JP2012010708A - 細胞状膜を有する少なくとも２種の融合相手の選択的電気融合方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞状膜を有する少なくとも２種の融合相手の選択的電気融合方法を提供する。
【解決手段】細胞状膜を有すると共に細胞もしくはサブ細胞寸法を有する少なくとも２種の融合相手の選択的電気融合方法。（Ａ）融合相手を互いに接触させ、（Ｂ）融合を得るのに充分な強度を有すると共に融合相手に高度に集中した電場を加えることを特徴とする前記選択的電気融合方法。融合相手は独立して単一細胞、リポソーム、蛋白リポソーム、合成小胞、卵細胞、除核卵細胞、任意の発育段階における精子細胞および植物プロトプラストよりなる群から選択される前記電気融合方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞状膜を有する少なくとも２種の融合相手の選択的電気融合方法に関するものである。

電気融合は、多数の生存融合生成物をもたらす主としてその緩和な条件のため、哺乳動物細胞を融合させるのに極めて効率的な方法まで開発されている［たとえばＫ．Ｌ．ホワイト（１９９５）、哺乳動物細胞の電気融合、分子生物学における方法、第４８巻、第２８３−２９３頁参照］。燐脂質二層膜に対する電場の適用は、加えた電位が膜破壊電位に達し或いは越える際に気孔形成を誘発させる。その結果、電気浸透技術が広範な種類の生物学的実験に使用されており、たとえばハイブリドーマおよび新規な細胞ラインの形成のための電気融合［たとえばＵ．チンマーマン等（１９８５）、電気融合：新規なハイブリッド化技術、アドバンスト・バイオテクノロジカル・プロセシス、第４巻、第７９−１５０頁；Ｇ．Ａ．ネイル等（１９９３）、電気融合、メソッズ・イン・エンチモロジー、第２２０巻、第１７４−１９６頁；Ｍ．グラシー（１９８８）、プロダクト・レビュー；電気融合によるハイブリドーマの形成、ネーチャー、第３３３巻、第５７９−５８０頁参照］、インビトロ受精［たとえばＡ．オグラ等（１９９５）、雄生殖体としての精細胞、レプロダクション・ファティリゼーション・デバイス、第７巻、第１５５−１５９頁参照］、クローン化実験［たとえばＡ．Ｅ．Ｐ．バン・ステケレンブルク−ハマース等（１９９３）、インビトロ成熟／インビトロ受精エンブリオにおける牛での核移動および電気融合：媒体および電気融合パラメータの作用、モレキュラ・レプロダクション・デバイス、第３６巻、第３０７−３１２頁参照］、細胞−浸透剤溶解質を導入するための細胞のエレクトロポレーション［たとえばエレクトロポレーション：細胞および組織を処理するための一般的現象、ジャーナル・細胞・バイオケミストリー、第５１巻、第４２６−４３５頁；Ｈ．リー等（１９９７）、エレクトロポレーションによるラット脳細胞のトランスフェクション、ジャーナル・ニューロサイエンス・メソッズ、第７５巻、第２９−３２頁；Ｊ．Ａ．ルンドビスト等（１９９８）超微小電極を用いる個々の培養細胞およびオルガネラの生物学的状態の変化、プロセシング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第９５巻、第１０３５６−１０３６０頁参照］、および蛋白質を包含する膜関連巨大分子を添加するための電気挿入［たとえばＹ．マウネイムン等（１９８９）、赤血球膜へのキセノ−グリコホリンの電気挿入、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション、第１５９巻、第３４−４０頁参照］に用いられている。インビボ電気融合の適用は、ヒトＨＬ６０細胞からヒト特異性病原体の生存モデルとしてウサギ角膜表皮組織への淋菌付着リセプタの組込みを包含する［たとえばＲ．ヘラー等（１９９０）、インビボにおける細胞−組織電気融合により完全動物組織へヒト細胞を組込むことによるヒト膜細胞成分の移行、バイオヒミカ・バイオフィジカ・アクタ、第１０２４巻、第１８５−１８８頁参照］。

電場誘発融合は、懸濁物における細胞集団の生物医学研究にて広範に使用されている。各細胞を最初に低程度かつ高周波数のＡＣフィールドを加えて誘電泳動により互いに接触させ、次いで各細胞のフラクションを強くかつ短いＡＣパルスにより融合させる。多量の細胞のバルク電気融合が新規な細胞ラインを形成さ細胞と共に選択するのに有用であるが、単一細胞を高精度で融合させるには適用することができない。これは同じ細胞ラインからの各細胞間の望ましくない融合をもたらすと共に、種々異なる細胞からの細胞間にて望ましい融合をもたらす。さらにバルク電気融合は互いに融合させるべき細胞の個数につき調節を可能にせず、二核融合生成物と多核融合生成物との望ましくない比をもたらす。

Ｋ．Ｌ．ホワイト（１９９５）、哺乳動物細胞の電気融合、分子生物学における方法、第４８巻、第２８３−２９３頁 Ｕ．チンマーマン等（１９８５）、電気融合：新規なハイブリッド化技術、アドバンスト・バイオテクノロジカル・プロセシス、第４巻、第７９−１５０頁 Ｇ．Ａ．ネイル等（１９９３）、電気融合、メソッズ・イン・エンチモロジー、第２２０巻、第１７４−１９６頁； Ｍ．グラシー（１９８８）、プロダクト・レビュー；電気融合によるハイブリドーマの形成、ネーチャー、第３３３巻、第５７９−５８０頁 Ａ．オグラ等（１９９５）、雄生殖体としての精細胞、レプロダクション・ファティリゼーション・デバイス、第７巻、第１５５−１５９頁 Ａ．Ｅ．Ｐ．バン・ステケレンブルク−ハマース等（１９９３）、インビトロ成熟／インビトロ受精エンブリオにおける牛での核移動および電気融合：媒体および電気融合パラメータの作用、モレキュラ・レプロダクション・デバイス、第３６巻、第３０７−３１２頁 エレクトロポレーション：細胞および組織を処理するための一般的現象、ジャーナル・細胞・バイオケミストリー、第５１巻、第４２６−４３５頁 Ｈ．リー等（１９９７）、エレクトロポレーションによるラット脳細胞のトランスフェクション、ジャーナル・ニューロサイエンス・メソッズ、第７５巻、第２９−３２頁 Ｊ．Ａ．ルンドビスト等（１９９８）超微小電極を用いる個々の培養細胞およびオルガネラの生物学的状態の変化、プロセシング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第９５巻、第１０３５６−１０３６０頁 Ｙ．マウネイムン等（１９８９）、赤血球膜へのキセノ−グリコホリンの電気挿入、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション、第１５９巻、第３４−４０頁 Ｒ．ヘラー等（１９９０）、インビボにおける細胞−組織電気融合により完全動物組織へヒト細胞を組込むことによるヒト膜細胞成分の移行、バイオヒミカ・バイオフィジカ・アクタ、第１０２４巻、第１８５−１８８頁

単一細胞の生化学的および遺伝的性質を選択的かつ調節自在に変化させることがしばしば望ましい。この挑戦に挑むと共にバルク電気融合の欠点を克服するため、本発明者等は単一対の細胞を一度に互いに融合させる技術を開発した。単一細胞を互いに調節自在に融合させる能力は長期の遺伝的同一性および選択細胞の性質を正確に処理しうる技術を示し、ハイブリッドおよびクローン化細胞の組合せ保存物を形成する新たな可能性を開く。強力な測定および影像化技術との組合せにて、単一細胞の遺伝的および生化学的性質を詳細に検討することができる。

細胞特性の変化をも、所望の小胞含有量および膜組成物を有する合成燐脂質小胞を標的細胞まで互いに融合させて達成することができる。この技術を使用して単一細胞の内容物および膜特性を変化させることができる。たとえば、リポソームにて再構成された膜蛋白質を細胞プラズマ膜に導入することができる。単一細胞の膜組成を選択的に形質転換させるこの能力は、たとえば有力なリガンドおよび関連薬理化合物をスクリーニングするための表面リセプタの導入のような有用な生物学的用途を有すると予想される。

すなわち本発明は、たとえば細胞およびリポソームのような細胞構造物の選択的電気融合につき新規な方法を提供する。この方法は細胞選択の高空間解像力を有する付着性細胞構造物の融合の利点を与え、複雑な細胞ネットワークを形成する可能性を与える。電気融合は緩和な方法であるため、この小型化した方法をたとえば単一細胞レベルにてクローン化につきおよびインビトロ受精につき使用することができる。特にクローン化実験につき、バルク電気融合の欠点が本発明により解消される。何故なら、これは融合プロセスに対し完全制御を与えると共に、体細胞の確認に対する疑いを提起する必要がないからである。さらに、この方法は好ましくは微小機械加工チップ技術と組合わせてクローン化細胞もしくはハイブリッド細胞のスクリーニング用保存物を形成することもできる。

図１は、実験施設を示す略図である。 図２Ａ〜Ｃは、微小電極を用いるリポソームと選択細胞との整列を示し、図２Ｄ〜Ｅは細胞と接触する６つのフルオレスセイン含有（１０μＭ）リポソームを示す。 図３Ａ〜Ｄは、細胞−細胞融合配列を示す。 図４Ａ〜Ｃは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）リポソーム（左側）とＣＯＳ７細胞（右側）との電気融合（８ｋＶ／ｃｍ、４ｍｓ）の前（図４Ａ）、その間（図４Ｂ）およびその後（図４Ｃ）に撮った鮮明フィールド画像を示し、図４Ｄ〜ＥはＮＧ−１０８細胞（３０分間にわたりプロテアーゼ処理）と組込みγ−グルタミルフランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）を有するＰＣリポソームとの間の融合を示す。 図５は、本発明による方法の臨床用途の１例を示す。

本発明の特徴は、以下の説明および請求の範囲から明らかとなるであろう。

図１は実験設備を示す略図である。細胞１、２はポリカーボネート製ホルダーに装着された顕微鏡カバースリップ３に懸濁物から添加される。各細胞を光学トラッピング（ＭＯＰＡレーザー４）により或いは単にこれらを高目盛マイクロマニキュレータ７により制御される微小電極５、６にて互いに押圧することにより予備整列される。蛍光画像化および光学トラッピングのため、２つのコリニアレーザー光線を顕微鏡対物レンズ９に送り、アルゴンイオンレーザー１０（黒色の細い矢印）を用いてフルオレスセインを励起させると共に、ＭＯＰＡダイオードレーザー４（黒色の太い矢印）を光学トラッピングにつき使用する。得られた蛍光および鮮明フィールド画像をＣＣＤカメラ１１に指向させる。

図２Ａ〜Ｃは微小電極を用いる選択細胞とのリポソームの整列を示し、図２Ｄ〜Ｅは細胞と接触させた６つのフルオレスセイン含有（１０μＭ）リポソームを示す。図２Ｇに示したように、背景の蛍光は検出されず、これは表面への（リポソームの電気浸透化）または内部（細胞とリポソームとの間の電気融合）への薬物の選択的供給が可能であることを示す。

図３Ａ〜Ｄは細胞−細胞融合配列を示す。図３Ａは電気泳動（０．３〜３ｋＶ／ｃｍ、２ＭＨｚ）の際のＰＣ１２細胞を示す。図３Ｂは、最後の融合パルス（それぞれ１ｍｓの持続時間の６パルス、３ｋＶ／ｃｍ）による融合の開始を示し、これは各細胞間における幅広かつ扁平な接触帯域により見ることができる。図３Ｃ（融合パルス後の１分間まで）および図３Ｄ（融合パルス後の２分間まで）はその後の各細胞間の融合領域の拡大を示し、完全融合を示す。

図４Ａ〜Ｃは、ホスファシジルコリン（ＰＣ）リポソーム（左側）とＣＯＳ７細胞（右側）との電気融合（８ｋＶ／ｃｍ、４ｍｓ）の前（図４Ａ）、その間（図Ｂ）およびその後（図４Ｃ）に撮った鮮明フィールド画像を示す。図４Ｄ〜ＥはＮＧ−１０８
細胞（３０分間にわたりプロテアーゼ処理）および組込みγ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）を有するＰＣリポソームとの間の融合を示す。図４Ｅにおいて、どのように微小電極が細胞から緩和に引き離されると共にリポソーム（微小電極に付着）は延伸するが細胞から脱着しないかが見られる。

図５は本発明による方法の臨床用途の１例を示し、ここで脳における単一もしくは複数の細胞を電気融合させて他の融合相手の内容物を組込む。融合相手は中空電極を介して供給される。電極を定位装置により位置決めし、カルテシヤン座標系および定位マイクロポジショナーにより図面に示す。

本発明は細胞状膜を有する少なくとも２種の融合相手の選択的電気融合方法に関するものであり、次の工程：（Ａ）融合相手を互いに接触させ、（Ｂ）融合を得るのに充分な強度を有すると共に融合相手に高度に集中した電場を加えることを特徴とする。

細胞状膜を有する前記少なくとも２種の融合相手は好ましくは細胞もしくはサブ細胞寸法の構造体である。「細胞もしくはサブ細胞寸法の構造体」という用語は特に生物学的構造体（たとえば独立細胞およびより小さい構造体）に関するものであるが、さらに同様な人工的構造体にも関するものである。すなわち、融合相手は互いに独立して単一細胞、リポソーム、蛋白リポソーム、合成小胞、植物プロトプラスト、卵細胞、精子もしくは精細胞および除核卵細胞とすることができる。

上記したように、融合相手を互いに接触させる。このことは、融合相手の外側表面が接触するようこれらを位置せしめ或いは融合相手を互いに極めて小間隔にて設置することを意味する。

大抵の場合、本発明による方法を用いて２種の融合相手（すなわち示した融合相手Ｉおよび融合相手ＩＩ）の融合につき使用するが、２種以上の融合相手を融合させるために使用することもできる。或る種の場合、３種以上の相手を融合させ、たとえば３個以上の核を有する多核細胞を形成させ、或いは相手の一方が他方よりもずっと大きい寸法を有する場合も特に興味がある。この例は、小胞に含有された物質を細胞中へ導入することが望ましい場合である。この場合、融合相手Ｉは細胞であると共に、融合相手ＩＩはより小さい小胞の数種である。

さらに本発明による方法を１回もしくは数回反復して、新たな融合相手を２種の既に融合された融合相手に融合させることもできる。これは、クローン化細胞およびハイブリッド細胞の組合せ保存物を形成させる際に特に重要である。

融合相手Ｉが細胞であると共に融合相手ＩＩが単一リポソームである場合、これらの融合は細胞内部へのリポソーム含有物の導入とリポソーム膜から細胞表面への脂質および膜蛋白質の付加との両者を可能にする。この細胞−リポソーム融合は膜内容物および単一細胞の表面特性の処理に新たな手法を与える。

たとえば細胞、リポソームまたは他の同様な構造体など融合相手Ｉを、たとえば細胞、リポソームまたは同様な構造体など融合相手ＩＩに融合させるには２種の融合相手を互いに隣接させ、すなわち互いに接触させて位置せしめる必要がある。２種の融合相手を融合前に互いに隣接位置せしめるという事実は、各細胞間の緊密接触の発生につき従来使用されている誘電泳動を回避することを可能にする。しかしながら、誘電泳動を本発明と組合わせて好適に使用することにより、ｄｃ−フィールド融合パルスを加える前に近接細胞−細胞接触を形成すると共に確立することができる。機械的に、核融合相手間の緊密接触は任意適するように行うことができる。整列につき２種の融合相手の個々の操作はこの整列を容易化させる。たとえば高度に集中されたレーザー光線で光学トラッピングするため、個々の細胞および小寸法のオルガネラを含め他の生物学的構造体を任意に処理および移動させることができる［これは従来記載されている：たとえばＭ．Ｊ．ジャロスデスキー等（１９９４）、機械促進細胞−細胞電気融合、バイオフィジックス・ジャーナル、第６７巻、第１５７４−１５８１頁；Ｍ．ウチダ等（１９９５）、光学トラッピングによる全細胞処理、カレント・バイオロジー、第５巻、第３８０−３８２頁；Ｄ．Ｔ．チュ等（１９９８）、毛細管電気泳動による単一分泌小胞の検査、サイエンス、第２７９巻、第１１９０−１１９３頁参照］。融合相手の位置決めにつき電極を使用する場合、下記するように電極の先端で移動させてその位置を調整することにより２種の融合相手を整列させることができる。電極を移動させるには顕微鏡、少なくとも１種のマイクロポジショナーおよび／または定位用具を使用するのが有利である。２種の融合相手の位置決めをさらに容易化させるには、工程Ａを行う前に融合相手の一方を固定化するのが有利である。電極を使用する場合、これはたとえば融合相手の少なくとも１種を微小電極の少なくとも１つに可逆的に付着させて行うことができる。或る種の場合、融合の前に２種の整列細胞の予備処理として誘電泳動を使用することが有利である。これはａｃ−フィールド掃引機能発生器を電極に接続して行うことができる。

電場は用いる電極および他の実験パラメータに応じて低電圧もしくは高電圧パルスゼネレータの使用により得ることができる。電圧ゼネレータを使用して、２種の融合相手の間に融合を生ぜしめるのに充分な電場強度（約０．１〜１０ｋＶ／ｃｍ）を１０μｓ〜数秒の持続時間にわたり発生させる。融合相手の膜にて測定される電圧は数百ミリボルト〜数ボルト、好ましくは約１．５Ｖとすべきである。複数電圧パルスプロトコールの場合、約１Ｈｚのパルス反復割合も適しているが、他の反復割合でも充分作動しうることが判明した。より長いバルス適用時間に応じ、より低い周波数の反復割合を使用すべきである。いずれの場合も、各パルスの長さおよび強度は融合させるべき相手の寸法に依存する。好ましくは、融合パルスは矩形波形を有するが、他の波形（たとえば各種のａｃ−フィールドパルスプロトコールも作動することができる。誘電泳動につき掃引機能ゼネレータは好ましくは１００Ｖ／ｃｍ〜５ｋＶ／ｃｍ、１００Ｈｚ〜２ＭＨｚのフィールド強度の交流フィールド（正弦波形）を発生する。

融合を得るため工程Ｂにて使用される電場は、周囲の構造体への悪影響を回避すると共に本発明の利点を得るため高度に集中させるべきである。電場を集中させるには、細胞膜から２種の融合相手に近接位置する（すなわち０〜１０μｍ、好ましくは０〜５μｍ）１個もしくは２個の微小電極を使用して電場を発生させるのが好ましい。単一電極を使用する場合、この電極は好ましくは陽電位（陽極）にてバイヤスさせると共に磨砕細胞調製物に対し作動させる。本発明によれば、微小電極は好ましくは細胞〜サブ細胞寸法の電極である。好ましくは融合相手に最も近接位置する電極の端部の外径は数ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは５〜３０μｍ、特に好ましくは約２０μｍである。各電極は密実導電性材料で作成することができ、或いは選択する融合相手もしくは化学薬剤を供給すべく中空とすることもできる。各電極は種々異なる材料から作成することができる。特殊タイプの電極は中空であると共に、しばしば毛細管電気泳動およびガスクロマトグラフィー分離につき使用されるタイプの融合シリカ毛細管から作成される。これら毛細管は、典型的には内径１〜１００μｍかつ外径５〜４００μｍであると共に、長さは数ｍｍ〜１ｍである。細胞融合用途につき、これら電極には電解質（好ましくは生理学的緩衝溶液）を満たす。細胞融合を生ぜしめるのに充分な電位を毛細管に加える場合、毛細管には電気エンドオスモシスバルク流が誘発され、これをポアセル流動（毛細管における重力流動）と組合わせて用いることにより、各材料を融合相手に効率的に移行させることができる。この種の中空細孔融合シリカ毛細管は、入口端部に添加される各成分をその電荷と摩擦とのドラッグ比に基づき分画しうるという更なる利点を有する。このシステムの特徴は、たとえば細胞融合に対する各種分画成分の作用を検討すべく使用することができる。

さらに工程Ｂに先立ち、２種の融合相手を電気融合緩衝剤にて供給することが好ましい。

融合を容易化させるには、工程Ａを実施する前に融合相手の少なくとも１種を予備エレクトロポレートするのが有利である。

融合相手の一方（または両者）が細胞である場合は、これを細胞ネットワークもしくは組織の部分として、たとえば選択細胞の生化学的性質の変化が全ネットワークの挙動に対し顕著な作用を及ぼしうる細胞ネットワークを検討することができる。

本発明による方法を実施するのに適する設備を図１に示す。この図面において、２種の融合相手１、２は両者とも細胞である。融合させるべき細胞を懸濁物からポリカーボネート製ホルダーに装着された顕微鏡カバースリップ３に添加する。

各細胞を、光学トラッピング（ＭＯＰＡレーザー４）を用いて或いは単にこれらを高目盛マイクロマニビュレータ７により制御される微小電極５、６と一緒に押圧することにより予備整列させる。好ましくは微小電極は炭素繊維電極、特に好ましくは酸素繊維超微小電極（直径５μｍ）または中空ガラス繊維電極である。

電圧ゼネレータ８を使用して所要の電場を与える。

蛍光画像化および光学トラッピングについては、２種のコリニアレーザー光線を顕微鏡対物レンズ９に送る。アルゴンイオンレザー１０からの４８８ｎｍ光線（アルゴンイオンレーザーからの光線を黒色の細線矢印で示す）を用いてフルオレスセインを励起させると共に、ＭＯＰＡダイオードレーザー４からの９９２ｎｍ光線（アルゴンイオンレーザーからの光線を黒色の太線矢印で示す）を光学トラッピングにつき使用した。

得られた蛍光かつ鮮明フィールド画像をＣＣＤカメラ１１に指向させる。

さらに設備は鏡１２と二色性ビームスプリッタ１３と多色性ビームスプリッタ１４とレンズ１５と回転盤１６とフィルタ１７とを備える。

本発明による方法は、たとえばオルガネラのような個々の細胞もしくはサブ細胞構造体の遺伝的性質および生化学的表面特性を取り扱うのに適する。これはインビトロ受精につき特に適すると共に興味がある。さらに、たとえばクローン化、ハイブリドーマの形成、細胞膜の組成の取り扱い、および細胞への充分規定された容積の物質の供給（特に細胞への医薬活性物質の供給）のような幾つかの他の用途にも使用することができる。

本発明による方法はさらに、個々の細胞群における生化学的障害を持った患者もしくは動物のインビボ電気融合にも適している。

遺伝的に獲得されても或いはされなくても、多くの病気は代謝障害をもたらす。たとえば黒質線状体経路におけるニューロンの変成によって生ずるパーキンソン氏病は、細胞の分離集団におけるドーパミンの生成につき生化学機作における機能不全をもたらす。次いで、これは運動挙動欠陥をもたらす。パーキンソン氏病の標準的処置はＬ−ＤＯＰＡ（すなわちドーパミンの先駆体）の経口投与である。代案として、ドーパミンを形成するニューロン細胞を持ったグラフト細胞を患者の脳に移植する。適する脳構造体へのインビボにおける細胞内薬物もしくは遺伝子投与は、上記例に記載されると共に治療方策として使用されるものと同様な電気融合過程を用いて行うことができる。

小集団の細胞が機能不全である他の病気は内部器官における多くの障害を包含するが腫瘍をも含む。

遺伝子供給のための遺伝子工学処理されたウィルスを用いる脳腫瘍の実験処置が成功報告例を以て使用されている。しかしながら、供給系としてのウィルスの使用は、これがウィルス突然変異種を与えるので強力な害を提起するという限界を有する。下記実施例に記載したものと同様な遺伝子供給のための電気融合過程（たとえば「自殺遺伝子」サイトキン・デアミナーゼもしくはチミジンキナーゼ）は、癌療法におけるウィルス供給システムの使用の必要性を排除する。

薬物もしくは遺伝子の局部投与（機能不全群の細胞に対する直接投与）（遺伝子療法）は腹腔内、経口、静脈内または他の任意の種類の一般に用いられる薬物投与技術よりもずっと優れていると思われる。インビボにおける細胞内薬物−遺伝子−投与は、下記実施例に記載したと同様な電気融合手順を用いて達成することができる。電極の極めて小さい寸法のため、印加する低電圧と組合せて極めて小さい組織外傷しか予想されない。さらに、電極の位置決めおよびその後の遺伝子もしくは薬物供給は極めて正確である。これは脳において特に重要である。エレクトロポレーションにつきここで用いられる電極よりも数１００倍大きい程度であるマイクロ透析プローブは移植の２４時間後にわたり極めて小さい組織外傷および局部的代謝の障害しか生ぜしめない。

エレクトロポレーションを用いるインビボにおける細胞およびオルガネラへの溶解質移行には、中空である電極を使用するのが好ましい。次いで細胞中へ電気融合させる融合相手を単に電極の中心における細いチャンネルを介して投与し、これには注射器ポンプもしくは蠕電動ポンプまたは電気泳動を含む他の任意の種類の溶液ポンプ輸送システムによる流動を加える。

特に興味ある可能性は、細胞もしくは組織への電気融合のため融合相手と共に溶解質を連続投与するための生物許容性材料にてバッテリー作動式灌流／エレクトロポレーション移植体を使用することである。この種の低電位が必要とされるので、数ボルト〜２０ボルトの範囲におけるｅｍｆを有するバッテリーを使用することができる。これらバッテリー作動式エレクトロポレーション装置は小さく作成することができ、実質的にこれらは僅か数ｍｍ^２の寸法のチップに含ませることができる。

インビボ施設の例を図５に示す。中空電極２０を脳における細胞２１に近い定位式用具の使用により位置決めする。この細胞２１は融合相手の１種を構成する。他の融合相手はたとえばＤＮＡ、蛋白質、ＲＮＡもしくは薬物のような医薬活性物質を含有するリポソームにより構成される。細胞には電極２１への第２融合相手の注入によりリポソームを灌流させ、これには図面に示した注射器２２を使用し、または或る種の他の適する手段を使用する。

以下、本発明を実施例により更に説明する。この実施例は単に本発明を例示する目的に過ぎず、決して本発明の範囲を限定するものでない。

これら実施例にて、以下の方法および材料を使用した。

顕微鏡操作および融合
高度集中レーザー光線での光学トラッピングを用いて各融合相手を整列させた。この手順を用い溶液における各融合相手の１種（細胞もしくはリポソーム）をＩＲレーザー光線によりトラップすると共に他の融合相手と接触させ、前記他の融合相手はサブストレータムにて成長した付着性細胞またはサブストレータムに設置された細胞のいずれかとし、これには図１に図示すると共に上記した施設で光学トラッピングを用いた。融合のための細胞標的に近接して細胞もしくはリポソームを位置決めするため、本発明者等はさらに炭素繊維微小電極先端への可逆的吸着を使用する。細胞−リポソーム融合に関するこの特定方式を用いる際、ポリ−Ｌ−リジン被覆ガラス表面にて細胞と共に同時固定化されたリポソームを表面から脱着させ、これには電極先端をリポソームに対し目的平面に対しほぼ平行に押し付けた。かくしてリポソームは電極先端に軽く付着し、三次元にて０．２μｍの増分で移動しうる顕微操作器により細胞構造体に近接して再位置せしめることができる。これを図２Ａ〜Ｃに示し、直径約５μｍのリポソームを標的細胞に対し約９０μｍ移動させるのに対し、図２Ｄ−Ｇはこの簡単な手法を用いてどのように複合細胞−リポソームパターンを形成しうるかを示す。図２Ａ〜Ｃにおけるリポソームを先ず最初にポリ−Ｌ−リジン被覆ボロシリケートカバースリップに固定化すると共に、細胞を懸濁物にて添加した。リポソームは９０μｍにわたり細胞まで容易に移動することができた。光学トラッピングに比べこの技術の１つの利点は、小胞に加えうるずっと大きい力である。２種の細胞の整列につき同じ方法を用いたが、ただしポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラスを使用する必要はない。何故なら、懸濁物における細胞は単に重力により表面に付着するからである。

電気融合につき、外径５μｍの炭素繊維微小電極の同じ対を用いる。図１は、融合につき予備整列された１対の細胞に関する電極の幾何学的配置を示す。細胞−細胞および細胞−リポソームの融合につき、高集中電場を低電圧パルスゼネレータを用いて加える。この施設の利点は、電極が細胞〜サブ細胞寸法であって複雑細胞ネットワークにおける単一細胞の融合をサブストレータムにて成長させうる点である。同時に高集中電場は、周囲細胞の望ましくない融合もしくはエレクトロポレーションの危険性を最少化させる。

実験プロトコール
光学トラッピング、顕微鏡および蛍光画像化
光学トラッピングおよび蛍光画像化システムをハウス内構築した。光学トラップは単一モードＭＯＰＡレーザーダイオード（モデルＳＤＬ−５７６２−Ａ６、ＳＤＬインコーポレーション）からの出力を空間フィルタ（モデル９００、ニューポート社）を介し送信することにより形成し、次いで出力を近赤外ミラーで反射させた。反射したレーザー光を二色性ミラーに通過させ、多色性ミラー（クロマ・テクノロジー・コーポレーション）から反射させ、この多色性ミラーは顕微鏡（ニコン・ダイヤフォト社もしくはライカＤＭ ＩＲＢ社）に戴置し、次いで多数孔対物（それぞれ１００ｘ、ＮＡ１．４ニコンおよび１００ｘ、ＮＡ１．３ライカ）を有する屈折制限焦点にした。アルゴンイオンレーザー（スペクトロ・フィジックス２０２５−０５）の４８８−ｎｍ出力を望遠鏡に通過させた後に回転盤に送って蛍光励起を達成した。回転盤の目的は、レーザー光を分散させて蛍光画像化につき均一照明を達成することである。円盤からの分散レーザー光をレンズにより集めると共に、二色性ミラー（クロマ・テクノロジー・コーポレーション）から反射させた。この反射光を顕微鏡に送ると共に、多色性ミラーにより反射させた。蛍光および鮮明画像化を３−チップカラーＣＣＤ−カメラ（ハママツ社）またはシリコン−強化標的カメラ（ハママツ社）により行い、スーパーＶＨＳレコーダー（パナソニック社）により記録し或いはフレームグラバーを介し硬質円盤に直接ダンプした。

電気融合装備
電気融合実験につき、細胞皿を減圧グリースを用いて円形ポリカーボネートホルダーに装着し、転倒顕微鏡のステージに移した。外径５μｍを有する２個の炭素繊維微小電極（アクソン・インスツールメンツ・インコーポレーションＰｒｏＣＦＥ）を各融合相手の各側に高目盛顕微操作器（ナリシゲＭＷＨ−３）により近接位置せしめた。２つの炭素繊維電極先端部（陽極および陰極）を目的平面に対し０〜２０°および１６０〜１８０°の角度にて位置せしめた。各細胞をパルスゼネレータ（デジタイマー・スチミュレータＤＳ９Ａ）または手作り品を用いて複数１−ｍｓパルスで融合させた。パルスゼネレータからの電圧出力を、高インピーダンス電極およびパッチ−クランプ増幅器を用いて検定した。電気融合緩衝剤は０．３モル／ｋｇハンクス・ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）溶液（１．３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．４１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．２６ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．６４ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、３．０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、５．５ｍＭ Ｄ−グルコース、２０ｍＭヘペス、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）または０．２モル／ｋｇヘペス塩水緩衝液（１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、および１０ｍＭヘペス）とし、３０〜５０％のＭｉｌｌｉＱ−水で希釈した。ＰＣ１２細胞については標準的イソ−オスモラおよびハイポ−オスモラ融合媒体をそれぞれ３００ Ｌ３および７５ Ｌ３として用いた［Ｓ．ファング等、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ、第１３４巻、第３５−４２頁］。

ＮＧ−１０８およびＣｏｓ７の細胞−細胞融合実験につき、５％ＰＥＧ ４０００融合媒体に添加し、細胞−リポソーム融合においては１．２５％ＤＭＳＯを添加した。

細胞培養
ジュルカットＭＧ １０８、ＣＯＳ ７およびＰＣ１２細胞を標準的手順に従い培養した。ＮＧ−１０８およびＣＯＳ ７細胞を２ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼ（アステルペルギルス・オリゼーから）で５〜３０分間にわたり培養器内（３７℃、湿度９０％および５％ＣＯ_２雰囲気）で処理した。

蛍光カプ細胞化ユニラメラ小胞および蛍光標識蛋白リポソームの作成
クロロホルムにおけるＬ−α−ホスファチジルコリンからのリポソーム（新鮮卵黄からの粉末、シグマ社、セントルイス、ＭＯ州）を、回転蒸発法を用いて高収率で得た［たとえばＡ．モスコ等（１９９６）、巨大ユニラメラ小胞の迅速作成、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第９３巻、第１１４４３−１１４４５頁参照］。蛍光標識されたγ−ＧＴを２．３ｍＭのフルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）との反応により作成した。γ−ＧＴ−ＦＩＴＣ溶液をエコノパック １０ＤＧカラム（ビオラド・ラボラトリース社、ＣＡ）に６０００ Ｄカットオフで通過させることにより、未反応ＦＩＴＣを除去した。次いで、標識されたγ−ＧＴを小胞形成プロセスに際し小胞中に組込んだ。

ポリ−Ｌ−リジン被覆カバースリップの作成
カバースリップ（ボロシリケート、直径２８ｍｍ、厚さ０．１３〜０．１７ｍｍ、ケボ社、スェーデン）を７０％エタノール／水の溶液（ｖ／ｖ）で洗浄した後、ＭｉｌｌｉＱ−水で洗浄した。ガラスをポリ−Ｌ−リジン（シグマ−アルドリッチ社、ヨーロッパ）／ＭＱ−水の溶液（０．１％、（ｗ／ｖ））に入れた。これらカバースリップを、減圧グリースを用いて円形ポリカーボネートホルダーに取り付けた。１ｍｌのリポソーム溶液を添加した。３０分間の後、充分な個数のリポソームを固定化させ、外側溶液を交換すると共に細胞を添加した。

微小電極を用いるリポソームおよび細胞の顕微操作
リポソームをポリ−Ｌ−リジン被覆ボロシリケート表面における種々異なる箇所に移行させるため、高目盛顕微操作器により制御された炭素繊維微小電極（ナリシゲ、日本国、０．２μｍ解像力）を、単に組合わせ押圧、剥取移動を使用して表面から小胞を緩めることにより使用した。小胞を表面から脱着させた後、これらを電極先端に付着させると共に長距離にわたり移動させて、細胞標的に近接位置せしめた。リポソーム含有量の顕著な損失がこの処理の結果であるかどうかを判定するため、リポソームをフルオレスセイン（１０μＭ）で処理し、カバースリップに取り付け、充分に洗浄して蛍光背景を顕著に減少させた。小胞を移動させる前後の小胞内蛍光強度の間の比較は、内容物の実質的な損失の徴候を示さなかった（データ示さず）。

薬品および材料
ヘペス（＞９９％）、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび水酸化ナトリウム（全てスプラプール社）、二塩化カルシウム、二塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、燐酸二水素カリウム、ＰＥＧ ４０００および炭酸水素ナトリウムはメルク社から購入した。Ｄ−グルコース（アラナＲ）はＢＤＨリミテッド・プール社から購入し、フルオレスセイン（ＧＣ−級）、γ−ＧＴ、プロテアーゼ（タイプＸＸＩＩＩ、アスペルギリス・オリゼーから）、フルオレスセイン（ナトリウム塩）、およびＤＭＳＯはシグマ−アルドリッチ社、スェーデンから入手した。フルオレスセインイソチオシアネートはモレキュラ・プローブ社、ヨーロッパから入手した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社）からの脱イオン水を使用した。

例１：細胞−細胞融合
この例においては、光学トラッピングにより接触させると共にカバースリップに固定化された２個のＰＣ１２細胞（直径８μｍおよび１０μｍ）を図３Ａ〜Ｄに示したように融合させた。図３Ａは誘電泳動（０．３〜３ｋＶ／ｃｍ、２ＭＨｚ）の際のＰＣ１２細胞を示す。図３Ｂは最終融合パルス（それぞれ１ｍｓ持続期間の６パルス、３ｋＶ／ｃｍ）による融合の開始を示し、これは各細胞間の一層幅広かつ扁平な接触帯域により見ることができる。図３Ｃ（融合パルスの〜１分間後）および図３Ｄ（融合パルス後の〜２分間）は各細胞間の融合領域の拡大を示し、完全融合を示す。

この技術により達成される高空間解像力を示すため、ネットワークにおける個々のＭＧ １０８細胞を融合させた（データ示さず）。ＰＣ１２細胞およびＮＧ １０８細胞の他に、ユルカット細胞およびＣｏｓ７細胞をも融合させることに成功した（データ示さず）。ＰＣ１２細胞とＮＧ １０８細胞との間のハイブリッド細胞を同様な融合方式により形成することに成功した（データ示さず）。

細胞骨格が存在するので、融合細胞はその膜を再構成すると共にリポソームに比べ球形となるにはずっと長い時間を要する。たとえば、同一の実験施設を用いる典型的リポソーム−リポソーム融合はミリ秒の範囲である（データ示さず）。強度の細胞骨格スカフォールドを有する或る種の細胞につき、膜再構成は数分間を要することがある。しかしながら、初期細胞質連続性を特徴とする融合はまだ１秒以内に生ずる。一般に０．２モル／ｋｇの緩衝液にて予備エレクトロポレートされた細胞の融合は、等張性０．３モル／ｋｇ緩衝液に保持された細胞の融合よりもずっと迅速であることが観察された。等張性培地における全融合細胞への初期細胞質連続性からの融合プロセスは数時間を要した。これは、エキソサイトシスのような膜融合イベントに対する融合培地作用［たとえばＧ．ウエーバー等（１９９２）、レーザーマイクロビームおよび光学トラッピングによる細胞、オルガネラおよびゲノムの操作、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔ、第１３３巻、第１−４１頁に記載］および細胞−細胞融合［たとえばＪ．チンマーベルク等（１９８０）、「カルシウム結合性蛋白質を含有する平面二層を有する脂質小胞の融合をマイクロモレキュラＣａ^２＋は刺激する」、サイエンス、第２１０巻、第９０６−９０８頁；Ｊ．Ｊ．シュミット等（１９８９）、強ハイポオスモラ溶液における電気融合による向上ハイブリドーマ生産、バイオヒミカ・バイオフィジカ・アクタ、第９８３巻、第４２−５０頁；Ｊ．Ｊ．シュミット等（１９８９）、浸透圧処理細胞の電気融合、ナチュールビッセンシャフト、第７６巻、第１２２−１２３頁に記載］に関する初期の見積もりと一致する。その後、ハイポ−オスモチック融合媒体により到達する電気融合の向上はスペクトリン変性に基づくと論じられている［たとえばＵ．チンマーマン等（１９９０）、ハイポオスモラ電気泳動によるマウス−ヒト細胞ラインの効率的ハイブリッド化、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ、第１３４巻、第４３−５０頁；Ｌ．Ｖ．チェルノモルジク等（１９９１）、スペクトリンネットワークおよび非浸透力は電気融合血小板ゴーストにて融合生成物形態を調節するという証明、バイオフィジックス・ジャーナル、第６０巻、第１０２６−１０３７頁に記載］。

全ＮＧ−１０８およびＣｏｓ ７融合実験において各細胞をプロテアーゼで処理し（５〜３０分間）、さらにＮＧ−１０８細胞につき細胞融合媒体は５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００を含有した［たとえばＡ．Ｅ．ソワース（１９９５）、血小板膜の融合に際する表面形状変化の膜骨格拘束：浸透圧および誘電泳動性の微小力としての使用からの証明、バイオフィジックス・ジャーナル、第６９巻、第２５０７−２５１６頁に記載］。各細胞ラインに関する種々異なる予備処理条件および融合条件の必要性は細胞融合に関する事前の観察と一致する。

電気融合細胞は生物学的に完全であって、成長し続けることが充分確認された。さらに本発明の融合プロトコールにおいて、各細胞は表面に付着すると共に融合後の５〜２４時間にわたる点検に際し成長し続けた。

例２：細胞−リポソーム融合
細胞融合の事前のカウントは他のフェノタイプの哺乳動物細胞に加え合成小胞および植物プロトプラストも哺乳動物細胞に融合させうることを示した。合成小胞は或る種の化学処理またはたとえばＰＥＧなどを用いて融合されている［たとえばＮ．Ｇ．ストイキバ等（１９９４）、ポリエチレングリコールの存在下における哺乳動物細胞の電気誘発融合、ジャーナル・メンブラン・バイオロジー、第１４０巻、第１７７−１８２頁］またはＨＶＪ−グルコ蛋白再構成リポソームを用いて融合されている［Ｓ．セイビッケ等（１９８８）、腹水腫瘍細胞およびその脂質欠如体との脂質小胞の融合、放射能−および蛍光−標識小胞での研究、バイオヒミカ・バイオフィジカ・アクタ、第９４４巻、第４８７−４９６頁記載］。合成脂質フィルムは細胞におけるプラスマ膜に組み込まれると共に、脂質被覆ガラスマイクロピペットと細胞膜との間の緩和な接触により微小注入が容易化されている［たとえばＩ．ラファフィアン等（１９９８）、脂質促進微小注入：小細胞のサイトストールおよび膜への物質の導入、バイオフィジックス・ジャーナル、第７５巻、第２５５−２５６３頁に記載］。合成小胞に関する融合方式は、細胞不透過性分子を内容物の混合を介し標的細胞に移行させると共にたとえば蛋白質のような膜脂質および膜関連構造体を標的細胞膜中へ移行させる目的で使用することができる。

図４Ａ〜Ｅは本発明による単一小胞−細胞融合を例示する画像の２つの配列である。第１配列（図４Ａ〜Ｃ）においては、直径〜５μｍのホスファチジルコリン小胞を直径〜１２μｍのＣｏｓ−７細胞と融合させ、第２配列（図４Ｄ〜Ｅ）においては直径〜３μｍのホスファチジルコリン小胞を再構成γ−ＧＴと共に直径〜２０μｍのＮＧ−１０８細胞（３０分間にわたりプロテアーゼ処理）と融合させる。これは、リポソーム組込み蛋白質を細胞構造体に導入する能力を示す。小胞と細胞との融合は同じ種類の２他の細胞間の融合よりも達成するのがずっと困難であることに注目される。０．３モル／ｋｇ融合媒体へのＤＭＳＯ（〜２％）の添加および０．２モル／ｋｇ融合媒体の使用の両者は融合を容易化させることが判明した。ＤＭＳＯはエレクトロポレーションを用いるＤＮＡの吸収を容易化させると共に融合の収率を増大させ、ハイポ−オスモラ媒体の使用は細胞の融合収率を増大させることが周知されている［上記］。図面に示した実験においては、融合をヘペス−緩衝塩水溶液にて行い、１．２５％のジメチルスルホキシドおよび２０％のＭＱ−水を外部緩衝溶液に添加して小胞−細胞電気融合を促進させた。

例３：単一開孔融合シリカ毛細管を用いる細胞融合
融合実験をＮＧ １０８細胞で行い、標準的手順に従って培養すると共に円形ポリカーボネートホルダーに装着されたＮｏ．１円形カバースリップに塗沫し、転倒顕微鏡ステージに移した。全実験の間、細胞バッチを白金ワイヤにより磨砕した。各細胞を光学トラッピングにより融合のため整列させた。１〜３０ｋＶの陽電位にて操作される高電圧出力供給部（ベルタンド社、ヒックスビル、ＮＹ、ＵＳＡ）を電解質充填融合シリカ毛細管（長さ３０ｃｍ、内径３０ｍｍ、外径３７５ｍｍ）と一緒に電極として使用した。その他は実験施設は図１に示したものと同一にした。融合シリカ電極を、回転サンドペーパー皿での先端部の磨砕により外径約５０ｍｍまで尖らせた。毛細管および緩衝剤容積（これは毛細管の入口端部を白金ワイヤにより高出力電圧供給部に接続する）にはハンクス緩衝塩水を充填した。尖らせた毛細管先端部（出口端部）を、高目盛り顕微操作器を用いて各融合相手の一方に近接（典型的には１０μｍ未満）にて位置せしめた。２つの整列ＮＧ１０８−１５細胞の融合は、５〜１５ｋＶのパルスを０．１〜５秒間にわたり加えて行った。

本発明によるこの方法は、複合システムにて２種の細胞の融合につき極めて効率的であることが示された。これは、細胞および他の融合相手のインビボ融合にて使用するのに特に重要である。

Claims (28)

1. 細胞状膜を有する少なくとも２種の融合相手の選択的電気融合インビトロ方法において、
   （Ａ）電極の使用により、融合相手を互いに接触させ；
   （Ｂ）融合を得るのに充分な強度であると共に融合相手に高度に集中した電場を加え、前記少なくとも１種の微小電極を顕微鏡、少なくとも１つのマイクロポジショナーおよび／または定位用具の使用により位置決めし、
   （Ｃ）２種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい２個の微小電極を用いて、工程Ｂにて電場を与える
   ことを特徴とする選択的電気融合インビトロ方法。
2. ２種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい１個のみの微小電極を用いて、工程Ｂにて電場を与える請求項１に記載のインビトロ方法。
3. マイクロチップに移動自在に装着された１個の電極を用いて、工程Ｂにて電場を与える請求項１または２に記載のインビトロ方法。
4. マイクロチップに移動自在に装着された数個の電極を用いて、工程Ｂにて電場を与える請求項１または２に記載のインビトロ方法。
5. 電極を、融合生成物の組合せ合成に適する設計のマイクロチップに移動自在に装着する請求項３または４に記載のインビトロ方法。
6. 少なくとも１個の微小電極が中空であると共に、２種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい請求項２〜５のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
7. 中空であり、電解質充填され、２種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい少なくとも１個の微小電極を用いて工程Ｂにて電場を与え、さらに前記微小電極を用いて電気浸透、電気泳動またはポアスール流動により融合相手または化学薬剤を供給する請求項２〜６のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
8. 前記電極の外径が、たとえば細胞、リポソームおよび蛋白リポソームのような近似構造に悪影響することなく前記少なくとも２種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい請求項２〜７のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
9. 前記電極の外径が１〜１００μｍである請求項８に記載のインビトロ方法。
10. 少なくとも１個の電極を融合部位への少なくとも一種の融合相手を供給すべく使用する請求項２〜９のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
11. 工程Ａを光学トラッピングの使用により行う請求項１〜１０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
12. 工程Ａをマイクロピペットの使用により行う請求項１〜１０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
13. 融合相手の少なくとも一方が細胞であると共に、他方の融合相手が独立して単一細胞、リポソーム、蛋白リポソーム、合成小胞および卵細胞、除核卵細胞、任意の発育段階における精子細胞および植物プロトプラストよりなる群から選択される請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
14. 融合相手の少なくとも一種が単一細胞、リポソーム、蛋白リポソーム、合成小胞、卵細胞、除核卵細胞、任意の発育段階における精子細胞および植物プロトプラストよりなる群から選択される複数の構造体により構成される請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
15. 融合相手を、工程Ｂに先立ち緩衝液にて供給する請求項１〜１４のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
16. 融合相手の少なくとも一種が工程Ａに先立ち固定化されている請求項１〜１５のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
17. 融合相手の一種が細胞ネットワークの部分である請求項１〜１６のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
18. 融合相手の少なくとも一種が、工程Ａに先立ち緩衝液にてエレクトロポレートされている請求項１〜１７のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
19. 融合相手の少なくとも一種が、工程Ａに先立ち緩衝液にて誘電泳動フィールドに露呈されている請求項１〜１８のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
20. 融合相手の少なくとも一種が、近接細胞−細胞接触を促進する融合剤もしくは他の薬剤により処理されている請求項１〜１９のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
21. インビトロ受精における請求項１〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
22. ヒトクローン化を除きクローン化における請求項１〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
23. ハイブリドーマを形成するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
24. 細胞膜の組成を処理するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
25. 充分規定された容積の物質を細胞に供給するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
26. 医薬活性物質を細胞に供給するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
27. 腫瘍の処置のための薬剤の調合における請求項１〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
28. たとえばパーキンソン氏病およびアルツハイマー氏病のような慢性神経変成病の処置のための薬剤の調合における請求項１〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。