KR20050056233A - 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호를 사용한,제ⅱ형 콜라겐 유전자 발현의 조절 - Google Patents

특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호를 사용한,제ⅱ형 콜라겐 유전자 발현의 조절 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질환에 걸렸거나 손상된 관절 연골을 치료하는데 있어서 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 인가함으로써 연골 세포에서의 제II형 콜라겐 유전자 발현을 조절하는 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다. 유전자 발현은 인간 게놈(DNA)의 특정 부분(유전자)이 mRNA로 전사된 후에 단백질로 번역되는 과정의 상향 조절 또는 하향 조절을 의미한다. 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 유전자 발현에 대해 최적화된 특이적이고 선택적인 장을 발생시키는 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호를 발생시키는 단계 및 상기 연골 조직을 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장에 노출시켜 이러한 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 유전자 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 손상되거나 질환에 걸린 연골 조직에서의 표적화된 치료를 위한 방법 및 이를 위한 장치가 제공된다. 본 발명에 따른 방법 및 장치는 골관절염, 류마티스성 관절염, 연골 손상 및 연골 결함의 표적화된 치료에 유용하다.

Description

특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호를 사용한, 제Ⅱ형 콜라겐 유전자 발현의 조절 {Regulation of Type II Collagen Gene Expression Using Specific and Selective Electrical and Electromagnetic Signals}
본 발명은 손상되거나 질환에 걸린 관절 연골을 치료하기 위해서 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 인가하여 연골 세포에서 제II형 콜라겐 유전자 발현을 조절하는 방법 및 이러한 신호 발생 장치에 관한 것이다.
다양한 생물학적 조직 및 세포에 존재하는 것으로 여겨지는 생체전기 상호작용 및 활성은 가장 적게 이해되고 있는 생리적 과정 중 하나이다. 그러나, 최근에는 특정 조직 및 세포의 성장 및 복구에 대한 상기 상호작용 및 활성이 많이 연구되어 왔다. 특히, 전기장 및 전자기장에 의한 자극 및 골 및 연골의 성장 및 복구에 미치는 그의 효과가 많이 연구되어 왔다. 연구자들은 이러한 연구가 다양한 의학적 문제들에 대한 새로운 치료법을 개발하는데 유용할 것이라 믿고 있다.
퇴행성 관절 질환으로도 알려져 있는 골관절염은 관절 연골의 퇴행 및 연골하 골의 증식 및 리모델링을 특징으로 한다. 보편적인 증상은 강직, 운동 제한 및 통증이다. 골관절염은 가장 통상적인 형태의 관절염이며, 유병률은 연령에 따라 현저하게 증가한다. 자가-보고된(self-reported) 골관절염을 앓는 노령의 환자들은 이 질환에 걸리지 않은 동년배들에 비해 2배 더 자주 의사를 찾는 것으로 나타났다. 또한, 이러한 환자들은 이 연령군의 다른 사람들에 비해 활동하는 날이 더 적으며 침대에 머무르는 날이 더 많다. 한 연구에서, 증상이 있는 대다수의 환자들은 8년의 재진 기간 동안 상당한 신체장애를 갖게 되었다(문헌 [Massardo et al., Ann Rheum Dis 48: 893-7 (1989)]).
비스테로이드성 항-염증성 약물(NSAID; NonSteroidal Anti-Inflammatory Drug)은 여전히 골관절염에 대한 주된 치료 방식이다. NSAID의 효능이 그의 진통 또는 항-염증 특성 또는 연골에서의 퇴행 과정 둔화에 따라 달라지는지의 여부는 알려져 있지 않다. 또한, NSAID는 환자에게 유해할 수 있다는 우려도 있다. 예를 들어, NSAID는 위, 위장관, 간 및 신장에서 잘 알려진 독성 효과를 나타낸다. 그러나, 아스피린은 동물에서 프로테오글리칸 합성 및 정상적인 연골 복구 과정을 억제한다. 인간에서의 한 연구는 인도메타신이 둔부 연골의 파괴를 촉진시킬 수 있음을 시사한다. 모든 역효과는 골관절염에 가장 민감한 노령의 집단에서 보다 통상적인 것으로 여겨진다.
통상적으로 골다공증으로 알려진 질환에서, 골은 미네랄이 빠져나가 비정상적으로 다공성이 된다. 골은 세포 및 기질의 유기 성분 뿐만이 아니라 무기 또는 미네랄 성분까지 포함한다. 세포 및 기질은 골에 강성을 부여하는 인산칼슘(85％) 및 탄산칼슘(10％)의 미네랄 성분으로 함침된 콜라겐 섬유의 구조를 포함한다. 골다공증은 일반적으로 노령에서 발병한다고 여겨지고 있지만, 특정 유형의 골다공증은 골이 기능성 스트레스를 받지 않는 모든 연령의 사람에서 발병할 수 있다. 이러한 경우, 환자에서는 피질 및 해면 골이 오랜 고정 기간 동안 유의하게 감소될 수 있다. 노령의 환자들은 골절 후 고정되는 경우에 비활동으로 인한 골 감소를 경험하며, 결국에는 이미 골다공증에 걸린 골격에서 2차 골절이 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 골 밀도 감소는 척추 붕괴, 둔부, 하박, 손목 및 발목의 골절 및 무력성 통증을 일으킬 수 있다. 이러한 질환에 대한 별법의 비수술적 요법이 요망된다.
펄스 전자기장(PEMF; Pulsed ElectroMagnetic Field) 및 용량성 결합(CC; Capacitive Coupling)은 1979년에 미국 식약청(Food and Drug Administration)의 승인을 받은 이후 골 치유에 있어서 비치유성 골절 및 관련 문제를 치료하는데 널리 사용되어 왔다. 이러한 형태의 요법을 시도하는데 있어서의 원래의 바탕은, 골에 대한 물리적인 스트레스가 미소 전기 전류를 발생시키고 이 전류가 물리적 스트레스를 기계적 변형과 함께 골 형성 자극 신호로 전환하는데 있어서의 기본 메카니즘인 것으로 여겨진다는 관찰 결과이다. 불유합의 치료에서 성공적이었던 직류 전기장 자극과 함께, PEMF 및 용량성 결합을 이용한 비침투성 기술(여기서, 전극은 치료 부위의 피부에 위치함)이 또한 효과적인 것으로 밝혀졌다. 펄스 전자기장은 고도로 전도성인 세포외 유체에서 적은 유도 전류(패러데이 전류)를 발생시키지만 용량성 결합은 조직에서 직류를 발생시키며, 따라서 PEMF 및 CC는 둘 다 내인성 전기 전류를 모방한다.
처음에는 골에서의 결정 표면에 나타나는 현상으로 인해 발생한다고 여겨졌던 내인성 전기 전류는, 1차적으로는 고정 음전하를 갖는 유기 성분을 함유하는 골의 채널에서 전해질을 함유하는 유체의 움직임으로 인해 "스트리밍 포텐셜(streaming potential)"이라 불리는 것을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 연골에서의 전기 현상에 대한 연구는 골에서 기술된 것과 유사한 기계-전기 전환 메카니즘을 입증하였으며, 연골이 기계적으로 압박되는 경우에는 연골 기질내 프로테오글리칸 및 콜라겐의 고정 음전하 표면에 걸쳐 유체 및 전해질의 이동을 유발하는 것으로 보인다. 이러한 스트리밍 포텐셜은 외관상으로는 골에서 작용하는 것과 유사하게 연골에서 작용하며, 기계적 변형과 함께 기질 성분의 연골세포 합성을 자극할 수 있는 신호 전달을 일으킨다.
직류 전류, 용량성 결합 및 PEMF는 정형외과 분야에서 불유합 골절의 치유에 주로 적용되어 왔다(문헌 [Brighton et al., J. Bone and Joint Surgery, 63: 2-13, 1981]; [Brighton and Pollack, J. Bone and Joint Surgery, 67: 577-585, 1985]; [Bassett et al., Crit. Rev. Biomed. Eng., 17: 451-529 (1989)]; [Bassett et al., J AMA 247: 623-8 (1982)]). 임상 반응은 성인의 둔부 무혈성 괴사 및 아동의 레그-퍼테스(Legg-Perthes's) 질환에서 보고되어 왔다(문헌 [Bassett et al., Clin Orthop 246: 172-6 (1989)]; [Aaron et al., Clin Orthop 249: 209-18 (1989)]; [Harrison et al, J Pediatr Orthop 4: 579-84 (1984)]). 또한, PEMF(문헌 [Mooney, Spine, 15: 708-712, 1990]) 및 용량성 결합(문헌 [Goodwin, Brighton et al., Spine, 24: 1349-1356, 1999])은 요추 융합의 성공률을 유의하게 증가시킬 수 있는 것으로 알려져 왔다. 또한, 말초 신경 재생 및 기능의 증가 및 혈관신생의 촉진에 대한 보고가 있다(문헌 [Bassett, Bioassays 6: 36-42 (1987)]). 스테로이드 주사 및 다른 통상의 조치에 대해 난치성인 지속성 회전근개(rotator cuff) 건염에 걸린 환자는 위약 처치한 환자에 비해 유의한 이점을 나타냈다(문헌 [Binder et al., Lancet 695-8 (1984)]). 마지막으로, 브라이턴(Brighton) 등은 래트에서 적절한 용량성 결합 전기장에 의해 요추에서 척추 골다공증을 예방하고 반전시킬 수 있음을 밝혀냈다(문헌 [Brighton et al., J. Orthop. Res. 6: 676-684, 1988]; [Brighton et al., J. Bone and Joint Surgery, 71 :228-236, 1989]).
보다 최근에, 이 분야에서의 연구는 조직 및 세포에 대해 자극을 행한 결과에 집중되어 왔다. 예를 들어, 직류 전류는 세포막을 투과하지 않으며, 제어는 세포외 기질 분화를 통해 달성되는 것으로 추측되었다(문헌 [Grodzinsky, Crit. Rev. Biomed. Engng 9: 133 (1983)]). 직류 전류와 달리, PEMF는 세포막을 투과할 수 있으며, 세포막을 자극하거나 또는 세포내 소기관에 직접적으로 영향을 미친다고 보고되었다. 조사에 따르면, 세포외 기질 및 생체내 연골내 골화에 대하여 PEMF는 연골 분자의 합성 및 골 소주의 성숙을 증가시키는 효과가 있는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Aaron et al., J. Bone Miner. Res. 4: 227-233 (1989)]). 보다 최근에, 로리치, 브라이턴(Lorich, Brighton) 등은 문헌[Clin Orthop and Related Research 350: 246-256, 1998]에서 용량성 결합된 전기 신호가 전압에 의해 개폐되는 칼슘 채널을 통해 신호 전달되어 세포질 칼슘을 증가시키고, 이후 활성화된(세포골격) 칼모둘린을 증가시킨다고 보고하였다.
반응 메카니즘을 이해하기 위한 조직 배양 연구에 많은 연구가 행해졌다. 한 연구에서, 전기장은 [3H]-티미딘이 연골세포의 DNA로 혼입되는 것을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 전기 자극에 의해 생성된 Na 및 Ca2+ 흐름이 DNA 합성을 촉발한다는 견해를 지지한다(문헌 [Rodan et al., Science 199: 690-692 (1978)]). 연구를 통해, 전기 동요에 의해 2차 메신저 cAMP가 변화되고 세포골격이 재배열된다는 것이 밝혀졌다(문헌 [Ryaby et al., Trans. BRAGS 6: (1986)]; [Jones et al., Trans. BRAGS 6: 51 (1986)]; [Brighton and Townsend, J. Orthop. Res. 6: 552-558, 1988]). 다른 연구에서는 글리코사미노글리칸, 술페이트화, 하이알루론산, 리소짐 활성 및 폴리펩티드 서열에 대한 영향이 밝혀졌다(문헌 [Norton et al., J. Orthop. Res. 6: 685-689 (1988)]; [Goodman et al., Proc. Natn. Acad. Sci. USA 85: 3928-3932 (1988)]).
1996년에 본 발명자는 시클릭 2축 0.17％ 기계적 변형이 배양된 MC3T3-E1 골세포에서 TGF-β1 mRNA를 유의하게 증가시킨다는 것을 보고하였다(문헌 [Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 449-453 (1996)]). 1997년에는 여러가지 중대한 연구를 수행하였다. 한 연구에서는, 동일한 시클릭 2축 0.17％ 기계적 변형이 유사한 골세포에서 PDGF-A mRNA를 유의하게 증가시킨다는 것을 보고하였다(문헌 [Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 43: 339-346 (1997)]). 또한, 20 mV/cm의 60 kHz 용량성 결합된 전기장이 유사 골세포에서 TGF-β1을 유의하게 증가시킨다는 것을 보고하였다(문헌 [Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 237: 225-229 (1997)]). 그러나, 이러한 전기장이 다른 유전자에 미치는 효과에 대해서는 문헌에 보고된 바 없다.
발명의 영문 명칭이 "Regulation of Genes Via Application of Specific and Selective Electrical and Electromagnetic Signals"인 상기 인용된 모(母) 특허 출원에는, 질환에 걸렸거나 손상된 조직의 표적 유전자를 조절하기 위한 특이적이고 선택적인 장의 생성에 사용되는 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호를 측정하는 방법이 개시되었다. 본 발명은 본원에 기재한 기술을 토대로 하여 연골 질환(관절염), 연골 손상 및 연골 결함을 치료하기 위해서 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호에 의해 생성된 특이적이고 선택적인 장을 인가하여 표적화된 1가지 유전자의 발현, 즉 제II형 콜라겐 유전자의 발현을 조절하는 방법을 기술함으로써 완성되었다.
발명의 개요
본 발명은 특이적이고 선택적인 전기 및(또는) 전자기 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 인가하여 연골 세포에서 제II형 콜라겐 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 전기장 기간, 진폭, 주파수 및 듀티 사이클(duty cycle)에 대한 용량-반응 곡선을 작성함으로써, 관절 연골의 연골세포에서 제II형 콜라겐 mRNA를 상향 조절하는 최적의 신호를 발견하였다. 최적 신호는 20 mV/cm의 진폭, 30분의 기간, 8.3％의 듀티 사이클 (1분 켜짐, 11분 꺼짐, 30 사이클), 60 kHz의 주파수 및 사인파형을 갖는 용량성 결합 전기장을 발생시켰다. 특히, 본 발명은 이러한 신호에 의해 발생된 장을 인가하여 연골 세포에서 제II형 콜라겐 유전자의 발현을 상향 조절하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 용량성 결합 전기장, 전자기장 또는 이들의 혼합장으로 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현을 특이적이고 선택적으로 상향 조절하는 방법이 제공된다. 골관절염, 류마티스성 관절염, 연골 손상 및 연골 결함 등을 제II형 콜라겐 mRNA의 발현을 상향 조절하는, 약 30분 기간의 전기장, 약 60 kHz의 주파수, 약 8.3％의 듀티 사이클 및 사인파형을 갖는 약 20 mV/cm의 용량성 결합 전기장으로 치료한다. 본 발명의 방법에 따라, "특이적이고 선택적인" 신호는 소정의 특징적인 진폭, 기간, 듀티 사이클, 주파수 및 파형을 갖는 신호로서 제II형 콜라겐 유전자의 발현을 상향 조절한다(특이성). 이러한 신호는, 제II형 콜라겐 유전자의 발현을 상향 조절하는 여러가지 신호를 선택함으로써 주어진 생물학적 또는 치료적 반응을 달성할 수 있게 한다(선택성). 추가로, 본 발명은 본원에 기술된 방법을 이용하여 제II형 콜라겐 유전자의 발현을 상향 조절하는 특이적이고 선택적인 장을 생성시키는 특이적이고 선택적인 신호를 발생시키는 장치에 관한 것이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 골관절염, 류마티스성 관절염, 연골 손상 및 연골 결함의 치료 방법 및 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 제II형 콜라겐의 세포내 생성을 증가시킨다고 알려져 있거나 증가시킬 것이라고 추정되는 출발 신호의 기간을 방법에 따라 변화시켜 제II형 콜라겐 유전자에 대한 "특이적이고 선택적인" 신호를 측정하는 방법을 포함한다. 최적 기간의 선택 후, 제II형 콜라겐의 유전자 발현에 의해 결정되는 최적의 시간 기간 동안 신호의 진폭을 변화시킨다. 듀티 사이클, 주파수 및 파형은 방법에 따라 달라지지만, 다른 신호 특성은 일정하게 유지된다. 제II형 콜라겐의 발현을 최대로 증가시키는 최적 신호가 측정될 때까지, 상기 과정을 반복한다.
당업자는 제II형 콜라겐 유전자의 발현이 다양한 전기 및 전자기 신호에 노출된 연골 세포에서 아그레칸 유전자의 발현에 대해 기능적으로 상보적이거나 또는 상승작용적이라는 것을 이해할 것이다. 아그레칸 유전자의 발현을 조절하기 위한 특이적이고 선택적인 신호는 본 발명자의 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제 호에 기술되어 있다. 본 발명의 상기 측면 및 기타 측면은 하기 본 발명의 상세한 설명에서 설명될 것이다.
본 발명은 이하에 설명하는 첨부된 도면 및 하기하는 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 관절 연골의 연골세포가 다양한 시간 기간 동안 20 mV/cm의 용량성 결합 전기장에 노출되었을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 제II형 콜라겐 mRNA의 최적 생성은 30분 기간의 신호에서 일어났다.
도 2는 관절 연골의 연골세포가 20 mV/cm의 용량성 결합 전기장에 30분 동안 노출되었을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 다양한 반응 시간 이후에 생성된 제II형 콜라겐 mRNA의 양을 대조군(전기 없음)의 제II형 콜라겐 mRNA의 양과 비교하여 도시하였다. 또한, 도시한 바와 같이 제II형 콜라겐 mRNA의 최적 생성은 전기 자극을 중단하고 5.5시간이 지난 후에 일어났다.
도 3은 관절 연골의 연골세포를 30분의 기간 동안 용량성 결합 전기장의 다양한 진폭에 노출시켰다가 전기 자극을 중단하고 5.5시간이 지난 후 수확하였을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 제II형 콜라겐 mRNA의 최적 생성은 20 mV/cm의 전기장 진폭을 발생시키는 신호에서 일어났다.
도 4는 관절 연골의 연골세포를 30분의 기간 동안 20 mV/cm의 용량성 결합 전기장에 노출시켰다가 전기 신호를 중단하고 5.5시간이 지난 후 수확하였을 때, 제II형 콜라겐 발현(백색 막대) 및 제II형 콜라겐 mRNA 발현(흑색 막대)의 노던 블롯 분석을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 제II형 콜라겐 mRNA의 노던 블롯 분석량은 자극하지 않은 대조군의 분석량보다 3.5배 더 많았고, RT-PCR로 측정한 제II형 콜라겐 mRNA의 양은 자극하지 않은 대조군의 mRNA 양보다 6.5배 더 많았다.
도 5는 관절 연골의 연골세포를 다양한 듀티 사이클의 용량성 결합 전기장에 20 mV/cm의 전기장 진폭으로 30분의 켜짐 시간 기간으로 노출시켰다가 전기 신호를 중단하고 5.5시간이 지난 후 수확하였을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 최적 듀티 사이클은 8.3％(1분 켜짐, 11분 꺼짐, 30 사이클)인 것으로 밝혀졌다.
도 6은 관절 연골의 연골세포를 다양한 주파수의 용량성 결합 전기장에 20 mV/cm의 전기장 진폭, 30분의 기간(켜짐 시간)으로 8.3％ 듀티 사이클(1분 켜짐, 11분 꺼짐, 30 사이클)에 노출시켰다가 전기 신호를 중단하고 5.5시간이 지난 후 수확하였을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 최적 주파수는 60 kHz인 것으로 밝혀졌다.
도 7은 7일 동안 배양하여 성장시킨 관절 연골의 연골세포를 20 mV/cm, 50％ 듀티 사이클(1분 켜짐, 1분 꺼짐, 30 사이클), 60 kHz의 주파수 및 사인파형을 갖는 용량성 결합 전기장에 노출시킨 경우를 도식적으로 나타낸 것이다. 상기 연골세포는 상기 전기장에 1일 당 1시간씩 7일 동안 노출시켰다. 대조군 연골세포는 동일 조건하에 성장시켰으나 어떠한 전기 자극에도 노출시키지 않았다. 상기 배양 배지 중에는 인터루킨-1β(IL-1β)(관절 연골 퇴화를 자극하는 사이토킨)가 존재하지 않았다. 나타난 바와 같이, 히드록시프롤린(콜라겐의 특징적인 구성 성분인 아미노산)은 연골세포가 전기장에 노출되었을 때가 전기장에 노출되지 않은 대조군 연골세포에 비해 1.7배 증가하였다.
도 8은 7일 동안 배양하여 성장시킨 관절 연골의 연골세포를 20 mV/cm, 50％ 듀티 사이클(1분 켜짐, 1분 꺼짐, 30 사이클), 60 kHz의 주파수 및 사인파형을 갖는 용량성 결합 전기장에 노출시킨 경우를 도식적으로 나타낸 것이다. 7일째에는 인터루킨-1β(10 ng/ml)를 배지에 첨가하였다. 이어서, 연골세포를 상기 전기장에 1일 당 1시간씩 7일 동안 노출시켰다. 대조군 연골세포는 동일 조건하에 상기 배지 중에서 인터루킨과 함께 성장시켰으나 어떠한 전기 자극에도 노출시키지 않았다. 나타난 바와 같이, 히드록시프롤린은 배양 배지 중의 인터루킨 존재에도 불구하고 전기장에 노출되었을 때가 전기장에 노출되지 않은 대조군 배양물에 비해 1.4배 증가하는 것으로 나타났다.
도 9는 무릎 골관절염에 걸린 환자를 치료하는데 사용되는, 본 발명에 따른 장치(10)을 예시한다.
이하에서는 도 1 내지 9를 언급하면서 본 발명을 보다 상세히 기재할 것이다. 당업자라면, 이들 도면에 대한 본 명세서의 설명이 단지 예시 목적을 위한 것에 불과하며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하지 않는다는 점을 인지할 것이다. 본 발명의 범위와 관련된 모든 의문은 첨부된 청구항을 참조함으로써 해소될 수 있다.
본 발명은 특정 유전자의 발현이 특이적이고 선택적인 전기 및(또는) 전자기 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장의 인가에 의해 조절될 수 있다는 발견에 기초한 것이다. 즉, 본 발명자는, 골, 연골 및 기타 조직 세포의 각각의 유전자를 조절하기 위한 특이적이고 선택적인 장을 발생시키는 특이적이고 선택적인 전기 및(또는) 전자기 신호가 존재하고, 이러한 장은 이들 세포 중의 유전자를 특이적이고 선택적으로 조절할 수 있다는 것을 알아냈다. 특히, 성장, 유지, 복구 및 조직 또는 세포의 퇴행 또는 퇴보를 결정하는 유전자의 발현이 본 발명에 따라 특이적이고 선택적인 전기 및(또는) 전자기 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장의 인가를 통해 조절되어 이로운 임상적 효과를 거둘 수 있다. 이러한 발견은 골절 및 골 결함, 골관절염, 골다공증, 암 및 기타 질환을 비롯한 특정한 의학적 상태를 표적으로 하는 치료 방법의 개발에 유용하며, 또한 이러한 방법을 이용하는 장치의 개발에 유용하다.
특히, 본 발명은 제II형 콜라겐의 발현이 유의하게 상향 조절되어 관절 연골에서 콜라겐의 생성을 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다. 제II형 콜라겐은 아그레칸과 함께 관절 연골의 주요 구성성분이며, 관절염의 진행시 조기에 파괴되고(되거나) 퇴화된다. 본 발명은 본원에 기재된 최적의 전기장이 제II형 콜라겐 mRAN를 유의하게 상향 조절할 수 있기 때문에 IL-1β가 존재한다고 할 지라도 제II형 콜라겐 합성을 증가시킬 수 있음을 명확하게 보여준다. 또한, 당업자라면 본원에서는 용량성 결합으로 기재한 적절한 전기장이 관절염(골관절염 및 류마티스성 관절염 둘다), 연골 손상 및 연골 결함의 치료에 사용될 수 있으며, 이것은 임의의 모든 장 인가 기술과 동등하게 효과적임을 인지할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "신호"라는 용어는 장치에 의해 출력되는 기계적 신호, 초음파 신호, 전자기 신호 및 전기 신호를 비롯한 다양한 신호들을 지칭하는데 사용된다. "장"이라는 용어는 본원에서 사용된 바와 같이 표적화된 조직 내의 전기장을 지칭하며, 혼합장 또는 펄스 전자기장 또는 직류 전류, 용량성 결합 또는 유도성 결합(inductive coupling)에 의해 발생된 것일 수 있다.
"원격"이라는 용어는 떨어진 거리에서 작용 또는 제어되는 작용을 의미하는 것으로 사용된다. "원격" 조절이란 떨어진 거리에서 유전자 발현을 제어하는 것을 지칭한다. "원격으로" 제공한다는 것은 떨어진 거리에서 제공하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 원격 공급원으로부터 특이적이고 선택적인 신호를 제공한다는 것은 떨어진 거리의 공급원으로부터 조직 또는 세포까지 신호를 제공하는 것을 지칭할 수도 있고, 또는 신체의 바깥쪽 또는 외부 공급원으로부터 신체까지 신호를 제공하는 것을 지칭할 수도 있다.
"특이적이고 선택적인" 신호라는 어구는 소정의 특징적인 진폭, 기간, 듀티 사이클, 주파수 및 파형 등을 갖는 특이적이고 선택적인 전기장을 발생시키는 신호를 의미하는 것으로서, 표적 유전자 또는 표적 유전자와 기능적으로 상보성인 유전자를 상향 조절 또는 하향 조절한다(특이성). 이것은 상이한 "특이적이고 선택적인" 신호를 선택하여 다양한 유전자 발현을 상향 조절 또는 하향 조절함으로써, 주어진 생물학적 반응 또는 치료적 반응을 달성할 수 있게 한다(선택성).
"조절하다"라는 용어는 유전자 발현을 제어하는 것을 의미한다. 조절에는 상향 조절 및 하향 조절 둘다 포함되는 것으로 이해된다. 상향 조절이란 유전자 발현을 증가시키는 것을 의미하는 반면, 하향 조절이란 유전자 발현을 억제하거나 방해하는 것을 의미한다.
"기능적 상보성"이란 주어진 세포 또는 조직에서의 발현이 상보적이거나 상승작용적인 2종 이상의 유전자를 지칭한다.
"조직"이란 환자의 구조적 물질 중 하나를 형성하는 세포외 물질과 세포와의 집합체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "조직"이라는 용어는 근육 및 기관 조직 뿐만 아니라 골 또는 연골 조직까지 포함하는 것으로 의도된다. 또한, "조직"이라는 용어는 본원에서 사용된 바와 같이 개개의 세포를 지칭할 수도 있다.
"환자"란 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명은 특정 조직, 세포 또는 질환을 표적으로 하는 치료 방법 및 치료 장치를 제공한다. 특히, 손상되거나 질환에 걸린 조직 또는 세포 내의 복구 과정과 관련이 있는 유전자의 발현은, 표적 조직 또는 세포 내에서 상기 유전자가 조절되도록 하는 특이적이고 선택적인 전기 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 인가함으로써 조절할 수 있다. 각각의 유전자 또는 상보적 유전자의 각 세트에 특이적이고 선택적인 신호를 인가함으로써 유전자 발현을 상향 조절 또는 하향 조절하여 이로운 임상적 효과를 거둘 수 있다. 예를 들어, 특이적이고 선택적인 특정 신호는 바람직한 특정 유전자의 발현을 상향 조절하는 특이적이고 선택적인 전기장을 생성하고, 특이적이고 선택적인 동일한 또는 또다른 특정 신호는 바람직하지 않은 특정 유전자의 발현을 하향 조절하는 특이적이고 선택적인 전기장을 생성할 수 있다. 특정 유전자는 특이적이고 선택적인 하나의 특정 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장에 의해 상향 조절될 수 있고, 특이적이고 선택적인 또다른 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장에 의해 하향 조절될 수도 있다. 당업자는 조직의 성장, 유지, 복구 및 퇴행 또는 퇴보를 결정하는 유전자들을 조절함으로써 질환에 걸리거나 손상된 특정 조직의 치료를 목표로 할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 방법 및 장치는 질환에 걸리거나 손상된 표적화된 특정 조직과 관련이 있는 유전자 발현에 특이적이고 선택적인 장을 발생시키는 신호를 식별하는 것을 근거로 한다. 예를 들어, 다양한 형태의 전류(예를 들어, 용량성 결합, 유도성 결합, 혼합장)는 선택된 각각의 유전자에 인가되는 특이적이고 선택적인 장의 주파수, 진폭, 파형 또는 듀티 사이클을 변화시킴으로서 환자의 신체 중에서 표적화된 조직 또는 세포 내의 유전자 발현을 특이적이고 선택적으로 조절할 수 있다. 또한, 전기에 노출되는 시간의 기간은 환자의 신체 중에서 표적화된 조직 또는 세포 내의 유전자 발현을 특이적이고 선택적으로 조절하는 전기의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 특이적이고 선택적인 신호는 유전자 발현에 대하여 원하는 효과가 제공되는 적절한 조합의 주파수, 진폭, 파형, 듀티 사이클 및 기간이 밝혀질 때까지 각 유전자에 조직적으로 인가되는 특이적이고 선택적인 전기장을 발생시킬 수 있다.
특정 유전자 발현에 대한 전기장의 특이성 및 선택성은 여러 인자에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 질환에 걸리거나 손상된 다양한 조직 또는 다양한 질환 상태가 치료의 표적이 될 수 있을 것으로 이해된다. 특히, 적절한 주파수, 진폭, 파형 및(또는) 듀티 사이클을 갖는 전기장은 특정 유전자의 발현에 특이적이고 선택적일 수 있기 때문에, 표적화된 치료를 위해 제공될 수 있다. 또한, 일시적인 인자(예를 들어, 전기장에 노출되는 시간의 기간)가 특정 유전자 발현에 대한 전기장의 특이성 및 선택성에 영향을 미칠 수도 있다. 유전자 발현의 조절은 특정 시간의 기간 동안 특이적이고 선택적인 전기장을 인가함으로써 보다 효과적이 될 수 있다(또는 가능해질 수 있다). 따라서, 당업자는 특정 유전자의 발현에 특이적이고 선택적이어서 질환에 걸리거나 손상된 다양한 조직 또는 다양한 질환을 표적으로 하는 치료를 제공하는 전기장이 밝혀질 때까지 본 발명이 다양한 주파수, 진폭, 파형, 듀티 사이클 및(또는) 전기장의 인가 기간을 제공함을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명에 따라 적절한 시간의 기간 동안 적절한 주파수, 진폭, 파형 및(또는) 듀티 사이클을 갖는 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 인가함으로써, 질환에 걸리거나 손상된 특정 조직과 관련이 있는 특정 유전자의 발현을 조절하는 것이 가능하기 때문에, 본 발명의 표적화된 치료를 제공할 수 있다. 따라서, 특이적이고 선택적인 전기장을 발생시키는 신호의 특이성 및 선택성에 특정 유전자의 발현이 조절되도록 하는 영향을 주어, 질환에 걸리거나 손상된 특정 조직 또는 특정 질환 상태가 치료되도록 할 수 있다. 특히, 본 발명은 골관절염, 류마티스성 관절염, 연골 손상 및 연골 결함을 표적으로 하는 치료를 제공한다.
본 발명은 또한 제II형 콜라겐 유전자 발현에 특이적이고 선택적인 하나 이상의 신호의 공급원을 포함하는 장치를 제공한다. 본 발명의 장치는 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생되는 특이적이고 선택적인 장을 인가하도록 개조된 하나 이상의 전극을 사용하여 연골 세포에 상기 신호가 인가되도록 할 수 있다. 특히, 본원에 기재된 최적의 장이, 두 개 이상이 쌍을 이루거나 열로 배열되어 가먼트, 보호대, 랩(wraps) 또는 캐스트로 혼입된 적절한 표면 전극을 통해 임의의 관절에 인가될 수 있고, 용량성 결합, 유도성 결합(전자기장) 또는 혼합장에 의해 전달될 수 있다.
본 발명의 장치는 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생되는 특이적이고 선택적인 장을 질환에 걸리거나 손상된 조직 및(또는) 환자 피부에 직접 인가할 수 있다. 또한, 본 발명의 장치는 용량성 결합 장치기 대상체 피부에 접촉되어야 한다는 것을 인식하겠지만, 특이적이고 선택적인 장을 원격 인가할 수도 있다(예를 들어, 질환에 걸리거나 손상된 조직으로부터 떨어진 거리에서 장을 인가함). 본 발명의 장치는 환자 신체 중 손상되거나 질환에 걸린 조직 주위에 전극을 부착시키는 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 자가-부착성 전도성 전극은 도 9에 나타낸 바와 같이 골관절염에 걸린 무릎 관절의 양쪽 측면상에서 환자 피부에 부착될 수 있다. 또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장치(10)은 상기 장치(10)을 환자의 신체에 부착시키기 위한 자가-부착성 전극(12)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치(10)은 전력 유닛(14)에 부착된 전극(12)를 포함할 수 있으며, 이때 전력 유닛(14)는 이것이 환자의 종아리, 대퇴 또는 허리 둘레에 고정되는 벨크로(VELCRO)(등록상표) 스트랩(strap)(도시되지 않음)에 부착될 수 있도록 반대 측에 벨크로(등록상표) 패치(16)을 갖는다.
본 발명의 장치(10)은 다양한 방법으로 이용될 수 있다. 이 장치(10)은 휴대가능할 수 있거나, 또는 환자 신체에 일시적으로 또는 영구적으로 부착될 수 있다. 본 발명의 장치(10)은 비-삽입형인 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 장치(10)은 특이적이고 선택적인 소정의 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 인가하기 위해 환자 피부 접촉용으로 개조된 전극을 환자 피부에 적용하여 사용할 수 있다. 또한, 이러한 신호는 전류 흐름을 시간에 따라 변화시킴으로써 조직을 침투하는 특이적이고 선택적인 전자기장을 생성하는 코일을 통해 인가될 수도 있다. 본 발명의 장치(10)은 환자의 피부 아래에 이식되는 것을 비롯하여 환자에게 이식될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 방법이 연골 성장 및 복구를 제공할 수 있음을 예시할 것이다. 연골 세포에서의 제II형 콜라겐 발현을 특이적이고 선택적으로 조절하는 신호를 통해 연골 성장 및 복구를 자극하여, 골관절염 환자에서의 관절 연골 복구를 자극할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법으로 제II형 콜라겐 유전자를 상향 조절하여 연골을 복구할 수 있다. 관절 연골세포 및 관절 연골, 유리질 연골 및 성장판 연골을 비롯한 다양한 연골 세포가 본 발명의 방법에서의 표적이 될 수 있다.
또한, 하기 실시예는 본 발명의 방법으로 관절 연골세포에서의 유전자 발현이 조절된다는 것을 추가로 예시한다. 예를 들어, 하기의 실시예에서, 태아 관절 연골세포를 0.5, 2.0, 6.0 및 24.0시간 동안 용량성 결합된 20 mV/cm의 60 kHz 전기장에 노출시켰다. 자극 후 겨우 30분 만에 통계적으로 유의한 35SO4/ug DNA의 혼입(유의한 프로테오글리칸 합성을 나타냄)이 관찰되었다. 동일한 실험을 반복하고, 제II형 콜라겐 mRNA(주요 연골 프로테오글리칸을 생성하는 메신저)의 수준을 모니터링하였다. 전기 자극 후 겨우 30분 만에 제II형 콜라겐 mRNA가 유의하게 증가하였다. 이처럼, 일시적인 인자가 관절 연골세포에서의 유전자 발현을 조절하는 특이적이고 선택적인 전기장을 발생시키는 신호의 특이성 및 선택성에 영향을 미칠 수 있다.
당업자는 다양한 다른 연골 질환 및 손상이 본 발명의 방법에 의한 치료의 표적이 될 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 당업자는 본 발명의 장치가 한쌍 또는 여러쌍의 전극에 인가될 스위칭가능한 여러개의 특이적이고 선택적인 신호가 프로그래밍되어 있는 용량성 결합 전력 유닛, 스위칭가능한 여러개의 특이적이고 선택적인 신호를 갖는 전력 유닛에 부착된 전자기 코일 및 특이적이고 선택적인 신호를 발생시키는 전력원을 갖는 초음파 자극기를 비롯한 다양한 형태로 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 일반적으로, 장치의 바람직함은 환자의 수용성 및 환자의 순응성에 기초한다. 현재 당업계에서 사용가능한 가장 작고 가장 휴대가능한 유닛은 용량성 결합 유닛이지만, 피부가 극도로 민감한 환자들에게는 유도성 결합 유닛의 사용이 바람직할 수 있다. 한편, 초음파 유닛은 대부분의 환자 집단에서 필요로 하지만 특정 환자들에 의해 사용되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로 입증되지만 이는 예시를 위한 것에 불과하며 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.
재료 및 방법
우태아 관절 연골로부터 연골세포 배양물을 제조하였다. 연골세포(5 ×105개 세포/cm2)를 특수하게 변형시킨 쿠퍼(Cooper) 접시에 플레이팅하였다. 세포를 7일 동안 성장시키고, 실험 조건의 시작 직전에 배지를 교체하였다. 본 연구 내내 실험 세포 배양물에 용량성 결합된 60 kHz 사인파 신호 전기장(출력은 44.81 볼트 피크-피크였음)을 가하였다. 이로써, 접시의 배양 배지에 전류 밀도가 300 μA/cm2인 20 mV/cm로 계산되는 장 강도가 생성되었다. 대조구 세포 배양 접시는 전극을 파형 발생기(function generator)에 연결시키지 않았다는 점을 제외하고는 자극된 접시의 세포 배양물과 동일하였다.
제조사의 지침에 따라 TRIzol을 사용하여 전체 RNA를 단리하고, 수퍼스크립트(SuperScript) II 역전사효소를 사용하여 역전사를 수행하였다. 경쟁적 PCR 기술에 사용될 올리고뉴클레오티드 프라이머는 공개된 cDNA 서열로부터 선택하였다. 사이온이미지(ScionImage) 소프트웨어를 사용하여 PCR 생성물의 정량적 분석을 수행하였다.
원하는 유전자 조절을 위한 최적 신호는 다음과 같이 조직적으로 찾아냈다. 주어진 단백질의 세포내 생성을 증가시킨다고 알려져 있는(또는, 심지어는 증가시킬 것이라고 추정되는) 전기 신호를 상기 단백질의 유전자 발현(mRNA)에 특이적이고 선택적인 장을 생성하는데 특이적인 신호를 결정하기 위한 출발 신호로 하였다. 먼저, 모든 다른 신호 특성값(진폭, 듀티 사이클, 주파수 및 파형)을 일정하게 유지하면서 신호 기간을 변화시켜 용량-반응 곡선을 작성하였다(도 1). 이를 통해 상기 단백질의 유전자 발현을 위한 출발 신호의 최적 기간을 결정하였다. 최적 기간에 대해 장 진폭을 변화시켜(도 3) 두번째 용량-반응 곡선을 작성하였다(도 2). 이를 통해 관심 단백질의 유전자 발현에 의해 측정된 최적 기간에 대한 최적의 장 진폭을 결정하였다. 이어서, 세번째 용량-반응 곡선을 작성하였으며, 이때는 최적 진폭 및 다른 신호 특성값은 일정하게 유지하면서 듀티 사이클을 100％(일정)에서 5％ 이하까지 변화시켰다(도 5). 다른 신호 특성값은 일정하게 하면서 네번째(주파수를 변화시킴)로 용량-반응을 반복하였다(도 6). 도시하지는 않았지만, 각 경우에서 다른 신호 특성값을 일정하게 하면서 다섯번째(파형을 변화시킴)로 용량-반응을 반복할 수 있다. 상기 방법에 의해, 관심 단백질의 유전자 발현을 최대로 증가시키기 위한 최적 신호를 결정하였다.
유전자 발현은 역전사효소 PCR법 및 노던 분석법 등과 같이 당업계에 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있고, 단백질 발현은 분광광도법, 형광광도법 등 및 면역분석법 등으로 측정할 수 있다.
관절 연골세포에 의한 제II형 콜라겐 생성
관절 연골세포를 60 kHz에서 20 mV/cm의 용량성 결합 전기장에 노출시켰다. 결과는 도 1 내지 8에 예시하였다.
도 1은 관절 연골의 연골세포(1 ㎕ 당 attomole)가 다양한 시간 기간 동안(0.5, 2, 6 및 24시간) 20 mV/cm의 용량성 결합 전기장에 노출되었을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 제II형 콜라겐 mRNA의 최적 생성은 30분 기간의 신호에서 일어났다.
도 2는 관절 연골의 연골세포(1 ㎕ 당 attomole)가 20 mV/cm의 용량성 결합 전기장에 30분 동안 노출되었을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 다양한 반응 시간 이후에 생성된 제II형 콜라겐 mRNA의 양을 대조구(전기 없음)와 비교하여 도시하였다. 또한, 도시한 바와 같이, 제II형 콜라겐 mRNA의 최적 생성은 전기 자극을 중단하고 5.5시간이 지난 후에 일어났다.
도 3은 관절 연골의 연골세포가 30분의 기간 동안 용량성 결합 전기장의 다양한 진폭에 노출시켰다가 전기 자극을 중단하고 5.5시간이 지난 후 수확하였을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 제II형 콜라겐 mRNA의 최적 생성은 20 mV/cm의 전기장 진폭을 발생시키는 신호에서 일어났다. 이와 비교하여, 본 발명자는 아그레칸 mRNA에 대해 확립된 최적 진폭은 10 내지 20 mV/cm임을 밝혀낸 바 있다.
도 4는 관절 연골의 연골세포를 30분의 기간 동안 20 mV/cm의 용량성 결합 전기장에 노출시켰다가 전기 신호를 중단하고 5.5시간이 지난 후 수확하였을 때, 제II형 콜라겐 발현(백색 막대) 및 제II형 콜라겐 mRNA 발현(흑색 막대)의 노던 블롯 분석을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 제II형 콜라겐 mRNA의 노던 블롯 분석량은 자극하지 않은 대조군의 분석량보다 3.5배 더 많았고, RT-PCR로 측정한 제II형 콜라겐 mRNA의 양은 자극하지 않은 대조군의 mRNA 양보다 6.5배 더 많았다.
도 5는 관절 연골의 연골세포를 다양한 듀티 사이클의 용량성 결합 전기장에 20 mV/cm의 전기장 진폭으로 30분의 켜짐 시간 기간으로 노출시켰다가 전기 신호를 중단하고 5.5시간이 지난 후 수확하였을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 최적 듀티 사이클은 8.3％(1분 켜짐, 11분 꺼짐, 30 사이클)인 것으로 밝혀졌다. 이와 비교하여, 본 발명자는 아그레칸 mRNA 발현에 대한 최적 듀티 사이클은 50％(1분 켜짐, 1분 꺼짐, 30 사이클)임을 밝혀낸 바 있다.
도 6은 관절 연골의 연골세포가 다양한 주파수의 용량성 결합 전기장에 20 mV/cm의 전기장 진폭, 30분의 기간(켜짐 시간)으로 8.3％ 듀티 사이클(1분 켜짐, 11분 꺼짐, 30 사이클)에 노출시켰다가 전기 신호를 중단하고 5.5시간이 지난 후 수확하였을 때의 제II형 콜라겐 mRNA 발현을 도식적으로 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 최적 주파수는 60 kHz인 것으로 밝혀졌다.
도 7은 7일 동안 배양하여 성장시킨 관절 연골의 연골세포를 20 mV/cm, 50％ 듀티 사이클(1분 켜짐, 1분 꺼짐, 30 사이클), 60 kHz의 주파수 및 사인파형을 갖는 용량성 결합 전기장에 노출시킨 경우를 도식적으로 나타낸 것이다. 상기 연골세포는 상기 전기장에 1일 당 1시간씩 7일 동안 노출시켰다. 대조군 연골세포는 동일 조건하에 성장시켰으나 어떠한 전기 자극에도 노출시키지 않았다. 상기 배양 배지 중에는 인터루킨-1β(IL-1β)(관절 연골 퇴화를 자극하는 사이토킨)가 존재하지 않았다. 나타난 바와 같이, 히드록시프롤린(콜라겐의 특징적인 구성 성분인 아미노산)은 연골세포가 전기장에 노출되었을 때가 전기장에 노출되지 않은 대조군 연골세포에 비해 1.7배 증가하였다. 당업자라면, 본 실험에 사용된 듀티 사이클(50％)이 제II형 콜라겐에 대한 최적의 듀티 사이클이 아니기 때문에(도 5 참조) 최적의 듀티 사이클(8.3％)이 사용될 경우에는 훨씬 더 큰 반응이 예측된다는 것을 인지할 것이다.
도 8은 7일 동안 배양하여 성장시킨 관절 연골의 연골세포를 20 mV/cm, 50％ 듀티 사이클(1분 켜짐, 1분 꺼짐, 30 사이클), 60 kHz의 주파수 및 사인파형을 갖는 용량성 결합 전기장에 노출시킨 경우를 도식적으로 나타낸 것이다. 7일째에는 인터루킨-1β(10 ng/ml)를 배지에 첨가하였다. 이어서, 연골세포를 상기 전기장에 1일 당 1시간씩 7일 동안 노출시켰다. 대조군 연골세포는 동일 조건하에 상기 배지 중에서 인터루킨과 함께 성장시켰으나 어떠한 전기 자극에도 노출시키지 않았다. 나타난 바와 같이, 히드록시프롤린은 배양 배지 중의 인터루킨 존재에도 불구하고 전기장에 노출되었을 때가 전기장에 노출되지 않은 대조군 배양물에 비해 1.4배 증가하는 것으로 나타났다. 당업자라면, 본 실험에 사용된 듀티 사이클(50％)이 제II형 콜라겐에 대한 최적의 듀티 사이클이 아니기 때문에(도 5 참조) 최적의 듀티 사이클(8.3％)이 사용될 경우에는 훨씬 더 큰 반응이 예측된다는 것을 인지할 것이다.
도 9는 무릎 골관절염에 걸린 환자를 치료하는데 사용되는 본 발명에 따른 장치(10)을 예시한다. 예시된 바와 같이, 2개의 원형의 연질 전도성 자가-부착성 전극(12)을 관절선 정도에서 어느 한쪽 무릎의 피부에 위치시킨다. 전극(12)는 전력 유닛(14)에 부착시키는데, 이때 전력 유닛(14)은 이것이 종아리, 대퇴 또는 허리 둘레에 고정되는 벨크로(등록상표) 스트랩(도시되지 않음)에 부착될 수 있도록 반대 측에 벨크로(등록상표) 패치(16)을 갖는다. 전극(12)는 환자가 잠자리에 들기 전에 매일 저녁 또는 임의의 다른 편리한 시간에 피부에 위치시킬 수 있다. 물론, 다른 적합한 유형의 전극(12)를 사용할 수도 있다.
전력 유닛(14)는 바람직하게는 소형(예를 들어, 6 내지 8 온스)이고, 표준 9볼트 배터리에 의해 전력이 공급되어 5 볼트 피크-피크, 6 내지 10 mAmp, 20 mV/cm, 60 kHz의 사인파형 신호를 피부에 위치한 전극(12)에 방출한다. 이 신호를 적절한 듀티 사이클(8.3％)로 1일 당 약 30분씩 제공할 경우에는 제II형 콜라겐을 코딩하는 유전자가 유의하게 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 처리는 추가의 관절 연골 퇴보를 예방하거나 최소화시킬 뿐만이 아니라, 이미 손상되거나 퇴화된 관절 연골을 치유할 수도 있다.
상기 기재된 실시예는 제II형 콜라겐 유전자의 발현이 유의하게 상향 조절되어 관절 연골에서의 프로테오글리칸 생성이 증가될 수 있어서 관절염(골관절염 및 류마티스성 관절염 둘다), 연골 손상 및 연골 결함을 치료할 수 있다는 것을 입증한다. 제II형 골라겐과 함께 프로테오글리칸은 관절 연골의 주요 구성성분이며, 관절염의 발병시 조기에 퇴화되고 파괴된다. 본 발명은 실시예에 기재된 최적의 전기장이 제II형 콜라겐 mRNA를 유의하게 상향 조절할 수 있기 때문에 IL-β1이 존재한다고 할 지라도 프로테오글리칸 합성을 증가시킬 수 있음을 명확하게 보여준다. 당업자라면 본원에서 용량성 결합으로 기재한 적절한 전기장은 또한 등가 또는 거의 등가인 전기장 특성을 생성하는 임의의 모든 전자기계와 동등하게 효과적이라는 것을 인지할 것이다. 또한, 당업자라면 보다 구체화된 신호 특성이 더 많은 데이타점을 사용한 더 많은 실험을 통해 발견될 수 있지만, 각각의 신호 특성에서 있어서의 비교적 작은 변화는 본원에서 교시된 측면에서 당업자의 수준 내에 있다고 여겨진다는 것을 인지할 것이다.
또한, 당업자라면 본 발명에 대한 수많은 다른 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능하다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 최적의 장이, 두 개 이상이 쌍을 이루거나 열로 배열되어 가먼트, 보호대, 랩 또는 캐스트로 혼입된 적절한 표면 전극을 통해 임의의 관절에 인가될 수 있고, 용량성 결합, 유도성 결합(전자기장) 또는 혼합장에 의해 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 기재된 바람직한 실시양태에 한정되는 것이 아니며, 단지 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정된다.
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 2000년 2월 23일 출원된 미국 가특허 출원 제60/184,491호의 출원일 이익을 청구하는 국제 출원 제PCT/US01/05991호(출원일: 2001년 2월 23일)의 미국 국내 단계 특허 출원인 미국 특허 출원 제297,454호의 일부 계속 특허 출원이다.

Claims (24)

  1. 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현을 상향 조절하도록 실질적으로 최적화된 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 발생시키는 단계 및
    상기 연골 조직을 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장에 소정의 시간 기간 동안 소정의 간격으로 노출시켜 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현을 상향 조절하는 단계
    를 포함하는, 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현을 특이적이고 선택적으로 상향 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 신호 발생 단계가 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현이 실질적으로 최적화될 때까지 특이적이고 선택적인 신호의 진폭, 기간, 듀티 사이클(duty cycle), 주파수 및 파형을 선택적으로 변화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 노출 단계가 관절 연골의 연골세포를 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장에 소정의 시간 기간 동안 소정의 간격으로 1일 1회 노출시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 신호 발생 단계가 특이적이고 선택적인 신호를 원격 공급원에서 발생시키는 단계를 포함하고, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 연골 조직에 인가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 신호를 연골 조직 부근에 위치시킨 전극에 인가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 용량성 결합(capacitive coupling) 및 유도성 결합(inductive coupling) 중 하나를 통해 연골 조직에 인가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 특이적이고 선택적인 신호에 의해 전극이 용량성 결합 전기장, 전자기장 및 혼합장 중 하나를 발생시키는 것인 방법.
  8. 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현을 상향 조절하는 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 발생시키는 단계 및
    상기 연골 조직을 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장에 소정의 기간 동안 소정의 간격으로 노출시켜 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현을 선택적으로 상향 조절하는 단계
    를 포함하는, 골관절염, 류마티스성 관절염, 연골 손상 및 연골 결함 중 하나 이상을 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 장을 연골 조직에 용량성 결합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 노출 단계가 전자기장 및 혼합장 중 하나를 연골 조직에 인가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 신호 발생 단계가 약 20 mV/cm의 진폭, 사인파형, 약 1/12의 듀티 사이클 및 약 60 kHz의 주파수를 갖는 특이적이고 선택적인 전기장을 발생시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 전기장을 매 24시간마다 약 30분의 기간 동안 연골 조직에 인가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 제8항에 있어서, 신호 발생 단계가 발생된 장에 의한 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 mRNA 유전자 발현 상향 조절이 실질적으로 최적화될 때까지 특이적이고 선택적인 신호의 진폭, 기간, 듀티 사이클, 주파수 및 파형을 선택적으로 변화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장을 용량성 결합 및 유도성 결합 중 하나를 통해 연골 조직에 인가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 특이적이고 선택적인 신호에 의해 전극이 용량성 결합 전기장, 전자기장 및 혼합장 중 하나를 발생시키는 것인 방법.
  16. 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현을 상향 조절하기 위한 특이적이고 선택적인 장을 생성시키는 하나 이상의 신호를 제공하는 신호 공급원 및
    상기 장을 연골 조직에 소정의 기간 동안 소정의 간격으로 인가하여 상기 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 mRNA의 유전자 발현을 선택적으로 상향 조절하기 위한 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 수신하는, 상기 신호 공급원에 연결된 전극
    을 포함하는, 골관절염, 류마티스성 관절염, 연골 손상 및 연골 결함 중 하나 이상을 치료하기 위한 장치.
  17. 제16항에 있어서, 신호 공급원을 구동하는 휴대가능한 전력 유닛을 추가로 포함하는 장치.
  18. 제16항에 있어서, 전극을 환자 신체의 연골 조직 부근에 부착하기 위한 수단을 추가로 포함하는 장치.
  19. 제16항에 있어서, 신호 공급원을 환자 신체에 부착하기 위한 수단을 추가로 포함하는 장치.
  20. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호에 의해 발생된 장이 용량성 결합 및 유도성 결합 중 하나를 통해 상기 연골 조직에 인가되는 장치.
  21. 제20항에 있어서, 특이적이고 선택적인 신호가 사인파형, 60 kHz, 약 20 mV/cm의 진폭, 약 1/12의 듀티 사이클을 갖는 특이적이고 선택적인 전기장을 발생시키는 장치.
  22. 연골 조직을 제21항에 따른 장치에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 장에 노출시켜 연골 조직에서의 제II형 콜라겐 mRNA의 발현을 상향 조절하는 단계를 포함하는, 골관절염, 류마티스성 관절염, 연골 손상 및 연골 결함 중 하나 이상을 치료하는 방법.
  23. 제II형 콜라겐의 세포내 생성을 증가시킨다고 알려져 있거나 그에 영향을 줄 것이라고 추정되는 출발 신호를 선택하는 단계,
    제II형 콜라겐의 최적 생성을 제공하는 최적 기간이 발견될 때까지 상기 출발 신호의 인가 기간을 선택적으로 변화시키는 단계,
    제II형 콜라겐의 최적 생성이 발견될 때까지 상기 최적 기간 동안 출발 신호의 진폭을 변화시키는 단계 및
    제II형 콜라겐의 최적 생성이 발견될 때까지 상기 신호의 듀티 사이클을 변화시키는 단계
    를 포함하는, 제II형 콜라겐을 상향 조절하는 특이적이고 선택적인 전기장을 발생시키는 선택적 신호를 결정하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제II형 콜라겐의 유전자 발현의 최대 증가가 발견될 때까지 다른 신호 특성은 일정하게 유지하면서 상기 신호의 주파수 및 파형을 선택적으로 변화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
KR1020057006097A 2002-10-09 2003-10-07 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호를 사용한,제ⅱ형 콜라겐 유전자 발현의 조절 KR20050056233A (ko)

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