ES2593307T3 - Regulación de expresión del gen de colágeno tipo II usando señales eléctricas y electromagnéticas específicas y selectivas - Google Patents

Regulación de expresión del gen de colágeno tipo II usando señales eléctricas y electromagnéticas específicas y selectivas Download PDF

Info

Publication number
ES2593307T3
ES2593307T3 ES03770683.5T ES03770683T ES2593307T3 ES 2593307 T3 ES2593307 T3 ES 2593307T3 ES 03770683 T ES03770683 T ES 03770683T ES 2593307 T3 ES2593307 T3 ES 2593307T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
specific
selective
signal
electrodes
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03770683.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Carl T. Brighton
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
University of Pennsylvania Penn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Pennsylvania Penn filed Critical University of Pennsylvania Penn
Application granted granted Critical
Publication of ES2593307T3 publication Critical patent/ES2593307T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
    • A61N1/326—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for promoting growth of cells, e.g. bone cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/40—Applying electric fields by inductive or capacitive coupling ; Applying radio-frequency signals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Abstract

Un dispositivo (10) para el tratamiento de osteoartritis, artritis reumatoide, lesión de cartílago y/o defectos del cartílago, que comprende: una fuente de señal diseñada para generar al menos una señal específica y selectiva que tiene una configuración de onda senoidal y un ciclo de trabajo de 1/12; y electrodos (12) o bobinas conectadas a la fuente de señal para recibir dicha al menos una señal específica y selectiva y que están diseñados para estar operativos y dispuestos con respecto al tejido de cartílago diana, por lo que dichos electrodos (12) o bobinas después de la recepción de dicha señal específica y selectiva provocan la generación de una campo que es específico y selectivo para aumentar la expresión de gen de mARN de colágeno tipo II en dicho tejido de cartílago diana, donde dicha fuente de señal es capaz de controlar y variar la duración de tiempo de aplicación de dicha al menos una señal específica y selectiva a dichos electrodos (12) o bobinas para provocar, después de la aplicación de dichos electrodos (12) o bobinas la generación de un campo específico y selectivo que tiene una amplitud de 20 mV/cm en el tejido de cartílago diana a 60 kHz, y dicho campo específico y selectivo aumenta de manera selectiva la expresión de gen de mARN de colágeno tipo II cuando se aplica a dicho tejido de cartílago diana; donde dicha fuente de señal está configurada para aplicar dicha al menos una señal específica y selectiva a dichos electrodos (12) o bobinas durante una duración de aproximadamente 30 minutos cada 24 horas, consistiendo dicha al menos una señal específica y selectiva en 30 ciclos de un minuto encendida y once minutos apagada.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Regulacion de expresion del gen de colageno tipo II usando senales electricas y electromagneticas especfficas y selectivas
Campo de la invencion
La presente invencion esta dirigida a un metodo para regular la expresion del gen de colageno tipo II en celulas de cartilago por medio de la aplicacion de campos especificos y selectivos generados por senales electricas y electromagneticas especificas y selectivas para el tratamiento de cartilago articular danado o enfermo, asi como un dispositivo para generar tales senales.
Antecedentes de la invencion
Las interacciones y actividades bioelectricas que se cree que estan presentes en una variedad de tejidos y celulas biologicas son uno de los procesos fisiologicos menos entendidos. Sin embargo, recientemente se han realizado muchas investigaciones sobre estas interacciones y actividades en relacion con el crecimiento y reparacion de ciertos tejidos y celulas. En particular, se han realizado muchas investigaciones sobre la estimulacion mediante campos electricos y electromagneticos en su efecto en el crecimiento y reparacion de huesos y cartilagos. Los investigadores creen que tal investigacion podria ser util en el desarrollo de nuevos tratamientos para una variedad de problemas medicos.
La osteoartritis, tambien conocida como enfermedad articular degenerativa, se caracteriza por la degeneracion de cartilago articular asi como proliferacion y remodelacion de hueso subcondral. Los sintomas habituales son rigidez, limitacion de movimiento y dolor. La osteoartritis es la forma mas comun de artritis, y sus indices de prevalencia aumentan notablemente con la edad. Se ha demostrado que los pacientes de edad avanzada con osteoartritis auto-evaluable vistan los medicos con el doble de frecuencia que sus iguales no afectados. Tales pacientes tambien experimentan mas dias de actividad restringida y reclutamiento en la cama en comparacion con otros en su grupo de edad. En un estudio, la mayoria de los pacientes sintomaticos se vuelven significativamente invalidos durante un periodo de consultas de 8 anos. Massardo et al., Ann Rheum Dis 48:893-7 (1989).
Los farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) siguen siendo la modalidad principal de tratamiento para osteoartritis. No se sabe si la eficacia de AINEs depende de sus propiedades analgesicas o antiinflamatorias o a la desaceleracion de los procesos degenerativos en el cartilago. Tambien hay una preocupacion sobre los AINEs que pueden ser perjudiciales para los pacientes. Por ejemplo, los AINEs tienen efectos toxicos bien conocidos en el estomago, tracto gastrointestinal, higado y rinon. Sin embargo, la aspirina inhibe la sintesis de proteoglicano y los procesos de reparacion cartilaginosa normal en animales. Un estudio en humanos sugirio que la indometacina podria acelerar la rotura del cartilago de la cadera. Todos los efectos adversos parecen mas comunes en los ancianos, la poblacion mas susceptible de osteoartritis.
En la enfermedad comunmente conocida como osteoporosis, el hueso se desmineraliza y se convierte en anormalmente rarificado. El hueso comprende componentes organicos de celulas y matriz asi como un componente inorganico o mineral. Las celulas y matriz comprenden una estructura de fibras de colageno que se impregna con el componente mineral de fosfato de calcio (85%) y carbonato de calcio (10%) que imparte rigidez al hueso. Mientras se cree que la osteoporosis generalmente afecta a los ancianos, ciertos tipos de osteoporosis pueden afectar a personas de todas las edades cuyos huesos no estan sometidos a tension funcional. En tales casos, los pacientes pueden experimentar una perdida significativa de hueso cortical y esponjoso durante periodos prolongados de inmovilizacion. Se sabe que los pacientes de edad avanzada experimentan perdida osea debido al desuso cuando se inmovilizan despues de una fractura de un hueso, que pude por ultimo llevar a una fractura secundaria en un esqueleto ya osteoporotico. La menor densidad osea puede llevar a un colapso de vertebras, fracturas de cadera, brazos inferiores, munecas, tobillos asi como dolores que incapacitan. Se necesitan terapias no quirurgicas alternativas para tales enfermedades.
Los campos electromagneticos pulsados (CEMP) y acoplamientos capacitivos (AC) se han usado en gran medida para fracturas que no cicatrizan y problemas relacionados en la curacion de huesos desde que lo aprobo la Administration de Alimentos y Farmacos en 1979. La base organica para el ensayo de esta forma de terapia fue la observation de que la tension fisica en huesos provoca la aparicion de pequenas corrientes electricas que, junto con la presion mecanica, se cree que son los mecanismos que subyacen la transduction de las tensiones fisicas en una senal que promueve la formation de huesos. Junto con la estimulacion directa de campo electrico que fue exitosa en el tratamiento de falta de union, las tecnologias no invasivas que usan CEMP y acoplamiento capacitivo (donde los electrodos se colocan en la piel en la zona del tratamiento) tambien resultaron ser efectivos. Los campos electromagneticos pulsados generan pequenas corrientes inducidas (corrientes Faraday) en el fluido extracelular altamente conductor., mientras que el acoplamiento capacitivo provoca directamente corrientes en los tejidos; por consiguiente, tanto CEMP como Ac imitan las corrientes electricas endogenas.
Las corrientes electricas endogenas, que originalmente se pensaba que se debian a fenomenos que ocurren en la superficie de cristales en el hueso, se ha demostrado que se deben principalmente al movimiento de fluido que contienen electrolitos en canales del hueso que contienen constituyentes organicos con cargas negativas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
fijas, generando lo que se llama “potenciales continuos”. Los estudios de fenomenos electricos en cartllagos han demostrado un mecanismo de transduccion mecanica-electrica que se parece al descrito en los huesos, que aparece cuando el cartllago se comprime mecanicamente, causando movimiento de fluido y electrolitos sobre la superficie de cargas negativas fijas en los proteoglicanos y colageno en la matriz de cartllago. Esos potenciales continuos tienen aparentemente un fin en los cartllagos similar al de los huesos y, junto con la presion mecanica, llevan a una transduccion de senal que es capaz de estimular slntesis de condrocitos de los componentes de matriz.
La principal aplicacion de corriente directa, acoplamiento capacitivo y CEMPs ha sido en ortopedia en la curacion de fracturas oseas sin union (Brighton et al, J. Bone and Joint Surgery, 63: 2-13, 1981; Brighton y Pollack, J. Bone and Joint Surger4y, 67: 577-585, 1985; Bassett et al., Crit. Rev. Biomed. Eng., 17: 451-529 (1989); Bassett et al., JAMA 247: 623-8 (1982). Se han presentado respuestas cllnicas en necrosis avascular de caderas en adultos y enfermedad de Perthes en ninos. Bassett et al. Clin Orthop 246: 172-6 (1989); Aaron et al., Clin Orthop 249: 20918 (1989); Harrison et al, J Pediatr Ortop 4: 579-84 (1984). Tambien se ha demostrado que CEMPs (Mooney, Spine, 15: 708-712, 1990) y el acoplamiento capacitivo (Goodwin, Brighton et al., Spine, 24: 1349-1356, 1999) pueden aumentar de manera significativa el Indice de exito en fusiones lumbares. Tambien hay informes sobre el aumento de regeneracion nerviosa periferica y funcion y promocion de angiogenesis. Bassett, Bioassays 6: 36-42 (1987). Los pacientes con tendinitis de manguito rotador persistente que son resistentes a la inyeccion de esteroides y otras medidas convencionales, mostraron un beneficio significativo en comparacion con pacientes tratados con placebo. Binder et al., Lancet 695-8 (1984). Finamente, Brighton et al. han demostrado en ratas la habilidad de un campo electrico apropiado de acoplamiento capacitivo tanto para prevenir como para invertir la osteoporosis vertebral en la espina lumbar (Brighton et al. J. Orthop. Res. 6: 676-684; Brighton et al. J. Bone and Joint Surgery, 71: 228-236, 1989).
Mas recientemente, la investigacion en esta area se ha centrado en los efectos que la estimulacion tiene en tejidos y celulas. Por ejemplo, se ha conjeturado que las corrientes directas no penetran en las membranas celulares y que se consigue el control a traves de diferenciacion de matriz extracelular. Grodzinsky, Crit. Rev. Biomed. Engng 9: 133 (1983). A diferencia de las corrientes directas, se ha presentado que CEMPs pueden penetrar en membranas celulares y estimularlas o afectar directamente a organulos intracelulares. Un examen en el efecto de CEMPs en matrices extracelulares y osificacion endocondral in vivo dio como resultado una mayor slntesis de moleculas de cartllago y maduracion de trabeculas oseas. Aaron et al., J. Bone Miner. Res. 4: 227-233 (1989). Mas recientemente, Lorich, Brighton et al. presentaron (Clin Orthop and Related Research 350: 246-256, 1998), que la transduccion de senal de una senal electrica acoplada capacitivamente es por medio de canales de calcio cerrados con voltaje, lo que lleva a un aumento en calcio citosolico con un posterior aumento en calmodulina activada (citoesqueletal).
Muchas investigaciones se han dirigido al estudio de cultivo de tejido con el fin de entender los mecanismos de respuesta. En un estudio, se descubrio que los campos electricos aumentaron la incorporacion de [3H]-timidina en el ADN de condrocitos, lo que apoya la nocion de que los flujos de Na y Ca2+ generados por estimulacion electrica provocan slntesis de ADN. Rodan et al., Science 199: 690-692 (1978). Los estudios han encontrado cambios en el segundo mensajero, cAMP, y reorganizaciones citoesqueletales debido a perturbaciones electricas. Ryaby et al, Trans, BRAGS 6: (1986); Jones et al., Trans. BRAGS 6: 51 (1986); Brighton y Townsed, J. Orthop. Res. 6:552-558, 1988. Otros estudios han encontrado efectos en glicosaminoglicano, sulfacion, acido hialuronico, actividad de lisozima y secuencias de polipeptido. Norton et al., J. Orthop. Res. 6: 685-689 (1988); Goodman et al., Proc. Natn. Acad. Sci. USA 85: 3928-3932 (1988).
En 1996 el presente inventor presento que una presion mecanica biaxial clclica de 0,17% producla un aumento significativo en TGF-p1 mARN en ceulas de hueso MC3T3-E1 cultivadas. Brighton et al., Biomech. Biophys. Res. Commun. 229: 449-453 (1996). En 1997 siguieron varios estudios significativos. En un estudio se presento que la misma presion mecanica biaxial clclica de 0,17% producla en aumento significativo en PDGF-A mARN en celulas oseas similares. Brighton et al., Biomech. Biophys. Res. Commun. 43:339-346 (1997). Tambien se presento que un campo electrico acoplado capacitivamente de 60 kHz de 20 mV/cm producla un aumento significativo en TGF-p1 en celulas oseas similares. Brighton et al., Biomech. Biophys. Res. Commun. 237:225-229 (1997). Sin embargo, los efectos que tal campo tendrla en otros genes no se han presentado en la bibliografla.
En WO 01/62336, titulada “Regulacion de genes por medio de aplicacion de senales electricas y electromagneticas especlficas y selectivas”, se desvelaron metodos para determinar las senales electricas y electromagneticas selectivas para su uso en la creacion de campos especlficos y selectivos para regular genes dianas de tejidos enfermos o danados. La presente invencion se construye en base a la tecnica aqul descrita al describir el metodo para regular una expresion genetica diana, esto es, expresion del gen de colageno tipo II, a traves de la aplicacion de un campo especlfico y selectivo generado mediante una senal electrica y electromagnetica especlfica y selectiva, para el tratamiento de enfermedad de cartllago (artritis), lesion de cartllago y defectos del cartllago.
Resumen de la invencion
La presente invencion se refiere a la regulacion de la expresion del gen de colageno tipo II en celulas de cartllago por medio de la aplicacion de campos especlficos y selectivos generados mediante senales electricas y/o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
electromagneticas especlficas y selectivas. Al realizar curvas en respuesta a las dosis en la duracion, amplitud, frecuencia y ciclo de trabajo del campo electrico, se descubrio la senal optima para aumentar el mARN de colageno tipo II en condrocitos de cartllago articular. La senal optima genero un campo electrico acoplado capacitivamente con una amplitud de 20 mV/cm, una duracion de 30 minutos, un ciclo de trabajo de 8,3% (1 minuto ENCENDIDO, 11 minutos APAGADO, 30 ciclos), una frecuencia de 60 kHz, y una configuracion de onda senoidal. En particular, la presente invention se refiere al aumento de expresion del gen d
e colageno tipo II en celulas de cartllago por medio de la aplicacion de campos generados por tales senales.
En una realization preferente de la invencion, se proporciona un dispositivo como el citado en las reivindicaciones. Se desvelan metodos para aumentar especlficamente y selectivamente la expresion de gen de mARN de colageno tipo II con campos electricos acoplados capacitivamente, campos electromagneticos o campos combinados. Osteoartritis, artritis reumatoide, lesion de cartllago, defectos del cartllago y similares se tratan con un campo electrico acoplado capacitivamente de aproximadamente 20 mV/cm con una duracion de campo electrico de aproximadamente 30 minutos, una frecuencia de aproximadamente 60 kHz, un ciclo de trabajo de aproximadamente 8,3% y una configuracion de onda senoidal que provoca que la expresion de mARN de colageno tipo II aumente. De acuerdo con la invencion, una senal “especlfica y selectiva” es una senal que tiene caracterlsticas predeterminadas de amplitud, duracion, ciclo de trabajo, frecuencia y forma de onda que aumenta la expresion de gen de colageno tipo II (especificidad). Esto permite elegir diferentes senales para aumentar las expresiones del gen de colageno tipo II con el fin de conseguir una respuesta bilogica o terapeutica dada (selectividad).
Tambien se desvelan metodos y dispositivos para el tratamiento de osteoartritis, artritis reumatoide, lesion de cartllago y defectos del cartllago. El metodo incluye la metodologla para determinar la senal “especlfica y selectiva” para el gel de colageno tipo II variando metodicamente la duracion de una senal de inicio conocida por aumentar o que se sospecha que aumenta la production celular de colageno tipo II. Despues de seleccionar la duracion optima, la amplitud de la senal varla para la duracion optima de tiempo como lo determina la expresion de gen de colageno tipo II. El ciclo de trabajo, frecuencia y forma de onda varlan metodicamente mientras se mantienen constantes las otras caracterlsticas de senal. Este proceso se repite hasta que se determina la senal optima que produce el mayor aumento en la expresion de colageno tipo II.
Aquellos expertos en la materia apreciaran que la expresion del gen de colageno tipo II es funcionalmente complementaria o sinergica a la expresion del gen de agrecano en celulas de cartllago expuestas a varias senales electrica y electromagneticas. Las senales especlficas y selectivas para regular la expresion del gen de agrecano se describe en la solicitud de patente en tramitacion de Estados Unidos N°, tambien del presente inventor. Estos y otros aspectos de la presente invencion se elucidaran en la siguiente description detallada de la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
La presente invencion sera aparente a partir de la siguiente descripcion detallada de la invencion tomada junto con los dibujos acompanantes, de los cuales:
La Figura 1 es una representation grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante varias duraciones de tiempo. Como se indica, la produccion optima de mARN de colageno tipo II ocurrio con una senal de una duracion de 30 minutos.
La Figura 2 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante 30 minutos. Se muestra la cantidad de mARN de colageno tipo II producido despues de varios tiempos de respuesta, en comparacion con los controles (sin electricidad). Como tambien se muestra, la produccion optima de mARN de colageno tipo II ocurrio 5,5 horas despues de que la estimulacion electrica cesara.
La Figura 3 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a varias amplitudes de un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante una duracion de 30 minutos y se extraen 5,5 horas despues de que la estimulacion electrica haya cesado. Como se indica, la produccion optima de mARN de colageno tipo II ocurrio con una senal que producla una amplitud de campo electrica de 20 mV/cm.
La Figura 4 es una representacion grafica de un analisis de ensayo Northern de expresion de colageno tipo II (barra blanca) y expresion de mARN de colageno tipo II (barra sombreada) cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante una duracion de 30 minutos y se extraen 5,5 horas despues del cese de la senal electrica. Como se indica, el analisis de ensayo Northern de mARN de colageno tipo II es 3,5 veces mayor que los controles no estimulados, y la cantidad de mARN de colageno tipo II como lo determina RT-PCR es 6,5 veces mayor que la de los controles no estimulados.
La Figura 5 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de varios ciclos de trabajo y una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
duracion de 30 minutos de tiempo ENCENDIDO en una amplitud de campo electrico de 20 mV/cm y se extraen 5,5 horas despues del cese de la senal electrica. Como se indica, el ciclo optimo de trabajo resulto ser 8,3% (1 minuto ENCENDIDO, 11 minutos APAGADO, 30 ciclos).
La Figura 6 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de varias frecuencias de una duracion de 30 minutos (tiempo ENCENDIDO) en una amplitud de campo electrico de 20 mv/cm con un ciclo de trabajo de 8,3% (1 minuto ENCENDIDO, 11 minutos APAgAdO, 30 ciclos) y se extraen 5,5 horas despues del cese de la senal electrica. Como se indica, la frecuencia optima resulto ser 60 kHz.
La Figura 7 es una representacion grafica de condrocitos de cartllago articular que crecieron durante 7 dlas en cultivo y despues se expusieron a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm, ciclo de trabajo 50% (1 minuto ENCENDiDo, 1 minutos ApAgADO, 30 ciclos), a una frecuencia de 60 kHz, y que tiene una configuracion de onda senoidal. Los condrocitos se expusieron a este campo durante 1 hora al dla durante 7 dlas. Los condrocitos de control crecieron bajo las mismas condiciones pero no se expusieron a ninguna estimulacion electrica. En el medio de estos cultivos no estuvo presente ninguna interleuquina-1 p (IL-1 p), una citoquina que estimula la degradacion de cartllago articular. Como se indica, hidroxiprolina, un aminoacido que es un constituyente caracterlstico de colageno, aumento 1,7 veces cuando los condrocitos se expusieron al campo electrico en comparacion con los condrocitos de control que no se expusieron al campo electrico.
La Figura 8 es una representacion grafica de condrocitos de cartllago articular que crecieron durante 7 dlas en cultivo y despues se expusieron a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm, ciclo de trabajo 50% (1 minuto ENCENDiDo, 1 minutos ApAgADO, 30 ciclos), a una frecuencia de 60 kHz, y que tiene una configuracion de onda senoidal. Se anadio interleuquina-1 p (10 ng/ml) al medio el dla 7. Los condrocitos se expusieron despues a este campo durante 1 horas por dla durante 7 dlas. Los condrocitos de control crecieron bajo las mismas condiciones con interleuquina en el medio pero no se expusieron a ninguna estimulacion electrica. Como se indica, hidroxiprolina aun mostro un aumento de 1, 4 veces cuando se expuso al campo electrico, a pesar de la presencia de interleuquina en el medio de los cultivos, en comparacion con los cultivos de control que no se expusieron a ningun campo electrico.
La Figura 9 ilustra un dispositivo 10 de acuerdo con la presente invencion que se usa para tratar un paciente con osteoartritis de la rodilla.
Descripcion detallada de realizaciones preferentes de la invencion
La invencion se describira con detalle mas abajo con referencia a las Figura 1-9. Aquellos expertos en la tecnica apreciaran que la descripcion aqul dada con respecto a aquellas figuras tiene unicamente fines ejemplares y no pretende de ninguna manera limitar el alcance de la invencion. Todas las preguntas en relacion con el alcance de la invencion pueden resolverse haciendo referencia a las reivindicaciones adjuntas.
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que la expresion de ciertos genes puede regularse mediante la aplicacion de campos especlficos y selectivos generados por senales electricas y/o electromagneticas especlficas y selectivas. En otras palabras, el presente inventor ha descubierto que hay una senal electrica y/o electromagnetica especlfica y selectiva que genera un campo especlfico y selectivo para regular cada gen en celulas de hueso, cartllago y otras celulas de tejido y que esos campos son capaces de regular especlficamente y selectivamente los genes en tales celulas. En particular, la expresion de gen que gobierna el crecimiento, mantenimiento, reparacion, degeneracion o deterioro de tejidos o celulas puede regularse de acuerdo con la invencion por medio de la aplicacion de campos especlficos y selectivos generados pro senales electricas y/o electromagneticas especlficas y selectivas para producir un efecto cllnico beneficioso. Tales descubrimientos son utiles en el desarrollo de metodos de tratamiento que se dirigen a ciertas condiciones medicas incluyendo fracturas y defectos oseos, osteoartritis, osteoporosis, cancer y otras enfermedades, as! como para desarrollar dispositivos que emplean tales metodos.
En particular, la presente invencion demuestra que la expresion de colageno tipo II puede aumentarse significativamente para incrementar la produccion de colageno en cartllago articular. El colageno tipo II, junto con agrecano, son los principales constituyentes de cartllago articular que se comprometen y/o degradan pronto en el curso de artritis. La presente invencion muestra claramente que el campo electrico optimo aqul descrito puede aumentar significativamente mARN de colageno tipo II y, por ello, aumentar la slntesis de colageno tipo II, incluso en presencia de IL-1 p. Aquellos expertos en la tecnica tambien apreciaran que un campo electrico apropiado, como aqul se describe con acoplamiento capacitivo pero igualmente efectivo con cualquiera y todas las tecnicas de aplicacion de campo, pueden usarse para tratar artritis (tambien osteoartritis como artritis reumatoide), lesion de cartllago y defectos de cartllago.
Como aqul se usa, el termino “senal” se usa para referirse a una variedad de senales que incluyen senales mecanicas, senales de ultrasonido, senales electromagneticas y senales electricas producidas por un dispositivo. Se entendera que el termino “campo” como aqul se usa se refiere a un campo electrico den un tejido destinado, ya sea
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
un campo electromagnetico combinado o pulsado o generado por corriente directa, acoplamiento capacitivo o acoplamiento inductivo.
El termino “remoto/a” se usa para significar que esta actuando o actua en o se controla desde una distancia. La regulacion “remota” se refiere a controlar la expresion de un gen desde una distancia. Proporcionar “remotamente” significa proporcionar desde una distancia. Por ejemplo, proporcionar una senal especlfica y selectiva desde una fuente remota puede referirse a proporcionar la senal desde una fuente en una distancia a un tejido o celulas o desde una fuente fuera de o externa al cuerpo.
La expresion senal “especlfica y selectiva” significa una senal que produce un campo electrico especlfico y selectivo que tiene caracterlsticas predeterminadas de amplitud, duracion, ciclo de trabajo, frecuencia y forma de onda que aumenta o reduce un gen destino o genes complementarios dirigidos complementariamente (especificidad). Esto permite elegir diferentes senales “especlficas y selectivas” para aumentar o reducir varias expresiones de gen con el fin de conseguir una respuesta biologica o terapeutica dada (selectividad).
El termino “regular” significa controlar una expresion de gen. Se entiende que regular incluye tanto aumentar como reducir. Aumentar significa incrementar la expresion de un gen, mientras que reducir significa inhibir o prevenir la expresion de un gen.
“Funcionalmente complementario” se refiere a dos o mas genes cuyas expresiones son complementarias o sinergicas en una celula o tejido dado.
“Tejido” se refiere a un agregado de celulas junto con sus sustancias extracelulares que forman uno de los materiales estructurales de un paciente. Como aqul se usa, el termino “tejido” pretende incluir tejido de musculo u organo as! como tejido de hueso o cartllago. Tambien, el termino “tejido” como aqul se usa puede tambien referirse a una celula individual.
“Paciente” se refiere a un animal, preferentemente un mamlfero, mas preferentemente un humano.
La presente invencion proporciona metodos de tratamiento y dispositivos que se dirigen a ciertos tejidos, celulas o enfermedades. En particular, la expresion de gen asociada con el proceso de reparacion en tejidos o celulas danadas o enfermas puede regularse mediante la aplicacion de campos especlficos y selectivos mediante senales electricas que son especlficas y selectivas para los genes que se regularan en los tejidos o celulas dianas. La expresion de gen puede aumentar o reducir mediante la aplicacion de senales que son especlficas y selectivas para cada gen o para cada conjunto de genes complementarios para producir un efecto cllnico beneficioso. Por ejemplo, una senal especlfica y selectiva particular puede crear un campo electrico especlfico y selectivo que aumentar una cierta expresion de gen deseable, mientras la misma u otra senal especlfica y selectiva particular pueden crear un campo electrico especlfico y selectivo que reduje una cierta expresion de gen no deseable. Un gen determinado puede aumentar mediante un campo especlfico y selectivo generado por una senal especlfica y selectiva particular y reducirse mediante un campo especlfico y selectivo generado por otra senal especlfica y selectiva particular. Aquellos expertos en la tecnica entenderan que ciertos tejidos enfermos o danados pueden ser el objetivo del tratamiento al regular aquellos genes que gobiernan el crecimiento, mantenimiento, reparacion y degeneracion o deterioro de los tejidos.
Los metodos y dispositivos de la presente invencion estan basados en la identificacion de aquellas senales que generan campos que son especlficos y selectivos para la expresion de gen asociadas con ciertos tejidos dianas enfermos o danados. Por ejemplo, la electricidad en sus varias formas (por ejemplo, acoplamiento capacitivo, acoplamiento inductivo, campos combinados) puede regular especlficamente y selectivamente la expresion de gen en tejidos o celulas dianas en el cuerpo de un paciente variando la frecuencia, amplitud, forma de onda o ciclo de trabajo del campo especlfico y selectivo aplicado para cada gen seleccionado. La duracion de tempo que se expone a electricidad tambien puede influenciar en la capacidad de la electricidad para regular especlficamente y selectivamente la expresion de gen en tejidos o celulas dianas en el cuerpo de un paciente. Las senales especlficas y selectivas pueden generar campos electricos especlficos y selectivos para su aplicacion a cada gen sistematicamente hasta que se encuentra la combinacion apropiada de frecuencia, amplitud, forma de onda, ciclo de trabajo y duracion que proporcione el efecto deseado de expresion de gen.
Se entendera que una variedad de tejidos enfermos o danados o estados enfermos pueden ser el objetivo del tratamiento porque la especificidad y selectividad de un campo electrico para una cierta expresion de gen pueden estar influenciadas por varios factores. En particular, un campo electrico de una frecuencia, amplitud, forma de onda y/o ciclo de trabajo adecuado pueden ser especlfico y selectivo para la expresion de ciertos genes y por lo tanto proporcionar tratamientos dirigidos. Los factores temporales (por ejemplo, la duracion de tiempo que se expone al campo electrico) tambien puede influenciar en la especificidad y selectividad de un campo electrico para una expresion de gen particular. La regulacion de expresion de gen puede ser mas efectiva (o hacerse posible) por medio de la aplicacion de un campo electrico especlfico y selectivo durante una duracion particular de tiempo. Por lo tanto, aquellos expertos en la tecnica entenderan que la presente invencion proporciona la variacion de frecuencia, amplitud, forma de onda, ciclo de trabajo y/o duracion de aplicacion de un campo electrico hasta que se encuentra el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
campo electrico que sea especlfico y selectivo para cierta expresion de gen con el fin de proporcionar tratamientos dirigidos a una variedad de tejido enfermo o danado o enfermedades.
Asl, la presente invencion puede proporcionar tratamientos dirigidos porque es posible regular la expresion de ciertos genes asociados con un tejido particular enfermo o danado por medio de la aplicacion de campos especlficos y selectivos generados por senales especlficas y selectivas de frecuencia, amplitud, forma de onda y/o ciclo de trabajo apropiados durante una duracion apropiada de tiempo. La especificidad y selectividad de una senal que genera un campo electrico especlfico y selectivo puede asl influenciarse para regular la expresion de ciertos genes con el fin de dirigirse a cierto tejido enfermo o danado o estados enfermos para su tratamiento. En particular, la presente invencion proporciona el tratamiento dirigido a osteoartritis, artritis reumatoide, lesion de cartllago y defectos de cartllago.
La presente invencion tambien proporciona un dispositivo que incluye una fuente de al menos una senal especlfica y selectiva para expresion de gen de colageno tipo II. Los dispositivos de la presente invencion pueden proporcionar la produccion de tales senales para la aplicacion a celulas de cartllago mediante al menos un electrodo adaptado para aplicar el campo especlfico y selectivo generado por la senal especlfica y selectiva. En particular, el campo optimo aqul descrito puede aplicarse a cualquier articulacion por medio de electrodos de superficie apropiados, dos o mas, en parejas o en tiras, incorporados en prendas, rodilleras/coderas, envoltorios o escayolas, y administrados por medio de acoplamiento capacitivo, acoplamiento inductivo (campos electromagneticos), o campos combinados.
El dispositivo de la presente invencion es capaz de aplicar un campo especlfico y selectivo generado por senales especlficas y selectivas directamente a tejido enfermo o danado y/o a la piel de un paciente. El dispositivo de la presente invencion tambien puede proporcionar la aplicacion remota de campos especlficos y selectivos (por ejemplo, aplicacion de un campo a una distancia del tejido enfermo o danado), aunque se apreciara que los dispositivos acoplados capacitivamente deben tocar la piel del sujeto. El dispositivo de la presente invencion puede incluir medios para unir los electrodos al cuerpo de un paciente cerca del tejido danado o enfermo. Por ejemplo, electrodos conductores auto-adherentes pueden unirse a la piel del paciente en vamos lados de la articulacion de la rodilla que sufre osteoartritis como se muestra en la Figura 9. Como tambien se muestra en la Figura 9, el dispositivo 10 de la presente invencion puede incluir electrodos auto-adherentes 12 para unir el dispositivo 10 al cuerpo de un paciente. Por ejemplo, el dispositivo 10 de la presente invencion puede incluir electrodos 12 unidos a una unidad de potencia 14 que tiene un parche de VELCRO® 16 en el lado opuesto de tal manera que la unidad de potencia 14 pueda unirse a una tira de VELCRO® (no mostrada) ajustada alrededor de la pantorrilla, muslo o cintura del paciente.
El dispositivo 10 de la presente invencion puede emplearse en una variedad de maneras. El dispositivo 10 puede ser portatil o puede unirse temporalmente o permanentemente al cuerpo de un paciente. El dispositivo 10 de la presente invencion es preferentemente no invasivo. Por ejemplo, el dispositivo 10 de la presente invencion puede aplicarse a la piel de un paciente mediante la aplicacion de electrodos adaptados para contactar con la piel de un paciente para la aplicacion de campos especlficos y selectivos generados por las senales especlficas y selectivas predeterminadas. Tales senales tambien pueden aplicarse por medio de bobinas en la que varias corrientes fluyen, produciendo asl campos electromagneticos especlficos y selectivos que penetran en el tejido. El dispositivo 10 de la presente invencion puede tambien ser capaz de implantarse en un paciente, incluyendo su implante bajo la piel de un paciente.
El ejemplo mas abajo ilustrara que el metodo de la presente invencion puede proporcionar crecimiento y reparacion de cartllago. El crecimiento y reparacion de cartllago pueden estimularse por medio de senales especlficas y selectivas para la regulacion de expresion de colageno tipo II en celulas de cartllago para estimular la reparacion de cartllago articular en pacientes con osteoartritis. En particular, los metodos de la presente invencion pueden proporcionar el aumento de genes de colageno tipo II que reparan el cartllago. Los metodos de la presente invencion pueden dirigirse a una variedad de celulas de cartllago incluyendo condrocitos articulares e incluyendo cartllago articular, cartllago hialino y crecimiento de cartllago de placa.
El ejemplo mas abajo ilustra ademas que el metodo de la presente invencion proporciona la regulacion de expresion de gen en condrocitos articulares. Por ejemplo, en el ejemplo mas abajo, los condrocitos articulares fetales se han expuesto a una campo electrico de 60 kHz acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante 0,5, 2,0, 6,0 y 24,0 horas. Se descubrio una incorporation estadlsticamente significativa de 35SO4/ug ADN (lo que indica una slntesis significativa de proteoglicano) despues de solamente 0,5 horas de estimulacion. Se repitio un experimento identico y se controlaron los niveles de mARN de colageno tipo II, el mensajero para el principal proteoglicano de cartllago. Despues de solamente 0,5 horas de estimulacion electrica hubo un aumento significativo de mARN de colageno tipo II. Por consiguiente, los factores temporales pueden influenciar en la especificidad y selectividad de una senal que genera campos electricos especlficos y selectivos para regular la expresion de gen en condrocitos articulares.
Aquellos expertos en la tecnica entenderan que el tratamiento puede estar dirigido a una variedad de otras enfermedades y danos del cartllago por medio del metodo de la presente invencion.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Aquellos expertos en la tecnica entenderan ademas que los dispositivos de la presente invencion pueden proporcionarse en una variedad de formas incluyendo unidad de potencia capacitivamente acoplado con multiples senales especlficas y selectivas programados y controlados por interruptores para aplicacion a un par o a multiples pares de electrodos, bobinas electromagneticas unidas a una unidad de potencia con multiples senales especlficas y selectivas controladas por interruptores y un estimulador de ultrasonido con un suministro de potencia para generar senales especlficas y selectivas. Hablando en terminos generales, la preferencia del dispositivo se basa en la aceptacion del paciente y en la conformidad del paciente. La unidad mas pequena y mas portatil disponible en la tecnica ahora mismo es una unidad de acoplamiento capacitivo; sin embargo, los pacientes con piel extremadamente sensible pueden preferir usar unidades de acoplamiento inductivo. Por otro lado, las unidades de ultrasonido requieren la maxima cooperacion por parte del paciente pero ciertos pacientes pueden desear su uso.
Ejemplo
La invencion se demuestra en el siguiente ejemplo, que tiene fines ilustrativos y no pretende limitar el alcance de la presente invencion.
Materiales y metodos
Los cultivos de condrocito se prepararon a partir de cartllago articular bovino fetal. Los condrocitos (5 x 105 celulas/cm2) se colocaron en colocaron en platos Cooper especialmente modificados. Las celulas crecieron hasta siete dlas con el medio cambiado justo antes del inicio de la condicion experimental. Los cultivos celulares experimentales en estos estudios se sometieron a campo electrico con senal de onda senoidal de 60 kHz acoplada capacitivamente con una potencia de salida de 44,81 voltios pico a pico. Esto produjo una fuerza de campo calculada en el medio de cultivo en los platos de 20 mV/cm con una densidad de corriente de 300 pA/cm2. Los platos de cultivo de la celula de control fueron identicos a los de los platos estimulados excepto que los electrodos no se conectaron a un generador de funcion.
El ARN total se aislo usando TRIzol, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se realizo transcriptasa inversa usando transcriptasa inversa Superscript II. Los cebadores de oligonucleotido que se usaron en la tecnica de PCR competitivo se seleccionaron de secuencias de cADN publicadas. El analisis cuantitativo de productos PCR se realizo usando software ScionImage.
La senal optima para la regulacion de gen deseada se descubrio sistematicamente de la siguiente manera. Se toma una senal electrica conocida para aumentar (o incluso que solo se sospeche que aumenta) la produccion celular de una protelna dada como senal de inicio para determinar la senal especlfica para generar el campo especlficos y selectivo para la expresion de gen (mARN) de esa protelna. Primero se realiza una curva de dosis- respuesta variando la duracion de la senal mientras se mantienen constantes todas las caracterlsticas de senal (amplitud, ciclo de trabajo, frecuencia y forma de onda) (Figura 1). Esto determina la duracion optima de la senal de inicio para la expresion de gen de esa protelna. Se realiza una segunda curva de dosis-respuesta variando la amplitud de campo (Figura 3) para la duracion optima de tiempo (Figura 2). Esto determina la amplitud optima de campo para la duracion optima de tiempo como lo determina la expresion de gen de la protelna de interes. Despues se realiza una tercera curva de dosis-respuesta, esta vez variando el ciclo de trabajo de 100% (constante) a 5% o menos mientras se mantienen constantes la amplitud optima y otras caracterlsticas de senal (Figura 5). Se repite una respuesta-dosis una cuarta vez (variando la frecuencia) (Figura 6) manteniendo constantes las otras caracterlsticas de senal. Aunque no se muestra, la dosis-respuesta puede repetirse una quinta vez (variando la forma de onda) manteniendo cada vez constantes las caracterlsticas de senal. Mediante este metodo se determina una senal optima para producir el mayor aumento en la expresion de gen de la protelna de interes.
La expresion de gen puede determinarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, como transcripcion inversa PCR y analisis Northern, y la expresion de protelna puede determinarse mediante analisis espectrofotometrico, fluorometrico, etc., inmunoensayos y similares.
Produccion de colageno tipo II mediante condrocitos articulares
Los condrocitos articulares se expusieron a un campo electrico capacitivamente acoplado de 20 mV/cm a 60 kHz. Los resultados se ilustran en las Figuras 1-8.
La Figura 1 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular (atomol por pl) se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante varias duraciones de tiempo (0,5, 2, 6 y 24 horas). Como se indica, la produccion optima de mARN de colageno tipo II ocurrio con una senal de una duracion de 30 minutos.
La Figura 2 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm (atomol por pl) durante 30 minutos. Se muestra la cantidad de mARN de colageno tipo II producido despues de varios tiempos de respuesta,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en comparacion con los controles (sin electricidad). Como tambien se muestra, la produccion optima de mARN de colageno tipo II ocurrio 5,5 horas despues de que la estimulacion electrica cesara.
La Figura 3 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a varias amplitudes de un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante una duracion de 30 minutos y se extraen 5,5 horas despues de que la estimulacion electrica haya cesado. Como se indica, la produccion optima de mARN de colageno tipo II ocurrio con una senal que producla una amplitud de campo electrica de 20 mV/cm. En comparacion, el presente inventor ha descubierto que la amplitud optima para agrecano de mARN es 10-20 mV/cm.
La Figura 4 es una representacion grafica de un analisis de ensayo Northern de expresion de colageno tipo II (barra blanca) y expresion de mARN de colageno tipo II (barra sombreada) cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm durante una duracion de 30 minutos y se extraen 5,5 horas despues del cese de la senal electrica. Como se indica, el analisis de ensayo Northern de mARN de colageno tipo II es 3,5 veces mayor que los controles no estimulados, y la cantidad de mARN de colageno tipo II como lo determina RT-PCR es 6,5 veces mayor que la de los controles no estimulados.
La Figura 5 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de varios ciclos de trabajo y una duracion de 30 minutos de tiempo ENCENDIDO en una amplitud de campo electrico de 20 mV/cm y se extraen 5,5 horas despues del cese de la senal electrica. Como se indica, el ciclo optimo de trabajo resulto ser 8,3% (1 minuto ENCENDIDO, 11 minutos APAGADO, 30 ciclos). En comparacion, el presente inventor ha descubierto el ciclo de trabajo optimo para expresion de mARN de agrecano es 50% (1 minuto ENCENDIDO, 1 minuto APAGADO, 30 ciclos).
La Figura 6 es una representacion grafica de expresion de mARN de colageno tipo II cuando condrocitos de cartllago articular se exponen a un campo electrico acoplado capacitivamente de varias frecuencias de una duracion de 30 minutos (tiempo ENCENDIDO) en una amplitud de campo electrico de 20 mv/cm con un ciclo de trabajo de 8,3% (1 minuto ENCENDIDO, 11 minutos APAGADO, 30 ciclos) y se extraen 5,5 horas despues del cese de la senal electrica. Como se indica, la frecuencia optima resulto ser 60 kHz.
La Figura 7 es una representacion grafica de condrocitos de cartllago articular que crecieron durante 7 dlas en cultivo y despues se expusieron a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm, ciclo de trabajo 50% (1 minuto ENCENDiDo, 1 minutos ApAgADO, 30 ciclos), a una frecuencia de 60 kHz, y que tiene una configuracion de onda senoidal. Los condrocitos se expusieron a este campo durante 1 hora al dla durante 7 dlas. Los condrocitos de control crecieron bajo las mismas condiciones pero no se expusieron a ninguna estimulacion electrica. En el medio de estos cultivos no estuvo presente ninguna interleuquina-1 p (IL-1 p), una citoquina que estimula la degradacion de cartllago articular. Como se indica, hidroxiprolina, un aminoacido que es un constituyente caracterlstico de colageno, aumento 1,7 veces cuando los condrocitos se expusieron al campo electrico en comparacion con los condrocitos de control que no se expusieron al campo electrico. Aquellos expertos en la tecnica apreciaran que ya que el ciclo de trabajo usado en este experimento (50%) no es el ciclo de trabajo optimo para colageno tipo II (vease Figura 5) se esperarla una respuesta incluso mayor si se usara un ciclo de trabajo optimo (8,3%).
La Figura 8 es una representacion grafica de condrocitos de cartllago articular que crecieron durante 7 dlas en cultivo y despues se expusieron a un campo electrico acoplado capacitivamente de 20 mV/cm, ciclo de trabajo 50% (1 minuto ENCENDiDo, 1 minutos ApAgADO, 30 ciclos), a una frecuencia de 60 kHz, y que tiene una configuracion de onda senoidal. Se anadio interleuquina-1 p (10 ng/ml) al medio el dla 7. Los condrocitos se expusieron despues a este campo durante 1 horas por dla durante 7 dlas. Los condrocitos de control crecieron bajo las mismas condiciones con interleuquina en el medio pero no se expusieron a ninguna estimulacion electrica. Como se indica, hidroxiprolina aun mostro un aumento de 1, 4 veces cuando se expuso al campo electrico, a pesar de la presencia de interleuquina en el medio de los cultivos, en comparacion con los cultivos de control que no se expusieron a ningun campo electrico. Aquellos expertos en la tecnica apreciaran que ya que el ciclo de trabajo usado en este experimento (50%) no es el ciclo de trabajo optimo para colageno tipo II (vease Figura 5) se esperarla una respuesta incluso mayor si se usara un ciclo de trabajo optimo (8,3%).
La Figura 9 ilustra un dispositivo 10 de acuerdo con la presente invencion que se usa para tratar un paciente con osteoartritis de la rodilla. Como se ilustra, dos electrodos circulares auto-adherentes, suaves y conductores 12 estan colocados en la piel en cada lado de la rodilla en el nivel de la llnea de la articulacion. Los electrodos 12 estan unidos a una unidad de potencia 14 que tiene un parche VELCRO® en el lado opuesto de tal manera que la unidad de potencia 14 pueda unirse a una tira de VELCRO® (no mostrada) ajustada alrededor de la pantorrilla, muslo o cintura del paciente. Los electrodos pueden colocarse en la piel antes de que el paciente vaya a la cama cada noche o en cualquier otro momento conveniente. Por supuesto, tambien pueden usarse otros tipos adecuados de electrodos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La unidad de potencia 14 es preferentemente pequena (por ejemplo, 6-8 onzas) y funciona con una baterla estandar de 9 voltios para emitir una senal de onda senoidal de 5 voltios pico a pico, 6-10 mAmp, 20 mV/cm, 60 kHz a los electrodos 12 colocados en la piel. Cuando la senal se proporciona aproximadamente 30 minutos por dla con el ciclo de trabajo apropiado (8,3%), se ha demostrado que aumenta significativamente genes que codifican colageno tipo II. Este tratamiento deberla prevenir o minimizar un deterioro adicional de cartllago articular as! como curar cartllago articular que ya se ha danado o degenerado.
El ejemplo anteriormente descrito demuestra que la expresion de gen de colageno tipo II puede aumentar significativamente para incrementar la produccion de proteoglicano en cartllago articular para tratar artritis (tanto osteoartritis como artritis reumatoide), lesion de cartllago y defectos de cartllago. Proteoglicano, junto con colageno tipo II, es el constituyente principal del cartllago articular y se degrada y destruye rapido en el desarrollo de artritis. La presente invencion muestra claramente que el campo electrico optimo descrito en el ejemplo puede aumentar de manera muy significativa mARN de colageno tipo II y, por ello, aumentar la slntesis de proteoglicano, incluso en presencia de IL-1 p. Aquellos expertos en la tecnica tambien apreciaran que un campo electrico apropiado, como aqul se describe con acoplamiento capacitivo, es tambien igualmente efectivo con cualquiera y todos los sistemas electromagneticos que producen caracterlsticas de campo electrico equivalentes o casi equivalentes. Aquellos expertos en la tecnica tambien apreciaran que pueden descubrirse caracterlsticas mas particularizadas por medio de mas experimentation con mas puntos de datos, pero se cree que hay relativamente menores variaciones en cada una de las caracterlsticas de senal en el nivel de aquellos expertos en la tecnica dados los contenidos aqul expuestos.
Aquellos expertos en la tecnica tambien apreciaran que otras numerosas modificaciones en la invencion son posibles en el alcance de la invencion. Por ejemplo, el campo optimo aqul descrito puede aplicarse a cualquier articulation por medio de dos o mas electrodos apropiados de superficie, en pares o tiras, incorporados en prendas, rodilleras/coderas, envoltorios o escayolas, y se administran por medio de acoplamiento capacitivo, acoplamiento inductivo (campos electromagneticos) o campos combinados. Por consiguiente, el alcance de la invencion no pretende limitarse a la realization preferente descrita anteriormente, sino solamente a las reivindicaciones adjuntas.

Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un dispositivo (10) para el tratamiento de osteoartritis, artritis reumatoide, lesion de cartliago y/o defectos del cartliago, que comprende:
    una fuente de senal disenada para generar al menos una senal especlfica y selectiva que tiene una configuration de onda senoidal y un ciclo de trabajo de 1/12; y electrodos (12) o bobinas conectadas a la fuente de senal para recibir dicha al menos una senal especlfica y selectiva y que estan disenados para estar operativos y dispuestos con respecto al tejido de cartllago diana, por lo que dichos electrodos (12) o bobinas despues de la reception de dicha senal especlfica y selectiva provocan la generation de una campo que es especlfico y selectivo para aumentar la expresion de gen de mARN de colageno tipo II en dicho tejido de cartllago diana,
    donde dicha fuente de senal es capaz de controlar y variar la duration de tiempo de aplicacion de dicha al menos una senal especlfica y selectiva a dichos electrodos (12) o bobinas para provocar, despues de la aplicacion de dichos electrodos (12) o bobinas la generacion de un campo especlfico y selectivo que tiene una amplitud de 20 mV/cm en el tejido de cartllago diana a 60 kHz, y dicho campo especlfico y selectivo aumenta de manera selectiva la expresion de gen de mARN de colageno tipo II cuando se aplica a dicho tejido de cartllago diana; donde dicha fuente de senal esta configurada para aplicar dicha al menos una senal especlfica y selectiva a dichos electrodos (12) o bobinas durante una duracion de aproximadamente 30 minutos cada 24 horas, consistiendo dicha al menos una senal especlfica y selectiva en 30 ciclos de un minuto encendida y once minutos apagada.
  2. 2. El dispositivo de la reivindicacion 1 que ademas comprende una unidad de potencia portatil (14) disenada para activar dicha fuente de senal.
  3. 3. El dispositivo de la reivindicacion 1 que ademas comprende medios para unir los electrodos (12) o bobinas al cuerpo de un paciente cerca del tejido de cartllago.
  4. 4. El dispositivo de la reivindicacion 1 que ademas comprende medios (16) para unir la fuente de senal al cuerpo de un paciente.
  5. 5. El dispositivo de la reivindicacion 1 donde los electrodos (12) o bobinas estan disenados para aplicar el campo electrico a dicho tejido de cartllago diana por medio de acoplamiento capacitivo o en acoplamiento conductor.
ES03770683.5T 2002-10-09 2003-10-07 Regulación de expresión del gen de colágeno tipo II usando señales eléctricas y electromagnéticas específicas y selectivas Expired - Lifetime ES2593307T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/267,708 US6919205B2 (en) 2000-02-23 2002-10-09 Regulation of type II collagen gene expression using specific and selective electrical and electromagnetic signals
US267708 2002-10-09
PCT/US2003/031793 WO2004033644A2 (en) 2002-10-09 2003-10-07 Regulation of type ii collagen gene expression using specific and selective electrical and electromagnetic signals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2593307T3 true ES2593307T3 (es) 2016-12-07

Family

ID=32068429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03770683.5T Expired - Lifetime ES2593307T3 (es) 2002-10-09 2003-10-07 Regulación de expresión del gen de colágeno tipo II usando señales eléctricas y electromagnéticas específicas y selectivas

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6919205B2 (es)
EP (1) EP1575475B1 (es)
JP (1) JP2006501853A (es)
KR (1) KR20050056233A (es)
CN (1) CN1703184A (es)
AU (1) AU2003279184A1 (es)
BR (1) BR0315241A (es)
CA (1) CA2501554C (es)
CR (1) CR7789A (es)
EG (1) EG23918A (es)
ES (1) ES2593307T3 (es)
MX (1) MXPA05003785A (es)
NO (1) NO20052254L (es)
NZ (1) NZ539833A (es)
WO (1) WO2004033644A2 (es)
ZA (1) ZA200503422B (es)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8321013B2 (en) 1996-01-08 2012-11-27 Impulse Dynamics, N.V. Electrical muscle controller and pacing with hemodynamic enhancement
JP4175662B2 (ja) 1996-01-08 2008-11-05 インパルス ダイナミクス エヌ．ヴイ． 電気的筋肉制御装置
US8825152B2 (en) 1996-01-08 2014-09-02 Impulse Dynamics, N.V. Modulation of intracellular calcium concentration using non-excitatory electrical signals applied to the tissue
US9289618B1 (en) 1996-01-08 2016-03-22 Impulse Dynamics Nv Electrical muscle controller
US7167748B2 (en) 1996-01-08 2007-01-23 Impulse Dynamics Nv Electrical muscle controller
US9713723B2 (en) 1996-01-11 2017-07-25 Impulse Dynamics Nv Signal delivery through the right ventricular septum
US9101765B2 (en) 1999-03-05 2015-08-11 Metacure Limited Non-immediate effects of therapy
US8700161B2 (en) 1999-03-05 2014-04-15 Metacure Limited Blood glucose level control
US8666495B2 (en) 1999-03-05 2014-03-04 Metacure Limited Gastrointestinal methods and apparatus for use in treating disorders and controlling blood sugar
US7429471B2 (en) * 2000-02-23 2008-09-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of matrix metalloproteinase gene expression using specific and selective electrical and electromagnetic signals
US7374916B2 (en) 2000-02-23 2008-05-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of aggrecan gene expression using specific and selective electrical and electromagnetic signals
US7465546B2 (en) * 2000-02-23 2008-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of transforming growth factor-beta (TGF-β) gene expression in living cells via the application of specific and selective electric and electromagnetic fields
US8313908B2 (en) 2000-02-23 2012-11-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of stem cell gene production with specific and selective electric and electromagnetic fields
US7022506B2 (en) * 2000-02-23 2006-04-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method and device for treating osteoarthritis, cartilage disease, defects and injuries in the human knee
US7465566B2 (en) * 2000-02-23 2008-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of genes via application of specific and selective electrical and electromagnetic signals
US7981611B2 (en) * 2000-02-23 2011-07-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of fibroblastic growth factor-2 (FGF-2) gene expression in living cells with the application of specific and selective electric and electromagnetic fields
US11439815B2 (en) 2003-03-10 2022-09-13 Impulse Dynamics Nv Protein activity modification
JP2006519663A (ja) 2003-03-10 2006-08-31 インパルス ダイナミックス エヌヴイ 心臓組織内の遺伝子発現を調節するための電気信号を送出する装置及び方法
GB2400316A (en) * 2003-04-10 2004-10-13 Richard Markoll Electromagnetic stimulation in patients with osteoporosis
US8792985B2 (en) 2003-07-21 2014-07-29 Metacure Limited Gastrointestinal methods and apparatus for use in treating disorders and controlling blood sugar
US9656096B2 (en) 2003-12-05 2017-05-23 Rio Grande Neurosciences, Inc. Method and apparatus for electromagnetic enhancement of biochemical signaling pathways for therapeutics and prophylaxis in plants, animals and humans
US20110112352A1 (en) * 2003-12-05 2011-05-12 Pilla Arthur A Apparatus and method for electromagnetic treatment
US10350428B2 (en) 2014-11-04 2019-07-16 Endonovo Therapetics, Inc. Method and apparatus for electromagnetic treatment of living systems
US9415233B2 (en) 2003-12-05 2016-08-16 Rio Grande Neurosciences, Inc. Apparatus and method for electromagnetic treatment of neurological pain
US9433797B2 (en) 2003-12-05 2016-09-06 Rio Grande Neurosciences, Inc. Apparatus and method for electromagnetic treatment of neurodegenerative conditions
US20130218235A9 (en) * 2005-03-07 2013-08-22 Arthur A. Pilla Excessive fibrous capsule formation and capsular contracture apparatus and method for using same
US9440089B2 (en) 2003-12-05 2016-09-13 Rio Grande Neurosciences, Inc. Apparatus and method for electromagnetic treatment of neurological injury or condition caused by a stroke
US8961385B2 (en) 2003-12-05 2015-02-24 Ivivi Health Sciences, Llc Devices and method for treatment of degenerative joint diseases with electromagnetic fields
US7744524B2 (en) * 2003-12-05 2010-06-29 Ivivi Health Sciences, Llc Apparatus and method for electromagnetic treatment of plant, animal, and human tissue, organs, cells, and molecules
US7840263B2 (en) * 2004-02-27 2010-11-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for device controlled gene expression
US8352031B2 (en) 2004-03-10 2013-01-08 Impulse Dynamics Nv Protein activity modification
US8548583B2 (en) 2004-03-10 2013-10-01 Impulse Dynamics Nv Protein activity modification
US11779768B2 (en) 2004-03-10 2023-10-10 Impulse Dynamics Nv Protein activity modification
KR20070024533A (ko) 2004-04-19 2007-03-02 아이비비 테크놀로지스, 아이엔씨. 전자기 치료 장치 및 방법
US7729761B2 (en) * 2004-07-14 2010-06-01 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for controlled gene or protein delivery
EP1827571B1 (en) 2004-12-09 2016-09-07 Impulse Dynamics NV Protein activity modification
US7981065B2 (en) * 2004-12-20 2011-07-19 Cardiac Pacemakers, Inc. Lead electrode incorporating extracellular matrix
US8060219B2 (en) 2004-12-20 2011-11-15 Cardiac Pacemakers, Inc. Epicardial patch including isolated extracellular matrix with pacing electrodes
US7279110B2 (en) * 2004-12-27 2007-10-09 Asml Holding N.V. Method and apparatus for creating a phase step in mirrors used in spatial light modulator arrays
US8244371B2 (en) 2005-03-18 2012-08-14 Metacure Limited Pancreas lead
US7840272B2 (en) 2005-06-03 2010-11-23 Medrelief Inc. Methods for modulating osteochondral development using bioelectrical stimulation
US7774057B2 (en) * 2005-09-06 2010-08-10 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for device controlled gene expression for cardiac protection
US20070190028A1 (en) * 2006-02-13 2007-08-16 Jihong Qu Method and apparatus for heat or electromagnetic control of gene expression
US20090018613A1 (en) * 2006-08-02 2009-01-15 Genestim, Llc Regulation of vascular endothelial growth factor (vegf) gene expression in tissue via the application of electric and/or electromagnetic fields
WO2011092710A2 (en) 2010-02-01 2011-08-04 Metacure Limited Gastrointestinal electrical therapy
CN101891803B (zh) * 2010-07-15 2012-09-05 北京大学第三医院 一种软骨亲和多肽序列、其筛选方法及应用
WO2012045079A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Ivivi Health Sciences, Llc Method and apparatus for electromagnetic treatment of head cerebral and neural injury in animals and humans
US8795147B1 (en) 2010-10-07 2014-08-05 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Modifying the genetic regulation of bone and cartilage cells and associated tissue by EMF stimulation fields and uses thereof
US9896681B2 (en) 2010-10-07 2018-02-20 The United States Of America As Represented By The National Aeronautics And Space Administration Genetic regulation of bone and cells by electromagnetic stimulation fields and uses thereof
US8343027B1 (en) 2012-01-30 2013-01-01 Ivivi Health Sciences, Llc Methods and devices for providing electromagnetic treatment in the presence of a metal-containing implant
WO2015161063A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Iviv Health Sciences, Llc A two-part pulsed electromagnetic field applicator for application of therapeutic energy
EP3481495A4 (en) * 2016-07-07 2020-04-29 Venus Concept Ltd Aesthetic device useful for increasing skin rejuvenation and method therefor
WO2018089795A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Qoravita LLC System and method for applying a low frequency magnetic field to biological tissues
CN110604098B (zh) * 2019-09-23 2021-09-07 广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院） 一种类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4509520A (en) 1982-02-22 1985-04-09 Biolectron, Inc. Electrical stimulating apparatus
US5269746A (en) 1982-12-20 1993-12-14 Jacobson Jerry I Therapeutic treatment of mammals for epilepsy and Parkinson's disease
US4535775A (en) 1983-02-10 1985-08-20 Biolectron, Inc. Method for treatment of non-union bone fractures by non-invasive electrical stimulation
IT1159024B (it) 1983-06-02 1987-02-25 Ruggero Cadossi Metodo e dispositivo per il trattamento di tessuti e cellule viventi mediante campi elettromagnetici pulsanti
US4600010A (en) 1984-10-04 1986-07-15 Biolectron, Inc. Electric stimulator and test instrument therefor
US5014699A (en) 1986-05-23 1991-05-14 Trustees Of The University Of Pennsylvania Electromagnetic method and apparatus for healing living tissue
US5038797A (en) 1990-02-20 1991-08-13 Romaine, Incorporated Electrical stimulation treatment device and method of use
US5273033A (en) 1991-09-19 1993-12-28 Murray Electronics Associates Limited Partnership Electrical stimulation for treatment of osteoarthritis
US5338286A (en) 1992-12-08 1994-08-16 Electro-Biology, Inc. Electromagnetic bioresponse by selective spectral suppression in pulsed field stimulation
US5374283A (en) 1993-12-01 1994-12-20 Flick; A. Bart Electrical therapeutic apparatus
US5743844A (en) 1996-11-01 1998-04-28 Amei Technologies, Inc. High efficiency pulsed electromagnetic field (PEMF) stimulation therapy method and system
US6132362A (en) 1996-11-01 2000-10-17 Amei Technologies, Inc. Pulsed electromagnetic field (PEMF) stimulation therapy system with bi-phasic coil
US6261221B1 (en) 1996-11-01 2001-07-17 Amei Technologies Inc. Flexible coil pulsed electromagnetic field (PEMF) stimulation therapy system
US5968527A (en) 1997-02-27 1999-10-19 Catholic University Of America, The Protection of living systems from the adverse effects of stress
US6083149A (en) 1997-10-22 2000-07-04 Emf Therapeutics, Inc. Magnetic field device and method for inhibiting angiogenesis and retarding growth rates of tumors in mammals
US6186940B1 (en) 1998-05-18 2001-02-13 Robert N. Kirschbaum Energized trace elements
US7465566B2 (en) 2000-02-23 2008-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of genes via application of specific and selective electrical and electromagnetic signals
US6485963B1 (en) 2000-06-02 2002-11-26 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Growth stimulation of biological cells and tissue by electromagnetic fields and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP1575475A2 (en) 2005-09-21
CA2501554A1 (en) 2004-04-22
NZ539833A (en) 2008-08-29
MXPA05003785A (es) 2005-09-20
CA2501554C (en) 2014-08-05
JP2006501853A (ja) 2006-01-19
NO20052254L (no) 2005-07-04
WO2004033644A3 (en) 2004-09-23
BR0315241A (pt) 2005-08-23
AU2003279184A1 (en) 2004-05-04
KR20050056233A (ko) 2005-06-14
US6919205B2 (en) 2005-07-19
NO20052254D0 (no) 2005-05-06
EP1575475B1 (en) 2016-06-29
CN1703184A (zh) 2005-11-30
ZA200503422B (en) 2006-12-27
EG23918A (en) 2007-12-30
US20040073260A1 (en) 2004-04-15
CR7789A (es) 2005-10-05
WO2004033644A2 (en) 2004-04-22
EP1575475A4 (en) 2007-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2593307T3 (es) Regulación de expresión del gen de colágeno tipo II usando señales eléctricas y electromagnéticas específicas y selectivas
USRE41391E1 (en) Regulation of type II collagen gene expression using specific and selective electrical and electromagnetic signals
ES2622076T3 (es) Regulación de la expresión de genes Aggrecan usando señales eléctricas y electromagnéticas específicas y selectivas
CA2553199C (en) System for up-regulating bone morphogenetic protein (bmp) gene expression in bone cells via the application of fields generated by specific electric and electromagnetic signals
CA2529374C (en) Regulation of matrix metalloproteinase gene expression using specific and selective electrical and electromagnetic signals
US20090018613A1 (en) Regulation of vascular endothelial growth factor (vegf) gene expression in tissue via the application of electric and/or electromagnetic fields
BRPI0711846A2 (pt) dispositivo para o tratamento de uma fratura óssea, risco de fratura, junção retardada, não soldadura de fraturas, insuficiência óssea, fusão espinal, osteonecrose, oesteoporose e/ou outras condições
WO2008017023A2 (en) Regulation of vascular endothelial growth factor (vegf) gene expression in tissue via the application of electric and/or electromagnetic fields