JPH08322568A - Ｄｎａ顕微注入法 - Google Patents
Ｄｎａ顕微注入法Info
- Publication number
- JPH08322568A JPH08322568A JP7157037A JP15703795A JPH08322568A JP H08322568 A JPH08322568 A JP H08322568A JP 7157037 A JP7157037 A JP 7157037A JP 15703795 A JP15703795 A JP 15703795A JP H08322568 A JPH08322568 A JP H08322568A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- injection
- dna
- tip
- eggs
- pronucleus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 トランスジェニックアニマル作出のために前
核期受精卵の前核内にＤＮＡを顕微注入するに当り、前
核期受精卵の核膜にＤＮＡを入れた注入ピペットの針先
を圧し当てた後、針先に微振動を与えることにより核膜
を貫通させてＤＮＡを注入するＤＮＡの顕微注入法。 【効果】 本発明により、前核期卵の前核内へのＤＮＡ
溶液の安定した注入を行なうことができ、注入卵の生存
率を飛躍的に高めることができる。従って、トランスジ
ェニックアニマルの作出効率を大幅に向上することがで
きる。
核期受精卵の前核内にＤＮＡを顕微注入するに当り、前
核期受精卵の核膜にＤＮＡを入れた注入ピペットの針先
を圧し当てた後、針先に微振動を与えることにより核膜
を貫通させてＤＮＡを注入するＤＮＡの顕微注入法。 【効果】 本発明により、前核期卵の前核内へのＤＮＡ
溶液の安定した注入を行なうことができ、注入卵の生存
率を飛躍的に高めることができる。従って、トランスジ
ェニックアニマルの作出効率を大幅に向上することがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トランスジェニック動
物作出のために前核期受精卵前核内へのＤＮＡ溶液の顕
微注入法（マイクロインジェクション法）に関する。本
発明の方法によるとＤＮＡ注入操作した卵の生存率を飛
躍的に高め、トランスジェニック動物の作出効率を大幅
に改善することができる。
物作出のために前核期受精卵前核内へのＤＮＡ溶液の顕
微注入法（マイクロインジェクション法）に関する。本
発明の方法によるとＤＮＡ注入操作した卵の生存率を飛
躍的に高め、トランスジェニック動物の作出効率を大幅
に改善することができる。
【０００２】
【従来の技術】近年、組換えＤＮＡ技術の進歩により、
異種遺伝子を生物個体で発現させたトランスジェニック
動物の作出が可能になった。この技術は遺伝子の機能研
究のみならず、作出した疾患モデル動物を用いた発病機
構の研究、医薬品開発を含む治療方法の開発、更に医薬
品の生産手段として、医学の発展に寄与するところが多
大であり注目されている。特にラットは、マウスと同様
に妊娠期間、性成熟期間が短く、産仔数も１０匹前後と
多く、且つ体重がマウスの約１０倍程度あるので、臓器
摘出などの細やかな実験処置を施すことができることか
ら、実験用動物としての有用性が高い。また、高血圧症
や発癌研究など過去のデータ蓄積も豊富であり、これら
の成績と直接比較して検討できるため、トランスジェニ
ックラット作出の意義は高い。
異種遺伝子を生物個体で発現させたトランスジェニック
動物の作出が可能になった。この技術は遺伝子の機能研
究のみならず、作出した疾患モデル動物を用いた発病機
構の研究、医薬品開発を含む治療方法の開発、更に医薬
品の生産手段として、医学の発展に寄与するところが多
大であり注目されている。特にラットは、マウスと同様
に妊娠期間、性成熟期間が短く、産仔数も１０匹前後と
多く、且つ体重がマウスの約１０倍程度あるので、臓器
摘出などの細やかな実験処置を施すことができることか
ら、実験用動物としての有用性が高い。また、高血圧症
や発癌研究など過去のデータ蓄積も豊富であり、これら
の成績と直接比較して検討できるため、トランスジェニ
ックラット作出の意義は高い。
【０００３】従来、トランスジェニック動物の作出に
は、目的とするＤＮＡの溶液を前核期の受精卵へマイク
ロピペットを用いて注入する顕微注入法が多く用いられ
てきた。しかしながら、この方法には、改善すべき点も
多く残っている。その一つとして、ラット等の前核期受
精卵では、細胞膜が脆弱で前核膜が弾力性に富むため、
注入針先の前核内への良好な挿入が難しいことが挙げら
れる。即ち、注入針先をうまく前核内に挿入することが
できず、前核の外周辺にＤＮＡ溶液が注入されたり、注
入された場合でも、前核外にＤＮＡ溶液が漏出してしま
うことがある。更に、注入操作により細胞膜を大きく破
損して、注入後に前核や細胞質が漏出する等の過剰な損
傷を卵に与えるため、注入操作した卵の生存率が３０〜
６０％程度と低く、仮親に移植できる注入操作した卵を
十分に得るためには非常に多くの卵を処理する必要があ
った。
は、目的とするＤＮＡの溶液を前核期の受精卵へマイク
ロピペットを用いて注入する顕微注入法が多く用いられ
てきた。しかしながら、この方法には、改善すべき点も
多く残っている。その一つとして、ラット等の前核期受
精卵では、細胞膜が脆弱で前核膜が弾力性に富むため、
注入針先の前核内への良好な挿入が難しいことが挙げら
れる。即ち、注入針先をうまく前核内に挿入することが
できず、前核の外周辺にＤＮＡ溶液が注入されたり、注
入された場合でも、前核外にＤＮＡ溶液が漏出してしま
うことがある。更に、注入操作により細胞膜を大きく破
損して、注入後に前核や細胞質が漏出する等の過剰な損
傷を卵に与えるため、注入操作した卵の生存率が３０〜
６０％程度と低く、仮親に移植できる注入操作した卵を
十分に得るためには非常に多くの卵を処理する必要があ
った。
【０００４】これらの問題に対し、顕微注入法の改善方
法が「新生化学実験講座19、動物実験法(1991)，309 〜
313頁, 日本生化学会編, 東京化学同人出版」や「実験
医学第12巻, 第２号（通巻 144号）(1994), 122 〜 129
頁, 羊土社出版」に記載されている。その中で注入の注
意として、注入ピペットの先端が十分に細いこと、挿入
前に支持ピペット、雄性前核、注入ピペットを一直線に
配置し、注入ピペットを透明帯から前核にまで一息に挿
入する等の改良点が挙げられている。しかし、このよう
な方法では、極端に細い注入ピペットは粘性の高いＤＮ
Ａ溶液を注入する場合には不利である。また、一息に注
入ピペットを挿入すると、注入ピペットが深く入り過ぎ
て前核を串刺しにしたり、核膜を大きく傷つけたり、さ
らに細胞膜を過度に傷つけたりして、注入ピペットを抜
いた後に卵外に注入したＤＮＡ溶液が漏出し、注入操作
した卵の生存性が損なわれる等の不都合を生じる。この
結果、操作した卵の生存率がマウスでは６０〜８０％で
あるのに対し、ラットでは約４０〜６０％と低くなって
しまい、トランスジェニック個体の高い作出効率を得る
上で不利であった。
法が「新生化学実験講座19、動物実験法(1991)，309 〜
313頁, 日本生化学会編, 東京化学同人出版」や「実験
医学第12巻, 第２号（通巻 144号）(1994), 122 〜 129
頁, 羊土社出版」に記載されている。その中で注入の注
意として、注入ピペットの先端が十分に細いこと、挿入
前に支持ピペット、雄性前核、注入ピペットを一直線に
配置し、注入ピペットを透明帯から前核にまで一息に挿
入する等の改良点が挙げられている。しかし、このよう
な方法では、極端に細い注入ピペットは粘性の高いＤＮ
Ａ溶液を注入する場合には不利である。また、一息に注
入ピペットを挿入すると、注入ピペットが深く入り過ぎ
て前核を串刺しにしたり、核膜を大きく傷つけたり、さ
らに細胞膜を過度に傷つけたりして、注入ピペットを抜
いた後に卵外に注入したＤＮＡ溶液が漏出し、注入操作
した卵の生存性が損なわれる等の不都合を生じる。この
結果、操作した卵の生存率がマウスでは６０〜８０％で
あるのに対し、ラットでは約４０〜６０％と低くなって
しまい、トランスジェニック個体の高い作出効率を得る
上で不利であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述の様に、ラット等
の核膜に弾力性があり、細胞膜が脆弱なる受精卵では、
注入ピペットの針先の前核内への導入が難しく、ＤＮＡ
溶液を前核への注入時に脆弱な細胞膜を注入操作により
大きく損傷して、ＤＮＡ溶液を注入した操作受精卵の生
存率が低く、多数の受精卵を準備してＤＮＡ溶液の注入
操作を行う必要があった。このため、ラットは実験用動
物としての有用性の高さにも係わらず、トランスジェニ
ック個体の作出が遅れており、有効なＤＮＡ溶液の前核
期受精卵への注入法の開発が切望されていた。即ち、本
発明は、顕微注入法によってトランスジェニック動物を
作出する際に、効率よくＤＮＡ溶液を注入する方法を提
供することを課題とする。
の核膜に弾力性があり、細胞膜が脆弱なる受精卵では、
注入ピペットの針先の前核内への導入が難しく、ＤＮＡ
溶液を前核への注入時に脆弱な細胞膜を注入操作により
大きく損傷して、ＤＮＡ溶液を注入した操作受精卵の生
存率が低く、多数の受精卵を準備してＤＮＡ溶液の注入
操作を行う必要があった。このため、ラットは実験用動
物としての有用性の高さにも係わらず、トランスジェニ
ック個体の作出が遅れており、有効なＤＮＡ溶液の前核
期受精卵への注入法の開発が切望されていた。即ち、本
発明は、顕微注入法によってトランスジェニック動物を
作出する際に、効率よくＤＮＡ溶液を注入する方法を提
供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上述の状況に鑑み、本発
明者らは、注入ピペットの針先を極端に細くすることな
く、弾力性のある核膜に過度の損傷を与えない制御可能
なＤＮＡ溶液の注入方法の開発に鋭意努力した結果、顕
微注入法において受精卵にＤＮＡ溶液を注入する際、注
入ピペット挿入の針先に微振動を与えることにより、８
０％以上の生存率が得られる新しい顕微注入法を見出す
に至った。さらに、注入ピペットの針先を前核膜に一旦
圧し当てた後に、注入ピペットの針先に適度な微振動を
与えることにより注入ピペットの針先が核膜を貫通する
ことを促すことが、無理のない前核内への注入ピペット
の針先の挿入方法であることを見出した。
明者らは、注入ピペットの針先を極端に細くすることな
く、弾力性のある核膜に過度の損傷を与えない制御可能
なＤＮＡ溶液の注入方法の開発に鋭意努力した結果、顕
微注入法において受精卵にＤＮＡ溶液を注入する際、注
入ピペット挿入の針先に微振動を与えることにより、８
０％以上の生存率が得られる新しい顕微注入法を見出す
に至った。さらに、注入ピペットの針先を前核膜に一旦
圧し当てた後に、注入ピペットの針先に適度な微振動を
与えることにより注入ピペットの針先が核膜を貫通する
ことを促すことが、無理のない前核内への注入ピペット
の針先の挿入方法であることを見出した。
【０００７】すなわち、本発明は、前核期受精卵前核内
にＤＮＡを顕微注入するに当り、前核期受精卵の核膜に
ＤＮＡを入れた注入ピペットの針先を圧し当てた後、針
先に微振動を与えることにより核膜を貫通させることよ
りなるＤＮＡの顕微注入法に関する。更に、本方法で
は、支持ピペットで固定した前核期受精卵の雄性前核膜
に注入針先を一度圧し当て、注入ピペット針先の挿入動
作を一旦停止させた後に、あらためて挿入動作を開始す
るため、顕微カメラに設置したセンサーでその挿入位置
を確認し、微震動操作による前核内への注入ピペットの
針先の挿入操作を行うことができるため機械を用いた自
動化システムを構築する上でも有利である。この様な注
入操作により核膜の過度の損傷を防止し、注入操作によ
る脆弱な細胞膜の物理的損傷を最小限に止め、無理なく
注入ピペット針先を前核内へ挿入することができること
によりＤＮＡ溶液の注入操作後の受精卵の生存率を飛躍
的に向上させることができ、トランスジェニック動物を
作出する上で非常に有用である。本発明におけるＤＮＡ
溶液としては、例えば、ヒト成長ホルモンＤＮＡ、ヒト
インターフェロン、ヒトインターロイキン２、ヒトコロ
ニー刺激因子等のトランスジェニック動物作出のための
溶液を例示することができる。また微振動は、細胞表面
に押し当てた針先が、細胞からはずれることのない程度
に振動している状態をさす。
にＤＮＡを顕微注入するに当り、前核期受精卵の核膜に
ＤＮＡを入れた注入ピペットの針先を圧し当てた後、針
先に微振動を与えることにより核膜を貫通させることよ
りなるＤＮＡの顕微注入法に関する。更に、本方法で
は、支持ピペットで固定した前核期受精卵の雄性前核膜
に注入針先を一度圧し当て、注入ピペット針先の挿入動
作を一旦停止させた後に、あらためて挿入動作を開始す
るため、顕微カメラに設置したセンサーでその挿入位置
を確認し、微震動操作による前核内への注入ピペットの
針先の挿入操作を行うことができるため機械を用いた自
動化システムを構築する上でも有利である。この様な注
入操作により核膜の過度の損傷を防止し、注入操作によ
る脆弱な細胞膜の物理的損傷を最小限に止め、無理なく
注入ピペット針先を前核内へ挿入することができること
によりＤＮＡ溶液の注入操作後の受精卵の生存率を飛躍
的に向上させることができ、トランスジェニック動物を
作出する上で非常に有用である。本発明におけるＤＮＡ
溶液としては、例えば、ヒト成長ホルモンＤＮＡ、ヒト
インターフェロン、ヒトインターロイキン２、ヒトコロ
ニー刺激因子等のトランスジェニック動物作出のための
溶液を例示することができる。また微振動は、細胞表面
に押し当てた針先が、細胞からはずれることのない程度
に振動している状態をさす。
【０００８】以下、本発明の詳細を実施例に従って説明
するが、これらによって本発明は何ら限定されるもので
はない。
するが、これらによって本発明は何ら限定されるもので
はない。
【０００９】
【実施例１】ＤＮＡ溶液の前核期受精卵への注入操作後の操作卵の生
存率の比較 (1) 注入するＤＮＡ溶液の調製方法注入した導入遺伝子の構造 ：本実施例で使用した２種の
導入遺伝子 (αS1CN/IL2-2, αS1CN/IL2-4) は、ウシα
Ｓ１カゼインプロモーターの下流にヒト成長ホルモン遺
伝子を導入したαS1CN/hGH (T.Ninomiya et al.(1994)
: Function ofmilk protein gene 5'flanking regions
on human growth hormone gene. Mol.Reprod. Dev.37,
276-283)（図１）のヒト成長ホルモン遺伝子の第２エ
クソンのAatIIサイト或いは第４エクソンのBbeIサイト
に、合成ヒトインターロイキン-2ｃＤＮＡ (British Bi
o-technology Ltdより購入した谷口らの報告する IL-2c
DNA： T.Taniguchi et al.(1983) : Structure and exp
ression of a cloned cDNA for human interleukin-2.
Nature 302, 276-283)（図２）のHindIII とEcoRI の
切断片を各制限酵素用リンカーを介して挿入することに
より作製した。作製したαＳ１ＣＮ／ＩＬ２−２の遺伝
子構造の概略を図３に、αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−４の遺伝
子構造の概略を図４に各々示す。
存率の比較 (1) 注入するＤＮＡ溶液の調製方法注入した導入遺伝子の構造 ：本実施例で使用した２種の
導入遺伝子 (αS1CN/IL2-2, αS1CN/IL2-4) は、ウシα
Ｓ１カゼインプロモーターの下流にヒト成長ホルモン遺
伝子を導入したαS1CN/hGH (T.Ninomiya et al.(1994)
: Function ofmilk protein gene 5'flanking regions
on human growth hormone gene. Mol.Reprod. Dev.37,
276-283)（図１）のヒト成長ホルモン遺伝子の第２エ
クソンのAatIIサイト或いは第４エクソンのBbeIサイト
に、合成ヒトインターロイキン-2ｃＤＮＡ (British Bi
o-technology Ltdより購入した谷口らの報告する IL-2c
DNA： T.Taniguchi et al.(1983) : Structure and exp
ression of a cloned cDNA for human interleukin-2.
Nature 302, 276-283)（図２）のHindIII とEcoRI の
切断片を各制限酵素用リンカーを介して挿入することに
より作製した。作製したαＳ１ＣＮ／ＩＬ２−２の遺伝
子構造の概略を図３に、αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−４の遺伝
子構造の概略を図４に各々示す。
【００１０】ＤＮＡ（導入遺伝子）溶液の調製：注入し
たＤＮＡ溶液は下記の手順で調製した。即ち、注入ＤＮ
Ａ断片を含むプラスミド（プラスミドｐＵＣ１２の Amp
r および大腸菌の複製開始点を含むHindIII とEcoRI の
約 2.7kb断片のEcoR I部位を SalI に変換した断片（即
ちベクター）に各挿入遺伝子を結合したもの)(図５）を
制限酵素（HindIII, SalI)で消化し、１％アガロースゲ
ル電気泳動によりベクター部分を除去した直鎖状の導入
遺伝子（ＤＮＡ断片）を分離した。GENECLEAN II(BIO 1
01 INC; フナコシ薬品取扱）を用い、NaI 溶液でアガロ
ースを溶解して得たＤＮＡ断片をシリカゲルマトリクス
の GLASSMILKに吸着させて洗浄後に溶出して精製した。
得られた精製ＤＮＡを５μｇ／mlとなるように注入用バ
ッファー(0.1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl, pH7.6) で
溶解した。尚、注入操作する使用期間までの保存時間の
ある場合は−２０℃で保存した。
たＤＮＡ溶液は下記の手順で調製した。即ち、注入ＤＮ
Ａ断片を含むプラスミド（プラスミドｐＵＣ１２の Amp
r および大腸菌の複製開始点を含むHindIII とEcoRI の
約 2.7kb断片のEcoR I部位を SalI に変換した断片（即
ちベクター）に各挿入遺伝子を結合したもの)(図５）を
制限酵素（HindIII, SalI)で消化し、１％アガロースゲ
ル電気泳動によりベクター部分を除去した直鎖状の導入
遺伝子（ＤＮＡ断片）を分離した。GENECLEAN II(BIO 1
01 INC; フナコシ薬品取扱）を用い、NaI 溶液でアガロ
ースを溶解して得たＤＮＡ断片をシリカゲルマトリクス
の GLASSMILKに吸着させて洗浄後に溶出して精製した。
得られた精製ＤＮＡを５μｇ／mlとなるように注入用バ
ッファー(0.1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl, pH7.6) で
溶解した。尚、注入操作する使用期間までの保存時間の
ある場合は−２０℃で保存した。
【００１１】(2) 前核期受精卵へ調製方法 ８週齢のWistarラットを日本チャールスリバー社より購
入し、明暗サイクル１２時間（明時間：4:00〜16:00)、
２２±４℃で飼育して実験に供した。膣スメアにより雌
の性周期を観察してホルモン処理日を選択した (T.Nobu
naga & K.Nakamura (1967): Fundamental study on th
e physiology of estrous cycle in theWister-Imamich
i rat. I. Cyclic change of viginal smear observed
continuously at intervals of 3 hours. Jpn. J. An
im. Reprod. 14, 1-7) 。先ず、雌ラットに１５０ＩＵ
／ｋｇの妊馬血清性腺刺激ホルモン（日本全薬：ＰＭＳ
全薬，PMSG; pregnant mare serum gonadotropin; ＰＭ
ＳＧ）を腹腔内投与して過剰排卵処理を行い、その４８
時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性ゴナドトロピン
（三共臓器：プベローゲン, hCG; human chorionic gon
adotropin ; ｈＣＧ）を投与し、種雄との同居により交
配を行った。ｈＣＧ投与３２時間後に卵管灌流により前
核期受精卵を採取した。卵管灌流および卵培養にはｍＫ
ＲＢ液（Y Toyoda & MC Chang : J. Reprod. Fertil. 3
6, 9-22 (1974)）を使用した。ｍＫＲＢ液の組成を表１
に示す。卵管灌流液には０．１％ヒアルロニダーゼ (シ
グマ社製,Hyaluronidase H3606) を添加し、３７℃で５
分間の酵素処理による卵丘細胞除去を行い、ｍＫＲＢ液
で３回洗浄することにより酵素を除去した後、注入操作
までＣＯ2-インキュベーター内（5%C02-95% Air,37℃，
飽和湿度）に保存した。
入し、明暗サイクル１２時間（明時間：4:00〜16:00)、
２２±４℃で飼育して実験に供した。膣スメアにより雌
の性周期を観察してホルモン処理日を選択した (T.Nobu
naga & K.Nakamura (1967): Fundamental study on th
e physiology of estrous cycle in theWister-Imamich
i rat. I. Cyclic change of viginal smear observed
continuously at intervals of 3 hours. Jpn. J. An
im. Reprod. 14, 1-7) 。先ず、雌ラットに１５０ＩＵ
／ｋｇの妊馬血清性腺刺激ホルモン（日本全薬：ＰＭＳ
全薬，PMSG; pregnant mare serum gonadotropin; ＰＭ
ＳＧ）を腹腔内投与して過剰排卵処理を行い、その４８
時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性ゴナドトロピン
（三共臓器：プベローゲン, hCG; human chorionic gon
adotropin ; ｈＣＧ）を投与し、種雄との同居により交
配を行った。ｈＣＧ投与３２時間後に卵管灌流により前
核期受精卵を採取した。卵管灌流および卵培養にはｍＫ
ＲＢ液（Y Toyoda & MC Chang : J. Reprod. Fertil. 3
6, 9-22 (1974)）を使用した。ｍＫＲＢ液の組成を表１
に示す。卵管灌流液には０．１％ヒアルロニダーゼ (シ
グマ社製,Hyaluronidase H3606) を添加し、３７℃で５
分間の酵素処理による卵丘細胞除去を行い、ｍＫＲＢ液
で３回洗浄することにより酵素を除去した後、注入操作
までＣＯ2-インキュベーター内（5%C02-95% Air,37℃，
飽和湿度）に保存した。
【００１２】
【表１】
【００１３】(3) 前核期受精卵へのＤＡＮ溶液の注入注入ピペットの作製 ：注入ピペットはガラスキャピラリ
ーチューブ（Ｇ−１：成茂社製）、プラー（ＰＮ−３：
成茂社製）、マイクロフォージ（ＭＦ−７９：成茂社
製）を使用しガラスキャピラリーチューブをプラーにて
引き切り、フッ化水素、シグマコート（シグマ社製，SI
GMACOAT SL-2) 及び蒸留水で洗浄後、マイクロフォージ
でマイクロマニピュレーターに装着した時に顕微鏡ステ
ージと水平にセットできるように先端部分を曲げた。
ーチューブ（Ｇ−１：成茂社製）、プラー（ＰＮ−３：
成茂社製）、マイクロフォージ（ＭＦ−７９：成茂社
製）を使用しガラスキャピラリーチューブをプラーにて
引き切り、フッ化水素、シグマコート（シグマ社製，SI
GMACOAT SL-2) 及び蒸留水で洗浄後、マイクロフォージ
でマイクロマニピュレーターに装着した時に顕微鏡ステ
ージと水平にセットできるように先端部分を曲げた。
【００１４】ＤＮＡの注入：顕微鏡（ニコン社製 DIAPH
OTO-TMD300微分緩衝装置付）に装着したマイクロマニピ
ュレーター（成茂社製 MO-102/MO-103）を用いて、パラ
フィンオイルで覆った２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を
含むリン酸緩衝食塩水(phosphate buffered saline; Ｐ
ＢＳ）４０μｌ液滴中で前記受精卵を保定用キャピラリ
ーで保持しながら注入用ピペットで顕微注入を実施し
た。従来法によるＤＮＡ溶液の注入（S.Hochi et al.(1
990): Successful production of transgenic rats. A
nimal Biotechnology 1 ,175-184) は、挿入前に支持ピ
ペット、雄性前核、注入ピペットを一直線に配置し、注
入ピペットを透明帯から前核にまで一息に挿入してＤＮ
Ａ溶液の注入を行った。また、本方法による改良法で
は、一度支持ピペットで固定した前核期受精卵の前核膜
に注入ピペットの針先を圧し当て注入ピペットの挿入の
作動を一旦停止させた。次に、顕微鏡のステージを軽く
たたくことにより注入針先に微震動を与えて前核内へ注
入ピペットの針先を挿入してＤＮＡ溶液の注入を行っ
た。ＤＮＡ溶液の注入量は前核の膨化によりモニターし
て前核の膨化が飽和状態になるように設定した。また、
注入速度は数秒（５〜６秒）で膨化が飽和する様に設定
した。注入操作を終了した操作卵をｍＫＲＢ液に移して
５％ＣＯ2-９５％Ａｉｒ（３７℃）のＣＯ2-インキュベ
ーター内で培養した。
OTO-TMD300微分緩衝装置付）に装着したマイクロマニピ
ュレーター（成茂社製 MO-102/MO-103）を用いて、パラ
フィンオイルで覆った２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を
含むリン酸緩衝食塩水(phosphate buffered saline; Ｐ
ＢＳ）４０μｌ液滴中で前記受精卵を保定用キャピラリ
ーで保持しながら注入用ピペットで顕微注入を実施し
た。従来法によるＤＮＡ溶液の注入（S.Hochi et al.(1
990): Successful production of transgenic rats. A
nimal Biotechnology 1 ,175-184) は、挿入前に支持ピ
ペット、雄性前核、注入ピペットを一直線に配置し、注
入ピペットを透明帯から前核にまで一息に挿入してＤＮ
Ａ溶液の注入を行った。また、本方法による改良法で
は、一度支持ピペットで固定した前核期受精卵の前核膜
に注入ピペットの針先を圧し当て注入ピペットの挿入の
作動を一旦停止させた。次に、顕微鏡のステージを軽く
たたくことにより注入針先に微震動を与えて前核内へ注
入ピペットの針先を挿入してＤＮＡ溶液の注入を行っ
た。ＤＮＡ溶液の注入量は前核の膨化によりモニターし
て前核の膨化が飽和状態になるように設定した。また、
注入速度は数秒（５〜６秒）で膨化が飽和する様に設定
した。注入操作を終了した操作卵をｍＫＲＢ液に移して
５％ＣＯ2-９５％Ａｉｒ（３７℃）のＣＯ2-インキュベ
ーター内で培養した。
【００１５】(4) ＤＡＮ溶液の注入操作を施した前核期
受精卵の２４時間後の生存率の比較 上述のＤＮＡ溶液注入操作後ＣＯ2-インキュベーター内
で２４時間培養した注入操作を施した卵の生存数は顕微
鏡下で形態観察して求めた。変成していない１細胞期或
いは２細胞期にある卵を生存卵と判別して計数した。前
核期受精卵へのＤＮＡ溶液の注入操作を同一のＤＮＡ溶
液を用いて上記の本発明による注入方法と従来の注入方
法で実施した注入操作卵の２４時間後の生存率を求め
た。結果を表２に示す。
受精卵の２４時間後の生存率の比較 上述のＤＮＡ溶液注入操作後ＣＯ2-インキュベーター内
で２４時間培養した注入操作を施した卵の生存数は顕微
鏡下で形態観察して求めた。変成していない１細胞期或
いは２細胞期にある卵を生存卵と判別して計数した。前
核期受精卵へのＤＮＡ溶液の注入操作を同一のＤＮＡ溶
液を用いて上記の本発明による注入方法と従来の注入方
法で実施した注入操作卵の２４時間後の生存率を求め
た。結果を表２に示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】この結果、本発明法により、ＤＮＡ溶液注
入操作２４時間後の卵の生存率が約６３％から約８４％
に向上した。即ち、本発明方法は従来の顕微注入法に比
べ操作卵の生存率がいちじるしく向上した優れた方法で
あることを示す。
入操作２４時間後の卵の生存率が約６３％から約８４％
に向上した。即ち、本発明方法は従来の顕微注入法に比
べ操作卵の生存率がいちじるしく向上した優れた方法で
あることを示す。
【００１８】
【実施例２】ＤＮＡ溶液の前核期受精卵への注入操作後の操作卵の生
存率の比較 以下に示した種々のＤＮＡ溶液を使用し、実施例１に記
載した方法により前核期受精卵へのＤＮＡ溶液の注入を
行い、培養２４時間後の注入操作卵の生存率を本発明方
法と従来法とで比較した。αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−１，α
１ＣＮ／ＩＬ２−５は、実施例１に記載した方法と同様
の方法で作製した。作製したαＳ１ＣＮ／ＩＬ２−１の
遺伝子構造の概略を図６に、αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−５の
遺伝子構造の概略を図７に各々示す。ｂαＬＡ／ｈＧＨ
（T.Ninomiya et al. Mol ReprodDev 37, 276-283,(199
4) ）は、制限酵素HindIII とEcoRI の部分切断により
得られた目的遺伝子断片を実施例１に記載した方法に準
じて調製した。作製したｂαＬＡ／ｈＧＨの遺伝子構造
とそれを導入したプラスミドの概略を図８に示す。ま
た、αＳ１３３とαＳ１５８は、それぞれ制限酵素 Eco
R I およびHindIII と制限酵素 XbaI の制限酵素消化に
より目的遺伝子断片を切り出し例１に記載した方法（ヒト
0SF-2 cDNA構造の詳細は文献〔S.Takeshita al. Bioche
m. J. 294, 271-278 (1993), 特開平5-268982〕によ
る。）に準じて得られたＤＮＡ断片を作製した。作製し
たαＳ１３３の遺伝子構造とそれを導入したプラスミド
の構造の概略を図９に、αＳ１５８の遺伝子構造とそれ
を導入したプラスミドの構造の概略を図１０に各々示
す。
存率の比較 以下に示した種々のＤＮＡ溶液を使用し、実施例１に記
載した方法により前核期受精卵へのＤＮＡ溶液の注入を
行い、培養２４時間後の注入操作卵の生存率を本発明方
法と従来法とで比較した。αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−１，α
１ＣＮ／ＩＬ２−５は、実施例１に記載した方法と同様
の方法で作製した。作製したαＳ１ＣＮ／ＩＬ２−１の
遺伝子構造の概略を図６に、αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−５の
遺伝子構造の概略を図７に各々示す。ｂαＬＡ／ｈＧＨ
（T.Ninomiya et al. Mol ReprodDev 37, 276-283,(199
4) ）は、制限酵素HindIII とEcoRI の部分切断により
得られた目的遺伝子断片を実施例１に記載した方法に準
じて調製した。作製したｂαＬＡ／ｈＧＨの遺伝子構造
とそれを導入したプラスミドの概略を図８に示す。ま
た、αＳ１３３とαＳ１５８は、それぞれ制限酵素 Eco
R I およびHindIII と制限酵素 XbaI の制限酵素消化に
より目的遺伝子断片を切り出し例１に記載した方法（ヒト
0SF-2 cDNA構造の詳細は文献〔S.Takeshita al. Bioche
m. J. 294, 271-278 (1993), 特開平5-268982〕によ
る。）に準じて得られたＤＮＡ断片を作製した。作製し
たαＳ１３３の遺伝子構造とそれを導入したプラスミド
の構造の概略を図９に、αＳ１５８の遺伝子構造とそれ
を導入したプラスミドの構造の概略を図１０に各々示
す。
【００１９】実施例１と同様に、得られたＤＮＡ溶液を
従来法および本発明方法により前核期受精卵に注入し、
ＣＯ2 インキュベーター内で２４時間培養後の注入操作
した卵の生存率を求めた。結果を表３に示す。
従来法および本発明方法により前核期受精卵に注入し、
ＣＯ2 インキュベーター内で２４時間培養後の注入操作
した卵の生存率を求めた。結果を表３に示す。
【００２０】
【表３】
【００２１】この結果、本発明方法により、ＤＮＡ溶液
注入操作２４時間後の卵の生存率が約６４％から約８３
％に向上した。即ち、本発明方法によると従来の顕微注
入法に比べ操作卵の生存率がいちじるしく高まり本発明
方法が優れた方法であることを示す。
注入操作２４時間後の卵の生存率が約６４％から約８３
％に向上した。即ち、本発明方法によると従来の顕微注
入法に比べ操作卵の生存率がいちじるしく高まり本発明
方法が優れた方法であることを示す。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、前核期受精卵へのＤＮＡ
溶液の注入操作が卵に与える物理的損傷を最小限に止
め、操作卵の生存率を従来法と比較して飛躍的に高める
ことができる。従って、トランスジェニック動物個体の
作出効率を大幅に向上することができる。また、注入操
作を機械化して自動化することができ、多数の卵の前核
内にＤＮＡ溶液を注入することができる。
溶液の注入操作が卵に与える物理的損傷を最小限に止
め、操作卵の生存率を従来法と比較して飛躍的に高める
ことができる。従って、トランスジェニック動物個体の
作出効率を大幅に向上することができる。また、注入操
作を機械化して自動化することができ、多数の卵の前核
内にＤＮＡ溶液を注入することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】αＳ１ＣＮ／ｈＧＦの構造の概略を示す。
【図２】ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡの構造の概略を示す。
【図３】αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−２の構造の概略を示す。
【図４】αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−５の構造の概略を示す。
【図５】ｐＵＣ１２プラスミドと導入遺伝子の導入部位
の構造の概略を示す。
の構造の概略を示す。
【図６】αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−１の構造の概略を示す。
【図７】αＳ１ＣＮ／ＩＬ２−５の構造の概略を示す。
【図８】ｂαＬＡ／ｈＧＨを導入したプラスミドの構造
の概略を示す。
の概略を示す。
【図９】αＳ１３３の構造及びそれを導入したプラスミ
ドの構造の概略を示す。
ドの構造の概略を示す。
【図１０】αＳ１５８の構造及びそれを導入したプラス
ミドの構造の概略を示す。
ミドの構造の概略を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 前核期受精卵の前核内にＤＮＡを顕微注
入するに当り、該受精卵の核膜にＤＮＡを入れた注入ピ
ペットの針先を圧し当てた後、針先に微振動を与えるこ
とにより核膜を貫通させることを特徴とする、ＤＮＡの
顕微注入法。 - 【請求項２】 前核期受精卵がラットのものである、請
求項１記載の顕微注入法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7157037A JPH08322568A (ja) | 1995-05-31 | 1995-05-31 | Ｄｎａ顕微注入法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7157037A JPH08322568A (ja) | 1995-05-31 | 1995-05-31 | Ｄｎａ顕微注入法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322568A true JPH08322568A (ja) | 1996-12-10 |
Family
ID=15640820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7157037A Pending JPH08322568A (ja) | 1995-05-31 | 1995-05-31 | Ｄｎａ顕微注入法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08322568A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005002651A1 (ja) * | 2003-07-04 | 2005-01-13 | Japan As Represented By President Of National Cardiovascular Center | 生体組織への細胞注入方法および装置 |
| WO2007004407A1 (ja) * | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Fujio Miyawaki | 振動型マイクロインジェクション装置 |
| US8426205B2 (en) | 1999-07-30 | 2013-04-23 | Collectricon AB | Method for selective electrofusion of at least two fusion partners having cell-like membranes |
| JP2016086645A (ja) * | 2014-10-29 | 2016-05-23 | 国立大学法人広島大学 | ナノピペット及びその作製方法 |
-
1995
- 1995-05-31 JP JP7157037A patent/JPH08322568A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8426205B2 (en) | 1999-07-30 | 2013-04-23 | Collectricon AB | Method for selective electrofusion of at least two fusion partners having cell-like membranes |
| WO2005002651A1 (ja) * | 2003-07-04 | 2005-01-13 | Japan As Represented By President Of National Cardiovascular Center | 生体組織への細胞注入方法および装置 |
| KR101141568B1 (ko) * | 2003-07-04 | 2012-05-15 | 코쿠리츠쥰칸키뵤우센타 소우쵸우가다이효우스루 니혼코쿠 | 생체조직에 대한 세포 주입방법 및 장치 |
| US8323881B2 (en) | 2003-07-04 | 2012-12-04 | Japan As Represented By President Of National Cardiovascular Center | Method of cell injection into biotissue and apparatus therefor |
| WO2007004407A1 (ja) * | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Fujio Miyawaki | 振動型マイクロインジェクション装置 |
| JP2007006775A (ja) * | 2005-06-30 | 2007-01-18 | Fujio Miyawaki | 振動型マイクロインジェクション装置 |
| JP4652906B2 (ja) * | 2005-06-30 | 2011-03-16 | 富士夫 宮脇 | 振動型マイクロインジェクション装置 |
| US8198072B2 (en) | 2005-06-30 | 2012-06-12 | Fujio Miyawaki | Vibration type microinjection device |
| JP2016086645A (ja) * | 2014-10-29 | 2016-05-23 | 国立大学法人広島大学 | ナノピペット及びその作製方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050112 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050512 |