CN101407546B

CN101407546B - 全人源抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体

Info

Publication number: CN101407546B
Application number: CN2008101550893A
Authority: CN
Inventors: 王旻; 陈卫; 张娟; 李海鑫; 张弢
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2008-11-03
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2028-11-03
Also published as: CN101407546A

Abstract

本发明公开了与人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)特异性结合的全人源单链抗体。本发明的抗体由一条柔性连接肽将抗体的轻链和重链可变区首尾相连而形成。本发明抗体在体外测试可中和hTNF-α的活性，可以用于检测hTNF-α，也适用于治疗与hTNF-α有关的疾病，如类风湿性关节炎和克罗恩氏病。本发明亦包括表达本发明全人源单链抗体的核酸、载体和宿主细胞。

Description

全人源抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可与人TNF-α特异结合的单链抗体。

背景技术

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)主要是由活化的单核/巨噬细胞产生的一种细胞因子，最初生成的是由233个氨基酸组成的相对分子质量约26kDa的前体蛋白，N端在胞内，C端在胞外，称为跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)。在金属蛋白酶作用下胞外部分水解为分子量约17kDa的157个氨基酸组成的多肽，称为可溶性分泌型TNF-α(S-TNF-α)。成熟TNF-α(即S-TNF-α)以三聚体形式与细胞表面的TNF受体(TNFR)结合，介导多种生物学活性。这是一种具有多种生物学效应的细胞因子，早期研究发现TNF-α能诱导肿瘤细胞坏死或凋亡，但后来发现TNF-α是介导炎症反应的主要细胞因子，也是引起发热和败血症休克的重要因素，并在心衰、移植排斥反应和自身免疫疾病中起重要作用。

正常水平的TNF-α可以参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复，引起肿瘤细胞凋亡等；但TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤，例如类风湿性关节炎(RA)、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、移植物抗宿主病(GVHD)、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭等多种疾病。应用TNF-α拮抗剂治疗类风湿性关节炎和克罗恩氏病等免疫性疾病取得了肯定的结果，进一步说明降低TNF-α水平确实是治疗这些疾病的一个有效措施，将促使人们去开发更加有效的拮抗TNF-α的新型分子。其他与高TNF-α水平密切相关的一些疾病也为TNF-α新型拮抗分子的应用提供了广阔的空间。

抗体对靶标分子具有高特异性和高亲和力，大大减少了脱靶所造成的副作用，正在发展成为国际药品市场上一大类新型治疗剂。尤其近年来开发的全人源单克隆抗体，避免了早期鼠源抗体的免疫原性，是一种理想的药物形式。目前，针对TNF-α的治疗抗体，美国FDA已经批准了三个，分别是Remicade(嵌合抗体)，Humira(全人源抗体)和Cimzia(人源化抗体，Fab’)。Remicade属于嵌合抗体，仍然保留一些鼠源序列，因此它们可能引起有害的免疫反应，即人抗嵌合抗体反应(HACA)。特别是当长期给药时，例如用于慢性适应症，如类风湿性关节炎。Humira是全人源抗体，长期给药不会产生人抗鼠抗体反应(HAMA)，而且血清半衰期长，降低了给药频率。Humira是通过哺乳动物细胞发酵生产的。目前哺乳动物细胞发酵产量低，而且生产成本高，导致Humira价格昂贵。类风湿性关节炎患者长期使用Humira，必然会产生高昂的治疗费用。Cimzia是PEG化的Fab’片段，通过E.coli发酵制备，降低了生产成本。但Cimzia是人源化抗体，仍然保留一些鼠源序列。

因此，有必要研究全人源抗hTNF-α的单链抗体，并且通过E.coli发酵降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗人TNF-α(hTNF-α)单链抗体。本发明抗体的特征为特异性结合hTNF-α，在体外L929细胞实验中能中和TNF-α诱导的细胞毒性。

全人源抗hTNF-α单链抗体基因序列全长711个核苷酸，预期有237个氨基酸。具有重链可变区(见图2)和轻链可变区(见图1)，通过柔性肽连接。

本发明通过噬菌体展示技术，筛选得到一个能特异性结合hTNF-α的全人源单链抗体F6；构建好了原核表达载体pET22b-F6，转化到BL21菌株，用IPTG诱导表达；利用超声破碎细胞，低温离心去细胞碎片，将上清过镍柱，进行分离纯化；Western Blotting鉴定分离纯化得到的F6；检测F6对TNF-α诱导的L929细胞毒性的抑制作用。IC₅₀约1.5×10^-8M。

附图说明

图1展示F6的轻链可变区的核苷酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序列。在所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3下划线。

图2展示F6的重链可变区的核苷酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序列。在所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3下划线。

图3是SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述构建成功的BL21(含pET22b-F6)的诱导表达。

图4是SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的F6片段通过镍柱进行分离纯化的结果。

图5展示利用Western Blotting鉴定分离到的F6。

图6是一曲线图，描述全人源抗hTNF-α单链抗体F6对TNF-α诱导的L929细胞毒性的抑制。

具体实施方式

实施例1 全人源抗hTNF-α单链抗体的筛选

以包被缓冲液(50mM NaHCO₃，pH9.6)稀释hTNF-α至100μg/ml；取4ml加入到免疫管中，4℃包被过夜；次日，弃上清，PBS迅速洗管3次；2％MPBS(含有2％脱脂牛奶的PBS)，37℃封闭2h；弃封闭液，用PBS迅速洗管3次；将噬菌体抗体库(10¹²～10¹³p.f.u)悬浮于4ml 2％MPBS并加入到免疫管中，室温反复倒转30min后，于室温静置90min以上；以含有0.1％Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污剂；加入1ml 100mM三乙胺(700μl 7.18mol/L三乙胺加入到50ml水中)，室温反复倒转孵育10min，进行特异性洗脱；0.5ml 1M Tris(pH7.4)用于迅速中和洗脱下来的噬菌体；中和后的噬菌体用于感染对数期的TG1菌，进行扩增和制备，用于下一轮筛选。

实施例2 构建原核表达质粒pET22b-F6

将F6基因或pET22b载体使用Nco I、Not I(购自Takara)双酶切，反应体系如下：

将上述反应体系在37℃反应2h，1.0％琼脂糖电泳，切胶回收，样品TE溶解，-20℃保存备用。

将双酶切后的F6基因和pET22b载体用T4连接酶(购自Takara)连接，反应体系如下：

将上述反应体系在16℃反应12h。

取构建好的质粒pET22b-F6 10μl，加入到90μl感受态细胞(BL21)悬液中，充分混匀；冰浴放置30min后，立即放入42℃水浴中热休克45s，再冰浴放置2min；加入900μl新鲜的LB液体培养基，37℃振荡培养45min；3000rpm/min离心10min后，弃上清夜；用100μl新鲜LB重悬菌体沉淀，均匀涂布于含100μg/ml Amp的LB固体培养基上，37℃倒置培养12～16h，挑选单克隆测序。

实施例3 抗hTNF-α单链抗体的可溶性表达及分离纯化

挑选测序正确的菌株，培养至OD₆₀₀≈0.6，加入终浓度1mM的IPTG，37℃诱导过夜，12％ SDS-PAGE检测诱导表达的结果(图3)。箭头所指的条带是诱导表达的目的蛋白，条带大小约28kDa，与理论值相符合。

6000rpm/min，4℃离心5min，收集菌体；PBS重悬菌体，超声破碎(超声3s，间隙3s，总共10min)；10000rpm/min，4℃离心20min，保留上清；将上清过镍柱(Novagen产品)，用不同浓度的咪唑洗脱；12％SDS-PAGE检测纯化的结果(图4)，-20℃保存目的蛋白。图4中箭头所指的目的条带大小约28kDa，符合图3诱导表达的结果。

实施例4 抗hTNF-α单链抗体的鉴定

纯化得到的F6进行变性SDS-PAGE电泳，胶浓度为12％；4℃，100mA恒流转印2h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore)；转印结束，将膜在5％MTBS(含有5％脱脂牛奶的TBS)中室温封闭1h；用5％MTBS按1∶1000稀释anti-6×His抗体(Novagen产品)，室温孵育1h，TBS洗涤3遍，每次10min；用5％MTBS按1∶10000稀释HRP-anti-Mouse二抗(购自联科)，室温孵育1h，TBS洗涤3遍，每次10min；用DAB显色(图5)。

实施例5在L929细胞中中和TNF-α诱导的细胞毒性

将F6进行系列稀释，每孔加入20μl；再加入30μl hTNF-α溶液，与F6共孵育30min；每孔加入50μl TNF-α敏感型小鼠成纤维细胞(L929)，使终浓度为每孔5×10⁴个细胞；然后将细胞培养板置于5％CO₂中，37℃培养过夜(18-24h)。

每孔中加入20μl 5mg/mL MTT，将细胞培养板于37℃培育4h；然后加入120μl细胞裂解液(10％SDS，5％异丁醇，12mM HCl)，37℃放置过夜或至甲瓒颗粒完全溶解；测定570/630nm的光密度，绘制曲线并通过标准方法确定IC₅₀(图6)。

序列表

<110>中国药科大学

<120>全人源抗人TNF-α单链抗体

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>110

<212>PRT

<213>人(Human)

<400>1

<210>2

<211>111

<212>PRT

<213>人(Human)

<400>2

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>人(Human)

<400>3

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>人(Human)

<400>4

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人(Human)

<400>5

<210>6

<211>5

<212>PRT

<213>人(Human)

<400>6

<210>7

<211>17

<212>PRT

<213>人(Human)

<400>7

<210>8

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial sequence)

<400>8

Claims

1.分离的全人源抗体或其抗原结合部分，具有轻链可变区域，该域包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；并且具有重链可变区域，该域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

2.一种分离的核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求1的全人源抗体。

3.含有权利要求2所述的核酸的表达载体。

4.权利要求1的抗体，其用途在于，用于制备抑制或中和hTNF-α活性的药物。