CN101891803B

CN101891803B - 一种软骨亲和多肽序列、其筛选方法及应用

Info

Publication number: CN101891803B
Application number: CN2010102273289A
Authority: CN
Inventors: 皮彦斌; 敖英芳; 张辛; 石俊俊; 朱敬先
Original assignee: Peking University Third Hospital
Current assignee: Peking University Third Hospital
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: CN101891803A

Abstract

本发明公开了一种软骨亲和多肽序列及其筛选方法，利用改进的噬菌体展示技术，首次将细胞和组织层面相结合的体外筛选方法运用于软骨亲和性多肽的筛选，筛选出软骨细胞亲和性和组织特异性兼备的多肽序列：DWRVIIPPRPSA，弥补了现有技术中单纯细胞筛选或组织筛选存在的不足，很好的兼顾了细胞亲和性和组织特异性。本发明还涉及该多肽在制备介导关节软骨疾病基因治疗的靶向性PEI纳米载体中的应用，实现软骨亲和多肽对PEI载体的修饰，赋予载体软骨组织特异性和细胞亲和性，实现针对软骨的靶向性治疗。此外，本发明以软骨细胞自身为筛选靶点，与现有技术中以细胞周围基质为筛选靶点相比较，具备更好的靶向效果和临床实用价值。

Description

一种软骨亲和多肽序列、其筛选方法及应用

技术领域

本发明涉及生物化学多肽的制备及其应用，具体涉及一种新的软骨亲和多肽序列及其筛选方法，本发明还涉及该多肽在制备介导关节软骨疾病基因治疗的靶向性PEI纳米载体中的应用，属于生物医学领域。

背景技术

骨关节炎是由于关节软骨退变引起的慢性骨关节疾病，常使受累关节肿胀、疼痛，僵直，活动受限，最终导致肢体失能。实际上，骨关节炎已成为老年人活动能力丧失的主要原因之一。随着我国进入老龄化社会，骨性关节炎将成为一个日趋严重的问题，给个人家庭和社会医疗卫生体系造成巨大的负担[1，2]。

骨性关节炎的治疗可分为非手术治疗和手术治疗两种。但是这两种治疗方法都存在很多缺点并严重制约其治疗效果：如长期口服药物副作用大，特异性较差；手术创伤较大，对患者身体状况要求高，以及手术费用过高等问题，给个人家庭和社会造成了极大的负担[3-7]。

因此，如何找到一种操作简便、创伤小、对损伤软骨的特异性高、作用时间长、全身反应小的有效治疗骨关节炎的手段，是极待解决的重大问题。

很多学者利用基因转染技术[8，9]，导入外源基因，促进关节软骨修复或抑制软骨退变，治疗骨关节炎。相关的生长因子，如：TGF-β[10，11]，IGF-1[12，13]，BMPs[14]等，可促进软骨修复；或导入炎性因子拮抗基因，如：IL：-1，TNF-a拮抗剂[15]，抑制炎性介质对软骨的破坏作用，可有效控制骨关节炎的进展。然而，由于这些基因治疗的非特异性，也造成了严重的并发症[16]，如：滑膜的网状内皮系统对外源基因的非特异性吞噬，使其在滑膜组织内过度表达，而软骨细胞本身的转染效率过低，导致所需转染剂量过大，出现严重的关节炎性反应、滑膜组织纤维化、异位软骨化、甚至软骨瘤样变，严重影响了基因治疗的效果。这些缺陷已成为基因治疗的瓶颈，阻碍了基因治疗技术的推广和应用[17]。

近年来，利用噬菌体展示技术[18]筛选对细胞和组织具有高度亲和性和特异性的多肽序列[19，20]，并用多肽对载体进行修饰，实现提高治疗的特异性，已成为基因治疗的主要发展方向之一。

所谓的噬菌体展示技术是将随机多肽的编码基因片段克隆入噬菌体壳膜蛋白结构基因的适当位置，在不影响其他壳膜蛋白正常功能的情况下，使外源多肽与壳膜蛋白融合表达，并展示在噬菌体表面。被展示的随机多肽序列可以保持相对独立的空间结构和生物活性。通过该方法构建的噬菌体文库可通过表面的多肽序列与靶组织或细胞发生特异性的结合，洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体，被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的筛选/扩增循环，以富集那些具有亲和性的噬菌体。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对亲和噬菌体进行鉴定，即可得到对该组织或细胞具有高度亲和性的多肽序列[18]。

早在1996年，Renata Pasqualini等人[20]，将噬菌体展示技术用于组织器官特异性多肽的筛选，取得了满意的效果。之后，很多学者分别采用噬菌体展示技术筛选出多种组织细胞的亲和多肽序列[21-23]，分别用于类风湿关节炎、心血管疾病、糖尿病以及肿瘤的靶向治疗，均取得了良好的效果[24，25]。该项技术在关节软骨基因治疗方面应用甚少，首先开展该项研究的是ROTHENFLUH[26]，他筛选出对软骨组织具有高度亲和性的多肽片段，以此修饰纳米载体，提高了软骨损伤基因治疗的靶向性，但是，其筛选的多肽片段主要是以软骨周围基质内的II型胶原为靶点，导致修饰后的纳米载体对软骨周围基质亲和性过高，无法从软骨基质中脱离，进入软骨细胞内，使该载体介导的基因转染效率过低。由此可知，以往的方法或者仅做组织层面的筛选或者仅做细胞层面的筛选，导致获取的多肽序列无法兼顾组织特异性和细胞亲和性两个要求。组织特异性可以提高基因治疗的靶向性，而细胞亲和性则可以促进外源基因的转染效率，提高治疗效率，因此，两者对基因治疗均具有重要的意义，缺一不可。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种新的既对软骨组织有较高的特异性，又对软骨细胞具有高度亲和作用的多肽序列；本发明的另一个目的是提供筛选上述多肽序列的方法；本发明还有一个目的是提供所述多肽在制备介导关节软骨疾病基因治疗的靶向性PEI纳米载体中的应用。

本发明采用了下述的技术方案以实现上述的目的：

首先，本发明对现有技术中筛选对软骨组织具有高度亲和性的多肽片段的方法进行了改进，利用噬菌体展示技术所构建的噬菌体多肽文库(Ph.D.-12^TMPhage Display Peptide Library Kit，NEB)[18]，采用组织和细胞筛选相结合的方法，筛选出既对软骨组织有较高的特异性，又对软骨细胞具有高度亲和作用的多肽序列，用以介导关节软骨疾患的靶向性治疗，克服了以往研究的缺点，提高了靶向性基因治疗的效果。该筛选方法包括以下步骤：

1、采用噬菌体展示技术所构建的噬菌体多肽文库对滑膜组织和软骨组织分别进行阴性筛选和阳性筛选，提高被筛选的多肽的组织特异性；

2、在阴性、阳性筛选之后，将软骨组织粉碎、消化；提取、纯化软骨细胞；裂解细胞，细胞裂解液内即包含对软骨细胞具有亲和性并可被软骨细胞内吞的噬菌体片段；

3、将步骤2所得的噬菌体片段进行扩增，然后再进行下一轮的筛选/扩增循环，以富集对软骨细胞具有亲和性的噬菌体，其中所述的筛选/扩增循环次数为2-4轮；

4、每轮筛选之后，对筛选获取的噬菌体菌液，即细胞裂解液，进行滴度测定，计算噬菌体的回收率，从回收率最高、亲和倍数提高显著的轮次所得的噬菌体中随机挑取多个单菌落各在1ml大肠杆菌菌液中扩增，提取噬菌体DNA，根据DNA测序结果，挑选出现频率最高且其显著性水平具有统计学意义的序列，即可获得对关节软骨组织具有特异性和对软骨细胞具有高度亲和性的多肽片段。

上述步骤1中所述的阴性筛选和阳性筛选过程包括：

(1)阳性筛选和阳性筛选样本的制备：

按常规方法制备家兔滑膜和软骨样本后，在盛有20-30片直径约5-10mm、厚度2-3mm的软骨切片的60mm细胞培养皿和盛有关节滑膜/交叉韧带/半月板、1ml用PBS(Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄2mM，NaCl 137mM，KCl 2.7mM，pH 7.4，DecentBio)稀释1倍的关节滑液的60mm细胞培养皿中，分别加入6ml封闭缓冲液(Blocking Buffer，PBS+5mg/ml BSA(album bovinefraction V，Merck))，4℃下孵育2小时；弃去封闭缓冲液，清除皿内水分后，用TBST(50mMTBS(pH 7.5，sigma)+0.1％TWeen-20(junyaobio，China))清洗6次，分别制得阳性筛选和阴性筛选样本；

(2)阴性筛选：

将10μl噬菌体多肽文库(Ph.D.-12^TMPhage Display Library，NEB)与4ml DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，Invitrogen)和1ml胺苄青霉素(1∶1000(w/V))混匀后，加至含有阴性筛选样本的细胞培养皿内，室温下，轻柔摇动60分钟，皿内留下的是与滑膜组织结合差的噬菌体菌液；

(3)阳性筛选：

抽取阴性筛选后皿内留下的的噬菌体菌液，10,000rpm离心10分钟，取上清加入阳性筛选样本的细胞培养皿内，37℃与软骨切片共同孵育过夜，使对关节软骨组织具有特异性和对软骨细胞具有亲和性的多肽片段被软骨细胞内吞。

上述步骤2中所述的可被软骨细胞内吞的噬菌体片段的提取过程包括：

(1)软骨的粉碎、消化：

弃去阳性筛选皿内噬菌体菌液，软骨切片用TBST清洗5次，5分钟/次；用眼科剪将软骨绞碎，加入用DMEM培养基稀释至浓度为0.1％的II型胶原酶(Collagen type II，Gibco)，使总体积为4ml，37℃消化6-8小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min，直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，加入等体积的DMEM培养基以中和胶原酶；消化后的细胞悬液连续通过两个400目的细胞筛，去除未消化完全的组织残渣，3000rpm，4℃离心5分钟，，保留细胞沉淀，弃上清，用1mlDMEM培养基重新悬浮细胞；

(2)软骨细胞的提取、纯化：

离心管内加入淋巴细胞分离液(Dingyuan，China)5ml，将(1)步所得软骨细胞悬浮液轻柔滴入淋巴细胞分离液上层，4℃下，400g离心30分钟，抽取水层与淋巴细胞分离液间白色细胞层，得到细胞悬液，台盼蓝(bioon，China)染色检测细胞活力达95％以上。将所得的细胞悬液在3000rpm，4℃离心5分钟，弃上清，用1ml 0.2M甘氨酸-HCl(pH 2.2)洗脱液重新悬浮细胞沉淀，室温下，孵育10钟，以洗脱结合力较差的噬菌体。通过以上步骤可清除大部分细胞周围基质，得到纯度较高的软骨细胞；

(3)软骨细胞的裂解：

用1M Tris-HCl(pH 9.1)按15％(V/V)的比例中和(2)步所得软骨细胞悬液中的甘氨酸-HCl，4℃下，3000rpm离心5分钟，弃上清，用1ml 50mM TBS(pH 7.5)重新悬浮；4℃下，3000rpm再次离心5分钟，1ml 50mM TBS(pH 7.5)重新悬浮，反复3次；将所得的细胞悬液移入1.5ml EP管内，用0.5ml 20％NP-40(Fluka，USA)悬浮软骨细胞，4℃孵育30分钟，充分裂解细胞，细胞裂解液内即包含对软骨细胞具有亲和性并可被软骨细胞大量内吞的噬菌体，此为第一轮筛选所得的噬菌体。

上述步骤3中所述的对步骤2所得的第一轮筛选的噬菌体片段进行扩增的过程包括：

(1)将细胞裂解液加入20ml处于对数早期的ER2738培养液中，在37℃摇动，孵育4.5 小时。

(2)将(1)所得的培养液加入离心管中，4℃下，10,000rpm离心10分钟，将上清移入新管中，4℃下，10,000rpm，再次离心10分钟；

(3)抽取80％体积的上清，加入到新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液(含20％(W/V)的聚乙二醇-8000，2.5M的NaCl，sigma)，使噬菌体在4℃下沉淀过夜；

(4)次日，10,000rpm，4℃下，将噬菌体菌液离心15分钟，弃上清，再次短暂离心，弃取上清；

(5)用1ml 50mM TBS(pH7.5)重新悬浮噬菌体沉淀，4℃下，离心5分钟；

(6)将上清移到新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl(同上)，在冰上孵育60分钟再次沉淀；4℃，10,000rpm离心10分钟；弃上清，重新短暂离心，再次弃上清；

(7)用200μl 50mM TBS(pH 7.5，含0.02％(w/v)NaN₃，sigma)重新悬浮沉淀，4℃，10,000rpm离心1分钟，将上清移到新离心管中，此即为扩增后的噬菌体提取液；

(8)测定扩增后的噬菌体提取液的滴度。

用扩增后的噬菌体提取液代替第一轮筛选中的噬菌体多肽文库原液，重复上述筛选方法中的步骤1-2，即得到第二轮筛选的细胞裂解液，经过2-4轮的筛选/扩增循环即可得到对软骨组织有较高的特异性，又对软骨细胞具有高度亲和的噬菌体。每轮筛选之后，对筛选获取的噬菌体菌液，即细胞裂解液，进行滴度测定，计算噬菌体的回收率，从回收率最高、亲和倍数提高显著的轮次所得的噬菌体中随机挑取多个单菌落各在1ml大肠杆菌(E.coliER2738，NEB，USA)菌液中扩增，提取噬菌体DNA，根据DNA测序结果，挑选出现频率最高且其显著性水平具有统计学意义的序列，即可获得对关节软骨组织具有特异性和对软骨细胞具有高度亲和性的多肽片段。

测序的过程如下：

(1)噬菌斑的扩增：将大肠杆菌扩增菌液(OD：0.5)按1∶100用LB培养液稀释，分装为1ml/管，每个待测序的噬菌斑克隆用一管；

(2)用灭菌牙签或吸头，在菌斑数为10-100之间的平皿内挑取单克隆蓝色菌斑到上述1ml培养管中，共挑取12个单克隆，37℃，250rpm摇床，孵育4.5-5小时；

(3)将孵育的噬菌体菌液转入离心管中，离心30秒(10000rpm，4℃)，上清移入新管，再离心30秒(10000rpm，4℃)，吸取80％体积的上清转入新离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以在4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1∶1稀释后，-20℃贮存；

(4)从上述扩增的单克隆噬菌体菌液中，吸取500μl到新离心管中；

(5)加200μl PEG/NaCl(同上)，颠倒混匀，室温放置10min；

(6)离心10min(10000rpm，4℃)，弃上清，再次短暂离心，小心吸去残余上清。

(7)噬菌体沉淀充分重悬于100μl碘化物缓冲液(Iodide buffer，10mM Tris-HCl(PH8.0)，1mM EDTA，4M NaCI，sigma)中，加入250μl乙醇，室温孵育10min；

(8)4℃，10,000rpm离心10min，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥；

(9)沉淀重悬于20μl双蒸水中，即为噬菌体模版DNA溶液；

(10)测序。

本发明的一个实施例经过四轮筛选，得到一组对关节软骨组织具有特异性和对软骨细胞具有高度亲和性的多肽序列，其长度为12个氨基酸，如序列表中的SEQ NO.1所示：Asp TrpArg Val Ile Ile Pro Pro Arg Pro Ser Ala，即：DWRVIIPPRPSA；其相应的DNA序列如序列表中的SEQ NO.2所示：

5′-GATTGGCGTGTGATTATTCCTCCTCGGCCTTCTGCG-3′。

另一方面，本发明利用由上述组织和细胞相结合的筛选方法所获得的多肽序列，对聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI，Sigma)阳离子多聚物进行修饰，制备用于介导关节软骨基因治疗的靶向性纳米载体，以实现基因治疗的靶向性和特异性，减少基因治疗的副作用，提高治疗效果。

聚乙烯亚胺(PEI)是一种经典、高效的非病毒基因载体，具有良好的组织相容性和较低的细胞毒性，广泛用于非病毒载体介导的基因治疗中[27-29]。其转染机理是，通过自身携带的正电荷将DNA凝聚成纳米级别的颗粒，避免被核酸酶降解，并促进DNA入胞，以及通过“质子泵效应”(proton-sponge mechanism)[27，30]，促进DNA从溶酶体内逸出，然后入核，最终在靶细胞内成功表达。而且，该聚合物转染的外源基因仅在染色体外转录、表达，无法整合到染色体基因组内，避免了由于外源基因的插入而导致的染色体突变或基因重排。同时，PEI侧链的-NH₂基团可用来对聚合物进行共价修饰，赋予PEI靶向性，提高基因转染效率和特异性。

为了实现对聚乙烯亚胺阳离子多聚物的修饰，本发明在所获取的12个氨基酸长度的多肽的3’C末端，连接一个半胱氨酸(C)，得到13个氨基酸长度的软骨亲和多肽：DWRVIIPPRPSAC，利用该半胱氨酸(C)残基，与PEI纳米载体的-NH₂共价耦联(图1)，实现软骨亲和多肽对PEI载体的修饰，赋予载体软骨组织特异性和细胞亲和性，实现针对软骨的靶向性治疗。

多肽对聚乙烯亚胺阳离子多聚物的修饰包括以下PEI的活化和多肽耦联步骤：

(1)干燥的氮气环境下，将PEI溶于DMSO(二甲基亚砜，Dimethylsulfoxide，sigma，中，配成10mg/ml的溶液；

(2)将MBS(Maleiimido-benzoic acid Nhydroxysuccinimide ester，sigma)加入PEI溶液中，37℃下，共同孵育15分钟，以活化PEI聚合物；

(3)将FITC(异硫氰酸荧光素，Fanbo，China)荧光标记的软骨亲和多肽(DWRVIIPPRPSAC)溶解于去离子水中，用注射器将多肽溶液缓慢滴入活化的PEI溶液中，室温下孵育过夜，以利于多肽的半胱氨酸残基(C)与PEI的亚氨基(-NH₂)共价结合(图1)；

(4)用超纯水过滤透析多肽耦联的PEI聚合物，透析2天，每天至少换水5次；

(5)将透析管内的溶液冷冻干燥，得到软骨亲和性多肽修饰的聚乙烯亚胺阳离子多聚物。

本发明的有益效果是：

1、本发明首次将细胞和组织层面相结合的体外筛选方法运用于软骨亲和性的筛选，筛选出软骨细胞亲和性和组织特异性兼备的多肽序列：DWRVIIPPRPSA，弥补了现有技术中单纯细胞筛选或组织筛选存在的不足，很好的兼顾了细胞亲和性和组织特异性，同时，本实验以软骨细胞自身为筛选靶点，与现有技术中以细胞周围基质为筛选靶点相比较，具备更好的靶向效果和临床实用价值；

2、与作为对照的随机错配多肽序列(ARDWPIRPVPIS)相比，本发明筛选出的多肽片段具有以下几个特点：

a.可选择性地与软骨组织结合，而与滑膜组织结合力较差；

b.与噬菌体空载体相比，筛选的噬菌体对软骨细胞的亲和性为噬菌体空载体的256.5倍；本发明筛选出的亲和多肽序列与随机错配多肽序列相比，前者对软骨细胞的亲和性为后者的34.20倍；

c.有较强的渗透作用，可透过胶原纤维和粘多糖构成的物理屏障和电荷屏障，达到软骨细胞表面，并特异性地与软骨细胞结合，可被软骨细胞大量内吞；

3、利用筛选的多肽序列对PEI纳米载体进行修饰后，赋予载体软骨细胞靶向性，提高了基因治疗的靶向性和效果，其原因是：

a.减少了纳米载体与关节滑膜组织非特异性结合的程度，降低了因此诱发的关节炎性反应和免疫排异反应，从而减少了基因治疗的副作用；

b.减少了软骨周围基质对纳米载体的物理和静电阻拦，提高了纳米载体与软骨细胞的结合程度，通过多肽介导的入胞功能，提高了纳米载体的入胞效率，进而，促进了对软骨细胞的转染效果，提高了基因治疗的效果。

对本发明所用的缓冲液、培养基等说明如下：

PBS：磷酸缓冲盐溶液(Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM，NaCl 137mM，KCl 2.7mM，pH 7.4，DecentBio)；

PBST：(PBS，0.1％Tween(Sigma)，1％BSA(album bovine fraction V，Merck))；

TBS：Tris缓冲盐溶液(50mM，pH7.5，sigma)；

TBST：50mM TBS(pH 7.5，sigma)+0.1％TWeen-20(junyaobio，China)；

甘氨酸-HCl：0.2M Glycine-HCl(pH2.2，sigma)

PEG/NaCl溶液：含20％(W/V)聚乙二醇-8000，2.5M NaCl，sigma；

封闭缓冲液(Blocking Buffer)：PBS+5mg/ml BSA(Merck)；

LB液体培养基：10g/L细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-trytone)，5g/L细菌培养用酵母提取物(yeast extract)，5g/L NaCl，sigma；

DMEM培养基：Dulbecco’s modified Eagle medium，Invitrogen：

顶层琼脂糖培养基：LB培养基+7g/L琼脂糖(agarose)，sigma；

LB/IPTG/Xgal琼脂平板：0.05g/L isopropyl β-D-thiogalactoside(IPTG)，0.04g/L5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(Xgal)+15g/L琼脂粉(agar)，sigma；

碘化物缓冲液(Iodide buffer)：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，4M NaCl，sigma。

附图说明

图1软骨亲和多肽通过半胱氨酸残基与PEI聚合物偶联。

图2噬菌体滴度测定中的噬菌体蓝斑实验结果，A：蓝斑数量为10²-10³个噬菌斑的平板；B：蓝斑数量10¹-10²个噬菌斑的平板。

图3实施例1中第一轮至第四轮筛选的噬菌体回收率。

图4实施例3中噬菌体对兔来源软骨细胞亲和性的检测结果。

图5实施例4中软骨亲和多肽对人来源软骨细胞亲和性的鉴定的流式细胞分析结果；A组：空白对照组(control group)，没有添加荧光标记多肽；B组：错配的多肽组(scramble group)；C组：软骨亲和多肽组(affinity group)。

图6实施例4中软骨亲和多肽对人来源软骨细胞亲和性的鉴定的激光共聚焦显微镜观察结果；A图：随机错配多肽；B图：软骨亲和多肽。

图7实施例5软骨亲和性多肽的组织亲和性鉴定中的激光共聚焦显微镜观察结果；A图：软骨亲和多肽组；B图：放大后的A图的局部(胞核部分)；C图：错配多肽组；D图：放大后的C图的局部(软骨细胞内部)。

具体实施方式

本发明(包括以下实施例)中涉及的噬菌体滴度测定均采用下述方法(参见Ph.D.-12^TMPhage Display Peptide Library Kit操作手册)：

(1)接种E.coli ER2738(NEB，USA)单菌落于5-10ml LB液体培养基(10g/L细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-trytone)，5g/L细菌培养用酵母提取物(yeast extract)，5g/LNaCl，sigma)中，37℃，250rpm摇床孵育至对数中期(OD₆₀₀：～0.5)；

(2)微波炉加热融化顶层琼脂糖培养基(LB培养基+7g/L琼脂糖(agarose)，sigma)，分成3ml/份分装到灭菌试管中，每个噬菌体稀释度用一管，保存于45℃备用；

(3)37℃预温LB/IPTG/Xgal琼脂平板(0.05g/L isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)，0.04g/L 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(Xgal)，15g/L琼脂粉(agar)，sigma)，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用；

(4)用LB培养液对噬菌体进行10倍比系列稀释。建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：10⁸-10¹¹；未扩增的淘选洗脱物：10¹-10⁴；每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染；

(5)当大肠杆菌菌液(步骤：(1))达对数中期时，将菌液分成200μl/等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管；

(6)每管大肠杆菌菌液中分别加入10μl不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min；

(7)将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂糖培养基管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal琼脂平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；

(8)待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜；

(9)检查平板，计数有～10²个噬菌斑的平板上的斑数(图2)，然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。

实施例1 用噬菌体展示技术筛选软骨亲和多肽序列

1、第一轮筛选

(1)家兔滑膜和软骨样本制备：

选取4周大小的健康家兔，雌雄不限，用100mg/Kg戊巴比妥钠过量麻醉致死。无菌条件下分离家兔双膝关节，剔除关节周围肌肉韧带组织，显微镜下，以锋利刀片刮除关节软骨表面滑膜组织，切取关节软骨和滑膜组织。PBS(Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM，NaCl 137mM，KCl 2.7mM，pH 7.4，DecentBio)充分洗涤3次。

阳性筛选皿：将家兔关节软骨切成直径约5-10mm，厚度2-3mm的软骨切片，约20-30片，置于60mm培养皿内；

阴性筛选皿：将家兔关节滑膜/交叉韧带/半月板(以滑膜为主，总质量：1000-1500mg)、1ml关节滑液(用PBS稀释1倍)，置于60mm培养皿内；

每个培养皿加入封闭缓冲液(Blocking Buffer，PBS+5mg/ml BSA(album bovine fractionV，Merck))6ml，孵育2小时(4℃)；弃去Blocking Buffer，清除皿内水分，用TBST(50mMTBS(pH 7.5，sigma)+0.1％TWeen-20(junyaobio，China))清洗6次；

(2)阴性筛选：

将10μl滴度为3×10¹¹的噬菌体多肽文库(Ph.D.-12^TMPhage Display Library，NEB)，与4ml DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，Invitrogen)和1ml胺苄青霉素(1∶1000(w/V))混匀后，加至阴性筛选皿内，与滑膜/交叉韧带/半月板/滑液共同孵育，室温下，轻柔摇动60分钟。

(3)阳性筛选：

抽取阴性筛选后的噬菌体菌液，4℃下，10,000rpm离心10分钟，取上清加入阳性筛选皿内，37℃与软骨切片共同孵育过夜；

(4)提取可被软骨细胞内吞的噬菌体片段：

a.软骨的粉碎、消化：

次日，弃去阳性筛选皿内噬菌体菌液，软骨切片用TBST清洗5次，5分钟/次；用眼科剪将软骨绞碎至直径1mm³大小，加入用DMEM培养基(Invitrogen，USA)稀释至浓度为0.1％的II型胶原酶(Collagen type II，Gibco)，使总体积为4ml，37℃消化6-8小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min，直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物；倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，加入等体积的DMEM培养基(Invitrogen，USA)以中和胶原酶，消化后的细胞悬液连续通过两个400目的细胞筛，去除未消化完全的组织残渣，3000rpm，4℃离心5分钟，，保留细胞沉淀，弃上清，用1mlDMEM培养基(Invitrogen，USA)重新悬浮细胞。

b.软骨细胞的提取、纯化：

10ml离心管内加入5ml淋巴细胞分离液(Dingyuan，China)，将a步所得软骨细胞悬浮液1ml轻柔滴入淋巴细胞分离液上层，4℃下，400g离心30分钟，抽取水层与淋巴细胞分离液间白色细胞层，得到细胞悬液。台盼蓝(bioon，China)染色检测细胞活力达95％以上。将所得的细胞悬液在3000rpm，4℃离心5分钟，弃上清，用1ml 0.2M甘氨酸-HCl(Glycine-HCl，pH 2.2，sigma)洗脱液重新悬浮细胞沉淀，室温下，孵育10分钟，以洗脱结合力较差的噬菌体。通过以上步骤可清除大部分细胞周围基质，得到纯度较高的软骨细胞。

c.软骨细胞的裂解：

用1M Tris-HCl(pH 9.1，sigma)按15％(V/V)的比例中和b步所得软骨细胞悬液中的Glycine-HCl(pH 2.2)，3000rpm离心5分钟，弃上清，用1ml 50mM TBS(pH 7.5，sigma)重新悬浮；3000rpm再次离心，1ml 50mM TBS(pH 7.5，sigma)重新悬浮，反复3次。将所得的细胞悬液移入1.5ml EP管内，用0.5ml 20％NP-40(Fluka，USA)悬浮软骨细胞，/4℃孵育30分钟，充分裂解细胞。细胞裂解液内即包含对软骨细胞具有亲和性并可被软骨细胞大量内吞的噬菌体。测定所得细胞裂解液中噬菌体的滴度为3.3×10³PFU。

2、噬菌体扩增(参见Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit操作手册)：对第一轮筛选所得的细胞裂解液内噬菌体滴度进行扩增：

(1)将细胞裂解液加入20ml ER2738培养液中(处于对数早期OD～0.1-0.2)，在37℃摇动，孵育4.5小时；

(2)将步骤1所得的培养液加入离心管中，4℃下，10,000rpm离心10分钟，将上清移入新管中，再次4℃下，10,000rpm，离心10分钟；

(3)抽取80％体积的上清，加入到新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液(含 20％(W/V)的聚乙二醇-8000(PEG)，2.5M NaCl，sigma)，使噬菌体在4℃下沉淀过夜；

(4)次日，10,000rpm，4℃下，离心噬菌体菌液15分钟。弃上清，再次短暂离心，弃取上清；

(5)用1ml 50mM TBS(pH7.5)重新悬浮噬菌体沉淀，4℃下，10,000rpm，离心5分钟；

(7)用200μl的50mM TBS(pH 7.5，含0.02％(w/v)NaN₃，sigma)重新悬浮沉淀，4℃下，10,000rpm，离心1分钟，将上清移到新离心管中。此即为扩增后的噬菌体提取液；

(8)测量扩增后的噬菌体提取液的滴度为1×10¹¹PFU/10ul；4℃保存。

3、第二轮筛选

用100μl步骤2所得的扩增后的噬菌体提取液代替步骤1第一轮筛选中的噬菌体文库原液，重复第一轮筛选的步骤(1)-(4)，即得到经二轮筛选的细胞裂解液，测定其噬菌体滴度为1.6×10⁵PFU。第一轮筛选噬菌体回收率为3.30E-09，第二轮筛选噬菌体回收率为1.6×10^-7。用同样的方法进行第三、第四轮的筛选，每轮筛选之后，对筛选获取的噬菌体菌液进行滴度测定，其回收率结果如表1、图3所示。

表1 从软骨细胞中回收噬菌体的回收率

	加入的噬菌体滴度(pfu)	回收的噬菌体滴度(pfu)	回收率	与第一轮的亲和倍数比
					第一轮	1.0E+12	3.3E+3	3.3E-9	1
第二轮	1.0E+12	1.6E+5	1.6E-7	48.48
					第三轮	1.0E+12；	6.4E+4	6.4E-8；	19.39
第四轮	1.0E+12；	8E+3	8E-9；	2.42

4、噬菌体多肽片段测序(参见Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit操作手册)

根据表1的结果，选择回收率最高、亲和倍数增加最明显的第二轮筛选所得的细胞裂解液，从中挑取单菌落，筛选软骨亲和多肽序列，同时也在第一轮筛选所得的细胞裂解液中挑取单菌落，作为对比。在滴度测定过程中，从第一、二轮细胞裂解液所得的蓝斑数在10-100之间的xgal培养板(见图2)上各随机挑取12个菌落分别在1ml E.coli ER2738大肠杆菌(NEB，USA)菌液中扩增，提取噬菌体DNA进行测序，测序步骤如下：

(2)用灭菌牙签或吸头，在菌斑数为10-100之间的平皿内挑取单克隆蓝色菌斑到上述1ml培养管中，每轮细胞裂解液各挑取12个单克隆，37℃，250rpm摇床，孵育4.5-5小时；

(3)将孵育的噬菌体菌液转入离心管中，离心30秒(10000rpm，4℃)，上清移入新管，再离心30秒(10000rpm，4℃)；吸取80％体积的上清转入新离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以在4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1∶1稀释后，-20℃贮存。

(5)加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min；

(8)离心10min，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥；

(9)沉淀重悬于20μ1双蒸水中，即为噬菌体模版DNA溶液；

(10)测序(样本送北京奥科生物公司测序)。

测序的结果如表2所示：

表2 多肽序列筛选结果

	第一轮筛选	第二轮筛选
			多肽 /DNA序列	STTPQSVYASAP 5-AGTGCTACTCCGCAGAGTGTTTATGCTAGTGC GCCT-3′ PMPSNRPGYNVS 5-TCGATGCCGTCTAATCGTCCTGGTTATAATGT TAGT-3′ YGCNTTPCHWAM 5-TATGGGTGTAATACGACGCCGTGTCATTGGGC GATG-3′ GRLDDHNQSRML 5-GGGCGTCTTGATGATCATAATCAGTCTCGTAT GCTT-3′ DWRVIIPPRPSA(2/12) 5-GATTGGCGTGTGATTATTCCTCCTCGGCCTTC TGCG-3′ NTSHE ILWQTYP 5-AATACTAGTCATGAGATTTTGTGGCAGACTTA TCCT-3′ SHGTLQRVHTWS 5-TCTCATGGGACGTTGCAGCGTGTTCATACTTG GTCT-3′ AAFTPRPWPSTV 5-GCGGCGTTTACGCCGCGGCCTTGGCCGTCTAC TGTT-3′ YDESTYHQGQKR 5-TATGATGAGTCTACTTATCATCAGGGGCAGAA GCGT-3′	DWRVIIPPRPSA(12/12) 5′-GATTGGCGTGTGATTATTCCTCCTCGGCCTTC TGCG-3′

由上表的测序结果可知，其中第一轮测定的12个噬菌体单克隆中，2个克隆的多肽序列为：DWRVIIPPRPSA；第二轮测定的12个噬菌体单克隆中，12个克隆的多肽序列均为：DWRVIIPPRPSA。因此，两轮筛选后，获取噬菌体软骨亲和多肽序列：DWRVIIPPRPSA。

实施例2 用关节软骨组织特异性和软骨细胞高度亲和性的多肽修饰聚乙烯亚胺阳离子多聚物

1、多肽合成：合成筛选获得的软骨亲多肽，并在其3’C末端再连接一个半胱氨酸(C)，得到相应的软骨亲多肽DWRVIIPPRPSAC(由Scilight-peptide Inc，china合成)，采用FITC (异硫氰酸荧光素，Fanbo，China)荧光染料对多肽进行标记。在多肽的3’端链接一个半胱氨酸残基(C)是为了对PEI(25KDa)进行共价修饰，以便于与PEI的亚氨基(-NH₂)共价结合。

2、PEI的活化和多肽耦联：

(1)干燥的氮气环境下，将5mg PEI溶于500μl DMSO(二甲基亚砜，Dimethylsulfoxide，sigma)中，配成10mg/ml的溶液；

(2)将1mg的MBS(Maleiimido-benzoic acid Nhydroxysuccinimide ester，sigma)加入PEI溶液中，37℃下，共同孵育15分钟，以活化PEI聚合物；

(3)将5mg FITC(异硫氰酸荧光素，Fanbo，Cha)荧光标记的软骨亲和多肽(DWRVIIPPRPSAC)溶解于250μl去离子水中，用注射器将多肽溶液缓慢滴入活化的PEI溶液中，室温下孵育过夜，以利于多肽的半胱氨酸残基(C)与PEI的亚氨基(-NH₂)共价结合(图1)；

实施例3软骨亲和性多肽对家兔来源软骨细胞亲和性的鉴定

本实施例用含DWRVIIPPRPSA多肽片段的软骨亲和性噬菌体来检测其对家兔来源软骨细胞的亲和性。

1、家兔来源软骨细胞培养：

(1)无菌条件下切取家兔膝关节全层软骨片，用含0.1％(W/V)胺苄青霉素的PBS冲洗3次，剪去非软骨组织如滑膜组织或纤维结缔组织；

(2)将清洗后的软骨，移入60mm培养皿中，加入0.2％的胰蛋白酶(Gibco，USA)6ml，37℃培养箱中消化60min(最好在搅伴状态下)，除去软骨表面滑膜和成纤维细胞，弃去胰蛋白酶，用含0.1％(W/V)胺苄青霉素的PBS(pH 7.4)冲洗3次；

(3)用1ml PBS重新悬浮软骨片，无菌刀片将软骨片切成1mm³大小的碎粒；

(4)加入5ml 0.2％的II型胶原酶(Gibco，USA)，37℃，5％CO₂培养箱中消化4h，每30分钟晃动培养皿一次，直到显微镜下观察，软骨块基本被消化，软骨基质崩解；

(5)将消化后的软骨移入10ml离心管内，加入等体积的含10％小牛血清(FBS，Hyclone，USA)的DMEM培养基(Invitrogen，USA)中和胶原酶，4℃下，1000rpm，离心10分钟，弃上清液，PBS(同上)反复清洗3次，4℃下，1000rpm，再离心10分钟，弃上清液，收集细胞沉淀；

(6)加入1ml含10％小牛血清(FBS，Hyclone，USA)的DMEM培养基(Invitrogen，USA)重新悬浮细胞，吹打均匀后移入60mm培养皿中，补足培养基，显微镜下观察细胞数量，以2×10⁴/60mm培养皿的密度为宜；

(7)当细胞融合率达到90％以上时，用含0.05％胰蛋白酶(Gibco，USA)的0.02％EDTA(sigma，USA)，37℃下，消化5分钟，直到细胞完全脱落，收集悬液，4℃下，1000rpm，离心5min，弃上清液，DMEM培养基重新悬浮细胞，六孔细胞培养板上传代。

2、软骨亲和性噬菌体对家兔来源软骨细胞亲和性的检测：

(1)方法：当1所述的家兔来源软骨细胞在6孔细胞培养板内培养至融合率90％以上后，弃去培养基，用PBST(PBS，0.1％Tween，1％BSA)漂洗3次，10min/次。然后在其中两个孔的软骨细胞中，分别添加经过两轮筛选后的软骨亲和性噬菌体(含DWRVIIPPRPSA多肽片段的噬菌体克隆，100μl(1.3×10⁹PFU/10μl))和空载体(没有插入多肽序列的噬菌体克隆，10μl(3.5×10¹⁰PFU/10μl))，用DMEM培养基将溶液体积补至2ml，37℃、5％CO₂孵箱内培养2.5小时后，在摇床上用PBST漂洗4次，10min/次，与1ml Glycine-HCl(pH 2.2)溶液孵育10分钟，洗脱未结合噬菌体，按15％(V/V)的比例加入1M TBS(pH9.1)中和Glycine，弃去上清，再次用PBS清洗3次。用1ml的20％NP-40(PBS稀释)，在4℃下，孵育30分钟，裂解细胞后，测量其噬菌体滴度。

(2)检测结果：如表3和图4所示，回收的噬菌体空载体滴度为1.0×10⁴pfu，回收的软骨亲和性噬菌体滴度为1.0×10⁶pfu。亲和噬菌体回收率为噬菌体空载体回收率的265.5倍，说明经过两轮筛选后，噬菌体亲和性有很大的提高。

表3：噬菌体对家兔来源软骨细胞亲和性鉴定

实施例4 软骨亲和多肽对人来源软骨细胞亲和性的鉴定：

1、人来源软骨细胞培养：患者64岁，男性，重度骨关节炎患者，行双膝关节置换术。于膝关节非负重区取材。原代软骨细胞培养至融合率90％以上，弃取培养基，用PBS溶液清洗，添加0.1％的II型胶原酶(GIBCO，USA)(用量为0.1ml/cm²细胞)，37℃，5％CO₂下孵育10分钟，用含0.05％胰蛋白酶(Gibco，USA)的0.02％EDTA溶液(用量为0.1ml/cm²细胞)消化5分钟，直到细胞完全脱落，收集悬液，4℃下，1200r/min离心5min，弃上清，添加10ml含10％小牛血清(FBS，Fetal Bovine serum Dfined，Hyclone，USA)的DMEM培养基(GIBCO，USA)，重新悬浮软骨细胞，于6孔板和30mm激光共聚焦专用培养皿上传代。

2、软骨亲和多肽对人来源软骨细胞亲和性的鉴定

(1)软骨亲和多肽和错配多肽(对照)的合成：

本实施例所用的软骨亲和多肽的序列是在实施例1筛选出的软骨亲和多肽DWRVIIPPRPSA的3’C末端再连接一个半胱氨酸(C)所得的序列：DWRVIIPPRPSAC；错配多肽的序列是在本发明设计的多肽序列ARDWPIRPVPIS的3’C末端再连接一个半胱氨酸(C)所得的序列：ARDWPIRPVPISC，两者均由Scilight-peptide Inc，china合成，并采用FITC(异硫氰酸荧光素，Fanbo，China)荧光染料对多肽进行标记。

(2)方法：当1所述的人来源软骨细胞在6孔板内培养至融合率90％以上后，弃去培养基，用PBST(PBS，0.1％Tween，1％BSA)漂洗3次，10min/次。然后在6孔板的不同孔内，分别加入1μM荧光染料标记的软骨亲和多肽(FITC-DWRVIIPPRPSAC)和错配多肽(对照，FITC-ARDWPIRPVPISC)，用DMEM培养基稀释到2ml，孵育3.5小时，PBS反复清洗3次，10min/次。

(3)流式细胞分析：在上述孵育的6孔板内添加II型胶原酶(Gibco，USA)(3mg/ml)，37℃5％CO₂下孵化10分钟，用含0.05％胰蛋白酶(Gibco，USA)的0.02％EDTA(Sigma，USA)溶液消化5分钟，直到细胞完全脱落，收集悬液，1000rpm，离心5分钟，弃上清，再次用PBS悬浮细胞，重复3次，400目滤网过滤细胞后，再次离心，0.5ml PBS重新悬浮细胞后，移入流式细胞管内，进行流式细胞分析，没有添加任何多肽的原代软骨细胞作为为空白对照组。

流式细胞分析结果：如图5所示：A空白对照组，平均荧光强度为9.95；B与错配多肽孵育的原代软骨细胞，平均荧光强度为37.42；C与软骨亲和多肽孵育的原代软骨细胞，平均荧光强度为1279.9。软骨亲和多肽组的荧光强度为错配多肽的34.20倍，说明软骨亲和多肽对人来源软骨细胞具有显著的亲和性。

(4)激光共聚焦显微镜观察及其结果：人来源软骨细胞在激光共聚焦培养皿上原代培养至融合率大于90％后，分别与1μM FITC标记的软骨亲和多肽(FITC-DWRVIIPPRPSAC)和错配多肽(FITC-ARDWPIRPVPISC)孵育3.5小时，然后加入1ml的Hoechst(用PBS按1∶1000(V/V) 比例稀释，Fanbo，china)荧光染料进行胞核复染，激光共聚焦显微镜下，观察FITC绿色荧光在软骨细胞中的分布情况，可见软骨亲和多肽可大量聚集在软骨细胞周围和内部(图6B)，而错配的随机多肽则仅有少量被软骨细胞随机内吞(图6A)。说明软骨亲和多肽对人来源的软骨细胞具有很高的亲和性，并且能易化细胞的内吞功能，同时，也说明获取的亲和多肽序列没有种属特异性，不但对兔来源的软骨细胞具有亲和性，对人来源的软骨细胞也表现出很高的亲和性。

实施例5软骨亲和性多肽对家兔来源软骨组织亲和性的鉴定

选取4周大小健康家兔，雌雄不限，用100mg/Kg戊巴比妥钠过量麻醉致死。无菌条件下分离家兔双膝关节，剔除关节周围肌肉韧带组织，显微镜下，以锋利刀片分离家兔关节软骨组织，PBS充分洗涤3次备用。

2、软骨亲和性多肽对家兔来源软骨组织亲和性的鉴定

(1)软骨亲和多肽和错配多肽(对照)的合成：同实施例4。

(2)方法：2μmol绿色荧光标记软骨亲和多肽(FITC-DWRVI IPPRPSAC)和错配多肽(FITC-ARDWPIRPVPISC)分别加入60mm平皿内，用DMEM培养基稀释至3ml，37℃，5％CO₂下与软骨组织共同孵育32小时之后，弃去包含多肽的培养基，用新鲜培养基清洗3次，摇晃30min/次，之后用PBS清洗3次，摇晃5min/次。OCT冰冻包埋剂(Optimal Cutting Temperature，Sakura，USA)包埋，液氮冷冻后，冰冻切片机切片，厚度10μm，铺板后，用4％多聚甲醛固定10分钟，PBS清洗后，用PBST(PBS+1％tritonX-100)孵育3次，每次5min，PBS再次清洗，加入Hoechst(用PBS按1∶1000(V/V)比例稀释，Fanbo，china)孵育5分钟，PBS清洗3次，10min/次，甩干切片，50％甘油封片。

(3)激光共聚焦显微镜观察OCT包埋冰冻切片的结果：

如图7A所示，软骨亲和多肽可在软骨组织内富集，而且多集中在软骨细胞内的胞核内部与周围(图7B)，而从图7C可见，错配多肽序列却很少聚集在软骨组织中，且没有进入软骨细胞内部(图7D)，说明软骨亲和多肽对软骨组织具有高度的亲和性，可以穿透软骨周围基质，进入软骨细胞，并在软骨细胞内富集。

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Claims

1.一种对软骨组织具有特异性和对软骨细胞具有亲和性的多肽，其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO.1，即：DWRVIIPPRPSA。

2.权利要求1所述的多肽在制备介导关节软骨疾病基因治疗的靶向性聚乙烯亚胺阳离子聚合物纳米载体中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于在所述多肽的3’C末端，连接一个半胱氨酸(C)，利用该半胱氨酸(C)残基与聚乙烯亚胺阳离子聚合物纳米载体的-NH₂共价耦联，制备介导关节软骨疾病基因治疗的靶向性纳米载体。