JPH1179A - Ｇａｓ６遺伝子改変マウス - Google Patents
Ｇａｓ６遺伝子改変マウスInfo
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】Ｇａｓ６遺伝子が改変されたマウスを作製し
て、その生理機能の変化を解析することによって、Ｇａ
ｓ６の生理的な役割を直接明らかにすることを可能にす
るとともに、同時に、Ｇａｓ６の関与する種々の病態の
解明あるいは治療法の研究のために、遺伝的背景の明確
な動物モデルを提供すること。 【解決手段】Ｇａｓ６蛋白質を発現しないようにＧａｓ
６遺伝子が改変されたマウス。
て、その生理機能の変化を解析することによって、Ｇａ
ｓ６の生理的な役割を直接明らかにすることを可能にす
るとともに、同時に、Ｇａｓ６の関与する種々の病態の
解明あるいは治療法の研究のために、遺伝的背景の明確
な動物モデルを提供すること。 【解決手段】Ｇａｓ６蛋白質を発現しないようにＧａｓ
６遺伝子が改変されたマウス。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｇａｓ６遺伝子改
変マウスに関する。さらに詳しくは、Ｇａｓ６蛋白質が
発現されないようにＧａｓ６遺伝子が改変されたマウス
に関する。
変マウスに関する。さらに詳しくは、Ｇａｓ６蛋白質が
発現されないようにＧａｓ６遺伝子が改変されたマウス
に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｇａｓ６は、細胞の増殖が停止した時に
特異的に発現が亢進する遺伝子の産物として発見された
ものである(Manfioletti, G. et al., Mol. Cell. Bio
l., 13,4976-4985(1993)) 。Ｇａｓ６がどのような生物
活性を有するのかは明らかにされていなかったが、本発
明者らにより、血管平滑筋細胞の増殖を促進する蛋白質
として血管平滑筋細胞の培養液から精製された蛋白質が
Ｇａｓ６そのものであったことから、Ｇａｓ６の生物活
性の一つは、細胞の増殖促進であることが判明した(Nak
ano, T. et al., J. Biol. Chem., 270, 5702-5705(199
5)) 。さらに、Ｇａｓ６は、血管平滑筋細胞の細胞死を
防ぐ活性をも有する(Nakano, T. et al.,FEBS Lett., 3
87, 78-80(1996)) 。一方、Ｇａｓ６は、チロシンキナ
ーゼ型のレセプターであるAxl 、Sky などのリガンドで
あることが明らかにされ、Ｇａｓ６の生物活性はおそら
くこれらのレセプターを介しているものと予想されてい
る(Varnum, B.C. et al., Nature, 373, 623-626; Ohas
hi, K. et al., J. Biol. Chem., 270, 22681-22684(19
95))。
特異的に発現が亢進する遺伝子の産物として発見された
ものである(Manfioletti, G. et al., Mol. Cell. Bio
l., 13,4976-4985(1993)) 。Ｇａｓ６がどのような生物
活性を有するのかは明らかにされていなかったが、本発
明者らにより、血管平滑筋細胞の増殖を促進する蛋白質
として血管平滑筋細胞の培養液から精製された蛋白質が
Ｇａｓ６そのものであったことから、Ｇａｓ６の生物活
性の一つは、細胞の増殖促進であることが判明した(Nak
ano, T. et al., J. Biol. Chem., 270, 5702-5705(199
5)) 。さらに、Ｇａｓ６は、血管平滑筋細胞の細胞死を
防ぐ活性をも有する(Nakano, T. et al.,FEBS Lett., 3
87, 78-80(1996)) 。一方、Ｇａｓ６は、チロシンキナ
ーゼ型のレセプターであるAxl 、Sky などのリガンドで
あることが明らかにされ、Ｇａｓ６の生物活性はおそら
くこれらのレセプターを介しているものと予想されてい
る(Varnum, B.C. et al., Nature, 373, 623-626; Ohas
hi, K. et al., J. Biol. Chem., 270, 22681-22684(19
95))。
【０００３】Ｇａｓ６は、血管平滑筋以外にも多くの組
織で発現していることが明らかにされており、レセプタ
ーであるAxl 、Sky に関してもSky が脳に特異的に、Ax
l がその他の多くの組織で発現していることが知られて
いる。従って、Ｇａｓ６は、血管以外の組織でも重要な
生理作用を有することが予想されているが、Ｇａｓ６の
生物活性については、前記したように未だ限られた情報
しかなく、生体の機能維持にどのように関与しているか
は解明されていない。また、このような生理機能の解明
に必要な、Ｇａｓ６遺伝子が改変された哺乳動物は知ら
れていない。
織で発現していることが明らかにされており、レセプタ
ーであるAxl 、Sky に関してもSky が脳に特異的に、Ax
l がその他の多くの組織で発現していることが知られて
いる。従って、Ｇａｓ６は、血管以外の組織でも重要な
生理作用を有することが予想されているが、Ｇａｓ６の
生物活性については、前記したように未だ限られた情報
しかなく、生体の機能維持にどのように関与しているか
は解明されていない。また、このような生理機能の解明
に必要な、Ｇａｓ６遺伝子が改変された哺乳動物は知ら
れていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、Ｇａｓ６遺伝子が改変
されたマウスを作製して、その生理機能の変化を解析す
ることによって、Ｇａｓ６の生理的な役割を直接明らか
にすることを可能にするとともに、同時に、Ｇａｓ６の
関与する種々の病態の解明あるいは治療法の研究のため
に、遺伝的背景の明確な動物モデルを提供することを目
的とする。
術に鑑みてなされたものであり、Ｇａｓ６遺伝子が改変
されたマウスを作製して、その生理機能の変化を解析す
ることによって、Ｇａｓ６の生理的な役割を直接明らか
にすることを可能にするとともに、同時に、Ｇａｓ６の
関与する種々の病態の解明あるいは治療法の研究のため
に、遺伝的背景の明確な動物モデルを提供することを目
的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、（１） Ｇａｓ６蛋白質を発現しないようにＧａｓ
６遺伝子が改変されたマウス、（２） Ｇａｓ６遺伝子
の領域内に他の遺伝子が挿入されることによりＧａｓ６
遺伝子が改変された前記（１）記載のマウス、（３）
他の遺伝子が選択マーカー遺伝子である前記（２）記載
のマウス、（４） Ｇａｓ６遺伝子の第１エキソンおよ
び第２エキソンを含む領域をネオマイシン耐性遺伝子と
置換することにより、該ネオマイシン耐性遺伝子がＧａ
ｓ６遺伝子の領域内に挿入されている、前記（１）〜
（３）いずれか記載のマウス、に関する。
は、（１） Ｇａｓ６蛋白質を発現しないようにＧａｓ
６遺伝子が改変されたマウス、（２） Ｇａｓ６遺伝子
の領域内に他の遺伝子が挿入されることによりＧａｓ６
遺伝子が改変された前記（１）記載のマウス、（３）
他の遺伝子が選択マーカー遺伝子である前記（２）記載
のマウス、（４） Ｇａｓ６遺伝子の第１エキソンおよ
び第２エキソンを含む領域をネオマイシン耐性遺伝子と
置換することにより、該ネオマイシン耐性遺伝子がＧａ
ｓ６遺伝子の領域内に挿入されている、前記（１）〜
（３）いずれか記載のマウス、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明において、マウスとは、Ｇ
ａｓ６蛋白質を発現しないようにＧａｓ６遺伝子が改変
されたマウスであればいかなるマウスであっても本発明
の範疇に含まれる。
ａｓ６蛋白質を発現しないようにＧａｓ６遺伝子が改変
されたマウスであればいかなるマウスであっても本発明
の範疇に含まれる。
【０００７】本発明のＧａｓ６遺伝子は、マウス由来の
遺伝子であり、マウスゲノミックＤＮＡが好ましい。ゲ
ノミックＤＮＡは、プロモーター領域、エキソン領域お
よびイントロン領域等を含む。
遺伝子であり、マウスゲノミックＤＮＡが好ましい。ゲ
ノミックＤＮＡは、プロモーター領域、エキソン領域お
よびイントロン領域等を含む。
【０００８】本発明において、「Ｇａｓ６遺伝子が改変
された」とは、前記Ｇａｓ６遺伝子の塩基配列におい
て、１または複数の塩基に、置換、欠失、挿入または付
加の変異を導入することにより、Ｇａｓ６遺伝子が検出
されないことまたはＧａｓ６蛋白質が発現されないこと
をいう。
された」とは、前記Ｇａｓ６遺伝子の塩基配列におい
て、１または複数の塩基に、置換、欠失、挿入または付
加の変異を導入することにより、Ｇａｓ６遺伝子が検出
されないことまたはＧａｓ６蛋白質が発現されないこと
をいう。
【０００９】前記Ｇａｓ６遺伝子が検出されないこと
は、例えば、ＰＣＲ法、後述の実施例４に記載のサザン
ブロッティング法により確認することができる。前記Ｇ
ａｓ６蛋白質が発現されないことは、例えば、後述の試
験例１に記載のように、ウエスタンブロッティング法に
より確認することができる。
は、例えば、ＰＣＲ法、後述の実施例４に記載のサザン
ブロッティング法により確認することができる。前記Ｇ
ａｓ６蛋白質が発現されないことは、例えば、後述の試
験例１に記載のように、ウエスタンブロッティング法に
より確認することができる。
【００１０】本発明においては、Ｇａｓ６遺伝子の領域
内に、他の遺伝子が挿入されることにより、Ｇａｓ６遺
伝子が改変されたマウスが好ましく、スクリーニングの
容易さの点から、選択マーカー遺伝子が挿入されること
により、Ｇａｓ６遺伝子が改変されたマウスがさらに好
ましい。
内に、他の遺伝子が挿入されることにより、Ｇａｓ６遺
伝子が改変されたマウスが好ましく、スクリーニングの
容易さの点から、選択マーカー遺伝子が挿入されること
により、Ｇａｓ６遺伝子が改変されたマウスがさらに好
ましい。
【００１１】前記選択マーカー遺伝子としては、ネオマ
イシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アン
ピシリン耐性遺伝子等のポジティブ選択マーカー遺伝子
が挙げられるが、選択マーカー遺伝子を含む相同組換え
用構築物が導入されるマウス胚性幹細胞をスクリーニン
グする観点から、ネオマイシン耐性遺伝子が好ましい。
ネオマイシン耐性遺伝子は、ｐＭＣ１ｎｅｏ（STRATAGE
NE社製) 等の市販のプラスミドから適宜制限酵素等によ
り切り出して用いることができる。
イシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アン
ピシリン耐性遺伝子等のポジティブ選択マーカー遺伝子
が挙げられるが、選択マーカー遺伝子を含む相同組換え
用構築物が導入されるマウス胚性幹細胞をスクリーニン
グする観点から、ネオマイシン耐性遺伝子が好ましい。
ネオマイシン耐性遺伝子は、ｐＭＣ１ｎｅｏ（STRATAGE
NE社製) 等の市販のプラスミドから適宜制限酵素等によ
り切り出して用いることができる。
【００１２】本発明においては、前記ポジティブ選択マ
ーカー遺伝子に加えて、ジフテリア毒素A フラグメント
遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子
等のネガティブ選択マーカー遺伝子を所望の相同組換え
部位の３’側に導入してもよい。そうすることによっ
て、所望の相同組換え体のスクリーニングが容易にな
る。
ーカー遺伝子に加えて、ジフテリア毒素A フラグメント
遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子
等のネガティブ選択マーカー遺伝子を所望の相同組換え
部位の３’側に導入してもよい。そうすることによっ
て、所望の相同組換え体のスクリーニングが容易にな
る。
【００１３】さらに、本発明においては、相同組換えに
より別の転写産物が生じるのを避けるため、Ｇａｓ６遺
伝子の第１エキソンおよび第２エキソンを含む領域をネ
オマイシン耐性遺伝子と置換することにより、該ネオマ
イシン耐性遺伝子がＧａｓ６遺伝子の領域内に挿入され
ているマウスが特に好ましい。
より別の転写産物が生じるのを避けるため、Ｇａｓ６遺
伝子の第１エキソンおよび第２エキソンを含む領域をネ
オマイシン耐性遺伝子と置換することにより、該ネオマ
イシン耐性遺伝子がＧａｓ６遺伝子の領域内に挿入され
ているマウスが特に好ましい。
【００１４】前記Ｇａｓ６遺伝子の第１エキソンおよび
第２エキソンを含む領域とネオマイシン耐性遺伝子との
置換は、例えば、相同組換えにより行なうことができ
る。
第２エキソンを含む領域とネオマイシン耐性遺伝子との
置換は、例えば、相同組換えにより行なうことができ
る。
【００１５】以下に、相同組換えによる本発明のマウス
の作製方法を具体的に説明する。 １）マウスＧａｓ６遺伝子の相同組換え用構築物の作製 Ｇａｓ６遺伝子を人為的に改変させたマウスを得るため
には、Ｇａｓ６遺伝子をクローニングし、Ｇａｓ６遺伝
子の塩基配列に前記したような変異を導入した相同組換
え用構築物を用いる相同組換えを行なう。Ｇａｓ６遺伝
子のクローニングは、例えばマウス肝臓からゲノミック
ＤＮＡを抽出し、常法に従ってＤＮＡライブラリーを作
製し、これをすでにクローニングされているマウスＧａ
ｓ６ＤＮＡ、たとえば cＤＮＡ(Manfioletti, G. et a
l., Mol. Cell. Biol., 13, 4976-4985(1993)) を用い
てスクリーニングすればよい。
の作製方法を具体的に説明する。 １）マウスＧａｓ６遺伝子の相同組換え用構築物の作製 Ｇａｓ６遺伝子を人為的に改変させたマウスを得るため
には、Ｇａｓ６遺伝子をクローニングし、Ｇａｓ６遺伝
子の塩基配列に前記したような変異を導入した相同組換
え用構築物を用いる相同組換えを行なう。Ｇａｓ６遺伝
子のクローニングは、例えばマウス肝臓からゲノミック
ＤＮＡを抽出し、常法に従ってＤＮＡライブラリーを作
製し、これをすでにクローニングされているマウスＧａ
ｓ６ＤＮＡ、たとえば cＤＮＡ(Manfioletti, G. et a
l., Mol. Cell. Biol., 13, 4976-4985(1993)) を用い
てスクリーニングすればよい。
【００１６】Ｇａｓ６遺伝子を改変させるためには、前
記したように、Ｇａｓ６遺伝子領域内のいずれかの部位
を欠失させてもよく、あるいはいずれかの部位に他の遺
伝子を挿入させてもよい。他の遺伝子を挿入させる場
合、Ｇａｓ６遺伝子の改変および相同組換えを検出する
ために、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子(G418 耐
性により選択) およびジフテリア毒素A フラグメント遺
伝子を用いる。これらの遺伝子の挿入は、試験管内で常
用のＤＮＡ組換え技法により行うことができる。
記したように、Ｇａｓ６遺伝子領域内のいずれかの部位
を欠失させてもよく、あるいはいずれかの部位に他の遺
伝子を挿入させてもよい。他の遺伝子を挿入させる場
合、Ｇａｓ６遺伝子の改変および相同組換えを検出する
ために、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子(G418 耐
性により選択) およびジフテリア毒素A フラグメント遺
伝子を用いる。これらの遺伝子の挿入は、試験管内で常
用のＤＮＡ組換え技法により行うことができる。
【００１７】より具体的には、マウスゲノミックＤＮＡ
ライブラリーをＧａｓ６ cＤＮＡ断片をプローブとして
ハイブリダイズさせることによって、陽性クローンを得
る。かかるクローンからＤＮＡを単離し、制限酵素で消
化して特定のエキソンを含むゲノミックＤＮＡをサブク
ローニングする。次いで、Ｇａｓ６遺伝子の構造を改変
しかつポジティブ／ネガティブセレクションを行うため
に、ネオマイシン耐性遺伝子およびジフテリア毒素A フ
ラグメント遺伝子を挿入した構築物を作製して相同組換
え用構築物（以下、相同組換え用ＤＮＡともいう）とし
て用いる（図１Ｂ）。
ライブラリーをＧａｓ６ cＤＮＡ断片をプローブとして
ハイブリダイズさせることによって、陽性クローンを得
る。かかるクローンからＤＮＡを単離し、制限酵素で消
化して特定のエキソンを含むゲノミックＤＮＡをサブク
ローニングする。次いで、Ｇａｓ６遺伝子の構造を改変
しかつポジティブ／ネガティブセレクションを行うため
に、ネオマイシン耐性遺伝子およびジフテリア毒素A フ
ラグメント遺伝子を挿入した構築物を作製して相同組換
え用構築物（以下、相同組換え用ＤＮＡともいう）とし
て用いる（図１Ｂ）。
【００１８】２）相同組換えによる胚性幹細胞でのＧａ
ｓ６遺伝子変異 次に、得られた相同組換え用ＤＮＡをマウス胚性幹細胞
(ES細胞) に導入し、ES細胞中のＧａｓ６遺伝子と相同
組換えを行う。ES細胞は株化されたものであり、多分化
能を保持し、しかも培養細胞として維持、継代が可能な
細胞である。相同組換え用ＤＮＡの導入は、たとえば常
用のエレクトロポレーションにより行うことができる。
この相同組換えにおいては、胚性幹細胞内のＧａｓ６遺
伝子のＤＮＡと相同組換え用ＤＮＡの対応する領域との
間で組換えが生じ、相同組換え用ＤＮＡ中に挿入されて
いたネオマイシン耐性遺伝子が胚性幹細胞のゲノムＧａ
ｓ６遺伝子に挿入される。この結果、胚性幹細胞はＧａ
ｓ６遺伝子を欠失し、同時にマーカー遺伝子を得る。な
お、ジフテリア毒素A フラグメント遺伝子まで挿入され
た組み換え体は、発現したジフテリア毒素A により細胞
死を起こして排除される。
ｓ６遺伝子変異 次に、得られた相同組換え用ＤＮＡをマウス胚性幹細胞
(ES細胞) に導入し、ES細胞中のＧａｓ６遺伝子と相同
組換えを行う。ES細胞は株化されたものであり、多分化
能を保持し、しかも培養細胞として維持、継代が可能な
細胞である。相同組換え用ＤＮＡの導入は、たとえば常
用のエレクトロポレーションにより行うことができる。
この相同組換えにおいては、胚性幹細胞内のＧａｓ６遺
伝子のＤＮＡと相同組換え用ＤＮＡの対応する領域との
間で組換えが生じ、相同組換え用ＤＮＡ中に挿入されて
いたネオマイシン耐性遺伝子が胚性幹細胞のゲノムＧａ
ｓ６遺伝子に挿入される。この結果、胚性幹細胞はＧａ
ｓ６遺伝子を欠失し、同時にマーカー遺伝子を得る。な
お、ジフテリア毒素A フラグメント遺伝子まで挿入され
た組み換え体は、発現したジフテリア毒素A により細胞
死を起こして排除される。
【００１９】より具体的には、相同組換え用構築物を胚
性幹細胞を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS) に懸濁し、
エレクトロポレーションを行なう。次いで、G418で選択
培養を行なう。G418耐性コロニーについては、サザンブ
ロットにより相同組換え体の確認を行なう。
性幹細胞を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS) に懸濁し、
エレクトロポレーションを行なう。次いで、G418で選択
培養を行なう。G418耐性コロニーについては、サザンブ
ロットにより相同組換え体の確認を行なう。
【００２０】３）Ｇａｓ６遺伝子変異胚性幹細胞による
キメラマウスの作製 次に、相同組換えにより得られた胚性幹細胞をマウスの
胚盤胞に注入し、さらに偽妊娠マウスの子宮角に移植し
て産仔を得る。さらに、得られたキメラマウスを適当な
系統のマウスと交配することにより産仔を得る。キメラ
マウスの生殖細胞が相同組換え体（Ｇａｓ６遺伝子が破
壊されている) に由来すればＧａｓ６遺伝子が改変され
たマウスを得ることができる。
キメラマウスの作製 次に、相同組換えにより得られた胚性幹細胞をマウスの
胚盤胞に注入し、さらに偽妊娠マウスの子宮角に移植し
て産仔を得る。さらに、得られたキメラマウスを適当な
系統のマウスと交配することにより産仔を得る。キメラ
マウスの生殖細胞が相同組換え体（Ｇａｓ６遺伝子が破
壊されている) に由来すればＧａｓ６遺伝子が改変され
たマウスを得ることができる。
【００２１】４）ホモ変異マウスの作製 移植によって得られたキメラマウスを、目的とする系統
のマウスと交配させ産仔を得る。キメラマウスの生殖細
胞が胚性幹細胞に由来しているか、交配マウスの系統に
由来しているかは、得られた産仔の適当な特質によって
決定できる。Ｇａｓ６遺伝子のヘテロ変異マウス同士を
交配し、産仔のＧａｓ６遺伝子をサザンブロットによっ
て確認し、目的物であるＧａｓ６遺伝子ホモ変異マウ
ス、即ちＧａｓ６遺伝子が改変されたマウスを得る。
のマウスと交配させ産仔を得る。キメラマウスの生殖細
胞が胚性幹細胞に由来しているか、交配マウスの系統に
由来しているかは、得られた産仔の適当な特質によって
決定できる。Ｇａｓ６遺伝子のヘテロ変異マウス同士を
交配し、産仔のＧａｓ６遺伝子をサザンブロットによっ
て確認し、目的物であるＧａｓ６遺伝子ホモ変異マウ
ス、即ちＧａｓ６遺伝子が改変されたマウスを得る。
【００２２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、これらは本発明の限定を意図するものでは
ない。
説明するが、これらは本発明の限定を意図するものでは
ない。
【００２３】実施例１ Ｇａｓ６遺伝子DNA の相同組換え用構築物の作製 129SVJ系マウス肝臓のゲノミックＤＮＡライブラリー
(STRATAGENE) から、マウスＧａｓ６の Gla（γ−カル
ボキシグルタミン酸）ドメインをコードする領域を含む
約170 bpのcDNAの部分配列をプローブとして用い、マウ
スＧａｓ６遺伝子の第１エキソン及び第２エキソンを含
むクローンを単離した（図１Ａ）。次いで、Ｇａｓ６遺
伝子の構造を破壊し、ポジティブ、ネガティブセレクシ
ョンを行うために、ネオマイシン耐性遺伝子およびジフ
テリア毒素A フラグメント遺伝子を用いて構築物を作製
した（図１Ｂ）。より具体的には、EcoRI-EcoRI 断片
（3.0kb, 第１エキソンの5'側）とBamHI-BamHI （3.5k
b,第２エキソンの3'側）を相同領域として用い、ネオマ
イシン耐性遺伝子とジフテリア毒素A フラグメント遺伝
子（京都大学、糸原博士より分与）を選択マーカーとし
て相同組換え用構築物を作製した。相同組換えが起こっ
た場合には、マウスＧａｓ６第１エキソン及び第２エキ
ソンを含むEcoRI-BamHI 領域（1.6 kb）がネオマイシン
耐性遺伝子（1.8kb ）に置き換わることになる。
(STRATAGENE) から、マウスＧａｓ６の Gla（γ−カル
ボキシグルタミン酸）ドメインをコードする領域を含む
約170 bpのcDNAの部分配列をプローブとして用い、マウ
スＧａｓ６遺伝子の第１エキソン及び第２エキソンを含
むクローンを単離した（図１Ａ）。次いで、Ｇａｓ６遺
伝子の構造を破壊し、ポジティブ、ネガティブセレクシ
ョンを行うために、ネオマイシン耐性遺伝子およびジフ
テリア毒素A フラグメント遺伝子を用いて構築物を作製
した（図１Ｂ）。より具体的には、EcoRI-EcoRI 断片
（3.0kb, 第１エキソンの5'側）とBamHI-BamHI （3.5k
b,第２エキソンの3'側）を相同領域として用い、ネオマ
イシン耐性遺伝子とジフテリア毒素A フラグメント遺伝
子（京都大学、糸原博士より分与）を選択マーカーとし
て相同組換え用構築物を作製した。相同組換えが起こっ
た場合には、マウスＧａｓ６第１エキソン及び第２エキ
ソンを含むEcoRI-BamHI 領域（1.6 kb）がネオマイシン
耐性遺伝子（1.8kb ）に置き換わることになる。
【００２４】実施例２ 相同組換えによるES細胞のＧａｓ６遺伝子の変異 １）ES細胞の調製およびその培養方法 実施例１により調製したマウスＧａｓ６遺伝子DNA の相
同組換え用構築物を導入する細胞として、マウス胚性幹
細胞（ES細胞）129/SVJ 系マウス胚盤胞由来のE14 株
（Hooper, M. L. et al., Nature, 326, 292(1987)）を
用いた。E14 株の培養には、ダルベッコ改変イーグル培
地 (D-MEM, 12800-066 GIBCO) に15% 牛胎児血清 (FC
S)、0.1 mMの2-メルカプトエタノール、核酸混合液、非
必須アミノ酸溶液（Gibco ）、L-グルタミン、ペニシリ
ン／ストレプトマイシン、および103units/mlのLIF (AM
RAD) を添加した培養液 (ES培地) を用いた。
同組換え用構築物を導入する細胞として、マウス胚性幹
細胞（ES細胞）129/SVJ 系マウス胚盤胞由来のE14 株
（Hooper, M. L. et al., Nature, 326, 292(1987)）を
用いた。E14 株の培養には、ダルベッコ改変イーグル培
地 (D-MEM, 12800-066 GIBCO) に15% 牛胎児血清 (FC
S)、0.1 mMの2-メルカプトエタノール、核酸混合液、非
必須アミノ酸溶液（Gibco ）、L-グルタミン、ペニシリ
ン／ストレプトマイシン、および103units/mlのLIF (AM
RAD) を添加した培養液 (ES培地) を用いた。
【００２５】また、E14 株のフィーダー細胞として用い
るマウス胎児線維芽細胞の培養には、D-MEM に10% FCS
、L-グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシ
ンを添加した培地 (EF培地) を用いた。マウス胎児線維
芽細胞の調製および培養は、以下の通りに行った。胎齢
10〜14日のC57BL/6J系マウスの胎児を無菌的に採取し、
PBS で洗浄後、頭および内臓を除いた組織をハサミを用
いて細切した。次いで、0.05% トリプシンおよび0.02%
EDTAを含む溶液（TE溶液、Gibco)で処理して細胞浮遊液
を得た。細胞浮遊液はナイロンメッシュを通して細胞塊
や組織片を除いた後に1500 rpmで5 分間遠心分離後、上
清を除去し、30 ml のEF培地に懸濁し、175 mlの培養用
フラスコで培養を行った。3 〜4 日間隔で継代を行い、
継代が3 代目の細胞を以下の様にマイトマイシンC で処
理し、フィーダー細胞として用いた。
るマウス胎児線維芽細胞の培養には、D-MEM に10% FCS
、L-グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシ
ンを添加した培地 (EF培地) を用いた。マウス胎児線維
芽細胞の調製および培養は、以下の通りに行った。胎齢
10〜14日のC57BL/6J系マウスの胎児を無菌的に採取し、
PBS で洗浄後、頭および内臓を除いた組織をハサミを用
いて細切した。次いで、0.05% トリプシンおよび0.02%
EDTAを含む溶液（TE溶液、Gibco)で処理して細胞浮遊液
を得た。細胞浮遊液はナイロンメッシュを通して細胞塊
や組織片を除いた後に1500 rpmで5 分間遠心分離後、上
清を除去し、30 ml のEF培地に懸濁し、175 mlの培養用
フラスコで培養を行った。3 〜4 日間隔で継代を行い、
継代が3 代目の細胞を以下の様にマイトマイシンC で処
理し、フィーダー細胞として用いた。
【００２６】コンフルエント状態に達したマウス胎児線
維芽細胞を10μg/mlのマイトマイシンC で２時間処理
し、EF培地で3 回洗浄した後に、TE溶液で処理して細胞
を剥離した。次いで、遠心分離後、細胞をEF培地に再懸
濁させ、ゼラチンでコートしたフラスコ、シャーレある
いはマイクロプレート上に、2 〜4 x 104 cells/cm2 と
なるように分注した。
維芽細胞を10μg/mlのマイトマイシンC で２時間処理
し、EF培地で3 回洗浄した後に、TE溶液で処理して細胞
を剥離した。次いで、遠心分離後、細胞をEF培地に再懸
濁させ、ゼラチンでコートしたフラスコ、シャーレある
いはマイクロプレート上に、2 〜4 x 104 cells/cm2 と
なるように分注した。
【００２７】E14 株の継代は、37℃で5 分間、TE溶液で
処理後、ピペッティングによって単一細胞にまで分散さ
せ、フィーダー細胞層上に播種することにより行った。
培養液は12時間の間隔で交換した。
処理後、ピペッティングによって単一細胞にまで分散さ
せ、フィーダー細胞層上に播種することにより行った。
培養液は12時間の間隔で交換した。
【００２８】２）相同組換えによるES細胞のＧａｓ６遺
伝子の変異 制限酵素Not I により線状化した相同組換え用ＤＮＡ30
μｇをE14 株2.3 〜2.5 x 106 個を含むPBS に懸濁し、
0.8 V, 3 mF の条件でエレクトロポレーション法により
遺伝子導入を行った。導入後、125 μg/ml G418 (Genet
isin, Sigma)を含むES培地で選択培養を行った。 G418
耐性コロニーについては、遺伝子導入約150 時間後か
ら、マイクロピペットを用いて20μl のTE溶液を含む96
穴のマイクロプレート (Corning,25850)に移し換え、数
分間処理し、さらにピペッティングにより細胞を分散さ
せた後、200 μl のES培地を含む96穴マイクロプレート
に移し換え、培養を継続した。
伝子の変異 制限酵素Not I により線状化した相同組換え用ＤＮＡ30
μｇをE14 株2.3 〜2.5 x 106 個を含むPBS に懸濁し、
0.8 V, 3 mF の条件でエレクトロポレーション法により
遺伝子導入を行った。導入後、125 μg/ml G418 (Genet
isin, Sigma)を含むES培地で選択培養を行った。 G418
耐性コロニーについては、遺伝子導入約150 時間後か
ら、マイクロピペットを用いて20μl のTE溶液を含む96
穴のマイクロプレート (Corning,25850)に移し換え、数
分間処理し、さらにピペッティングにより細胞を分散さ
せた後、200 μl のES培地を含む96穴マイクロプレート
に移し換え、培養を継続した。
【００２９】96穴のマイクロプレート上の細胞がコンフ
ルエントに達した段階で、TE処理後、順次、24穴のマイ
クロプレート (IWAKI,3820-024) に移し換えて培養し、
細胞の増殖を図った。なお、ES細胞の培養は、すべてフ
ィーダー細胞上で行った。
ルエントに達した段階で、TE処理後、順次、24穴のマイ
クロプレート (IWAKI,3820-024) に移し換えて培養し、
細胞の増殖を図った。なお、ES細胞の培養は、すべてフ
ィーダー細胞上で行った。
【００３０】３）相同組換え体の確認 相同組換え体の確認は、サザンブロットによって以下の
通りに行った。G418耐性細胞からゲノミックＤＮＡを抽
出し、２種類の制限酵素とプローブを用いて、3'および
5'側の組換えを確認した。3'側の確認は、ゲノミックＤ
ＮＡを制限酵素EcoRV で消化後、BamHI-Hind III断片
(0.8 kb)をプローブとして行った。相同組換え体および
野生型の確認は、それぞれ8.0 kbおよび約23 kb のバン
ドの検出により行った。この方法により相同組換え体と
して検出された細胞は、さらに5'側の組換えについて確
認した。5'側の確認はゲノミックＤＮＡを制限酵素Hind
IIIで消化後、Hind III-EcoRI断片(0.5 kb)をプローブ
として行った。相同組換え体および野生型の確認は、そ
れぞれ5.3 kbおよび3.9 kbのバンドの検出により行っ
た。相同組換え体のコロニー数は、G418耐性コロニー47
6 個のうち9 個であった。
通りに行った。G418耐性細胞からゲノミックＤＮＡを抽
出し、２種類の制限酵素とプローブを用いて、3'および
5'側の組換えを確認した。3'側の確認は、ゲノミックＤ
ＮＡを制限酵素EcoRV で消化後、BamHI-Hind III断片
(0.8 kb)をプローブとして行った。相同組換え体および
野生型の確認は、それぞれ8.0 kbおよび約23 kb のバン
ドの検出により行った。この方法により相同組換え体と
して検出された細胞は、さらに5'側の組換えについて確
認した。5'側の確認はゲノミックＤＮＡを制限酵素Hind
IIIで消化後、Hind III-EcoRI断片(0.5 kb)をプローブ
として行った。相同組換え体および野生型の確認は、そ
れぞれ5.3 kbおよび3.9 kbのバンドの検出により行っ
た。相同組換え体のコロニー数は、G418耐性コロニー47
6 個のうち9 個であった。
【００３１】以上、実施例１および２により作製した相
同組換え体の作製模式図を図１に示す。図１ＡはＧａｓ
６遺伝子を示す。点線内の拡大された領域に第１エキソ
ンおよび第２エキソンを示し、かかる領域内の実線はイ
ントロンを示す。第１エキソン中のATG は開始コドンの
位置を示す。プローブとしてサザンブロット解析用の5'
プローブ（Hind III-EcoRI ゲノムＤＮＡ断片（0.5 k
b））および3'プローブ（BamHI-Hind III ゲノムＤＮ
Ａ断片（0.8 kb））を示す。
同組換え体の作製模式図を図１に示す。図１ＡはＧａｓ
６遺伝子を示す。点線内の拡大された領域に第１エキソ
ンおよび第２エキソンを示し、かかる領域内の実線はイ
ントロンを示す。第１エキソン中のATG は開始コドンの
位置を示す。プローブとしてサザンブロット解析用の5'
プローブ（Hind III-EcoRI ゲノムＤＮＡ断片（0.5 k
b））および3'プローブ（BamHI-Hind III ゲノムＤＮ
Ａ断片（0.8 kb））を示す。
【００３２】図１ＢはマウスＧａｓ６遺伝子相同組換え
用構築物を示す。ネオマイシン耐性遺伝子(pgk-neor )
、およびジフテリア毒素A フラグメント遺伝子（DT-
A）をボックスで示している。実線は相同領域を示す。
用構築物を示す。ネオマイシン耐性遺伝子(pgk-neor )
、およびジフテリア毒素A フラグメント遺伝子（DT-
A）をボックスで示している。実線は相同領域を示す。
【００３３】図１Ｃは予想および観察される相同組換え
体を示す。
体を示す。
【００３４】実施例３ Ｇａｓ６遺伝子変異ES細胞によるキメラマウスの作製 相同組換えが確認されたＧａｓ６遺伝子変異ES細胞E14
株（以下、単にES細胞と称する）をC57BL/6J系マウスの
胚盤胞へ注入した後、偽妊娠マウスの子宮角に移植して
産仔を得た。
株（以下、単にES細胞と称する）をC57BL/6J系マウスの
胚盤胞へ注入した後、偽妊娠マウスの子宮角に移植して
産仔を得た。
【００３５】注入に用いたES細胞は、20時間前に凍結か
ら融解させ培養を開始したものを用い、TE処理により分
散させた後、ゼラチンコートした24穴プレートに30分間
静置することによりフィーダー細胞をディッシュの底に
付着させ、ES細胞のみを回収した。ES細胞は顕微操作に
供するまで、氷上に静置した。ES細胞の注入針は毛細管
(MICROCAPS 50μl)を細く引き延ばし、先端を破砕し、
鋭くカットされ、内径がES細胞よりやや小さめのものだ
けを用いた。胚の保持針は、前記の方法で引き延ばした
ガラス管を切断した後に先端を溶融して用いた。
ら融解させ培養を開始したものを用い、TE処理により分
散させた後、ゼラチンコートした24穴プレートに30分間
静置することによりフィーダー細胞をディッシュの底に
付着させ、ES細胞のみを回収した。ES細胞は顕微操作に
供するまで、氷上に静置した。ES細胞の注入針は毛細管
(MICROCAPS 50μl)を細く引き延ばし、先端を破砕し、
鋭くカットされ、内径がES細胞よりやや小さめのものだ
けを用いた。胚の保持針は、前記の方法で引き延ばした
ガラス管を切断した後に先端を溶融して用いた。
【００３６】注入針と保持針を針先を約30度屈曲させ、
マイクロマニピュレーター (NARISIGE) にセットした。
顕微操作に用いたチャンバーは5 cmのシャーレのふたを
用い、10 mM Hepes(pH7.3)緩衝化ES培地を滴下しドロッ
プを形成し、その上面をミネラルオイルで覆った。
マイクロマニピュレーター (NARISIGE) にセットした。
顕微操作に用いたチャンバーは5 cmのシャーレのふたを
用い、10 mM Hepes(pH7.3)緩衝化ES培地を滴下しドロッ
プを形成し、その上面をミネラルオイルで覆った。
【００３７】自然交配3.5 日目に、5% FCSを含むPBS で
子宮を灌流することによって子宮より採取したC57BL/6J
系マウスの胚盤胞を、37℃、5% CO2条件下、10 mM Hepe
s (pH7.3) 緩衝化ES培地中で1 時間培養した。この拡張
した胚盤胞とES細胞をガラス針を用いてドロップ中に入
れ、倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレートを行った。
胚盤胞1 個につき、15〜 20 個の相同組換え体のES細胞
を注入した。
子宮を灌流することによって子宮より採取したC57BL/6J
系マウスの胚盤胞を、37℃、5% CO2条件下、10 mM Hepe
s (pH7.3) 緩衝化ES培地中で1 時間培養した。この拡張
した胚盤胞とES細胞をガラス針を用いてドロップ中に入
れ、倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレートを行った。
胚盤胞1 個につき、15〜 20 個の相同組換え体のES細胞
を注入した。
【００３８】操作胚は、1 時間の培養後、偽妊娠2.5 日
目のICR 系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日を２
日過ぎても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝
王切開を施し、里親に哺育させた。
目のICR 系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日を２
日過ぎても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝
王切開を施し、里親に哺育させた。
【００３９】娩出される産仔は、胚盤由来のC57BL/6J系
細胞とES細胞由来の129SVJ系細胞からなるキメラであ
り、そのキメリズムの良し悪しは毛色で判断される。C5
7BL/6J系細胞よりなるマウスは黒色を呈するが、ES細胞
由来の129SVJ系細胞の寄与率が高いほど一般にキメラマ
ウスは野生色（あるいは白色）の割合が上がり、毛色は
黒色と野生色とのまだら模様となる。得られた産仔のう
ち、毛色でキメラマウスと判定できたのは３つのES細胞
クローンからそれぞれ３匹（雄２、雌１）、８匹（雄
２、雌６）、６匹（雄３、雌３）であった。
細胞とES細胞由来の129SVJ系細胞からなるキメラであ
り、そのキメリズムの良し悪しは毛色で判断される。C5
7BL/6J系細胞よりなるマウスは黒色を呈するが、ES細胞
由来の129SVJ系細胞の寄与率が高いほど一般にキメラマ
ウスは野生色（あるいは白色）の割合が上がり、毛色は
黒色と野生色とのまだら模様となる。得られた産仔のう
ち、毛色でキメラマウスと判定できたのは３つのES細胞
クローンからそれぞれ３匹（雄２、雌１）、８匹（雄
２、雌６）、６匹（雄３、雌３）であった。
【００４０】実施例４ ホモ変異マウスの作製 １）キメラマウスの交配 実施例３で得られたキメラマウスを、C57BL/6J系マウス
と交配させた。娩出される産仔の毛色は、キメラマウス
の生殖細胞が相同組換え体に由来していれば、野生色を
呈し、C57BL/6J系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色
を呈する。17例のキメラマウスのうち、8 例について野
生色の産仔が得られ、ES細胞の生殖系列への伝達が確認
された。
と交配させた。娩出される産仔の毛色は、キメラマウス
の生殖細胞が相同組換え体に由来していれば、野生色を
呈し、C57BL/6J系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色
を呈する。17例のキメラマウスのうち、8 例について野
生色の産仔が得られ、ES細胞の生殖系列への伝達が確認
された。
【００４１】具体的には、8 例のキメラマウスとC57BL/
6J系との交配で、20回の分娩で合計112 匹の産仔が得ら
れ、このうち90匹が野生色の毛色を示していた。これら
の野生色の毛色のマウスについて遺伝子型の解析を行っ
た結果、46例でＧａｓ６遺伝子のヘテロ変異を確認し
た。マウスの遺伝子型については、2 〜3 週令のマウス
より採取した尾先端からＤＮＡを調製し、3'- プローブ
（図１）を用いてサザンブロットを行って決定した。
6J系との交配で、20回の分娩で合計112 匹の産仔が得ら
れ、このうち90匹が野生色の毛色を示していた。これら
の野生色の毛色のマウスについて遺伝子型の解析を行っ
た結果、46例でＧａｓ６遺伝子のヘテロ変異を確認し
た。マウスの遺伝子型については、2 〜3 週令のマウス
より採取した尾先端からＤＮＡを調製し、3'- プローブ
（図１）を用いてサザンブロットを行って決定した。
【００４２】２）ホモ変異マウスの作製 雄のＧａｓ６遺伝子のヘテロ変異マウスを、ES細胞由来
の染色体を置き換えるために、雌のC57BL/6J系マウスと
1 度以上戻し交配を行った。戻し交配によって得られた
産仔は、サザンブロットによりＧａｓ６遺伝子の変異を
確認した。こうして得られたＧａｓ６遺伝子のヘテロ変
異マウス同士を交配させ、サザンブロットにより産仔の
Ｇａｓ６遺伝子の変異を確認し、Ｇａｓ６遺伝子のホモ
変異マウスを得た。図２に示すように、野生型マウス
（+/+ ）では、23 kb のバンドが、またホモ変異マウス
（-/- ）ではpgk-neo を含む8.0 kbのバンドが検出さ
れ、ヘテロ変異マウス（+/- ）では両方のバンドが検出
された。
の染色体を置き換えるために、雌のC57BL/6J系マウスと
1 度以上戻し交配を行った。戻し交配によって得られた
産仔は、サザンブロットによりＧａｓ６遺伝子の変異を
確認した。こうして得られたＧａｓ６遺伝子のヘテロ変
異マウス同士を交配させ、サザンブロットにより産仔の
Ｇａｓ６遺伝子の変異を確認し、Ｇａｓ６遺伝子のホモ
変異マウスを得た。図２に示すように、野生型マウス
（+/+ ）では、23 kb のバンドが、またホモ変異マウス
（-/- ）ではpgk-neo を含む8.0 kbのバンドが検出さ
れ、ヘテロ変異マウス（+/- ）では両方のバンドが検出
された。
【００４３】試験例１ Ｇａｓ６蛋白質の発現分析 野生型マウス、ヘテロ変異マウスおよびホモ変異マウス
の各組織を、界面活性剤SDS (1%)を含む緩衝液中でホモ
ジナイズし、不溶性画分を遠心分離で除いた。可溶化さ
れた蛋白質を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
て分離後、PVDF膜（ATTO）に電気的に転写し、ウサギ抗
Ｇａｓ６抗体およびビオチン化抗ウサギIgG を用いてウ
エスタンブロッティングを行ない、Ｇａｓ６を検出し
た。肺における結果を図３に示す。野生型マウス（+/+
）およびヘテロ変異マウス（+/- ）の各組織で認めら
れる70 kD のＧａｓ６蛋白質は、Ｇａｓ６遺伝子ホモ変
異マウス（-/- ）では検出されなかった。
の各組織を、界面活性剤SDS (1%)を含む緩衝液中でホモ
ジナイズし、不溶性画分を遠心分離で除いた。可溶化さ
れた蛋白質を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
て分離後、PVDF膜（ATTO）に電気的に転写し、ウサギ抗
Ｇａｓ６抗体およびビオチン化抗ウサギIgG を用いてウ
エスタンブロッティングを行ない、Ｇａｓ６を検出し
た。肺における結果を図３に示す。野生型マウス（+/+
）およびヘテロ変異マウス（+/- ）の各組織で認めら
れる70 kD のＧａｓ６蛋白質は、Ｇａｓ６遺伝子ホモ変
異マウス（-/- ）では検出されなかった。
【００４４】
【発明の効果】本発明により、Ｇａｓ６遺伝子改変マウ
スが提供される。かかるマウスは、Ｇａｓ６の関与する
循環器系、呼吸器系、中枢系ならびに免疫系疾患の病態
生理、原因の解明および治療法の開発等の研究のための
実験動物として有用である。
スが提供される。かかるマウスは、Ｇａｓ６の関与する
循環器系、呼吸器系、中枢系ならびに免疫系疾患の病態
生理、原因の解明および治療法の開発等の研究のための
実験動物として有用である。
【図１】図１は、マウスＧａｓ６遺伝子、相同組換え用
構築物およびＧａｓ６遺伝子の相同組換え体の模式図を
示す。
構築物およびＧａｓ６遺伝子の相同組換え体の模式図を
示す。
【図２】図２は、F2世代のマウスより調製したDNA をEc
oRV で消化し、3'- プローブを用いてサザンブロット分
析を行なった電気泳動の写真である。レーン３、５およ
び９は、野生型を示し、レーン１、２、４および８は、
ヘテロ変異を示し、レーン６、７および１０は、ホモ変
異を示す。右端には、野生型（23 kbp) および変異型
（8.0 kbp ）の位置を示している。
oRV で消化し、3'- プローブを用いてサザンブロット分
析を行なった電気泳動の写真である。レーン３、５およ
び９は、野生型を示し、レーン１、２、４および８は、
ヘテロ変異を示し、レーン６、７および１０は、ホモ変
異を示す。右端には、野生型（23 kbp) および変異型
（8.0 kbp ）の位置を示している。
【図３】図３は、野生型、Ｇａｓ６ヘテロ変異およびＧ
ａｓ６ホモ変異マウスにおけるＧａｓ６蛋白質の発現を
示すウエスタンブロッティングの電気泳動の写真であ
る。左のパネルは、抗Ｇａｓ６抗体により各マウスの肺
におけるＧａｓ６蛋白質の発現を検出した結果を示し、
右のパネルは、抗Ｇａｓ６抗体をＧａｓ６蛋白質で吸収
した際の結果を示す。W ：野生型マウス（+/+ ）、He：
ヘテロ変異マウス（+/- ）、Ho：ホモ変異マウス（-/-
）。
ａｓ６ホモ変異マウスにおけるＧａｓ６蛋白質の発現を
示すウエスタンブロッティングの電気泳動の写真であ
る。左のパネルは、抗Ｇａｓ６抗体により各マウスの肺
におけるＧａｓ６蛋白質の発現を検出した結果を示し、
右のパネルは、抗Ｇａｓ６抗体をＧａｓ６蛋白質で吸収
した際の結果を示す。W ：野生型マウス（+/+ ）、He：
ヘテロ変異マウス（+/- ）、Ho：ホモ変異マウス（-/-
）。
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｇａｓ６蛋白質を発現しないようにＧａ
ｓ６遺伝子が改変されたマウス。 - 【請求項２】 Ｇａｓ６遺伝子の領域内に他の遺伝子が
挿入されることによりＧａｓ６遺伝子が改変された請求
項１記載のマウス。 - 【請求項３】 他の遺伝子が選択マーカー遺伝子である
請求項２記載のマウス。 - 【請求項４】 Ｇａｓ６遺伝子の第１エキソンおよび第
２エキソンを含む領域をネオマイシン耐性遺伝子と置換
することにより、該ネオマイシン耐性遺伝子がＧａｓ６
遺伝子の領域内に挿入されている、請求項１〜３いずれ
か記載のマウス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9167999A JPH1179A (ja) | 1997-06-09 | 1997-06-09 | Ｇａｓ６遺伝子改変マウス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9167999A JPH1179A (ja) | 1997-06-09 | 1997-06-09 | Ｇａｓ６遺伝子改変マウス |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1179A true JPH1179A (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=15859933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9167999A Pending JPH1179A (ja) | 1997-06-09 | 1997-06-09 | Ｇａｓ６遺伝子改変マウス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1179A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000076309A3 (en) * | 1999-06-10 | 2001-04-19 | Vlaams Interuniv Inst Biotech | Non-human transgenic animals deficient in gas6 function and their use |
-
1997
- 1997-06-09 JP JP9167999A patent/JPH1179A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000076309A3 (en) * | 1999-06-10 | 2001-04-19 | Vlaams Interuniv Inst Biotech | Non-human transgenic animals deficient in gas6 function and their use |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060831 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061221 |