JPH09504425A - トランスフェクションプロセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的活性因子を細胞集団中の標的細胞に送達する方法であって、該細胞集団を、該生物学的活性因子および該標的細胞に結合可能なリガンドを含む複合体に曝する工程、および細胞生存能を維持させながら該細胞集団を電場に供する工程を包含する、方法。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスフェクションプロセス 本発明は、標的核酸ベクターを用いる細胞のトランスフェクションプロセスに 関する。詳細には、本発明は、造血細胞、特に複雑な細胞集団中に存在する幹細 胞およびＴ細胞を、特異的な細胞表面リガンドに対して標的となるベクターでト ランスフェクトするための改良方法について記載する。 細胞による核酸ベクターの取り込みは分子生物学の中心であり、また他の科学 に対する、そして臨床背景における分子生物学技術の応用の中心である。DEAEお よびリン酸カルシウム介在のトランスフェクション技術以来、トランスフェクシ ョンプロセスの効率を改良することが求められている。このため、リポソーム送 達、マイクロインジェクション、およびリポフェクションのような技術を含む、 核酸を細胞へ送達する多くの新規プロトコールが出現している。このような改良 技術の一つがエレクトロポレーションである(Tsong、1991を参照のこと)。DNAの 導入に加えて、エレクトロポレーションはまた、酵素、抗体、および細胞膜タン パク質を含む種々のマクロ分子をインビボで単離された細胞または組織中に導入 するために使用されている(Weaver、1993を参照のこと)。 細胞のエレクトロポレーションは、細胞膜横断の電圧の印加を包含し、細胞膜 に孔の形成を生じさせ、そしてマイクロ秒またはミリ秒の単位の短時間の間にそ の伝導性を上昇させ、電気浮動(electrical drift)、電気浸透、または拡散のよ うな候補メカニズムによって、マクロ分子および他の物質の取り込みを可能にす る。 正確なメカニズムは確立されていないが、このメカニズムは可逆的であり、そ して膜タンパク質の安定な挿入後、赤血球のような標的細胞は生存可能の状態に あることが知られている(Mouneimneら、1989)。あいにく、核酸の導入に必要な 大きな電場を用いるエレクトロポレーションはまた、細胞ストレスおよび細胞死 の高発生率に関連する。このように大きな電場の使用は、DNAを取り込む初期集 団の割合としての細胞の数を上昇させるが、生存細胞の割合の減少も同時に引き 起こす。従って、エレクトロポレーション効率は、高いトランスフェクション効 率を起こすのに必要な場強度で細胞を死滅させる傾向があるために制限される。 上述の一般的なトランスフェクション技術(エレクトロポレーションを含む)は 、ある条件では効果的であるが、異種細胞集団中の特定の細胞タイプを選択的に 標的とすることが望ましい場合は、非効果的である。これは、一般的なトランス フェクション方法に選択的事象がないことが原因である。利用可能な核酸はあら ゆる細胞によって取り込まれる。但し、DNA取り込みの効率は細胞のタイプによ って変化し得る。 標的取り込みは多くの研究室によって探求されている。最初の有効な標的トラ ンスフェクション技術の一つは、Wuによって開示された(WuおよびWu、1987；Wu ら、1989)。この技術(レセプター介在遺伝子伝達)は、肝細胞に対してDNAベクタ ーを標的とした。これは、肝細胞上のアシアログリコプロテインレセプターによ って結合される糖タンパク質にベクターを複合させることによる。肝細胞へのベ クターの有効な標的化をインビボおよびインビトロで示した。 レセプター介在遺伝子伝達は、細胞表面上の適切なリガンドの存在に依存し、 これによって所望の細胞タイプに対して特異的に標的化することを可能とし、そ の後複合体の内在化およびDNAの発現が起こる。このことは多くの問題を引き起 こし得る。何故なら、細胞表面マーカーは、しばしば細胞タイプ間で共有される からである。この問題に対する解決法が提案されている(とくに英国特許出願第9 325759.0号)が、現在までのところ、最も一般的に引用されている解決法は、ト ランスフェクトしようとする細胞を精製し、それらを処理し、そして続いてそれ らを元の細胞集団に再導入することである。 提案されている一つの解決法は、標的細胞を分離する必要がなく、高い特異性 を持つ細胞表面抗原を標的化するように設計され得る抗体にベクターまたは送達 システムを結合させることを包含する(WongおよびHuang、1987；Rouxら、1989； Trubetskoyら、1992；Hirschら、1993)。Wuの方法におけるように、核酸はポリ リジンを用いて抗体分子に結合され得る(Wagnerら、1990；1991)。 ベクター標的化に関して抗体を使用することが示唆され、そして実際に記載さ れているが、ベクターの取り込みおよび細胞による発現の効率は依然として低く (WO 8805077、WO9001951、およびWO9117773を参照のこと)、そして培養中の細胞 系においてのみ示されているに過ぎず、ヒトの初代細胞および組織では認められ ない。 エンドソーム経路により細胞によって取り込まれたリガンド-DNA複合体由来の DNAの発現増大は、標的化複合体または標的細胞の極周辺の培地のいずれかにお いて、インフルエンザウイルスヘマグルチニン融合誘導ペプチド(influenza vir us heamagglutinin fusogenic peptide)のようなエンドソーム破壊剤を含有させ ることによって達成されている。しかし、このようなペプチドおよびそれらの誘 導体の作用のメカニズムは、エンドソームのレベルで細胞内にあることが知られ ている(WileyおよびSkehel、1987)ことから、これらの機能はペプチドと共に細 胞エンドソーム内にDNAの捕獲があることに依存する。従って、融合誘導ペプチ ドは、既に細胞に内在化され、そしてエンドソーム内に捕獲されたDNAの発現効 率を改善し得るが、融合誘導ペプチドの使用によって、細胞表面レセプターに結 合したDNA−リガンド複合体のエンドソームコンパートメント内への取り込み効 率の問題を解決できるわけではなく、従って、生存能を維持しながら有効にトラ ンスフェクトされる、所定の細胞集団内の細胞の割合も解決できない。 従って、核酸ベクターの特異的な細胞への高効率での標的送達および取り込み が、好ましくは混合細胞集団から細胞を精製することなく行われるような、強化 されたトランスフェクションプロトコールが必要である。したがって、この強化 されたプロトコールは、ベクターの特異的細胞タイプへの標的化が可能なように 充分に特異的であり、さらにまた実質的な割合の標的細胞が細胞生存能を維持し ながらトランスフェクトされることを確実にするように充分に効率的である、標 的送達システムを提供すべきである。 このようなプロトコールは、治療目的、例えば、血液細胞集団内のＴ細胞、Ｂ 細胞、またはマクロファージ、または好ましくは造血幹細胞自体（系統内の全て の細胞の前駆細胞）のような造血系統(図１を参照のこと)の細胞への核酸ベクタ ーの治療上有用な送達に対して大きな価値がある。幹細胞に対して標的されるベ クターは、遺伝子座制御領域(Locus Control Regions)(LCRs)(欧州特許出願第33 2667号を参照のこと)のような種々の調節配列を含有しており、このことは、治 療上の利益が送達された遺伝子の細胞特異的発現の結果として得られようとする ものであったかどうか、または強力な偏在的活性プロモーターの誘導により全て の細胞において発現が望ましいものであったかどうかに依存する。例えば、造血 幹細胞への治療上有効な核酸の効率的送達は、例えば、リソソーム蓄積症、血友 病、および異常ヘモグロビン症のような遺伝子疾患の矯正において、HIVのよう な病的状態の器官に対して保護を提供するように、免疫応答を誘起するように、 炎症性応答または自己免疫応答を調整するように、あるいはカルシトニン、α1- アンチトリプシン、または種々の成長因子またはサイトカインのような治療上有 益な因子の生産を増大させるように免疫系の細胞を改変するために、大きな臨床 的価値がある。 臨床的に、造血系統の細胞への遺伝子の標的化には大きな利点がある。何故な ら、この細胞は、確立された手順を用いて血液から多量に得られ、エクスビボ(e x vivo)でトランスフェクトされて、次に患者へのトランスフェクション後に置 き換えられ得るからである。このことは、循環白血球のリンパ球サブ集団のほぼ 90%程度を示すＴ細胞に特にあてはまるが、また、GCSF患者の前処理の結果とし て毛細血においてかなりの数で動員され得る幹細胞に対してもあてはまる(Demuy nckら、1992を参照のこと)。幹細胞は臍帯血および骨髄にも存在する。 確立された技術を用いて、幹細胞は、広範な富化手順後のDNAトランスフェク ションにおいて使用され得るのみである(例えば、造血細胞集団から幹細胞を分 離する方法を開示している欧州特許出願第0 455 482号および同第0 451 611号を 参照のこと)。しかし、現行の安全な非ウイルストランスフェクションプロトコ ールでは、このような幹細胞を少ない割合でしかトランスフェクトし得ない。 本発明者らは、臨床的にかなり有益な細胞への生物学的活性因子の送達のため の改良方法を記載している。レセプター介在DNA取り込みプロトコールの効率は 、標的化複合体の存在下で中程度の電場にトランスフェクトされようとする細胞 を供することによって、強化されることが決定されている。 従って、本発明の最初の局面に従って、生物学的活性因子を細胞集団中の標的 細胞に送達する方法であって、 ａ） 該細胞集団を、該因子および該標的細胞に結合可能なリガンドを含む複合 体に曝する工程；および ｂ） 該細胞集団を電場に供する工程； を包含する、方法が提供される。 好ましくは、複合体はさらに、エンドソーム破壊剤を包含する。有利なことに 、エンドソーム破壊剤は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン融合誘導ペプ チドまたはそのアナログのようなウイルス起源である。 エンドソーム破壊剤(WileyおよびSkehel、1987；White、1990を参照のこと)と 本発明の方法との組合せにより、相乗的な利益がもたらされ得、宿主細胞内にお いて生物学的因子単独の効果が大いに増大することが分かった。本出願者らは、 この理論によって限定されることを望んではいないが、この相乗性は、因子内在 化プロセス(agent internalisation process)の２つの異なる点における、本発 明の方法の操作およびエンドソーム破壊剤に依存すると思われる。電場の印加は 、エンドソーム経路による細胞膜に結合した因子の内在化を増大させると考えら れている。次に、エンドソーム破壊剤の使用が、エンドソームからの因子の放出 効率を増大させる。 本発明の方法の利点は、エンドソーム経路によっては作用しないと考えられて いるエレクトロポレーションと異なり、標的細胞の生存能が維持されることであ る。 本発明の方法は、精製された集団または異種集団のどちらにおいても、適切な リガンドを用いる任意の細胞タイプの標的化に適しており、そして先行技術の方 法よりも、改善されたトランスフェクション効率および細胞生存能を示す。従っ て、「細胞集団」とは、単離された単一の細胞を含む単一の細胞タイプからなる 精製集団ならびに複数の細胞タイプを含む異種集団を称することを意図する。 好ましくは、本発明は、複数の細胞タイプを含む未精製の異種集団に適用可能 であって、ここで複合体の標的化機能は、異種集団における特定の細胞タイプを 選択的に標的化するように開発され得る。 同時に、共通のレセプターに対して特異的であるリガンドを用いることによっ て、細胞の混合集団における１つを超える細胞タイプを形質転換するように本発 明を開発することが可能である。 好ましくは、標的細胞は、精製されたまたは未精製の細胞集団に存在する造血 細胞である。好ましくは、細胞集団は血液から得られる。処置前の血液からの標 的細胞の精製が必須ではないことが本発明の利点である。好ましくは、造血細胞 は、幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはマクロファージである。 本発明の生物学的活性因子は、細胞内で生物学的効果を誘発可能な任意の因子 であり得る。このような因子は、タンパク質、核酸、イオン、または他の生物学 的に活性な分子であり得る。 好ましくは、生物学的活性因子は、生物学的効果を誘発可能なタンパク質性分 子またはRNA分子をコードする少なくとも１つの転写単位を有する核酸である。 好ましくは、転写単位は、タンパク質をコードする。例えば、成長因子、ホル モン、サイトカイン、転写因子、細胞表面タンパク質、または任意の種類の構造 タンパク質である。タンパク質は、既知機能の１つまたはそれ以上のドメインを 含有し得るが、哺乳動物が起源である必要はない。このタンパク質は、標的細胞 に相同なタンパクであるか、あるいは、標的細胞中で欠乏しているか、存在しな いか、または変異したタンパク質であり得る。例えば、転移単位は、感染症の治 療、例えばHIV治療において有効なタンパク質をコードし得る。あるいは、転写 単位は、遺伝子欠損またはタンパク質欠乏を矯正可能なタンパク質をコードし得 る。 HIV治療において、タンパク質は、その発現または活性が、例えばタンパク質 を発現するためのHIV特異的転写活性化系（transactivation system）（英国特 許出願第9305759.4号を参照のこと）を用いることによって、抗HIV用途のために 改変されている非特異的毒素または抗ウイルス剤であり得る。あるいは、この因 子は、抗HIV剤として特異的に設計され得る。例えば、その活性化特性は破壊さ れているが、天然のウイルスによってコードされるタンパク質と競合する能力を 保持するように改変されているtat、nef、またはrev遺伝子産物のような、HIVペ プチドの転写優性(transdominant)のネガティブな変異体をコードするデコイ遺 伝子がある。WO 9014427；EchetbuおよびRice、1993；Pearsonら、1990参照のこ と。 遺伝子欠損またはタンパク質欠乏を矯正するために、このようなタンパク質は 、ガイシャー(Gaisher)病またはアウバー(Auber)病矯正のためのリソソーム酵素 (S cottら、1990；Sorgaら、1987)、鎌形赤血球貧血またはサラセミア矯正のための αまたはβグロビン遺伝子、あるいは骨粗鬆症または気腫の発症または進行を防 止するためのカルシトニンまたはα1アンチトリプシンであり得る。 さらに、転写単位の産物は、アンチセンスRNA分子(Mirabelliら、1991)または 特定の様式で作用するように調製されたリボザイム(Cechら、1992)のようなRNA 分子であり得ると認められる。 本発明において、「リガンド」は細胞表面に特異的に結合可能な任意の実体で ある。 例えば、細胞レセプターが存在するいずれの分子もリガンドとして使用し得る 。このような物質はタンパク質、核酸、炭水化物、および必要に応じてタンパク 質と錯体を形成した金属イオンを含む。複数の特異性を含む操作された特異性を 有する改変されたリガンドの使用が認められる。成長因子および抗体およびそれ らの抗原結合フラグメント(例えば、Fab、F(ab')₂、およびFvフラグメント)が特 に好ましい。各リガンドまたはそのフラグメントの生物学的因子を送達する能力 は、各場合に基づいて決定されなければならない。効率は、細胞上のレセプター 密度および細胞表面エピトープに対するリガンドの親和性のようなパラメーター ならびに細胞内在化の正確なメカニズムに依存して変化する。 本発明において、トランスフェクトしようとする細胞への電場の印加は、エレ クトロポレーションとは等価ではないことを強調すべきである。 エレクトロポレーションとは異なり、細胞の生存能は維持される。印加された 電場は、エンドソーム取り込み、すなわち細胞現象を強化するようである。これ とは対照的に、エレクトロポレーションは細胞膜に物理的孔を形成し、エレクト ロポレーションを用いる物質の導入のための提案されたメカニズムである電気浮 動、電気浸透、または拡散の結果、そこから物体が通過し得る(Weaver、1993)。 さらに、本発明は、異種細胞集団内の標的細胞への物質の送達のための選択的ア プローチを提供し、エレクトロポレーションを用いる物質の無差別送達とは対照 的である。 好ましくは、本発明の方法において用いられる電場は、0.4cmの電極ギャップ を隔てて、600μF未満、有利には500μF未満のキャパシタンスで作動する。最も 好ましくは、キャパシタンスは、200μFと300μFとの間にあり、そして必要に応 じて250μFである。電場の電圧は、本発明の操作にとってそれ程重要ではないが 、400V未満、そして好ましくは200Vと350Vとの間が有利である。 60%と100%との間の生存率が本発明の方法によって得られている。対照的に、 毛細血リンパ球のエレクトロポレーションのための標準的条件は、960μFで250V であり、予想生存能は約10〜15%である(ヒト初代リンパ球に対するBio-Rad GENE 本発明の方法は、インビボ(Powellら、1989；Titomirovら、1991)ならびにイ ンビトロで使用され得る。インビトロでの使用は、骨髄吸引物、毛細血、または 臍帯血に存在する造血幹細胞へのDNAのエクスビボ標的送達について特に明示さ れる。次に、トランスフェクトされた細胞が患者に戻され得る。個別の細胞の分 離工程が省かれることは有利である。何故なら、細胞の取り扱いは必然的に感染 の危険性および細胞生存能の減少を伴い、加えて患者の外傷および健康管理費の 増大を伴うからである。 本発明の第２の局面に従って、リガンドが結合可能である標的細胞への生物学 的活性因子の電気刺激送達における使用のための、トランスフェクション混合物 の調製における、生物学的活性因子およびリガンドを含む複合体の使用が提供さ れる。 以下の図を参考にしながら、例示のみを目的として、本発明について記載する 。 図１は、造血細胞系統内の細胞の関係を示す概略図である。 図２は、一定の電圧(300V)でのキャパシタンス値の範囲にわたる、抗CD7抗体: DNA複合体を用いる、全白血球集団におけるヒトＴ細胞のトランスフェクション の結果を示す；文字Ｘは、エレクトロポレートされた細胞の予想生存能を示す。 図３は、電気ショック処理の存在下または非存在下における、抗体:DNA複合体 を用いる細胞系のトランスフェクションの結果を示し、そして標的化の特異性を 示す。 図４は、抗CD7抗体:DNA複合体を用いる全白血球調製物における初代ヒトＴ細 胞のトランスフェクションの結果(図4A)および融合誘導ペプチドの相乗効果(図4 B)を示す。 図５は、図４に示す結果の再現性を示す。 図６は、抗CD33抗体:DNA複合体(図6A)、および抗MHCクラスII抗体:DNA複合体( 図6B)を用いるヒト毛細血単核細胞のトランスフェクションを示し、そして電気 刺激と融合誘導ペプチドの使用との間の相乗性を示す。そして 図７は、臍帯血由来の総白血球調製物(MNCs)に存在する初代ヒト幹細胞(CD34⁺ )のトランスフェクションの結果を示す。 方法論毛細血および臍帯血由来の単核細胞の調製 等容量のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)をヘパリン化した血液サンプルに添加 し、そしてよく混合した。ピペットの先を万能管の壁に当てて、表面のメニスカ スを乱さないように配慮することによって、注意深くそして穏やかに、10mlの細 胞懸濁液を10mlのJ-PREP溶液（1.077mg/ml密度、TechGen International）上に 重層した。調製物を400gで30分間、室温で遠心分離した。これにより管の底に赤 血球および顆粒球のペレット、分離媒体の透明層、単核細胞(MNC)を含有する濁 った中間層、そして最上層に血漿/PBS層が生じた。中間層をパスツールピペット を用いて回収し、そして800gで10分間室温で遠心分離して、MNCペレットを回収 した。RPMI-5%熱不活化ウシ胎児血清(RPMI/5%FCS)を用いて、800gで５分間室温 で遠心分離することによって、細胞を２回洗浄した。臍帯血の単核細胞からのCD34＋の単離 ビオチン化抗CD34モノクローナル抗体による細胞の標識 CERATE LCシステム(CellPro Incorporated、WA、USA)はアビジン-ビオチン免 疫アフィニティープロセスを用い、異種細胞集団からポジティブにCD34+細胞を 選択する。分離手順を開始する前に、一次抗CD34モノクローナル抗体(MoAb)をフ リーザーから取り出し、ゆっくりと平静に室温まで解凍した(30分)。MNCをPBS/ １%ウシ血清アルブミン(PBS/1% BSA)で２回洗浄し、そして１mlの同緩衝液に再 懸濁した。細胞を抗CD34 MoAbと混合して最終濃度20μg/mlとし、そして室温で2 0分間インキュベートした。インキュベーション後、PBS/１% BSAで細胞を10mlに 希釈し、そして500gで５分間回転することにより、同緩衝液で２回洗浄した。細 胞をPBS/５% BSA中10⁸/mlの濃度で再懸濁した。 アビジンカラムの調製 ４mlのPBSをサンプルチャンバーに添加し、そしてシステムを確実に空気泡が 存在しないようにした。PBSを洗浄チャンバー中に流した。別の５mlのPBSをサン プルチャンバーに加え、そして洗浄チャンバーをPBSで10mlまで満たした。徐々 にプレゲル(pre-gel)を滴下でサンプルチャンバーに添加した(均一な0.7ml床の プレゲルが、アビジンカラムの上に位置するサンプルチャンバーの底に形成し、 これは組織破砕物および細胞塊を捕獲する役割を果たす)。５mlのPBSを通過させ た。５mlのPBS/５% BSA溶液を添加し、そして緩衝液のレベルがプレゲルの最上 部に達したら流動を停止させた。 細胞分離プロトコール 抗体で標識した細胞をサンプルチャンバー(最大4ml)中のプレゲルに層状に重 ね、溶出した吸収されなかった細胞を新しいチューブに回収した。細胞サンプル がプレゲルの最上部に達したとき、さらに2mlのPBS／５％BSAを添加して、残っ ている全ての細胞をアビジンカラムに流し落とした。残りの緩衝液がプレーゲル の最上部に達したとき、PBSを洗浄チャンバーとアビジンカラムとの間に流した （この段階でアビジンカラムに空気が入らないようにする）。洗浄チャンバー内 のPBSが5mlの印のところに達したとき、流れを停止させた。１mlPBS／５％BSAを 含む新しいチューブを置いて吸収した細胞を回収した。流れを開始してアビジン カラムを３〜５回強く圧搾した。１mlのPBSを回収チューブ中に流した。圧搾を 繰り返し、洗浄チャンバーから全てのPBSが排出されるまで流し続けた。回収し た細胞をRPMI/5%FCSで２度洗浄し、そして細胞数を計数する前に同緩衝液2mlに 再懸濁した。異なる抗CD34MoAbを用いて回収された画分中のCD34+細胞のFACS分 析を行う前に、この細胞を95％空気５％CO₂のインキュベーターに30分間入れた 。トランスフェクション手順 モノクローナル抗体−ポリリジン結合体の調製 種々のヒト造血細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を、196〜278鎖 長を有するポリ（Ｌ−リジン）（MoAb-PL）と結合させた。リガンド：ポリリジ ン：DNA複合体を、最初にWuおよびWu(1987)によって記載され、続いてBirnstiel および共同研究者(Wagnerら、1990；1991)によって改変された手順に従って構築 した。DNA標的化複合体当たりのリガンド：ポリリジン、およびペプチド：ポリ リジンの比は、細胞タイプ対細胞タイプに基づく力価の測定によって決定され得 る。 抗体−ポリリジン結合体は、ジスルフィド結合を介して合成され、それは、Wa gner E.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，87,3410-3414，1990によって記載 されたプロトコールの改変を用いる二官能性試薬3-(2-ピリジリルチオ)プロピオ ン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP：Sigma Chemical Co.)を用いて 形成される。抗体は結合の前に精製され、そしてホスフェートまたはN-(2-ヒド ロキシエチル)ピペラジドN'-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジンN'-2-(エタンスル ホン酸)、HEPES緩衝化生理食塩水溶液に移された。平均鎖長が200モノマーユニ ットであり、117-234ユニットの範囲であるポリ-L-リジンヒドロブロマイド塩を Sigma Chemical Co.から入手した。 抗体のSPDP改変 SPDP（乾燥したアセトニトリルに20mMの濃度で溶解した）を、モル比10:1で抗 体に添加した。抗体は、HBS溶液(pH7.9)またはPBS(pH7.5)溶液のいずれかにおい て濃度１−５mg/mlであった。反応物を室温で１時間混合し、その後、抗体を標 識している間に放出された過剰で遊離のリンカー酸(linker acid)をサイズ排除 クロマトグラフィー(G25:Pharmacia)によって除去し、回収された標識された抗 体を、次に、＋４℃で保存した。標識された抗体のピリジン-2-チオン含有量を 、ジチオスレイトール(DTT)の存在下で343nmにおける吸光度の増加を測定するこ とにより決定し、抗体の濃度は、l.7Au280ml/mg抗体の吸光係数を用いて、A280 測定によって（ピリジン-2-チオン含有量の効果を補正、Carlsson,J.ら、Bioche m. J.、173,723,1978)決定した。次いで、リンカー添加量(loading)レベルをピリジ ン-2-チオン含有量と抗体含有量との関係によって決定した。代表的には、１抗 体当たり２〜６リンカーユニットの比が得られた。 ポリ-L-リジンの改変 20mg/mlの濃度で50mM Hepes、pH7.9に溶解したポリリジンをSPDP（先に記載し たように調製した）と反応させ、SPDPは5:1のモル過剰で添加した。反応物を室 温で１時間混合し、その後溶液のpHをpH5.0のIM酢酸ナトリウムを添加すること により５に合わせた。 過剰なSPDPおよび遊離のリンカー酸をサイズ排除クロマトグラフィー(G25：Ph armacia、20mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0で平衡化）によって除去し、そしポリ リジンのピリジン-2-チオン含有量を先に記載したように測定した。この値は、 ポリリジンにリンカー添加量値を与えるために反応混合物に添加された最初のポ リリジンの量に関連した。代表的には、１−４の間の値が得られた。回収された ポリリジンのプールのpHを、pH7.9の1M Hepes緩衝液の添加により7.9に合わせ、 ＋４℃で保存した。 標識したポリリジン溶液を10-15モル過剰のDTTの添加により還元し、そして遊 離のチオール基を生成させるために30〜60分間室温で反応させた。次いで溶液の pHを1M酢酸ナトリウムpH5.0の添加により5.0に合わせ、過剰なDTTをサイズ排除 クロマトグラフィー(G25:Pharmacia)によって除去した。ポリリジンプールの遊 離のチオールレベルは5,5'-ジチオ-ビス(2ニトロ安息香酸)(5,5'-Dithio-bis(2N itrobenzoic acid)Ellman試薬(Deakin H.ら、Biochem.J.,89，296，1963)を用い て測定された。 抗体とポリリジンとの結合 標識された抗体を、50mM Hepes pH7.9を用いて1mg/mlのレベルまで希釈し、そ してグリセロールを20%v/vまで添加した。標識されたポリリジンを標識された抗 体に5:1過剰で添加し、そして反応物を16〜20時間10℃で混合した（抗体／ポリ リジン比は測定された抗体濃度、および仮定されたポリリジン濃度に基づく）。 達成された結合体化レベルは、343nmでの吸光度を測定し、始めの溶液の吸光度 と比較することにより決定された。従って、343nmでの吸光度における増加は最 初のピリジン-2-チオン含有量、および始めの結合体化混合物に添加された遊離 のチオールの量に関係した。代表的には、結果は利用可能なジピリジル基の50〜 100％が反応し、そして添加された遊離チオールの10〜50％が種々の結合体化混 合物中で反応することを示した。このことはポリリジン対抗体のレベルが２と５ との間であることを示唆する。 結合体の精製 結合体をカチオン交換クロマトグラフィー(Fractogel EMD SO₃E．Merck)によ って精製した。精製の前に、３M NaCl 50mM Hepes pH7.9の添加により0.6Mのレ ベルにまでNaClを結合体混合物に添加した。サンプルをのせる前に、クロマトグ ラフィーカラムを0.6M NaCl 50mM Hepes pH7.9で平衡化し、結合体化した物質を 溶出するために0.6〜3.0M NaClグラジエントをカラムにかけた。結合体は1.0Mお よび2.5M NaClで溶出した。 溶出した物質中の結合体の存在は、SDS PAGEによって決定し、ここで、サンプ ルを還元型および非還元型状態でローディングした。結合体を、非還元条件では ゲルに入らないが、還元条件では正常な抗体のプロフィールを示すサンプルとし て規定した。 次いで、全ての抗体−ポリリジン結合体の結合特異性を、FACS分析によって抗 体単独の場合と比較し、化学的改変が抗体ポリリジン結合体の結合特異性を弱め るかまたは変えることがなかったことを確認した。 抗体−ポリリジン：DNA複合体の調製 RSVLuc、すなわちRSVプロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含むDNA プラスミド(Dr.M.Crossにより提供された)を、レポーター遺伝子として用いた。 適切な量のDNAをHBS(120mM NaCl，20mM Hepes，pH7.4)中に希釈し、そしてMoAb- PL溶液を常に撹拌しながらHBSに滴下した。複合体混合物を少なくとも30分間室 温で放置した。異なるMoAb-PL調製物に結合するDNAの量は、各調製物の結合特性 により異なっていた(MoAb-PL対DNAの質量比は0.5：１から２：１の範囲である) 。しかし、複合体中のDNA濃度は、20μg/mlを超えるべきではなく、さもなけれ ば複合体の沈澱が起こるであろう。代表的な実験では、５μgのRSVLucを含む300 μlのHBS溶液と10μgのHB2-PL278(抗CD7)を含む100μlのHBS溶液とを混合するこ とにより複合体を形成した。 モノクローナル抗体−ポリリジン／DNA複合体およびインフルエンザウイルスへ マグルチニンHA-2 Ｎ末端融合誘導ペプチドとの造血細胞のインキュベーション 条件 ５×10⁶細胞を、2mMグルタミン、I00U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプ トマイシンを添加した3mlのRPMI/5％ FCSに再懸濁した。MoAb-PL/DNA複合体溶液 を５〜10μg MoAb/10⁶細胞で添加した(上記の代表的な実験の場合では2mlのHB2- PL/DNA複合体溶液)。インフルエンザ融合誘導ペプチド(GLFGAIAGFIGAGTGGMIAGGG C；Neosystem，Strasbourg，Franceにより合成された)を30μMの最終濃度で添加 した。細胞懸濁液を含むチューブを５％CO₂で充填し、そしてチューブのキャッ プをしっかりと締め、そしてこのチューブを氷上に２時間、30分間毎に穏やかに 振とうしながら放置し、抗体複合体による全ての関連細胞表面マーカーの飽和を 生じさせた。チューブを５％CO₂のインキュベーターに移し、そして45分間、MoA b-PL/DNAを内在化および循環させる。 電気ショック手順 インキュベーションの終わりに、細胞をRPMI/５％ FCSで1回、そして氷冷PBS で１回、800gで10分間の遠心により洗浄し、非結合MoAb-PL/DNA複合体を除去し た。細胞を0.5mlのエレクトロポレーション型Hepes緩衝液(120mM KCl，0.15mM C aCl₂，10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄，5mM MgCl₂，25mM Hepes，pH7.4)に再懸濁した(この 段階で、細胞をピペッティングすることは避ける；細胞は、注意深くチューブを 振ることにより容易に再懸濁した)。細胞懸濁液を４mmの電極間滅菌エレクトロ ポレーションキュベットに移した。細胞懸濁液を含むキュベットを氷上で約２分 間保持した。電気ショックの処理前に、キュベットの外表面を完全に乾燥し、回 路 のショートを避けた。単一電圧パルスを300Vおよび250μFキャパシタンスの条件 で、Gene-Pulserシステム(Bio-rad)を用いて印加した。電気ショックの処理後、 細胞を氷上で２分間冷却し、次いで、滅菌プラスチックパスツールピペットを用 いて新しいチューブに注意深く移した。細胞をRPMI/５％FCSで10倍(合計5ml)希 釈した。細胞を低速遠心分離(150、４分間)により回収した。細胞を３mlのRPMI/ 40％FCSに再懸濁し、12ウエルの培養プレートに入れ、そしてルシフェラーゼ活 性を評価する前に前24時間インキュベートした。細胞の生存率を染色排除により 測定した。実施例１ ヒトの初代Ｔ細胞をヒト血液から得、融合誘導ペプチドの非存在下で、Bio-Ra d遺伝子パルサー装置の種々のキャパシタンス値を用い、本発明の方法によって 抗CD7抗体：RSVLuc複合体で記載のようなトランスフェクションに供した。最適 なレベルでは、０μF（すなわち、電場なし）でのコントロールと比較する場合 、細胞の生存率は本質的に変わらないことが図２に見られ得る。実施例２ CD7表面マーカーを有するCEM細胞を、上記のプロトコールにより、抗CD7抗体 および抗CD19抗体と複合体化されたRSVLucでトランスフェクトした。結果を図３ に示す。 コントロールとして、非複合体化DNAを用いて、電気ショック処理の存在また は非存在下で、CEM細胞をトランスフェクトした。コントロール実験におけるル シフェラーゼ遺伝子活性は非常に低く、そして有意に、電気ショック処理により 影響されなかった。これは、本方法において用いられる電場が細胞膜の有効なエ レクトロポレーションを引き起こさないことを示す。 同様に、抗CD19と複合体化したDNAによってトランスフェクトされた細胞に電 気ショック処理を行う場合、効果は見られなかった。CEM細胞はCD19-である。 しかし、ルシフェラーゼ遺伝子活性の大きな増加は、電気ショックを行った場 合、抗CD7と複合体化したDNAで形質転換された細胞に見られる。実施例３ 白血球を、遠心分離によりヒト全血から単離した。白血球の粗調製物中に存在 するＴ細胞を、抗CD7：RSVLuc複合体(必要に応じてさらにインフルエンザウイル スヘマグルチニン融合誘導ペプチドを含む)で標的した。 図４に示す結果は、本発明の電気ショック処理の存在下で、大いに優れたトラ ンスフェクション効率が観察されることを示した。融合誘導ペプチドの使用は、 本発明の方法により得られる効率をさらに促進する。実施例４ 実施例３に記載の実験は、結果の再現性を示すために５回繰り返された。５回 の実験からのデータを図５に示す。実施例５ ヒト全血から単離した白血球(PBMNC)を抗CD33：RSVLuc複合体(図６Ａ)または 抗MHCクラスII：RSVLuc複合体(図６Ｂ)で標的したことを除いて、実施例３に記 載の実験を繰り返した。結果は、細胞の生存能を維持しながらトランスフェクシ ョン効率を促進することにおいて、融合誘導ペプチドと電気ショック処理との間 に相乗的な効果があることを示す。実施例６ ヒト臍帯全血から単離した全白血球集団(MNC)中の幹細胞を、RSVLucと複合体 化したQBEND-10、すなわち抗CD34抗体で標的した。 細胞は分画されず、そして3.4％のCD34＋細胞を含んだ。電気ショック処理お よび融合誘導ペプチドの使用効果をアッセイした。結果を図７に示し、融合誘導 ペプチドのみの使用よりも、電場および融合誘導ペプチドの使用によって、トラ ンスフェクションが促進されることを示す。実施例７ 全白血球調製物中の幹細胞への抗CD34：DNA複合体の送達の特異性を示すため に、白血球をヒト血液から単離し、そして2.5×10⁷単核細胞を表１に示す複合体 とともに２時間４℃でインキュベートした。次いで、細胞を45分間、37℃で２回 洗浄し、そして電気ショック処理に供した（サンプルＤを除く）。 生存率を測定し、表１に示す。この結果は、本発明の手順に供されなかったサ ンプルＤのレベルと比較されるべきであることを銘記されたい。 37℃で24時間の反応後、細胞をCD34細胞選択フラスコに分画し、そして計数し た。 次いで、ルシフェラーゼ活性を細胞でアッセイし、その結果を表１に示す。ル シフェラーゼ活性は、CD34⁺細胞におけるバックグランドレベルを超える場合の み、検出可能であり、用いた標的化システムの特異性を示すことが理解され得る 。 本発明は、例示のみのために上記に記載され、添付の請求の範囲の範囲内にあ る細部の多くの改変は、当業者には明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アントニオウ，マイク イギリス国 エイチエイ８ ６エルジェイ ミドルセックス，エッジウェア，ミード ロード 36 (72)発明者 ジェハ，ハキム イギリス国 エム20 ２エックスユー マ ンチェスター，ウェスト ディドベリー, ボロウデイル クレセント ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 生物学的活性因子を細胞集団中の標的細胞に送達する方法であって、 ａ） 該細胞集団を、該生物学的活性因子および該標的細胞に結合可能なリガン ドを含む複合体に曝する工程；および ｂ） 該細胞集団を電場に供する工程； を包含する、方法。 ２． 前記複合体がエンドソーム破壊剤を含む、請求項１に記載の方法。 ３． 前記エンドソーム破壊剤が、インフルエンザウイルスヘマグルチニン融合 誘導ペプチドまたはそのアナログである、請求項２に記載の方法。 ４． 前記細胞集団が異種である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５． 前記リガンドが前記標的細胞に特異的である、請求項１〜４のいずれかに 記載の方法。 ６． 前記生物学的活性因子が核酸分子である、請求項１〜５のいずれかに記載 の方法。 ７． 前記核酸分子がタンパク質またはリボザイムをコードする、請求項６に記 載の方法。 ８． 前記生物学的活性因子が治療に有用である、請求項１〜７のいずれかに記 載の方法。 ９． 前記生物学的活性因子が遺伝子欠損の訂正に有用である、請求項８に記載 の方法。 １０．前記生物学的活性因子が感染症の治療に有用である、請求項８に記載の方 法。 １１． 前記生物学的活性因子がタンパク質欠乏の矯正に有用である、請求項８ に記載の方法。 １２． 前記感染症がAIDSである、請求項１０に記載の方法。 １３． 前記生物学的活性因子がデコイタンパク質またはリボザイムである、請 求項１２に記載の方法。 １４． 前記リガンドが抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜１３の いずれかに記載の方法。 １５． 前記リガンドが成長因子またはそのフラグメントである、請求項１〜１ ４のいずれか１つに記載の方法。 １６． 前記方法がインビボで使用される、請求項１〜１５のいずれかに記載の 方法。 １７． 前記標的細胞が幹細胞である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法 。 １８． 前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項１７に記載の方法。 １９． 前記標的細胞が造血幹細胞から誘導される、請求項１〜１６のいずれか １つに記載の方法。 ２０． 前記標的細胞がＴ細胞である、請求項１９に記載の方法。 ２１． 疾患を治療するための方法であって、患者の身体から細胞を除去する工 程、および該患者の身体に該細胞を再導入する前に、請求項１〜８のいずれか１ 項に記載の方法に従って該細胞を処理する工程を包含する、方法。 ２２． 生物学的活性因子およびリガンドを含む複合体の使用であって、該リガ ンドが結合可能な標的細胞への該生物学的活性因子の電気刺激送達での使用のた めの、トランスフェクション混合物の調製における、複合体の使用。 ２３． 実施例に関して、上に記載の通りの方法または使用。