strukturen wird von außen durchgeführt. Folglich kann das Medikament, wenn das Medikament ein Polymer ist, nicht in das Innere der Lipidmembran-Strukturen eindringen, und das Medikament kann in einer Art und Weise vorliegen, in welcher es an die Oberflächen der Lipidmembran-Strukturen bindet. Wenn Liposomen als Lipidmembran-Strukturen verwendet werden, kann die Anwendung von Herstellungsverfahren 3 die Bildung von sandwichartigen Strukturen zur Folge haben, bei welchen das Medikament zwischen Liposompartikeln eingefügt ist (im Allgemeinen als Komplex bezeichnet). Eine wässrige Dispersion von lediglich den Lipidmembran-Strukturen wird bei diesem Herstellungsverfahren im Voraus zubereitet. Demzufolge muss eine Zersetzung eines Medikaments während der Zubereitung nicht in Betracht gezogen werden, und eine Kontrolle der Größe (Partikeldurchmesser) wird außerdem auf einfache Weise bewirkt, was eine verhältnismäßig einfache Zubereitung im Vergleich zu Herstellungsverfahren 1 und 2 ermöglicht.
Herstellungsverfahren 4
Herstellungsverfahren 4 ist ein Verfahren, um ferner ein wässriges Lösungsmittel, enthaltend ein Medikament, einem getrockneten Produkt zuzufügen, welches erhalten wurde, indem zunächst in einem wässrigen Lösungsmittel dispergierte Lipidmembran-Strukturen hergestellt werden, welche anschließend getrocknet werden. Bei diesem Verfahren ist das Medikament in der gleichen Weise wie bei Herstellungsverfahren 3 auf ein wasserlösliches Medikament beschränkt. Ein signifikanter Unterschied zu Herstellungsverfahren 3 ist die Art und Weise, in welcher die Lipidmembran-Strukturen und ein Medikament vorliegen. Das heißt, dass bei Herstellungsverfahren 4 in wässrigem Lösungsmittel dispergierte Lipidmembran-Strukturen zunächst hergestellt und in der Folge getrocknet werden, um ein getrocknetes Produkt zu erhalten, und auf dieser Stufe liegen die Lipidmembran-Strukturen in einem festen Zustand als Fragmente von Lipidmembranen vor. Um es den Fragmenten der Lipidmembranen zu ermöglichen, in einem festen Zustand vorzuliegen, ist es vorzuziehen, eine wässrige Zuckerlösung, vorzugsweise eine wässrige Saccharoselösung oder eine wässrige Lactoselösung, als wässriges Lösungsmittel wie oben beschrieben zu verwenden. Bei diesem Verfahren, wenn das wässrige Lösungsmittel, enthaltend ein Medikament zugesetzt wird, setzt mit dem Eindringen von Wasser schnell die Hydratisierung der in einem Feststoffzustand vorliegenden Fragmente der Lipidmembranen ein, und somit können die Lipidmembran-Strukturen wiederhergestellt werden. Zu diesem Zeitpunkt kann eine Struktur von einer Form, bei welcher ein Medikament im Inneren der Lipidmembran-Strukturen aufgenommen ist, hergestellt werden.
Bei Herstellungsverfahren 3, wenn ein Medikament ein Polymer ist, kann das Medikament nicht in das Innere der Lipidmembran-Strukturen eindringen, und liegt in einer Art und Weise vor, in welcher es an die Oberflächen der Lipidmembran-Strukturen bindet. Herstellungsverfahren 4 weicht in diesem Punkt signifikant davon ab. Bei Herstellungsverfahren 4 wird eine wässrige Dispersion allein aus Lipidmembran-Strukturen im Voraus zubereitet, und demzufolge muss eine Zersetzung des Medikaments während des Emulgierens nicht in Betracht gezogen werden, und eine Kontrolle der Größe (Partikeldurchmesser) ist außerdem leicht zu erreichen. Aus diesem Grund erlaubt dieses Verfahren eine verhältnismäßig einfache Zubereitung im Vergleich zu den Herstellungsverfahren 1 und 2. Neben den oben genannten Vorteilen besitzt dieses Verfahren außerdem Vorteile solcherart, dass die Lagerstabilität für eine pharmazeutische Zubereitung leicht sichergestellt wird, da das Verfahren Gefriertrocknung oder Sprühtrock nung verwendet; wenn die getrocknete Zubereitung mit einer wässrigen Lösung eines Medikaments rehydratisiert wird, kann die ursprüngliche Größe (Partikeldurchmesser) reproduziert werden; wenn ein polymeres Medikament verwendet wird, kann das Medikament leicht im Inneren der Lipidmembran-Strukturen aufgenommen werden.
Als anderes Verfahren zur Herstellung einer Mischung aus Lipidmembran-Strukturen und einem Medikament in Form einer Dispersion in einem wässrigen Lösungsmittel kann ein zur Herstellung von Liposomen wohlbekanntes Verfahren, beispielsweise die Reverse-Phase-Verdampfung, separat angewendet werden. Wenn gewünscht wird, die Größe (Partikeldurchmesser) zu kontrollieren, kann eine Extrusion (Extrusionsfiltration) unter hohem Druck unter Verwendung eines Membranfilters mit einheitlicher Porengröße durchgeführt werden. Des Weiteren schließen Beispiele des Verfahrens, um ferner eine Dispersion zu trocknen, bei welcher die vorgenannte Mischung aus Lipidmembran-Strukturen und einem Medikament in einem Lösungsmittel dispergiert ist, Gefriertrocknung und Sprühtrocknung ein. Als wässriges Lösungsmittel bei diesem Vorgang ist es vorzuziehen, eine wässrige Zuckerlösung zu verwenden, vorzugsweise eine wässrige Saccharoselösung oder eine wässrige Lactoselösung. Zu den Beispielen des Verfahrens, um ferner eine Dispersion einzufrieren, bei welcher die vorgenannte Mischung aus Lipidmembran-Strukturen und einem Medikament in einem wässrigen Lösungsmittel dispergiert ist, zählen übliche Gefrierverfahren. Als wässriges Lösungsmittel bei diesem Verfahren ist es vorzuziehen, eine wässrige Zuckerlösung oder eine wässrige Polyol-Lösung auf die gleiche Weise zu verwenden wie bei der Lösung für die Lipidmembran-Strukturen allein.
Lipide, welche der pharmazeutischen Zusammensetzung zugesetzt werden können, können entsprechend ausgewählt werden in Abhängigkeit von der Art des anzuwendenden Medikaments. Die Lipide werden in einer Menge von beispielsweise 0,1 bis 1000 Teile je Masseneinheit, vorzugsweise 0,5 bis 200 Teile je Masseneinheit verwendet, bezogen auf 1 Teil je Masseneinheit eines Medika ments, wenn das Medikament kein Gen ist. Wenn das Medikament ein Gen ist, beträgt die Menge vorzugsweise 1 bis 500 nmol, besonders bevorzugt 10 bis 200 nmol, je 1 mg eines Medikaments (Gen).
Das Verfahren zur Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, welche die Lipidmembran-Strukturen enthält, kann in geeigneter Weise berücksichtigt werden in Abhängigkeit von der Form derselben. Der Verabreichungsweg für Menschen ist nicht besonders beschränkt, und es kann entweder eine orale Verabreichung oder eine parenterale Verabreichung angewendet werden. Zu den Beispielen von Darreichungsformen zur oralen Verabreichung zählen beispielsweise Tabletten, Pulver, Granalien, Sirups, Kapseln und Lösungen zur inneren Anwendung, und zu den Beispielen von Darreichungsformen zur parenteralen Verabreichung zählen beispielsweise Injektionen, Infusionen, Augentropfen, Salben, Suppositorien, Suspensionen, Kataplasmen, Tinkturen, Aerosole und Pflaster. Im medizinischen Bereich werden unter diesen Injektionen oder Infusionen bevorzugt, und als Methode der Verabreichung sind intravenöse Injektion, subkutane Injektion und intradermale Injektion, ebenso wie lokale Injektionen in die Zielzellen oder Zielorgane, bevorzugt. Ferner, was den Kosmetikbereich betrifft, zählen zu den Beispielen von Formen von Kosmetika Lotionen, Cremes, Eau de Toilette, milchartige Lotionen, Schäume, Schminke, Lippenstifte, Packungen, Hautreinigungsmittel, Shampoos, Spülungen, Conditioner, Haartonika, Haarwässer und Haarcremes.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf die folgenden Beispiele genauer beschrieben.
Herstellungsbeispiel 1: Herstellung eines Copolymers (CP)
Die folgenden Verbindungen wurden in 1 l Toluol in einem 2-Liter-Kolben, ausgestattet mit einem Rührer und einem Kühlrohr, und bei 80°C ± 2°C für 7 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre erhitzt, um die Polymerisationsreaktion durchzuführen.

CH₂=CHCH₂O(C₂H₄O)₁₁CH₃ 556 g (1,0 mol)

Maleinsäureanhydrid 103 g (1,05 mol)

tert-Butylperoxy-2-ethylhexanoat 4,3 g (0,02 mol)
Anschließend wurden das Toluol und der nicht umgesetzte Maleinsäureanhydrid bei 100°C ± 10°C unter einem verminderten Druck von 1,3 bis 4,0 kPa verdampft, um 528 g von Copolymer Nr. 1 zu erhalten. Das erhaltene Copolymer Nr. 1 war eine klare, braune Flüssigkeit und besaß eine kinematische Viskosität von 206 cSt bei 100°C und eine Verseifungszahl von 182 mg KOH pro Gramm.
Herstellungsbeispiel 2
Die folgenden Verbindungen wurden in 2 l Toluol in einem 5-Liter-Kolben, ausgestattet mit einem Rührer und einem Kühlrohr, gelöst und bei 80°C ± 2°C für 9 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre erhitzt, um die Polymerisationsreaktion durchzuführen.

CH₂=CHCH₂O(C₂H₄O)₃₃CH₃ 1524 g (1,0 mol)

Maleinsäureanhydrid 103 g (1,05 mol)

tert-Butylperoxy-2-ethylhexanoat 10,8 g (0,05 mol)
Anschließend wurden das Toluol und der nicht umgesetzte Maleinsäureanhydrid bei 100°C ± 10°C unter einem verminderten Druck von 1,3 bis 4,0 kPa verdampft, um 1518 g von Copolymer Nr. 2 zu erhalten. Das erhaltene Copolymer Nr. 2 war bei 25°C ein brauner Feststoff und besaß eine Verseifungszahl von 49,2 mg KOH pro Gramm.
Herstellungsbeispiele 3 bis 8

Die Verbindungen, welche repräsentiert werden durch die in Tabelle 1 abgebildete Formel (1), ebenso wie Maleinsäureanhydrid und Katalysatoren, in Tabelle 2 angegeben, wurden verwendet, um die Copolymere Nr. 3 bis 8 auf die gleiche Weise herzustellen wie in Herstellungsbeispiel 2, mit der Ausnahme, dass die Molverhältnisse, wie in den Tabellen 1 und 2 dargestellt, abgeändert wurden. Die Eigenschaften der Copolymere Nr. 3 bis 8, wie beispielsweise massenmittleres Molekulargewicht, Verseifungszahl, Form sowie Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 1

Copolymer	Alkenylether, repräsentiert durch Formel (1)
Copolymer	Art (Strukturformel)	Molverhältnis	OE*	Molekulargewicht
Nr. 1	CH₂=CHCH₂O(C₂H₄O)₁₁CH₃	1,0	100	556
Nr. 2	CH₂=CHCH₂O(C₂H₄O)₃₃CH₃	1,0	100	1524
Nr. 3	CH₂=CHCH₂O(C₂H₄O)₆CH₃	1,0	100	336
Nr. 4	CH₂=C(CH₃)CH₂O(C₂H₄O)₄₄CH₃	1,0	100	2022
Nr. 5	CH₂CHCH₂O{(C₂H₄O)₂₀(C₃H₆O)₁₀}CH₃	1,0	100	1532
Nr. 6	CH₂=CHCH₂O(C₃H₆O)₁₀(C₂H₄O)₂₀CH₃	1,0	60	1532
Nr. 7	CH₂=CHCH₂O(C₂H₄O)₃₃CH₃	0,5	100	1524
Nr. 7	CH₂CHCH₂O{(C₂H₄O)₂₀(C₃H₆O)₁₀}CH₃	0,5	60	1532
Nr. 8	CH₂=CHCH₂O(C₂H₄O)₃₃C₁₆H₃₃	0,2	100	1734
Nr. 8	CH₂=CHCH₂O(C₂H₄O)₃₃CH₃	0,8	100	1524

*: Anteil der Oxyethylengruppen (Massenprozent)
Hinweis: der Teil in {} ist ein statistisches Addukt

Copolymer	Maleinsäureanhydrid	Katalysator
Copolymer	Mol	Art	Mol
Nr. 1	1,05	t-BEH	0,02
Nr. 2	1,05	t-BEH	0,05
Nr. 3	1,05	t-BEH	0,01
Nr. 4	1,05	t-BEH	0,05
Nr. 5	1,0	LPO	0,03
Nr. 6	1,0	LPO	0,03
Nr. 7	1,0	BPO	0,07
Nr. 8	1,0	tBEH	0,05

BPO: Benzoylperoxid
LPO: Lauroylperoxid
t-BEH: tert-Butylperoxy-2-ethylhexanoat

Copolymer	Massenmittleres Molekulargewicht	Verseifungszahl	Phase		Löslichkeit
Copolymer	Massenmittleres Molekulargewicht	Verseifungszahl	20°C	100°C	Wasser	Aceton	Toluol
Nr. 1	22.000	182,0	flüssig	flüssig	löslich	löslich	löslich
Nr. 2	21.000	73,3	fest	flüssig	löslich	löslich	löslich
Nr. 3	23.000	233,2	flüssig	flüssig	löslich	löslich	löslich
Nr. 4	91.000	49,2	fest	flüssig	löslich	löslich	löslich
Nr. 5	21.000	64,5	flüssig	flüssig	löslich	schwer löslich	löslich
Nr. 6	21.000	61,9	flüssig	flüssig	löslich	schwerlöslich	löslich
Nr. 7	17.000	71,1	fest	flüssig	schwerloslich	schwer-löslich	löslich
Nr. 8	16.000	62,0	fest	flüssig	schwerlöslich	schwer-löslich	löslich

Beispiel 1
Synthese des Addukts aus Copolymer Nr. 1 und Distearylphosphatidylethanolamin (1 mol)
Einer Menge von 748 mg (1 mmol) Distearylphosphatidylethanolamin wurden in einem 100-ml-Kolben, ausgestattet mit einem Rührer, 50 ml Toluol zugegeben und bei 40°C gerührt, des Weiteren wurden 82 mg (1 mmol) Natriumacetat und 21,9 g (0,98 mmol) des Copolymers Nr. 1 zugesetzt und bei 40°C für 5 Stunden reagieren gelassen. Das Ende der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (DC) festgestellt, als ein Punkt, an dem Distearylphosphatidylethanolamin nicht länger mittels einer Ninhydrin-Farbreaktion nachgewiesen werden konnte. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend gefiltert, um nicht umgesetztes Distearylphosphatidylethanolamin und Natriumacetat abzutrennen, und das Toluol wurde unter vermindertem Druck verdampft, um 19,8 g von einer Verbindung von Copolymer Nr. 1 und Distearylphosphatidylethanolamin zu erhalten.
Das Produkt wurde mittels Dünnschichtchromatographie (DC) unter Verwendung einer Silicagel-Platte identifiziert. Ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol bei einem Volumenmischverhältnis von 85:15 wurde als Entwicklerlösungsmittel verwendet. Die Färbung wurde erreicht mit Iod-Dampf, und die enthaltenen Substanzen wurden quantifiziert durch Vergleich mit bekannten Mengen von Standardsubstanzen. Der Fleck mit Distearylphosphatidylethanolamin, welcher bei der DC einen R_f-Wert von etwa 0,05 aufwies, verschwand. Das Produkt wurde bestätigt auf Basis des Verschwindens des Peaks der Aminogruppe bei 2960 cm^-1 und des Erscheinens des Peaks des sekundären Amids, welcher bei 1740 cm^-1 im IR-Spektrum als neu beobachtet wurde aufgrund der Bindung der Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin an Copolymer Nr. 1 über eine Amidbindung.
Beispiel 2
Synthese des Addukts aus Copolymer Nr. 1 und Distearylphosphatidylethanolamin (2 mol)
Einer Menge von 748 mg (1 mmol) Distearylphosphatidylethanolamin wurden in einem 100-ml-Kolben, ausgestattet mit einem Rührer, 50 ml Toluol zugegeben und bei 40°C gerührt, des Weiteren wurden 82 mg (1 mmol) Natriumacetat und 11,0 g (0,5 mmol) des Copolymers Nr. 1 zugesetzt und bei 40°C für 5 Stunden reagieren gelassen. Das Ende der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (DC) festgestellt, unten beschrieben als ein Punkt, an dem Distearylphosphatidylethanolamin nicht länger mittels einer Ninhydrin-Farbreaktion nachgewiesen werden konnte. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend gefiltert, um nicht umgesetztes Distearylphosphatidylethanolamin und Natriumacetat abzutrennen, und das Toluol wurde unter vermindertem Druck verdampft, um 10,4 g von einer Verbindung von Copolymer Nr. 1 und Distearylphosphatidylethanolamin zu erhalten.
Das Produkt wurde mittels Dünnschichtchromatographie (DC) unter Verwendung einer Silicagel-Platte identifiziert. Ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol bei einem Volumenmischverhältnis von 85:15 wurde als Entwicklerlösungsmittel verwendet. Die Färbung wurde erreicht mit Iod-Dampf, und die enthaltenen Substanzen wurden quantifiziert durch Vergleich mit bekannten Mengen von Standardsubstanzen. Der Fleck mit Distearylphosphatidylethanolamin, welcher bei der DC einen R_f-Wert von etwa 0,05 aufwies, verschwand. Das Produkt wurde bestätigt auf Basis des Verschwindens des Peaks der Aminogruppe bei 2960 cm^-1 und des Erscheinens des Peaks des sekundären Amids, welcher bei 1740 cm^-1 im IR-Spektrum als neu beobachtet wurde aufgrund der Bindung der Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin an Copolymer Nr. 1 über eine Amidbindung.
Beispiel 3
Synthese des Addukts aus Copolymer Nr. 2 und Distearylphosphatidylethanolamin (1 mol)
Einer Menge von 748 mg (1 mmol) Distearylphosphatidylethanolamin wurden in einem 100-ml-Kolben, ausgestattet mit einem Rührer, 50 ml Toluol zugegeben, bei 40°C gerührt und des Weiteren mit 82 mg (1 mmol) Natriumacetat und 20,9 g (0,99 mmol) von Copolymer Nr. 2 versetzt und bei 40°C für 5 Stunden reagieren gelassen. Das Ende der Reaktion wurde bestätigt durch DC, unten beschrieben als ein Punkt, bei welchem Distearylphosphatidylethanolamin nicht länger mittels einer Ninhydrin-Farbreaktion nachgewiesen werden konnte. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend gefiltert, um nicht umgesetztes Distearylphosphatidylethanolamin und Natriumacetat abzutrennen, und das Toluol wurde unter vermindertem Druck verdampft. Anschließend wurde der Rückstand mit 20 ml Toluol versetzt, gelöst und dann tropfenweise zu 100 ml Hexan gegeben, um Kristalle einer Verbindung aus Copolymer Nr. 2 und Distearylphosphatidylethanolamin zu erhalten. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet, um 19,3 g trockener Kristalle der Zielsubstanz zu erhalten.
Das Produkt wurde durch Dünnschichtchromatographie (DC) identifiziert unter Verwendung einer Silicagel-Platte. Ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol bei einem Volumenmischverhältnis von 85:15 wurde als Entwicklerlösungsmittel verwendet. Die Färbung wurde erreicht mit Iod-Dampf, und die enthaltenen Substanzen wurden quantifiziert durch Vergleich mit bekannten Mengen von Standardsubstanzen. Der Fleck mit Distearylphosphatidylethanolamin, welcher bei der DC einen R_f-Wert von etwa 0,05 aufwies, verschwand. Das Produkt wurde identifiziert auf Basis des Verschwindens des Peaks der Aminogruppe bei 2960 cm^-1 und des Erscheinens des Peaks des sekundären Amids, welcher bei 1740 cm^-1 im IR-Spektrum als neu beobachtet wurde aufgrund der Bindung der Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin an Copolymer Nr. 1 über eine Amidbindung.
Beispiel 4
Synthese des Addukts aus Copolymer Nr. 2 und Distearylphosphatidylethanolamin (2 mol)
Einer Menge von 748 mg (1 mmol) Distearylphosphatidylethanolamin wurden in einem 100-ml-Kolben, ausgestattet mit einem Rührer, 50 ml Toluol zugegeben, bei 40°C gerührt und des Weiteren mit 82 mg (1 mmol) Natriumacetat und 10,5 g (0,5 mmol) von Copolymer Nr. 2 versetzt und bei 40°C für 5 Stunden reagieren gelassen. Das Ende der Reaktion wurde bestätigt durch DC, unten beschrieben als ein Punkt, bei welchem Distearylphosphatidylethanolamin nicht länger mittels einer Ninhydrin-Farbreaktion nachgewiesen werden konnte. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend gefiltert, um nicht umgesetztes Distearylphosphatidylethanolamin und Natriumacetat abzutrennen, und das Toluol wurde unter vermindertem Druck verdampft. Anschließend wurde der Rückstand mit 20 ml Toluol versetzt, gelöst und dann tropfenweise zu 100 ml Hexan gegeben, um Kristalle einer Verbindung aus Copolymer Nr. 2 und Distearylphosphatidylethanolamin zu erhalten. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet, um 10,0 g trockener Kristalle der Zielsubstanz zu erhalten.
Das Produkt wurde durch Dünnschichtchromatographie (DC) unter Verwendung einer Silicagel-Platte identifiziert. Ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol bei einem Volumenmischverhältnis von 85:15 wurde als Entwicklerlösungsmittel verwendet. Die Färbung wurde erreicht mit Iod-Dampf, und die enthaltenen Substanzen wurden quantifiziert durch Vergleich mit bekannten Mengen von Standardsubstanzen. Der Fleck mit Distearylphosphatidylethanolamin, welcher bei der DC einen R_f-Wert von etwa 0,05 aufwies, verschwand. Das Produkt wurde identifiziert auf Basis des Verschwindens des Peaks der Aminogruppe bei 2960 cm^-1 und des Erscheinens des Peaks des sekundären Amids, welcher bei 1740 cm^-1 im IR-Spektrum als neu beobachtet wurde aufgrund der Bin dung der Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin an Copolymer Nr. 1 über eine Amidbindung.
Beispiel 5
Synthese des Addukts aus Copolymer Nr. 5 und Distearylphosphatidylethanolamin (2 mol)
Einer Menge von 748 mg (1 mmol) Distearylphosphatidylethanolamin wurden in einem 100-ml-Kolben, ausgestattet mit einem Rührer, 50 ml Toluol zugegeben, bei 40°C gerührt und des Weiteren mit 82 mg (1 mmol) Natriumacetat und 10,4 g (0,49 mmol) von Copolymer Nr. 5 versetzt und bei 40°C für 5 Stunden reagieren gelassen. Das Ende der Reaktion wurde festgestellt durch DC, unten beschrieben als ein Punkt, bei welchem Distearylphosphatidylethanolamin nicht länger mittels einer Ninhydrin-Farbreaktion nachgewiesen werden konnte. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend gefiltert, um nicht umgesetztes Distearylphosphatidylethanolamin und Natriumacetat abzutrennen, und das Toluol wurde unter vermindertem Druck verdampft, um 10,1 g einer Verbindung aus Copolymer Nr. 5 und Distearylphosphatidylethanolamin zu erhalten.
Das Produkt wurde durch Dünnschichtchromatographie (DC) unter Verwendung einer Silicagel-Platte identifiziert. Ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol bei einem Volumenmischverhältnis von 85:15 wurde als Entwicklerlösungsmittel verwendet. Die Färbung wurde erreicht mit Iod-Dampf, und die enthaltenen Substanzen wurden quantifiziert durch Vergleich mit bekannten Mengen von Standardsubstanzen. Der Fleck mit Distearylphosphatidylethanolamin, welcher bei der DC einen R_f-Wert von etwa 0,05 aufwies, verschwand. Das Produkt wurde bestätigt auf Basis des Verschwindens des Peaks der Aminogruppe bei 2960 cm^-1 und des Erscheinens des Peaks des sekundären Amids, welcher bei 1740 cm^-1 im IR-Spektrum als neu beobachtet wurde aufgrund der Bindung der Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin an Copolymer Nr. 1 über eine Amidbindung.
Beispiel 6
Synthese des Addukts aus Copolymer Nr. 5 und Distearylphosphatidylethanolamin (1 mol)
Einer Menge von 748 mg (1 mmol) Distearylphosphatidylethanolamin wurden in einem 100-ml-Kolben, ausgestattet mit einem Rührer, 50 ml Toluol zugegeben, bei 40°C gerührt und des Weiteren mit 82 mg (1 mmol) Natriumacetat und 90,9 g (0,99 mmol) von Copolymer Nr. 4 versetzt und bei 40°C für 8 Stunden reagieren gelassen. Das Ende der Reaktion wurde bestätigt durch die unten beschriebene DC als ein Punkt, bei welchem Distearylphosphatidylethanolamin nicht länger mittels einer Ninhydrin-Farbreaktion festgestellt werden konnte. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und anschließend gefiltert, um nicht umgesetztes Distearylphosphatidylethanolamin und Natriumacetat abzutrennen, und das Toluol wurde unter vermindertem Druck verdampft, um 85,4 g einer Verbindung aus Copolymer Nr. 4 und Distearylphosphatidylethanolamin zu erhalten.
Das Produkt wurde durch Dünnschichtchromatographie (DC) unter Verwendung einer Silicagel-Platte identifiziert. Ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol bei einem Volumenmischverhältnis von 85:15 wurde als Entwicklerlösungsmittel verwendet. Die Färbung wurde erreicht mit Iod-Dampf, und die enthaltenen Substanzen wurden quantifiziert durch Vergleich mit bekannten Mengen von Standardsubstanzen. Der Fleck mit Distearylphosphatidylethanolamin, welcher bei der DC einen R_f-Wert von etwa 0,05 aufwies, verschwand. Das Produkt wurde bestätigt auf Basis des Verschwindens des Peaks der Aminogruppe bei 2960 cm^-1 und des Erscheinens des Peaks des sekundären Amids, welcher bei 1740 cm^-1 im IR-Spektrum als neu beobachtet wurde aufgrund der Bindung der Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin an Copolymer Nr. 1 über eine Amidbindung.
Beispiel 7: Herstellung von Gesichtswasser (Beurteilung als Lösungsvermittler)

Unter Verwendung des Addukts aus Copolymer Nr. 5 und Distearylphosphatidylethanolamin (1 mol) aus Synthesebeispiel 6 wurde ein Gesichtswasser hergestellt. Aus den Grundsubstanzen der in Tabelle 4 angegebenen Zusammensetzung wurden Glycerin und Propylenglykol zu gereinigtem Wasser gegeben und einheitlich gelöst. Weitere Grundsubstanzen wurden zu Ethanol gegeben und die Mischung vereinheitlicht, anschließend unter Rühren zu der vorgenannten Phase gereinigten Wassers gegeben und solubilisiert, um ein Gesichtswasser zu erhalten. Tabelle 4

Propylenglykol	5,0 Gew-%
Glycerin	2,0 Gew-%
Octadecylalkohol	0,5 Gew-%
hydriertes Sojalecithin	0,5 Gew-%
Ethanol	7,0 Gew-%
Addukt aus Copolymer Nr. 5 und Distearylphosphatidylethanolamin (1 mol)	2,0 Gew-%
Tocopherol	0,02 Gew-%
Parfum	nach Bedarf
Konservierungsstoff	nach Bedarf
gereinigtes Wasser	73 Gew-%

Beispiel 8: Herstellung einer Liposom-Emulsion (Beurteilung als Dispergiermittel für Kosmetika)
Verfahren zur Herstellung von Liposomen

Zu einer Menge von 645 mg an hydriertem Soja-Phosphatidylcholin wurden 299 mg Cholesterin, 23 mg Myristinsäure (Molverhältnis 1:1:0,1) und das Addukt aus Copolymer Nr. 2 und Distearylphosphatidylethanolamin (1 mol) gegeben, so dass die Konzentration der Lipidmischung 5 Mol-% betragen sollte, mit 10 bis 11 ml an physiologischer, zuvor auf 60°C erhitzter Kochsalzlösung versetzt, so dass die Konzentration der Lipidmischung 10 Massenprozent betrug, und gerührt und ferner gemischt unter Verwendung eines Homogenisators auf einem Wasserbad bei 60°C für 10 Minuten, um eine Liposomlösung zu erhalten. Aus den Grundsubstanzen der in Tabelle 5 angeführten Zusammensetzung wurden jene der Ölphase, welche einen Emulgator enthielten, auf 60°C erhitzt und einheitlich gelöst, und jene der wässrigen Phase, welche die Liposomlösung verwendete, wurden unter Rühren bei der gleichen Temperatur zugefügt, um eine Liposom-Emulsion zu erhalten. Tabelle 5

Ölphase:
Hexadecylalkohol	2,0 Gew-%
Vaseline	2,0 Gew-%
Squalan	5,0 Gew-%
flüssiges Paraffin	10,0 Gew-%
Monooleinsäurepolyoxyethylenester	2,0 Gew-%
Tocopherol	0,02 Gew-%
Parfum	nach Bedarf
Konservierungsstoff	nach Bedarf
wässrige Phase:
Propylenglykol	2,0 Gew-%
gereinigtes Wasser	7,0 Gew-%
Liposomlösung	10,0 Gew-%

Beispiel 9: Beurteilung als Liposom, fähig zu einer langen Verweildauer im Blut
(1) Verfahren zur Herstellung von Liposomen
Jedes der Lipide, welche jeweils bei den in Tabelle 6 (Formulierungsbeispiele 1 bis 6, Kontrollbeispiele 1 bis 2) angeführten Membranzusammensetzungen genannt werden, wurden im jeweiligen Anteil eingewogen und in einer Mischung aus Chloroform/Methanol (2:1) gelöst, anschließend wurden die organischen Lösungsmittel unter Verwendung eines Verdampfers verdampft, und ferner wurde der Rückstand unter vermindertem Druck für 1 Stunde getrocknet. Anschließend wurden die getrockneten Lipide (Lipidfilm) mit 10 ml einer wässrigen, zuvor auf 65°C erhitzten 155 mM Ammoniumsulfatlösung (pH 5,5) versetzt, und die Mischung wurde auf einem heißen Wasserbad leicht gerührt unter Verwendung eines Vortex-Mischers (bis das Lipid im Wesentlichen von einem Auffangkolben abgelöst war). Die Lipiddispersion wurde in einen Homogenisator überführt, für 10 Hübe homogenisiert und klassiert unter Verwendung von Polycarbonat-Membranfiltern mit verschiedenen Porengrößen (0,2 μm × 3 mal, 0,1 μm × 3 mal, 0,05 μm × 3 mal und 0,03 μm × 3 mal), um eine Dispersion leerer Liposomen herzustellen, welche einen Partikeldurchmesser von etwa 100 nm aufweisen.
Eine Menge von 4 ml dieser Dispersion von leeren Liposomen wurde auf das 2,5-fache mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und die resultierende Liposomdispersion wurde in ein Ultrazentrifugenröhrchen gegeben und bei 65.000 UPM für eine Stunde zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand verworfen und die Rückstände in physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert, um die Dispersion auf ein Volumen von 10 ml zu bringen, dem Volumen der Liposomdispersion vor der Zentrifugation (zu diesem Zeitpunkt war die Gesamtkonzentration an Lipiden auf 50 mM eingestellt). Die vorgenannte Dispersion von leeren Liposomen, bei welcher die äußere wässrige Phase ersetzt worden war durch physiologische Kochsalzlösung (Gesamtkonzentration an Lipid: 50 mM) und eine Doxorubicin-Lösung (Medikamentenkonzentration: 3,3 mg/ml in physiologischer Kochsalzlösung) wurden zuvor auf 60°C erhitzt, und die Dispersion aus leeren Liposomen und die Doxorubicin-Lösung wurden in einem Volumenverhältnis von 4:6 (finale Medikamentenkonzentration: 2,0 mg/ml, finale Lipidkonzentration: 20 mM) vereinigt und bei 60°C für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt, um eine Doxorubicin enthaltende Liposomdispersion zu erhalten.
(2) Physikalische Eigenschaften der Liposomen
Der Anteil des in die Liposomen aufgenommen Doxorubicins wurde ermittelt durch Sammeln eines Teils der vorgenannten Liposomdispersion, Unterwerfen der Probe einer Gelfiltration (Sephadex G-50, die mobile Phase war eine physiologische Kochsalzlösung), und anschließendem Quantifizieren des Doxorubicins in der Liposomfraktion, welche im Ausschlussvolumen eluiert wurde, unter Verwendung von Flüssigchromatographie. Ferner wurden die Partikeldurchmesser bestimmt durch Messungen, welche auf dem Verfahren der quasi-elastischen Lichtstreuung (QELS) basieren, durchgeführt für einen Teil der vorgenannten Liposomdispersion. Demzufolge betrug der Anteil an Doxorubicin, dem von den Liposomen aufgenommenen Wirkstoff, in den Liposomen nahezu 100%, ausgenommen jene aus Formulierungsbeispiel 4 und 5, wie in Tabelle 6 angegeben. Daher wurde die jeweilige ursprüngliche Liposomdispersion ohne jede Behandlung verwendet und auf das 4/3-fache mit physiologischer Kochsalzlösung für das unten beschriebene Experiment zur Verweildauer im Blut bei Ratten verdünnt (finale Medikamentenkonzentration: 1,5 mg/ml, finale Lipidkonzentration: 15 mM). Ferner wurden die Liposomen aus den Formulierungsbeispielen 4 und 5 einer Ultrazentrifugation unterworfen (65.000 UPM, 1 Stunde), um nicht verkapseltes Medikament im Überstand zu entfernen, und anschließend mit physiologischer Kochsalzlösung wiederhergestellt, so dass eine finale Medikamentenkonzentration von 1,5 mg/ml erhalten wurde (die finalen Lipidkonzentration der Verschreibungsbeispiele 4 und 5 betrugen etwa 17,2 mM beziehungsweise etwa 17,9 mM). Die Partikeldurchmesser der Liposomen betrugen für beide Beispiele 50 bis 100 nm.
(3) Experiment zur Bestimmung der Verweildauer im Blut bei Ratten
Ein Experiment zur Bestimmung der Verweildauer im Blut wurde in männlichen SD-Ratten (6 Wochen alt) durchgeführt unter Verwendung der oben erwähnten Formulierungsbeispiele 1 bis 6 sowie der Kontrollbeispiele 1 bis 2. Die jeweilige Liposomdispersion wurde den Ratten über die Halsvene unter Ether-Anästhesie verabreicht (jede Gruppe bestand aus 5 Tieren, Dosis: 7,5 mg Doxorubicin/5 ml/kg), dann wurde Blut aus der Halsvene unter Ether-Anästhesie in Heparin (0,5 bis 1 ml) beim jeweiligen Blutsammelzeitpunkt (2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168 Stunden) gesammelt und einer Trennung des Blutplasmas von den Blutzellen (Plasma-Skimming) unterworfen. Anschließend wurde das Blut auf herkömmliche Weise vorbehandelt, und die Medikamentenkonzentration im Plasma wurde mittels HPLC gemessen. Die FUK (Fläche unter der Kurve, 0 bis) wurde entsprechend der Trapezregel aus der Medikamentenkonzentration im Plasma errechnet, welche mit der jeweiligen Formulierung der Liposomdispersion erhalten wurde. Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurden mit den Liposomformulierungen, welche die Phospholipidderivate der vorliegenden Erfindung enthielten (Formulierungsbeispiele 1 bis 6), FUKs erhalten, welche um 1 oder mehr Größenordnungen größer waren im Vergleich zu den FUKs, welche mit den Liposomen aus Kontrollbeispiel 1 erhalten wurden, welche das Lipidderivat der vorliegenden Erfindung nicht enthielten, oder zu den Liposomen aus Kontrollbeispiel 2, welche nur mit dem Phospholipid-Anteil (DSPE: Distearylphosphatidylethanolamin) des Lipidderivats der vorliegenden Erfindung versetzt waren, und somit wurde klar eine längere Verweildauer im Blut mit den Liposomformulierungen beobachtet, welche die Phospholipidderivate der vorliegenden Erfindung enthielten.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung ist hochgradig sicher für lebende Körper und verwendbar als Tensid, Lösungsvermittler oder Dispergiermittel im Kosmetikbereich und dergleichen. Ferner kann das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung verwendet werden zur Herstellung von Lipidmembran-Strukturen, wie beispielsweise Liposomen, und eine Lipidmembran-Struktur, welche das Phospholipidderivat der vorliegenden Erfindung enthält, vorzugsweise Liposom, ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine höhere Zirkulationsdauer im Blut aufweist.

Claims

Phospholipidderivat, welches ein Phospholipid und ein Copolymer ist, als wesentliche Monomereinheiten enthaltend (A) eine Monomereinheit A, repräsentiert durch die folgende Formel (1), (B) eine Monomereinheit B, repräsentiert durch die folgende Formel (2A) und/oder die folgende Formel (2B), und (C) eine Monomereinheit C, repräsentiert durch die folgende Formel (3):
wobei, in der Formel (1), R¹ und R² unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe repräsentieren, sofern R¹ und R² nicht beide zugleich eine Me thylgruppe repräsentieren; R³ eine zweiwertige Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen repräsentiert; AO unabhängig eine Oxyalkylengruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen repräsentiert; m eine durchschnittliche Molzahl der addierten Oxyalkylengruppen repräsentiert und eine Zahl in einem Bereich ist, der repräsentiert wird durch 4 ≤ m ≤ 100; und R⁴ ein Wasserstoffatom, eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Acylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen repräsentiert; in der Formel (2A) X unabhängig ein Wasserstoffatom, ein Alkalimetallatom, Ammonium oder ein organisches Ammonium repräsentiert; und in der Formel (3) R⁵CO und R⁶CO unabhängig eine Acylgruppe mit 8 bis 24 Kohlenstoffatomen repräsentieren; R⁷ eine zweiwertige Kohlenwasserstoffgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen repräsentiert; X ein Wasserstoffatom, ein Alkalimetallatom, Ammonium oder ein organisches Ammonium repräsentiert; und Y ein Wasserstoffatom, ein Alkalimetallatom, Ammonium oder ein organisches Ammonium repräsentiert, wobei ein Molverhältnis der Monomereinheit A relativ zur Gesamtzahl der Monomereinheit B und der Monomereinheit C von 7/3 bis 3/7 reicht, und die Monomereinheit C in einem Verhältnis von 1 bis 5 mol je 1 mol des Copolymers enthalten ist.
Phospholipidderivat nach Anspruch 1, wobei die Gesamtzahl der Monomereinheit(en) A, der Monomereinheit(en) B und der Monomereinheit(en) C, welche im Copolymer enthalten sind, 3 oder mehr und 150 oder weniger beträgt.
Phospholipidderivat nach Anspruch 1, wobei die Gesamtzahl der Monomereinheit(en) A, der Monomereinheit(en) B und der Monomereinheit(en) C, welche im Copolymer enthalten sind, 5 oder mehr und 50 oder weniger beträgt.
Phospholipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R¹ ein Wasserstoffatom ist, R² ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist und R³ eine Methylengruppe ist.
Phospholipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R⁷ eine Ethylengruppe ist.
Tensid, umfassend das Phospholipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Lipidmembran-Struktur, umfassend das Phospholipidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Lipidmembran-Struktur nach Anspruch 7, welche ein Liposom ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die ein Medikament aufnehmende Lipidmembran-Struktur nach Anspruch 7 oder 8.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Medikament ein Antitumormittel ist.
Verfahren zur Herstellung des Phospholipidderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend den Schritt der Umsetzung eines Copolymers, enthaltend die Monomereinheit A und die Monomereinheit B in einem Molverhältnis von 7/3 bis 3/7, mit einer Verbindung, welche repräsentiert wird durch die folgende Formel (4):
wobei R⁵CO, R⁶CO, R⁷ und Y die gleichen Bedeutungen haben wie oben definiert.