ES2230502T3

ES2230502T3 - Disolucion tampon para la electroporacion y procedimiento que incluye el uso de la misma.

Info

Publication number: ES2230502T3
Application number: ES02740284T
Authority: ES
Inventors: Kirsten Rothmann-Cosic; Heike Wessendorf; Juliana Helfrich; Corinna Thiel; Gudula Riemen; Helmut Brosterhus; Herbert Muller-Hartmann; Meike Weigel; Elke Lorbach; Michael Nix; Gregor Siebenkotten
Original assignee: Amaxa AG
Current assignee: Amaxa AG
Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2022-04-23
Also published as: WO2002086134A2; NO20034682L; KR20040014503A; US20110117654A1; DE50201240D1; US8003389B2; MXPA03009622A; US7332332B2; US8039259B2; WO2002086134B1; KR100845057B1; US8192990B2; KR100879824B1; EP1390518A2; AU2002315658B2; JP4070611B2; NO20034682D0; CA2445260C; US20050064596A1; KR20080005345A

Abstract

Disolución tampón para suspender células animales o humanas y disolver moléculas biológicamente activas con el fin de la introducción de estas moléculas biológicamente activas en las células por medio de corriente eléctrica que presenta, para una variación del valor de pH desde pH 7 hasta pH 8 y una temperatura de 25ºC, una capacidad tampón de al menos 20 mmol * l-1 * pH-1 y una fuerza iónica de al menos 200 mmol * l-1 y para la cual la concentración de iones potasio (K+) es de 2 a 6 mmol * l-1 de K+ y la concentración de iones sodio (Na+) es de 100 a 150 mmol * l-1 de Na+.

Description

Disolución tampón para la electroporación y procedimiento que incluye el uso de la misma.

La invención se refiere a una disolución tampón para suspender células animales o humanas y disolver moléculas activas con el fin de la introducción de estas moléculas biológicamente activas en las células mediante corriente eléctrica, así como a un procedimiento para la introducción de moléculas biológicamente activas en células animales o humanas mediante corriente eléctrica, que incluye el uso de la disolución tampón.

Antecedentes

La introducción de moléculas biológicamente activas, como por ejemplo, ADN, ARN o proteínas en células vivas, representa un instrumento importante para la investigación de las funciones biológicas de estas moléculas. En este sentido, un método preferido para introducir moléculas extrañas en las células es la electroporación que, al contrario que otros métodos, sólo produce pequeñas alteraciones permanentes de la estructura y funciones biológicas de la célula diana mediante los agentes de transferencia. En la electroporación, se introducen las moléculas extrañas en las células mediante un flujo de corriente de corta duración a partir de una disolución acuosa, haciéndose permeable la membrana celular para las moléculas extrañas mediante la acción de los impulsos eléctricos cortos. Las moléculas biológicamente activas llegan al citoplasma primero a través de los "poros" que se producen durante un tiempo corto en la membrana celular, donde ya pueden opcionalmente llevar a cabo su función investigada. Sin embargo, en el caso de la introducción de ADN en células eucariotas, aquellas deben llegar al núcleo celular para posibilitar una expresión de la información genética. En el caso de células activas en fase de división, esto puede realizarse durante la división celular, llegando el ADN de manera pasiva al núcleo celular después de la rotura preliminar de la envoltura nuclear. Sin embargo, en el caso de investigaciones con células en reposo o poco activas en fase de división, por ejemplo células animales primarias, el ADN no llega de esta manera al núcleo celular, de modo que los procedimientos correspondientes no pueden utilizarse aquí o por lo menos son muy costosos. Especialmente en el caso de la introducción de ADN en células animales, la denominada transfección, aparecen además con frecuencia problemas especiales debidos a la labilidad de las células en el caso de la electroporación, ya que la tasa de supervivencia de las células influye en la eficiencia de la transfección como parámetro más importante.

Estado de la técnica

Para la incorporación de células animales y de la molécula de ADN durante la electroporación, en el pasado se utilizaron a menudo medios de cultivo celular (Anderson et al. (1991), J. Biochem. Biophys. Meth. 22, 207) o disoluciones salinas tamponadas con fosfato o HEPES (Potter et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161; Fromm et al. (1985), Nature 319, 791). Pero también se usaron disoluciones de manitol o sacarosa no tamponadas o poco tamponadas en la electroporación de células animales (Shimizu et al. (1986), Med. Immunol. 11, 105; Riggs et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5602). Pero, tales disoluciones no tamponadas o poco tamponadas tienen la desventaja de que su uso lleva a un aumento de la mortalidad celular y una eficiencia de transfección marcadamente disminuida (Yan et al. (1998), BioTechniques 24, 590).

Por tanto, Yan et al. (1998) usaron una disolución tamponada para la electroporación compuesta por HEPES 100 mM, NaCl 137 mM, Na_{2}HPO_{4} 4 mM y dextrosa 6 mM. En este tampón, pudieron transfectarse con éxito concretamente células de músculo liso de aorta humana, sin embargo en este caso la eficiencia de transfección fue simplemente del 15% con una tasa de supervivencia desde sólo el 10 hasta el 20%. Además, el tampón usado por Yan et al. está optimizado simplemente para pulsos de tensión de hasta 500 V, de manera que no se sugiere si este tampón también puede utilizarse en caso de pulsos de tensión más alta, como por ejemplo son necesarios para la transfección directa en los núcleos celulares. En cualquier caso, sin embargo, las eficiencias de transfección logradas en este tampón son demasiado bajas para pensar en pretensiones mayores.

En muchos casos, se han utilizado tampones con fuerza iónica baja y por tanto con conductividad baja para evitar los daños celulares debidos a corrientes elevadas, lo que se ha observado en el caso de utilización de disoluciones tampón con conductividad alta, especialmente en el caso de aplicación de pulsos de alta tensión de larga duración.

Friedrich et al., 1998 (Bioelectrochem. and Bioenerg. 47, 103) pudieron demostrar que el flujo de corriente en la electroporación mediante electrólisis del agua conduce a una variación del valor del pH en la proximidad de los electrodos. Esta variación del valor del pH determina la liberación de iones Al^{3+} citotóxicos desde los electrodos de aluminio de las cubetas y con ello una mortalidad celular elevada. Para aumentar la eficiencia de la transfección, los autores proponen aquí un acortamiento de la duración de pulso. No se sugiere una variación del tampón utilizado.

Con frecuencia, se han añadido también al tampón de electroporación cationes divalentes, como por ejemplo, Mg^{2+}. Los iones de magnesio facilitan la unión del ADN a la superficie de las células y mediante ello producen una tasa de transfección elevada. Sin embargo, parece que esto sólo es válido para concentraciones de Mg^{2+} de hasta 10 mM, ya que para concentraciones más elevadas prevalecen los efectos negativos, como por ejemplo disminución de la electroforesis mediante neutralización de las cargas de la molécula de ADN o calentamiento del tampón mediante aumento de la conductividad (Xie and Tsong (1993), Biophys. J. 65. 1684); Neumann et al. (1982), EMBO J. 1, 841; Klenchin et al (19919, Biophys. J. 60, 804).

Se ha propuesto adicionalmente ajustar el tampón, en cuanto a su composición, a los comportamientos intracelulares, para aumentar la tasa de supervivencia de las células. Por tanto, debería utilizarse un tampón con concentración alta de potasio y baja de sodio, correspondientes al citoplasma, para evitar un fallo de la relación intracelular de Na^{+}/K^{+} mediante transferencia de masa a través de los poros formados durante la electroporación en la membrana celular (van den Hoff et al. (1995), Methods in Mol. Biol. 48, capítulo 15, 185-197). Sin embargo, se estableció aquí una disminución de la eficiencia de transfección para pulsos con intensidades de campo más altas, a partir de 1300 V/cm.

Sin embargo, todas las disoluciones tampón descritas hasta el momento tienen la desventaja de que, en caso de su uso, las eficiencias de transfección conseguidas son relativamente bajas y/o los tampones no son adecuados para el uso en caso de electroporación de células en reposo o poco activas en fase de división.

Descripción de la invención

Por tanto, la invención se basa en la tarea de poner a disposición una disolución tampón para la electroporación que posibilite eficiencias de transfección altas con tasas de mortalidad celular bajas, así como de desarrollar un procedimiento correspondiente.

La tarea se soluciona mediante una disolución tampón según la invención que presenta, para una variación del valor de pH de pH 7 a pH 8 y una temperatura de 25ºC, una capacidad tampón de al menos 20 mmol * l^{-1} * pH^{-1} y una fuerza iónica de al menos 200 mmol * l^{-1} y para la cual la concentración de iones potasio (K^{+}) es de 2 a 6 mmol * l^{-1} de K^{+} y la concentración de iones sodio (Na^{+}) es de 100 a 150 mmol * l^{-1} de Na^{+}. Con una disolución tampón de este tipo, es posible la introducción de moléculas biológicamente activas en células animales o humanas mediante electroporación con eficiencias de transfección de hasta el 93%, simultáneamente con mortalidad celular baja. En este tampón, pueden transfectarse con éxito diferentes tipos celulares, especialmente también células en reposo o poco activas en la división. Además, mediante el uso de la disolución tampón, se posibilita la utilización de pulsos de alta tensión con una intensidad de campo de al menos 2000 V/cm, lo que hace posible la transfección directa de moléculas de ADN en los núcleos celulares de células animales y humanas primarias. En este sentido, es decisivo para las propiedades ventajosas del tampón según la invención la combinación de una capacidad tampón alta con una fuerza iónica alta. La capacidad tampón \beta describe la cantidad de un proteolito que es necesaria para variar el valor de pH de una disolución tampón en una unidad (\beta = dC * dpH^{-1} con dC = adición de ácido o base y dpH = variación del valor de pH). La fuerza iónica I de una disolución se calcula con ayuda de la fórmula I = 0,5 \Sigmac_{i} * z_{i}^{2} (c_{i} = concentración iónica en mol/l, z_{i} = carga iónica). Para calcular las fuerzas iónicas de las sustancias especificadas en esta solicitud, se utilizó el programa "Java Buffer Calculador" (Twigger & Beynon, 1998). En este sentido, el tampón puede optimizarse en su composición para los diferentes tipos celulares y requisitos.

En una forma de realización preferida, se prevé que la disolución tampón presente una capacidad tampón de entre 22 y 80 mmol * l^{-1} * pH^{-1}, preferiblemente entre 40 y 70 mmol * l^{-1} * pH^{-1}. En cuanto a la fuerza iónica, se ha demostrado especialmente ventajosa en el intervalo entre 200 y 500 mmol * l^{-1}, preferiblemente entre 250 y 400 mmol * l^{-1}. Generalmente, en función del tipo celular y de las condiciones de ensayo adicionales, existe por tanto un valor óptimo en relación con la capacidad tampón y fuerza iónica, existiendo una interacción entre estos dos parámetros.

En otra forma de realización preferida, se prevé que la disolución tampón contenga al menos 10 mmol * l^{-1} de iones magnesio (Mg^{2+}), preferiblemente de 15 a 20 mmol * l^{-1} de iones magnesio. En contra de los conocimientos previos, se ha demostrado sorprendentemente que los iones Mg^{2+} en el tampón según la invención, también en concentraciones más altas, pueden producir un aumento de la tasa de transfección y concretamente en un grado claramente más alto que el que se podría atribuir al pequeño aumento simultáneo de la fuerza iónica. En este sentido, el tampón puede contener cloruro de magnesio (MgCl_{2}) y/o sulfato de magnesio (MgSO_{4}).

En comparación con el citoplasma de las células, el tampón según la invención contiene una concentración más baja de iones potasio (K^{+}) y una concentración más alta de iones sodio (Na^{+}). El tampón según la invención no se ajusta por tanto a la relación intracelular de Na^{+}/K^{+}, sino que existen a este respecto más bien relaciones "extracelulares". Pero, sorprendentemente, esto no tiene ningún efecto negativo sobre las células, sino que se produce, sin embargo, un claro aumento de la tasa de transfección y de supervivencia celular.

Se ha previsto ventajosamente que el tampón según la invención contenga como sustancia tampón HEPES y/o Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4}. Pero también pueden utilizarse por ejemplo Tris/HCl o K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}. Además, también pueden estar contenidos en el tampón otros constituyentes adicionales, por ejemplo, cloruro de sodio, succinato de sodio, manitol, glucosa, lactobionato de sodio y/o péptidos.

Como ejemplos de composiciones especialmente ventajosas de las disoluciones tampón según la invención se mencionarán a continuación seis grupos de sistemas tampón, que están optimizados, respectivamente, para diferentes tipos celulares. Pero en el marco de la invención, también son posibles otras composiciones, de modo que estos ejemplos no deben entenderse como limitación.

1): KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM y Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 120-160 mM (pH 7,2)

2): KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, HEPES 5-25 mM y Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 120-160 mM (pH 7,2)

3): KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50-160 mM (pH 7,2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM

4): KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, HEPES 5-25 mM, Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50-160 mM (pH 7,2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM

5): KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, NaCl 80-100 mM, glucosa 8-12 mM, Ca(NO_{3})_{2} 0,3-0,5 mM, HEPES 20-25 mM y tris/HCl 50-100 mM o Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 30-50 mM (pH 7,2)

6): MgCl_{2} 0,1-3,0 mM, K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50-200 mM (pH 6,5) y/o manitol 1-50 mM y/o succinato de sodio 1-50 mM

La tarea se soluciona adicionalmente mediante un procedimiento para la introducción de moléculas biológicamente activas en células animales o humanas por medio de corriente eléctrica, que comprende la suspensión de las células y la disolución de la molécula biológicamente activa en una disolución tampón que presenta para una variación del valor de pH desde pH 7 hasta pH 8 y una temperatura de 25ºC, una capacidad tampón de al menos 20 mmol * l^{-1} * pH^{-1} y una fuerza iónica de al menos 200 mmol * l^{-1}, y la aplicación de una tensión eléctrica sobre la suspensión. Con ayuda de este procedimiento, es posible introducir moléculas biológicamente activas en células animales y humanas por medio de electroporación con eficiencias de transfección de hasta el 93%, simultáneamente con mortalidad celular baja. En este sentido, pueden transfectarse con éxito diferentes tipos celulares, especialmente incluso células en reposo o poco activas en la fase de división.

Otras configuraciones ventajosas del procedimiento según la invención en relación con la composición de la disolución tampón se especifican en las siguientes reivindicaciones y deben deducirse de la descripción previa.

La disolución tampón según la invención es adecuada especialmente para la realización de un procedimiento de electroporación en el que se consigue la introducción de moléculas biológicamente activas en las células mediante un impulso de tensión con una intensidad de campo de desde 2 hasta 10 kV*cm^{-1} y una duración de desde 10 hasta 200 \mus, así como una densidad de corriente de al menos 2 A*cm^{-2}. En este sentido, mediante el pulso de alta tensión se posibilita la transfección directa de ADN en los núcleos celulares de células animales y humanas, evitándose una lesión irreversible de la membrana mediante la corta duración del pulso. La fuerza iónica o la conductividad elevada del tampón tampoco conduce aquí, debido a la corta duración del pulso de alta tensión, a un calentamiento desventajoso de la disolución, de manera que junto con las células activas en fase de división, también se transfectan con alta eficiencia y baja mortalidad, células en reposo o poco activas en fase de división. La actuación conjunta de la fuerza iónica elevada del tampón y los pulsos cortos de alta tensión produce más bien una apertura eficaz de los poros, pudiendo compensar la fuerte acción del tampón incluso desviaciones extremas del valor de pH.

Mediante la utilización del tampón según la invención en el procedimiento, también se hace posible de una manera ventajosa la aplicación de un flujo de corriente que sigue sin interrupción al pulso de alta tensión mencionado con una densidad de corriente de desde 2 hasta 14 A*cm^{-2}, preferiblemente de hasta 5 A*cm^{-2} y una duración de desde 1 hasta 100 ms, preferiblemente de hasta 50 ms. En este sentido, la elevada capacidad tampón de la disolución tampón según la invención produce, durante el segundo pulso que permanece largo tiempo, que produce la electroforesis del ADN, una variación del valor del pH en la proximidad de los electrodos, de manera que la mortalidad celular puede disminuirse eficazmente.

Mediante el procedimiento según la invención, se optimiza por tanto de manera ventajosa la transfección de la molécula biológicamente activa por medio de corriente eléctrica en los núcleos celulares de las células animales o humanas. En este sentido, pueden introducirse con elevada eficiencia ácidos nucleicos, proteínas o péptidos en células en reposo o activas en fase de división, animales o humanas. La disolución según la invención favorece también la introducción de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos en células primarias mediante la ayuda de pulsos de alta tensión.

En la disolución tampón, los ácidos nucleicos también pueden presentarse como complejo o en combinación con péptidos, proteínas u otras moléculas biológicamente activas.

El procedimiento según la invención es adecuado especialmente también para la transfección de células sanguíneas humanas primarias, células precursoras pluripotentes de la sangre humana, fibroblastos y células endoteliales, así como células musculares o melanocitos humanos primarios.

Las células producidas mediante el procedimiento según la invención son adecuadas de manera especialmente ventajosa para los procedimientos diagnósticos y/o analíticos, así como para la producción de medicamentos para la terapia génica ex vivo.

En la tabla 1, se mencionan las composiciones concretas de las disoluciones tampón según la invención, que están optimizadas respectivamente para diferentes aplicaciones o tipos celulares y que han demostrado ser especialmente ventajosas con respecto a las elevadas eficiencias de transfección y disminución de la mortalidad celular. Pero, en el marco de la invención, también son posibles otras composiciones, de modo que estos ejemplos tampoco deben entenderse como limitación.

A continuación, se explican en detalle, en combinación con las figuras, ejemplos de aplicación de las disoluciones tampón individuales.

Descripción de las figuras

La invención se explica en detalle a continuación por medio de las figuras.

Muestran

la figura 1 una representación gráfica de la eficiencia de transfección y la tasa de supervivencia en células endoteliales humanas primarias frente a la capacidad tampón y la fuerza iónica de la disolución tampón.

la figura 2 una representación gráfica de la eficiencia de transfección y la tasa de supervivencia en linfocitos humanos primarios frente a la capacidad tampón y la fuerza iónica de la disolución tampón.

la figura 3 un análisis citométrico de flujo de fibroblastos humanos primarios transfectados con el vector de expresión H-2K^{k}, en el que se incubaron las células con un anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a Cy5 y se analizaron con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) (FL-1, FL-2, FL-3 = canales de fluorescencia 1, 2, 3; SSC = "sideward scatter" (dispersión lateral), FSC = "forward scatter" (dispersión frontal)),

la figura 4 un análisis citométrico de flujo de células de músculo liso humanas transfectadas con el vector de expresión H-2K^{k}, en el que se incubaron las células con un anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a Cy5 y se analizaron con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) (FL-1, FL-2, FL-3 = canales de fluorescencia 1, 2, 3; SSC = "sideward scatter" (dispersión lateral), FSC = "forward scatter" (dispersión frontal)),

la figura 5 un análisis citométrico de flujo de melanocitos humanos primarios transfectados con el vector de expresión GFP, en el que se analizaron las células con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) (FL-2, FL-3, FL-4 = canales de fluorescencia 2, 3, 4; SSC = "sideward scatter" (dispersión lateral), FSC = "forward scatter" (dispersión frontal)),

la figura 6 un análisis citométrico de flujo de la línea celular K562 de LMC (leucemia mieloide crónica) humana transfectada con el vector de expresión GFP, en el que se analizaron las células con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) (FL-2, FL-3, FL-4 = canales de fluorescencia 2, 3, 4; SSC = "sideward scatter" (dispersión lateral), FSC = "forward scatter" (dispersión frontal)),

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin embargo no deben entenderse como limitantes.

Ejemplo 1 Eficiencia de transfección y tasa de supervivencia de células endoteliales humanas primarias

Para analizar la tasa de transfección y de supervivencia de células en la electrotransfección en función de la capacidad tampón y la fuerza iónica, se transfectaron células endoteliales humanas primarias con un vector que codifica para la cadena pesada de la proteína del MHC clase I de ratón, H-2K^{k}.

En una cubeta con 2 mm de separación de los electrodos, se dispusieron 7 x 10^{5} células con 5 \mug de ADN-vector, respectivamente, con el tampón de electrotransfección correspondiente a temperatura ambiente y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V y 100 \mus de duración. Adicionalmente, se determinaron valores de comparación con PBS ("Phosphate Buffered Saline", solución salina tamponada con fosfato: fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2 + NaCl 137 mM, fuerza iónica = 161,5 mM, capacidad tampón = 4,8 mM/pH). Inmediatamente después de la electrotransfección, se aclararon las células con 400 \mul de medio de cultivo, se incubaron durante 10 minutos a 37ºC y se trasladaron después a una placa de cultivo con medio calentado previamente. Después de 6 h de incubación, se analizaron las células con un anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a Cy5 y con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson).

Tal como se aprecia en la figura 1, cuando aumentan la capacidad tampón y la fuerza iónica, aumentan tanto las eficiencias de transfección como también las tasas de supervivencia. En este sentido, pudieron lograrse valores claramente mejores, respectivamente, que con la disolución de comparación de PBS, en la que apareció una tasa de mortalidad extremadamente elevada. En el caso de algunas disoluciones tampón, la tasa de mortalidad fue también tan elevada que estos valores no pudieron evaluarse estadísticamente.

Ejemplo 2 Eficiencia de transfección y tasa de supervivencia de linfocitos humanos primarios

Además, se analizó la tasa de transfección y de supervivencia de linfocitos humanos primarios en la electrotransfección en función de la capacidad tampón y de la fuerza iónica.

Para ello, en una cubeta con 2 mm de separación de los electrodos, se dispusieron 5 x 10^{6} células con 5 \mug de ADN-vector de expresión H-2K^{k}, respectivamente, en los tampones de electrotransfección correspondientes a temperatura ambiente y se electrotransfectaron mediante un pulso de 1000 V y 100 \mus, seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 4 A*cm^{-2} y 40 ms. Adicionalmente, se determinaron valores de comparación utilizando PBS (fuerza iónica = 161,5 mM, capacidad tampón = 4,8 mM/pH). El análisis se realizó después de 16 horas.

Tal como se reconoce en la figura 2, queda aquí aclarado que concretamente las tasas de supervivencia de las células aumentan cuando la capacidad tampón y la fuerza iónica de las disoluciones tampón utilizadas aumentan, pero para las eficiencias de transfección resulta un máximo. Pudieron lograrse valores en parte claramente mejores que con la disolución de comparación (PBS: 40,1% de células transfectadas, 38,3% de células vivas). También en este caso puede aumentarse claramente la eficiencia de la electrotransfección, por tanto, mediante la elección de la disolución tampón según la invención adecuada en comparación con las disoluciones habituales, como por ejemplo medio o PBS.

Ejemplo 3 Transfección de fibroblastos humanos primarios

La figura 3 muestra un análisis mediante FACScan de fibroblastos humanos primarios que se transfectaron con el vector de expresión H-2K^{k}. En una cubeta con 2 mm de separación de los electrodos, se dispusieron 5 x 10^{6} células con 5 \mug de ADN-vector en tampón 6 de la tabla 1 a temperatura ambiente y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V y 100 \mus, seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 6 A*cm^{-2} y 33 ms. Después de 5 h de incubación, se incubaron las células con un anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a Cy5 y se analizaron con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson). El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. El 93% de las células vivas expresaron el antígeno H-2K^{k}, lo que se corresponde con una eficiencia de transfección muy elevada.

Ejemplo 4 Transfección de células de músculo liso humanas

La figura 4 muestra un análisis mediante FACScan de células de músculo liso humanas que se transfectaron con el vector de expresión H-2K^{k}. En una cubeta con 2 mm de separación de los electrodos, se dispusieron 5 x 10^{5} células con 5 \mug de ADN-vector en tampón 6 de la tabla 1 a temperatura ambiente y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V y 100 \mus, seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 5,6 A*cm^{-2} y 40 ms. Después de 13,5 h de incubación, se incubaron las células con un anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a Cy5 y se analizaron con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson). El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. El 53,8% de las células vivas expresaron el antígeno H-2K^{k}, lo que se corresponde con una eficiencia de transfección elevada.

Ejemplo 5 Transfección de melanocitos humanos primarios

La figura 5 muestra un análisis mediante FACScan de melanocitos humanos primarios que se transfectaron con el vector de expresión GFP. En una cubeta con 2 mm de separación de los electrodos, se dispusieron 5 x 10^{5} células con 5 \mug de vector pEGFP-C1 (Clontech Lab.) en tampón 40 según la tabla 1 a temperatura ambiente y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V y 100 \mus, seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 6 A*cm^{-2} y 33 ms. Después de 24 h de incubación, se analizaron las células con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson). El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. El 56,2% de las células vivas expresaron el GFP, lo que se corresponde con una eficiencia de transfección elevada.

Ejemplo 6 Transfección de la línea celular K562 de LMC humana

La figura 6 muestra un análisis mediante FACScan de la línea celular K562 de LMC humana que se transfectó con el vector de expresión GFP. En una cubeta con 2 mm de separación de los electrodos, se dispusieron 5 x 10^{5} células con 5 \mug de vector pEGFP-C1 (Clontech Lab.) en tampón 42 según la tabla 1 a temperatura ambiente y se transfectaron mediante un pulso de 1000 V y 70 \mus, seguido de un flujo de corriente con una densidad de corriente de 4 A*cm^{-2} y 10 ms. Después de 24 h de incubación, se analizaron las células con un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson). El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. El 77,7% de las células vivas expresaron el GFP, lo que se corresponde con una eficiencia de transfección elevada.

Lista de las abreviaturas utilizadas

Además de las habituales del diccionario "Duden", se utilizaron las siguientes abreviaturas:

A: amperio

APC: aloficocianina

CD: cluster of differentiation (grupo de diferenciación)

cm: centímetro

ADN: ácido desoxirribonucleico

FACScan: Fluorescence activated cell scanning (análisis de células activadas mediante fluorescencia)

FCS: suero bovino fetal

FL: fluorescencia

FSC: forwardscatter (dispersión frontal)

HEPES: ácido N-(2-hidroxietil)-piperazin-N'-(2-etanosulfónico)

ml: mililitro

mM: milimolar

msec: milisegundo

PBS: Phosphate Buffered Saline (solución salina tamponada con fosfato)

PE: ficoeritrina

PerCp: proteína clorofila peridinina

pH: logaritmo decimal negativo de la concentración de iones hidrógeno

ARN: ácido ribonucleico

RPMI: Rosewell Park Memorial Institute

SSC: sidewardscatter (dispersión lateral)

Tris: clorhidrato de tris-(hidroximetil)-aminoetano

\mug: microgramo

\mul: microlitro

\musec: microsegundo

V: voltio

1

2

Claims

1. Disolución tampón para suspender células animales o humanas y disolver moléculas biológicamente activas con el fin de la introducción de estas moléculas biológicamente activas en las células por medio de corriente eléctrica que presenta, para una variación del valor de pH desde pH 7 hasta pH 8 y una temperatura de 25ºC, una capacidad tampón de al menos 20 mmol * l^{-1} * pH^{-1} y una fuerza iónica de al menos 200 mmol * l^{-1} y para la cual la concentración de iones potasio (K^{+}) es de 2 a 6 mmol * l^{-1} de K^{+} y la concentración de iones sodio (Na^{+}) es de 100 a 150 mmol * l^{-1} de Na^{+}.

2. Disolución tampón según la reivindicación 1, caracterizada porque ésta presenta una capacidad tampón (pH 7-8, 25ºC) de entre 22 y 80 mmol * l^{-1} * pH^{-1}.

3. Disolución tampón según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque ésta presenta una capacidad tampón (pH 7-8, 25ºC) de entre 40 y 70 mmol * l^{-1} * pH^{-1}.

4. Disolución tampón según la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizada porque ésta presenta una fuerza iónica de entre 200 y 500 mmol * l^{-1}.

5. Disolución tampón según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, caracterizada porque ésta presenta una fuerza iónica de entre 250 y 400 mmol * l^{-1}.

6. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque ésta contiene al menos 10 mmol * l^{-1} de iones magnesio (Mg^{2+}).

7. Disolución tampón según la reivindicación 6, caracterizada porque ésta contiene de 15 a 20 mmol * l^{-1} de iones magnesio (Mg^{2+}).

8. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque ésta contiene cloruro de magnesio (MgCl_{2}) y/o sulfato de magnesio (MgSO_{4}).

9. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque como sustancia tampón está contenido HEPES y/o Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} y/o Tris/HCl y/o K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}.

10. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque en la disolución tampón están contenidos constituyentes adicionales, por ejemplo, cloruro de sodio, succinato de sodio, manitol, glucosa, lactobionato de sodio y/o péptidos.

11. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque ésta contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM y Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 120-160 mM (pH 7,2).

12. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque ésta contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, HEPES 5-25 mM y Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 120-160 mM (pH 7,2).

13. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque ésta contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50-160 mM (pH 7,2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM.

14. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque ésta contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, HEPES 5-25 mM, Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50-160 mM (pH 7,2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM.

15. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque ésta contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, NaCl 80-100 mM, glucosa 8-12 mM, Ca(NO_{3})_{2} 0,3-0,5 mM, HEPES 20-25 mM y Tris/HCl 50-100 mM o Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 30-50 mM (pH 7,2).

16. Disolución tampón según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque ésta contiene MgCl_{2} 0,1-3,0 mM, K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50-200 mM (pH 6,5) y/o manitol 1-50 mM y/o succinato de sodio 1-50 mM.

17. Procedimiento para la introducción de moléculas biológicamente activas en células animales o humanas por medio de corriente eléctrica que comprende:

i.: suspender las células y disolver las moléculas biológicamente activas en una disolución tampón que presenta para una variación del valor de pH desde pH 7 hasta pH 8 y una temperatura de 25ºC, una capacidad tampón de al menos 20 mmol * l^{-1} * pH^{-1} y una fuerza iónica de al menos 200 mmol * l^{-1} y

ii.: aplicar una tensión eléctrica sobre la suspensión.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la disolución tampón presenta una capacidad tampón (pH 7-8, 25ºC) de entre 22 y 80 mmol * l^{-1} * pH^{-1}.

19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, en el que la disolución tampón presenta una capacidad tampón (pH 7-8, 25ºC) de entre 40 y 70 mmol * l^{-1} * pH^{-1}.

20. Procedimiento según la reivindicación 17, 18 ó 19, en el que la disolución tampón presenta una fuerza iónica de entre 200 y 500 mmol * l^{-1}.

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 20, en el que la disolución tampón presenta una fuerza iónica de entre 250 y 400 mmol * l^{-1}.

22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 21, en el que la disolución tampón contiene al menos 10 mmol * l^{-1} de iones magnesio (Mg^{2+}).

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que la disolución tampón contiene de 15 a 20 mmol * l^{-1} de iones magnesio (Mg^{2+}).

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 23, en el que la disolución tampón contiene cloruro de magnesio (MgCl_{2}) y/o sulfato de magnesio (MgSO_{4}).

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 24, en el que la disolución tampón, en comparación con el citoplasma de las células, contiene una concentración más baja de iones potasio (K^{+}), preferiblemente de 2 a 6 mmol * l^{-1} y una concentración más alta de iones sodio (Na^{+}), preferiblemente de 100 a 150 mmol * l^{-1}.

26. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 25, en el que como sustancia tampón está contenido HEPES y/o Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} y/o Tris/HCl y/o K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}.

27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 26, en el que en la disolución tampón están contenidos constituyentes adicionales, por ejemplo, cloruro de sodio, succinato de sodio, manitol, glucosa, lactobionato de sodio y/o péptidos.

28. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 27, en el que la disolución tampón contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM y Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 120-160 mM (pH 7,2).

29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 27, en el que la disolución tampón contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, HEPES 5-25 mM y Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 120-160 mM (pH 7,2).

30. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 27, en el que la disolución tampón contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50-160 mM (pH 7,2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM.

31. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 27, en el que la disolución tampón contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, HEPES 5-25 mM, Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50-160 mM (pH 7,2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM.

32. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 27, en el que la disolución tampón contiene KCl 4-6 mM, MgCl_{2} 10-20 mM, NaCl 80-100 mM, glucosa 8-12 mM, Ca(NO_{3})_{2} 0,3-0,5 mM, HEPES 20-25 mM y Tris/HCl 50-100 mM o Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 30-50 mM (pH 7,2).

33. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 27, en el que la disolución tampón contiene MgCl_{2} 0,1-3,0 mM, K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50-200 mM (pH 6,5) y/o manitol 1-50 mM y/o succinato de sodio 1-50 mM.

34. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 33, en el que la introducción de las moléculas biológicamente activas en las células se consigue mediante un impulso de tensión con una intensidad de campo de desde 2 hasta 10 kV*cm^{-1} y una duración de desde 10 hasta 200 \mus, así como una densidad de corriente de al menos 2 A*cm^{-2}.

35. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que la introducción de las moléculas biológicamente activas en las células se consigue mediante un flujo de corriente que sigue sin interrupción a un impulso con una densidad de corriente de desde 2 A*cm^{-2} hasta 14 A*cm^{-2}, preferiblemente de hasta 5 A*cm^{-2} y una duración de desde 1 hasta 100 ms, preferiblemente de hasta 50 ms.

36. Procedimiento según la reivindicación 34 ó 35, en el que las moléculas biológicamente activas se transfectan por medio de corriente eléctrica en los núcleos celulares de las células animales o humanas.

37. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 36, en el que se introducen ácidos nucleicos, proteínas, péptidos u otras moléculas biológicamente activas en células en reposo o activas en fase de división, animales o humanas.

38. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 37, en el que se introducen ácidos nucleicos, proteínas o péptidos en células animales o humanas, primarias.

39. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 38, en el que los ácidos nucleicos se presentan como complejo o en combinación con péptidos, proteínas u otras moléculas biológicamente activas.

40. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 39, en el que las células son células sanguíneas humanas primarias, células precursoras pluripotentes de la sangre humana, fibroblastos humanos, células endoteliales, células musculares o melanocitos humanos.