CN1703184A - 利用特异性和选择性的电以及电磁信号调节ⅱ型胶原蛋白的基因表达 - Google Patents

利用特异性和选择性的电以及电磁信号调节ⅱ型胶原蛋白的基因表达 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过在患病关节软骨或关节软骨损伤的治疗中使用由特异性和选择性的电信号和电磁信号产生的特异性和选择性的场调节软骨细胞中II型胶原蛋白基因表达的方法和装置。基因表达是指人基因组(DNA)的特异性部分(基因)被转录为mRNA以及其后被翻译为蛋白的过程的上调或下调。本发明提供的用于靶向治疗损伤或患病的软骨组织的方法和装置包括产生用于II型胶原蛋白基因表达最佳化的特异性和选择性场的特异性和选择性的电信号和电磁信号，以及将软骨组织暴露于由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场来调节此种软骨组织中II型胶原蛋白基因的表达。产生的方法和装置可用于靶向治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤和软骨缺损。

Description

利用特异性和选择性的电以及 电磁信号调节II型胶原蛋白的基因表达
相关申请的交叉引用
本专利申请是美国专利申请297,454的部分继续，所述美国专利申请是于2001年2月23日提交的PCT/US01/05991的国家阶段专利申请，其要求在2000年2月23日提交的美国临时申请60/184,491的优先权。
发明领域
本发明涉及施加由特异性和选择性的电以及电磁信号产生的特异性和选择性电场调节软骨细胞中II型胶原蛋白基因表达的方法用于治疗损伤或者患病的关节软骨，本发明还涉及用于产生这种信号的装置。
背景技术
被认为是存在于各种生物组织和细胞中的生物电相互作用以及活性是中最不被人们所了解的生理学过程之一。
然而，近来出现了许多涉及某些组织和细胞生长和修复的这些相互作用和活性的研究。尤其是，目前已经进行了许多针对电和电磁场刺激及其对骨和软骨生长和修复的作用的研究。研究人员相信这种研究可用于开发若干医药难题的新的治疗方法。
骨关节炎，又名变性性关节病其特征在于关节软骨的变性以及软骨下骨的增殖和重塑。通常的症状是僵硬，限制运动和疼痛。骨关节炎是最普通的关节炎，并且随年龄增长流行率显著增加。研究显示自己声称患有骨关节炎的年长病人访问医生的次数是未患病群的两倍。这种病人与其它年龄群的病人相比也经历了更多天数的限制活动以及卧床。在一项研究中，大多数有症状的病人在随后的8年周期中明显丧失了行动能力。
MASSARDO等人，ANN RHEUM DIS 48：893-7(1989)。非胆固醇抗炎药物(NSAIDs)保持了骨关节炎的初级治疗状态。不知道NSAIDs的效力是否依赖于其止痛或者抗炎特性或者软骨退化过程的减缓。还有需要关心的是NSAIDs可能对病人有害。例如，NSAIDs对胃，肠道，肝脏以及肾具有公知的毒性。然而，乙酰水杨酸抑制动物蛋白多糖的合成以及正常软骨的修复过程。针对人的一项研究显示抗炎吲哚酸(indomethacin)可以加速臀软骨的分解。所有的副作用在老年人-对骨关节炎最敏感的人群中出现的更普遍。
通称骨质疏松症的疾病中，骨流失矿物质变得异常疏松。骨包括有机组分的细胞和基质以及无机或者矿物成分。细胞和基质包含掺入了磷酸钙(85％)和碳酸钙(10％)的矿物成分的胶原纤维骨架，所述磷酸钙和碳酸钙的矿物成分给骨赋予了硬性。虽然骨质疏松症通常被人为是折磨老年人，某些类型的骨质疏松症可能影响骨并未经受机能性应力的所有年龄的人。在此情况下，在延长的固定期间，病人可能经受皮层和松质骨的显著损失。
年长病人由于骨折后固定物的拆除经受的骨损失，可能最终导致已骨质疏松骨架的继发性骨折。减小的骨密度可能导致脊椎塌陷，臀部，下臂，手腕，踝骨折以及不适的疼痛。需要其它用于这种疾病的非外科治疗方法。
脉冲电磁场(PEMF)以及电容耦合(CC)已经在1979年获得食品药物管理局的批准被广泛用于治疗非愈合性骨折以及骨愈合中的相关难题。用于这种治疗形式试验的最初基础是观察到骨上的物理学应力引起很少电流的出现，所述电流连同机械应力被人为是将物理学应力转化成促进骨形成信号的机制。
连同成功治疗骨折不愈合的直接电场刺激，利用PEMF以及电容耦合(其中将电极置于治疗区域的皮肤上)的非侵害技术也是有效的。脉冲电磁场在高度传导性细胞外液中产生较小的诱导电流(法拉弟电流)，而电容耦合直接在组织中产生电流；PEMFs和CC均由此模拟内源性电流。
最初被人为是归因于骨中晶体表面发生的现象的内源性电流，已经被证明是主要源于含有电解质的液体在含有有机的骨腔中的运动；带有固定负电荷的组分产生通常所说的“流动电位。”对软骨电学现象的研究已经证明了类似于描述于骨中所存在的机械-电转换机制，即当软骨被机械压缩时，液体和电解质在蛋白多糖和软骨基质的胶原蛋白中的固定负电荷表面的运动。这些流动电位显然在软骨中起到了与骨中类似的作用，并且连同机械应力，引起能够激发软骨细胞合成基质成分的信号转导。
直流，电容耦合和PEMFs的主要用途是不fusions.还有报告...的情况增加物的外周神经再生与作用和促进的血管生成巴塞特，生物测定6：36-42(1987)骨折fusions.还有报告...的情况增加物的外周神经再生与作用和促进的血管生成巴塞特，生物测定6：36-42(1987)的矫形术(Brighton等人，J.Bone and Joint Surgery，63：2-13，1981；Brightonand Pollack，J.Bone and Joint Surgery，67：577-585，1985；Bassett等人，Crit.Rev.BIOMED.ENG.17：451-529(1989)；巴塞特等人，JAM4247：623-8(1982)。临床反应已经报道了成人臀部的无血管形成性坏死以及儿童的Legg-骨软骨炎，Bassett等人，Clin Orthop 246：172-6(1989)；Aaron等人，Clin ORTHOP 249：209-18(1989)；Harrison等，JPediatr ORTHOP 4：579-84(1984)。同样已经显示PEMFs(Mooney，Spine，15：708-712，1990)以及电容耦合(Goodwin，Brighton等人，Spine，24：1349-1356，1999)可以显著地增加腰愈合的成功率。而且还有报道外周神经再生和血管生成的功能和促进，Bassett，Bioassays 6：36-42(1987)。用持续的旋转器CUFFTENDINITIS耐熔质类固醇注射液及其他传统的方法治疗的病人显示出比安慰剂治疗的病人显著的疗效。
Binder等人，Lancet 695-8(1984)。最后，Brighton等人已经显示了电容耦合电场对大鼠具有预防以及逆转脊柱腰段脊椎骨质疏松症的作用(Brighton等人，J.ORTHOP.Res.6：676-684，1988；Brighton等人，J.Bone and Joint Surgery，71：228-236，1989)。
最近，在这个领域的研究已经集中在对组织以及细胞的刺激效果。例如，已经推测出直流电不能穿透细胞膜而且通过细胞外基质分化实现了控制。
Grodzinsky，Crit.Rev.Biomed.Engng 9：133(1983)。与直流电相反，已有报道PEMFs可以穿透细胞膜并且激发它们或者直接影响胞内细胞器。PEMFs对细胞外基质以及体内软骨内骨化的影响研究发现软骨分子合成的增加以及骨小梁的成熟。Aaron等人，J.Bone Miner.Res.4：227-233(1989)。最近，Lorich，Brighton等人报告(Clin Orthopand Related Research 350：246-256，1998)电容偶联的电信号是通过电压门控的钙通道进行信号转导，导致胞质钙的增加，随后活化的(细胞骨架)钙调蛋白的增加。
许多研究针对组织培养的研究以便了解应答的机制。在一项研究中，人们发现电场增加了-掺入软骨细胞DNA的胸苷，从而证明由电刺激产生的Na以及Ca2+流引发DNA合成。Rodan等人，Science 199：690-692(1978)。研究发现第二信使cAMP的改变以及细胞骨架重排是由于电perturbations，Ryaby等人，Trans.BRAGS 6：(1986)；Jones等人，Trans.BRAGS 6：51(1986)；Brighton以及Townsend，J Orthop.Res.6：552-558，1988。其它研究已经发现了对氨基多糖，硫酸化，透明质酸，溶菌酶活性以及多肽序列的作用。Norton等人，J.Orthop.Res.6：685-689(1988)；GOODMAN等人，Proc.Natn.Acad.Sci.USA85：3928-3932(1988)。
本申请发明人在1996年报道了在培养的MC3T3-E1骨细胞中施加周期性双向0.17％机械压力导致TGF-β1 mRNA的显著增加。Brighton等，Biochem.Biophys.Res.Commun.229：449-453(1996).1997之后开展了一些重要的研究。在一个研究中据报导相同的周期性双向的0.17％机械压力使得PDGF-A mRNA在类似的骨细胞中产生了显著的增加。BRIGHTON等，BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.43：339-346(1997)。同样据报道60kHz的电容偶联的20mV/cm电场类似骨细胞中的TGF-β1产生了显著的增加。Brighton等，Biochem.Biophys.Res.Commun.237：225-229(1997)。然而，此种场对其它基因的作用在文献中没有报道。
上述引用的母专利申请，名为“通过特异性和选择性的电以及电磁信号的应用对基因的调控”，测定用于产生调节病态或损伤组织的靶基因的特异性和选择性的场的特异性和选择性电的和电磁信号的方法已被公开。本发明基于调节靶基因表达也即II型胶原蛋白基因表达的方法，通过应用由特异性和选择性的电和电磁信号产生的特异性和选择性的场，用于治疗软骨疾病(关节炎)、软骨损伤和软骨缺损。
发明概述
本发明涉及通过应用由特异性和选择性的电的和/或电磁信号产生的特异性和选择性的场调节软骨细胞中II型胶原蛋白基因的表达。通过运行电场工作时间、振幅、频率和占空度的剂量反应曲线，发现了上调节关节软骨软骨细胞中II型胶原蛋白mRNA的最佳信号。最佳信号产生具有20mV/cm振幅，30分钟持续时间，8.3％占空度(1分钟ON，11分钟OFF，30个循环)，60kHz频率以及正弦波波形的电容偶联电场。具体地，本发明涉及通过施加由这种信号产生的场上调节软骨细胞中II型胶原蛋白基因的表达。
在本发明的一个优选的实施方案中，所提供的方法利用电容偶联的电场、电磁场或复合的场特异性和选择性地上调节II型胶原蛋白mRNA的基因表达。用引起II型胶原蛋白mRNA上调节的具有约30分钟的电场工作时间、约60kHz的频率、约8.3％的占空度以及正弦波波形的约20mV/cm的电容偶联电场治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤、软骨缺损等。根据本发明的方法，“特异性和选择性的”信号为具有上调节II型胶原蛋白基因(特异性)表达预先确定的振幅、工作时间、负载循环、频率和波形的信号。这些允许选择不同的信号上调节II型胶原蛋白基因表达来实现生物学的或治疗性的应答(选择性)。本发明进一步地涉及利用在这里描述的方法来产生特异性和选择性的信号的装置，所述信号产生特异性和选择性的场来上调节II型胶原蛋白基因的表达。
在相关的方面，本发明涉及治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤和软骨缺损的方法和装置。本发明的方法同样也包括通过系统地改变已知增加或怀疑增加II型胶原蛋白产生细胞的起动信号的持续时间，来测定对II型胶原蛋白基因“特异性和选择性”的信号的方法。选择最佳持续时间之后，信号的振幅被改变至通过II型胶原蛋白基因表达测定的时间的最佳持续时间。当保持另一信号特征恒定时，占空度、频率和波形被系统地改变。重复这些过程直至测定出II型胶原蛋白的表达产生出最大的增加。
本领域的技术人员将能够理解II型胶原蛋白基因表达是暴露于各种电的和电磁信号的软骨细胞中聚集蛋白聚糖基因表达的功能性补充或协同作用。调节聚集蛋白聚糖基因表达的特异性和选择性的信号描述在本发明人的共同悬而未决的US专利申请NO.中。本发明的这些及其它方面将在下文的发明详述中说明。
附图的简要说明
本发明通过结合附图进行如下的发明详细说明更加直观，其中：
图1是当关节软骨的软骨细胞暴露于20mV/cm电容偶联电场不同的持续时间时，II型胶原蛋白mRNA表达的图示。如所显示的，最佳的II型胶原蛋白mRNA产生发生在30分钟持续时间的信号处。
图2是当关节软骨的软骨细胞暴露于20mV/cm电容耦合场30分钟时，II型胶原蛋白mRNA表达的图示。不同的应答时间之后，II型胶原蛋白mRNA的产生量-如与对照的相比(无电流)-被显示。同样如所显示的，最佳的II型胶原蛋白mRNA产生发生在电刺激停止后5.5小时。
图3是当暴露于不同振幅的电容偶联电场30分钟持续时间并且在电刺激停止后5.5小时时收集的关节软骨软骨细胞中II型胶原蛋白mRNA表达的图示。如所显示的，II型胶原蛋白mRNA的最佳产生量发生在产生20mV/cm电场振幅的信号处。
图4是当暴露于20mV/cm电容偶联电场30分钟持续时间并在电信号停止后5.5小时时收集的关节软骨细胞的II型胶原蛋白表达(白条带)以及II型胶原蛋白mRNA表达(暗条带)的Northern印迹分析的图示。如所显示的，II型胶原蛋白mRNA的Northern印迹分析比未刺激对照的大3.5倍，且通过RT-PCR测定的II型胶原蛋白mRNA的量比未刺激对照的大6.5倍。
图5是暴露于在20mV/cm电场振幅具有30分钟ON持续时间的不同占空度的电容偶联电场并在电信号停止后5.5小时收集的关节软骨软骨细胞的II型胶原蛋白mRNA表达的图示。如所显示的，最佳的占空度被发现为8.3％(1分钟ON，11分钟OFF，30循环)。
图6是暴露于在具有8.3％占空度(1分钟ON，11分钟OFF，30循环)的20mV/cm电场振幅的30分钟持续时间(ON)的不同频率电容偶联电场并在电信号停止后5.5小时收集的关节软骨软骨细胞的II型胶原蛋白mRNA表达的图示。如所显示的，最佳的频率为60KHZ。
图7为关节软骨软骨细胞在培养基中培养7天然后暴露于20mV/cm电容偶联电场的生长图示，其中电场具有50％占空度(1分钟ON，1分钟OFF，30个循环)，60kHz的频率以及具有正弦波波形。软骨细胞暴露于此种场每天1小时持续7天。对照软骨细胞在相同的条件下生长但不暴露于任何的电刺激。无白介素-1β(IL-1β)，一种刺激关节软骨分解的细胞因子，存在于这些培养的培养基中。如所显示的，羟基脯氨酸是一种作为胶原蛋白特征成分的氨基酸。当与不暴露于电场的对照软骨细胞相比时，暴露于电场的软骨细胞的羟基脯氨酸增加1.7-倍。
图8为关节软骨软骨细胞在培养基中培养7天然后暴露于20mV/cm电容偶联电场的生长图示，其中电场具有50％占空度(1分钟ON，1分钟OFF，30个循环)，60kHz的频率以及具有正弦波波形。白介素-1β(10ng/ml)在第7天被添加到培养基中。软骨细胞然后暴露于此种场每天1小时持续7天。对照软骨细胞在培养基中具有白介素的相同条件下生长但不暴露于任何的电刺激。如所显示的，当暴露于电场时，尽管在培养基中存在白介素，但与不暴露于电场的对照培养相比，羟基脯氨酸仍然显示出1.4-倍的增加。
图9显示了本发明的用于治疗膝骨关节炎患者的装置。
本发明优选实施方案的具体描述
下面结合图1-9对本发明进行详细的描述。本领域技术人员应能理解在这里关于图的描述仅仅用于实例性的目的且并非对本发明范围的限定。本发明范围涉及的所有问题均可通过所附的权利要求进行解决。
本发明是基于发现某些特定基因的表达可通过施加由特异性和选择性的电的和/或电磁信号产生的特异性和选择性的场进行调节。换句话说，本发明人已发现了特异性和选择性的电的和/或电磁信号其产生用于调节骨、软骨及其它组织细胞中各基因的特异性和选择性的场，且这些场能够特异性地和选择性地调节此类细胞中的基因。特别地，支配组织或细胞的生长、维持、修复和变异或老化的基因表达可根据本发明通过施加特异性和选择性电的和/或电磁信号产生的特异性和选择性的场来产生有益的临床作用进行调节。此种发现在治疗方法的靶向特定的医学病症的治疗方法以及施用这种方法的装置的改进中是有用的，所述病症包括骨折和缺损、骨关节炎、骨质疏松症、癌症及其它疾病。
尤其是，本发明证明了II型胶原蛋白的表达可显著地上调节来增加关节软骨中胶原蛋白的产生量。II型胶原蛋白与聚集蛋白聚糖是关节软骨的主要组分，其在关节炎发展的早期被损害和/或降解。本发明清楚地表明在这里描述的最佳电场可显著地上调节II型胶原蛋白mRNA且，因此，增加II型胶原蛋白的合成，甚至在IL-1β存在的情况下。本领域技术人员可以理解合适的电场，如在这里描述的任意具有相同效果的电容耦合电场以及所有的场应用技术，可用于治疗关节炎(骨关节炎和类风湿性关节炎二者)、软骨损伤以及软骨缺损。
如在这里所使用的，术语“信号”是指各种信号包括通过装置输出的机械信号，超声波信号，电磁信号以及电信号。术语“场”应被理解为是指靶组织内的电场，无论其是复合的场或脉冲的电磁场或通过直流电，电容耦合或感应作用产生的场。
术语“遥控的”是指从远距离实施，被实施或控制。
“遥控”调控是指从远距离控制基因的表达。“远距离”提供是指从远方提供。例如，从远距离电源提供特异性和选择性信号是指由在远距离的来源或由体内或体外的来源提供信号到组织或细胞。
术语“特异性和选择性的”信号是指产生特异性和选择性电场的信号，所述电场具有预定的振幅、工作时间、负载循环、频率和波形，其上调节或下调节靶基因或靶向功能性的互补基因(特异性)。这些允许选择不同的“特异性和选择性的”信号来上调节或下调节不同的基因表达来实现生物学的或治疗性应答(选择性)。
术语“调节”是指控制基因表达。调节被理解为包括上调节和下调节。上调节是指增加基因的表达，而下调节是指抑制或阻止基因的表达。
“功能性互补”是指两个或更多基因其在一个所给细胞或组织中的表达是互补的或协同的。
“组织”是指细胞与其患者的形成结构原料的细胞外物质的集合。此处所述的术语“组织”意欲包括肌肉和器官组织以及骨或软骨组织。同样，在这里所用的术语“组织”也可指个体细胞。
“患者”是指动物，优选地为哺乳动物，更优选地为人。
本发明提供了靶向特定组织、细胞或疾病的治疗方法与装置。尤其是，与损伤的或疾病组织或细胞的修复过程有关的基因表达可通过施加由电信号产生的特异性和选择性的场被调节，也即特异性和选择性地调节靶组织或细胞中的基因。基因表达可通过施加对各基因或各系列的互补基因特异性和选择性的信号被上调节或下调节来产生有益的临床作用。例如，特定的特异性和选择性的信号可产生特异性和选择性的电场其上调节特定的所期望的基因表达，而相同的或另外的特定特异性和选择性信号可产生下调节特定不期望的基因表达的特异性和选择性的电场。特定的基因可通过由特定的特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场上调节以及通过由另外的特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场下调节。本领域技术人员应能理解特定的病态或损伤组织可通过调节其支配组织生长、维持、修复以及变异或老化的基因被靶向治疗。
本发明的方法和装置基于确定产生对与特定靶向的病态或损伤组织有关的基因表达特异性和选择性的场的信号。例如，通过改变应用于各所选基因的特异性和选择性场的频率、振幅、波形或占空度，不同形式(例如，电容耦合，电感耦合，复合场)中的电流可特异性和选择性地调节患者靶组织或细胞中的基因表达。暴露于电流的持续时间还影响电流特异性和选择性调节患者体内靶组织或细胞中的基因表达的能力。特异性和选择性信号可产生特异性和选择性的电场来系统地施加于各基因直到发现提供对基因表达的预期效果的适当的频率、振幅、波形、占空度和持续时间的组合。
可以理解各种各样的患病或损伤组织或疾病状态可被靶向治疗，因为电场对于特定基因表达的特异性和选择性受一些因素的影响。具体地，合适频率、振幅、波形和/或占空度的电场可以是对于特定基因的表达是特异性和选择性的且因此被提供用于靶向治疗。临时的因素(例如，暴露于电场的持续时间)也影响用于特定基因表达的电场的特异性和选择性。通过应用特定持续时间的特异性和选择性电场，基因表达的调控可以是更有效的(或成为可能)。因此，本领域技术人员应能理解改变本发明电场的频率、振幅、波形、占空度和/或应用的持续时间直到电场对于特定基因表达是特异性和选择性的，以便用于靶向治疗各种病态的或损伤的组织或疾病。
因此，本发明可用于靶向治疗，因为通过施加由具有合适的频率、振幅、波形和/或占空度的特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场合适的持续时间来调节与特定的病态或损伤组织有关的特定基因的表达是有可能的。产生特异性和选择性电场治疗特异性和选择性信号可因此被影响来调节特定基因的表达从而靶向用于治疗的特定病态或损伤组织或疾病。特别地，本发明提供了对于骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤和软骨缺损的的靶向治疗。
本发明也提供了包括至少一个对于II型胶原蛋白特异性和选择性的信号的来源的装置。本发明的装置可被提供来产生施加于软骨细胞的此种信号，其至少一个电极适用于由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场。尤其是，在这里描述的最佳场可通过合适的表面电极，两个或更多，成对地或条状，与服装、托板、覆盖物或脱落物混合，并通过电容耦合、电感耦合(电磁场)或复合场输送，被用于任意的关节。
本发明的装置能够将由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场直接应用于患者的病态或损伤组织和/或皮肤。本发明的装置也可遥控施加特异性和选择性的场(例如，施加与病态的或损伤组织有一段距离的场)，尽管可以理解电容偶联装置必须接触受试者的皮肤。本发明的装置可包括将电极连接于患者身体的损伤或患病组织附近的方式。
例如，自我粘附的传导电极可被附着于如图9所示的骨关节炎患者膝关节两侧的皮肤。同样如图9所示，本发明的装置10可包括用于将装置10连接于患者身体的自我粘附的电极12。例如，本发明的装置10可包括附着于动力单元14的电极12，所述动力单元14在内层具有VELCRO补片16使得动力单元14可合适地环绕患者的小腿、大腿或腰附着于VELCRO搭接片(未显示)。
本发明的装置10可用于各种各样的方式。装置10可以是便携式的或可以是暂时或永久地附着于患者的身体。本发明的装置10优选地是非-植入式的。例如，本发明的装置10可通过施加适于与患者皮肤接触电极应用于患者的皮肤来施加由预定的特异性和选择性信号产生特异性和选择性的场。此种信号也可以通过盘管被应用，其中电流随时间变化，从而产生穿透组织的特异性和选择性的电磁场。本发明的装置10同样也能够被植入患者体内，包括移植在患者皮肤的下面。
下面的实施例将进一步说明本发明的方法可用于软骨生长和修复。软骨生长和修复可通过对于软骨细胞中II型胶原蛋白的表达调控特异性和选择性的信号进行刺激来刺激骨关节炎患者的关节软骨修复。尤其是，本发明的方法可上-调控修复软骨的II型胶原蛋白基因的上-调控。各种各样的软骨细胞可通过本发明的方法被靶向，包括关节软骨细胞以及包括关节软骨、透明软骨和生长板软骨。
下面的实施例进一步说明本发明方法用于调控关节软骨细胞中的基因表达。例如，在下列的实施例中，胎儿关节的软骨细胞已经暴露于电容偶联的20mV/cm的60kHz电场0.5、2.0、6.0和24.0小时。在激活仅仅0.5小时后，发现了统计上显著的35SO4/ug DNA的结合(表示显著的蛋白多糖合成)。重复相同的实验并监视II型胶原蛋白mRNA的水平，其中II型胶原蛋白mRNA是主要软骨蛋白多糖的信使。
电刺激仅仅0.5小时后，II型胶原蛋白mRNA显示出显著的增加。因此，临时的因素可能影响产生用于调节关节软骨细胞中基因表达的特异性和选择性电场的信号的特异性和选择性。
本领域技术人员应能理解其它的软骨疾病和损伤可通过本发明的方法被靶向治疗。
本领域技术人员进一步地应能理解本发明的装置可为各种各样的形式包括具有程序多重转换特异性和选择性信号用于一对或多对电极的电容耦合功率单元，附着于具有可换向的多重特异性和选择性信号的动力单元的电磁线圈，以及具有用于产生特异性和选择性信号的电源的超声波激发器。一般而言，装置的选择基于患者接受性和患者符合性。目前本领域最小的和最便携的装置为电容耦合单元；然而，具有极端敏感皮肤的病人可能喜欢使用电感耦合单位。另一方面，超声波单元要求大多数的患者配合但是对于特定的病人而言是可取的。
实施例
本发明在下文实施例中被证明，其用于例证的目的且不应被理解为对本发明范围的限制。
材料和方法
由胎儿牛关节软骨制备软骨细胞培养物。
软骨细胞(5×105细胞/cm2)被铺板在特定修饰的Cooper平皿上。细胞被培养生长七天时间，且仅仅在试验条件开始前改变培养基。实验的细胞培养物在这些研究的自始至终被施加具有44.81伏峰一峰值输出的电容偶联的60kHz正弦波信号电场。这些在具有300μA/cm2电流密度的20mV/cm平皿的培养基中产生预计的-场强度。对照的细胞培养皿与已刺激的平皿中的相同，只是电极没有连接到功能发生器。
利用TRIzol按照生产商的说明分离总RNA，以及利用SuperScriptII逆转录酶进行逆转录。
用于竞争性PCR方法的寡核苷酸引物选自公开的cDNA序列。利用ScionImage软件进行PCR产物的定量分析。
目的基因调节的最佳信号被系统地发现如下。已知增加(或甚至仅仅怀疑增加)所给蛋白的胞内产量的电信号被作为起始信号用于测定产生调节所述蛋白的基因表达(mRNA)的特异性和选择性的场的特异性信号。首先通过当保持所有的其它信号特性(振幅、负载循环、频率和波形)恒定时改变信号的工作时间运行剂量反应曲线(图1)。这样测定了用于蛋白基因表达的起始信号的最佳工作时间。通过在最佳工作时间改变场的振幅(图3)运行第二剂量反应曲线。这些测定了通过目的蛋白的基因表达测定的最佳工作时间时最佳的场振幅。然后运行第三剂量反应曲线，这次将负载循环从100％(恒定)改变为5％或更少，而同时保持最佳的振幅及其它信号特征不变(图5)。重复的第四次剂量-反应(改变频率)(图6)，保持其它的信号特征不变。尽管未显示，剂量反应可以重复第五次(改变波形)，每次均保持其它的信号特征不变。通过此方法测定出产生目的蛋白基因表达的最大增加的最佳信号。
基因表达可以通过本领域任意已知的方法进行测定，诸如逆转录PCR和Northern分析，且蛋白表达可以通过分光光度法、荧光测定、免疫测定等进行测定。
通过关节软骨细胞产生II型胶原蛋白
关节软骨细胞暴露于60kHz的20mV/cm电容偶联电场。结果显示于图1-8中。
图1是当关节软骨软骨细胞(attomole/μl)暴露于20mV/cm电容偶联电场不同的持续时间(0.5，2，6，和24小时)时，II型胶原蛋白mRNA表达的图示。如所显示的，最佳的II型胶原蛋白mRNA产生发生在30分钟持续时间信号处。
图2是当关节软骨的软骨细胞(attomole/μl)暴露于20mV/cm电容耦合场30分钟时，II型胶原蛋白mRNA表达的图示。II型胶原蛋白mRNA在不同的应答时间后产生的量-如与对照的相比(无电流)-被显示。同样如所显示的，最佳的II型胶原蛋白mRNA产生发生在电刺激停止后5.5小时。
图3是当暴露于不同振幅的电容偶联电场30分钟持续时间并且在电刺激停止后5.5小时时收集的关节软骨软骨细胞中II型胶原蛋白mRNA表达的图示。如所显示的，II型胶原蛋白mRNA的最佳产生量发生在产生20mV/cm电场振幅的信号处。通过比较，建立用于聚集蛋白聚糖mRNA的最佳振幅已由本发明人发现为10-20mV/cm。
图4是当暴露于20mV/cm电容偶联电场30分钟持续时间并在电信号停止后5.5小时时收集的关节软骨细胞中II型胶原蛋白表达(白条带)以及II型胶原蛋白mRNA表达(暗条带)的Northern印迹分析的图示。如所显示的，II型胶原蛋白mRNA的Northern印迹分析比未刺激对照的大3.5倍，且通过RT-PCR测定的II型胶原蛋白mRNA的量比未刺激对照的大6.5倍。
图5是暴露于在20mV/cm电场振幅具有30分钟ON持续时间的不同占空度的电容偶联电场并在电信号停止后5.5小时收集的关节软骨软骨细胞的II型胶原蛋白mRNA表达的图示。如所显示的，最佳的占空度被发现为8.3％(1分钟ON，11分钟OFF，30循环)。通过比较，本发明人发现聚集蛋白聚糖mRNA表达的最佳占空度为50％(1分钟ON，11分钟OFF，30个循环)。
图6是暴露于在具有8.3％占空度(1分钟ON，11分钟OFF，30循环)的20mV/cm电场振幅的30分钟持续时间(ON)的不同频率电容偶联电场并在电信号停止后5.5小时收集的关节软骨软骨细胞的II型胶原蛋白mRNA表达的图示。如所显示的，最佳的频率为60KHZ。
图7为关节软骨软骨细胞在培养基中培养7天然后暴露于20mV/cm电容偶联电场生长的图示，其中电场具有50％占空度(1分钟ON，1分钟OFF，30个循环)，60kHz的频率以及具有正弦波波形。软骨细胞暴露于此种场每天1小时持续7天。对照软骨细胞在相同的条件下生长但不暴露于任何的电刺激。白介素-1β(IL-1β)，一种刺激关节软骨分解的细胞因子，不存在于这些培养的培养基中。如所显示的，羟基脯氨酸是一种作为胶原蛋白特征成分的氨基酸。当与不暴露于电场的对照软骨细胞相比时，暴露于电场的软骨细胞的羟基脯氨酸增加1.7-倍。本领域技术人员应能理解由于在这些实验中使用的占空度(50％)不是II型胶原蛋白的最佳的占空度(参见图5)，则更大的应答被预期使用最佳的占空度(8.3％)。
图8为关节软骨软骨细胞在培养基中培养7天然后暴露于20mV/cm电容偶联电场生长的图示，其中电场具有50％占空度(1分钟ON，1分钟OFF，30个循环)，60kHz的频率以及具有正弦波波形。白介素-1β(10ng/ml)在第7天被添加到培养基中。软骨细胞然后暴露于此种场1小时/天持续7天时间。对照软骨细胞在培养基中具有白介素的相同条件下生长但不暴露于任何的电刺激。如所显示的，当暴露于电场时，尽管在培养基中存在白介素，但与不暴露于电场的对照培养相比，羟基脯氨酸仍然显示出1.4-倍的增加。
本领域技术人员应能理解由于在这些实验中使用的占空度(50％)不是II型胶原蛋白的最佳的占空度(参见图5)，则更大的应答被预期使用最佳的占空度(8.3％)。
图9显示了本发明的用于治疗具有膝骨关节炎的患者的装置。如所图示的，两个圆形的，温和传导的，自我附着的电极12被在结合线水平置于膝两侧的皮肤上。电极12连接于动力单元14，所述动力单元14在内层具有VELCRO补片16使得动力单元14可合适地环绕患者的小腿、大腿或腰附着于VELCRO搭接片(未显示)。电极12可在患者晚上上床之前或任意其它方便的时侯置于皮肤上。当然，其它合适类型的电极12也可被使用。
动力单元14优选地为小的(例如，6-8盎司)和标准的9-伏电池功率以发射5伏峰-峰，6-10mAmp，20mV/cm，60kHz正弦波信号到置于皮肤上的电极12。当此信号被以适当的占空度(8.3％)每天提供大约30分钟时，其已经显示出显著地上调节II型胶原蛋白编码基因。此种治疗将阻止或最小化进一步的关节软骨老化以及治愈已经损伤或恶化的关节软骨。
上面描述的实施例证明了II型胶原蛋白基因的表达可被显著地上调节来增加关节软骨中蛋白多糖的产量从而治疗关节炎(骨关节炎和类风湿性关节炎)、软骨损伤和软骨缺损。蛋白多糖与聚集蛋白聚糖是关节软骨的主要组分，其在关节炎发展的早期被侵蚀和破坏。本发明清楚地表明实施例中描述的最佳电场可非常显著地上调节II型胶原蛋白mRNA且，因此增加蛋白多糖合成，甚至在IL-β1存在的情况下。本领域技术人员应能理解合适的电场，如在这里描述的具有电容耦合的电场，与任意的和所有的产生相同或几乎相同的电场特征的电磁系统是等效的。本领域技术人员也应能够理解更多列举的信号特征可通过更多试验与更多的数据点被发现，但是每一信号特征中相对较少的变化被认为在本领域技术人员在这里所述教导的水平内。
本领域的技术人员也应能理解大量的对本发明的改变可能在本发明的范围内。例如，在这里描述的最佳场可通过合适的表面电极，两个或更多，成对地或条状，与服装、托板、覆盖物或脱落物混合，并通过电容耦合、电感耦合(电磁场)或复合场输送，被用于任意的关节。
因此，本发明的范围不但不局限于上面描述的优选实施方案，而且不局限于所附的权利要求。

Claims (24)

1.一种特异性和选择性上调节软骨组织中II型胶原蛋白mRNA的基因表达的方法，包括下列步骤：
产生至少一种基本上使上调节II型胶原蛋白mRNA基因表达最佳化的特异性和选择性信号；以及
以预定的时间间隔将软骨组织暴露于由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场预定的持续时间来上调节II型胶原蛋白mRNA的基因表达。
2.根据权利要求1的方法，其中产生步骤包括下列步骤：选择性改变特异性和选择性信号的振幅、持续时间、占空度、频率和波形直到软骨组织中II型胶原蛋白mRNA的基因表达基本上最佳化。
3.根据权利要求1的方法，其中暴露步骤包括下列步骤：以预定的每天一次的时间间隔将关节软骨的软骨细胞暴露于由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场预定的持续时间。
4.根据权利要求1的方法，其中所述产生步骤包括在远距离电源产生特异性和选择性信号的步骤并且所述暴露步骤包括将由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性场应用于软骨组织的步骤。
5.根据权利要求4的方法，其中暴露步骤包括将特异性和选择性信号应用于位于软骨组织附近电极的步骤。
6.根据权利要求5的方法，其中暴露步骤包括通过电容耦合和电感耦合中的一种将由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性场应用于软骨组织的步骤。
7.根据权利要求6的方法，其中特异性和选择性信号使得电极产生电容耦合电场、电磁场和复合场中的一种。
8.一种治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤和软骨缺损中至少一种的方法，包括下列步骤：
产生至少一种上调节II型胶原蛋白mRNA的基因表达的特异性和选择性信号；和
以预定的时间间隔将软骨组织暴露于由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场预定的持续时间来选择性上调节II型胶原蛋白mRNA的基因表达。
9.根据权利要求8的方法，其中暴露步骤包括将特异性和选择性场电容偶联于软骨组织的步骤。
10.根据权利要求8的方法，其中暴露步骤包括将电磁场和复合场中的一种应用于软骨组织的步骤。
11.根据权利要求8的方法，其中产生步骤包括产生具有大约20mV/cm振幅、正弦波波形、大约1/12的占空度和大约60kHz的频率的特异性和选择性电场的步骤。
12.根据权利要求11的方法，其中暴露步骤包括将特异性和选择性电场每24小时应用于软骨组织大约30分钟持续时间的步骤。
13.根据权利要求8的方法，其中产生步骤包括下列步骤：选择性改变特异性和选择性信号的振幅、持续时间、占空度、频率和波形直到由所产生的场对软骨组织中II型胶原蛋白mRNA基因表达的上调节基本上最佳化。
14.根据权利要求13的方法，其中暴露步骤包括通过电容耦合和电感耦合中的一种将由特异性和选择性信号产生的特异性和选择性的场应用于软骨组织的步骤。
15.根据权利要求14的方法，其中特异性和选择性信号使得电极产生电容耦合电场、电磁场和复合场中的一种。
16.一种治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤和软骨缺损中至少一种的装置，含有提供至少一种信号的信号源，所述信号产生特异性和选择性上调节II型胶原蛋白mRNA基因表达的场，以及连接于信号源的电极，所述信号源以预定间隔接收所述的至少一种特异性和选择性信号用于将场施加到软骨组织预定的持续时间从而选择性上调节所述软骨组织中II型胶原蛋白mRNA的基因表达。
17.根据权利要求16的装置，进一步含有驱动所述信号源的便携式动力单元。
18.根据权利要求16的装置，进一步包括将电极连接于软骨组织附近的患者身体的设备。
19.根据权利要求16的装置，进一步包括将信号源连接于患者身体的设备。
20.根据权利要求16的装置，其中由所述至少一种特异性和选择性信号产生的场通过电容耦合和电感耦合中的一种施加于所述软骨组织。
21.根据权利要求20的装置，其中特异性和选择性信号具有正弦波波形并在60kHz产生具有约20mV/cm振幅以及约1/12的占空度的特异性和选择性的电场。
22.一种治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤和软骨缺损中至少一种的方法，包括将软骨组织暴露于由权利要求21的装置产生的特异性和选择性场从而上调节软骨组织中II型胶原蛋白mRNA表达的步骤。
23.一种检测产生上调节II型胶原蛋白的特异性和选择性电场的选择性信号的方法，包括下列步骤：选择已知增加或可能影响II型胶原蛋白的胞内生成的起始信号，选择性地改变施加所述起始信号的持续时间直到发现提供II型胶原蛋白最佳产量的最佳持续时间，改变在最佳持续时间的起始信号的振幅直到发现II型胶原蛋白的最佳产量，以及改变信号的占空度直到发现II型胶原蛋白的最佳产量。
24.根据权利要求23的方法，进一步包括下列步骤：选择性地改变所述信号的频率和波形，保持其它信号特征不变直到发现II型胶原蛋白基因表达的最大增加。
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