KR101698984B1

KR101698984B1 - 렙틴을 포함하는 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 방법

Info

Publication number: KR101698984B1
Application number: KR1020140155497A
Authority: KR
Inventors: 김재호; 도은경
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2017-01-24
Also published as: WO2016076507A1; KR20160056367A

Abstract

본 발명은 렙틴(Reptin) 단백질 또는 렙틴 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물; 및 상기 조성물을 이용한 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 렙틴 단백질을 이용하여 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화를 유도할 경우, 종래 종양 유발 가능성이 있다고 알려진 c-myc 유전자 등을 이용하지 않아 안정적이며, 상기 유도만능줄기세포는 만능성 또는 분화능력이 우수하여 이를 심근세포, 인슐린 생산세포, 또는 신경세포 등의 세포로 분화시켜 심부전, 인슐린 의존성 당뇨병, 파킨슨병이나 척수손상 등 다양한 질환에 대한 줄기세포 이식요법에 이용할 수 있다.

Description

렙틴을 포함하는 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 방법{Composition for inducing dedifferentiation for induced pluripotent stem cells with Reptin and method for inducing induced pluripotent stem cells using the same}

본 발명은 렙틴(Reptin) 단백질 또는 렙틴 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물; 및 상기 조성물을 이용한 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cells)는 자가 재생(self-renewal)이 가능하고, 우리 몸을 구성하는 다양한 세포로의 분화가 가능한 만능세포의 특성을 가지고 있다. 이에 따라, 줄기세포를 이용하여 손상된 조직이 발생했을 때 재생(regeneration)이 가능하며, 다양한 난치성 질환들의 치료 가능성이 확대되고 있다. 줄기세포는 크게 배아줄기세포와 성체줄기세포, 그리고 최근 보고된 유도만능줄기세포가 있다(Watt, F.M., and Hogan, B.L. 2000. Science 287, 1427-1430).

배아줄기세포(embryonic stem cells)는 냉동배아의 배반포(blastocyst) 및 내부세포괴(inner cell mass)로부터 유래한 만능줄기세포(pluripotent stem cells)이다. 배아줄기세포는 자가 재생이 성체줄기세포 보다 뛰어나고 분화능력에 제한이 없어 재생의학의 치료개발과 세포치료의 목적으로 큰 주목을 받고 있다. 반면 성체줄기세포는 성인의 각 신체 조직에 존재하며, 지방, 골수, 간 등 다양한 조직으로부터 쉽게 분리가 가능하다. 하지만 성체줄기세포는 증식이 원활지 않아 많은 세포를 확보하는데 어려움이 있고, 배아줄기세포와 비교 하였을 때 분화능력이 떨어지는 문제점이 있다(Murry, C.E., and Keller, G. 2008. Cell 132, 661-680).

유도만능줄기세포(iPS cells; induced pluripotent stem cells)는 성인의 체세포(somatic cell)에 특정 역분화 전사인자를 도입해 만능세포의 상태로 변환시킨 것으로, 2006년 일본의 신야 야마나카(Shinya Yamanaka) 박사 팀에 의해 개발되었다(Takahashi, K., and Yamanaka, S. 2006. Cell 126, 663-676). 역분화를 위해 도입될 수 있는 전사인자는 다양하게 알려 있지만, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc이 대표적이다. 이 중 Oct4는 옥타머 전사인자(octamer transcription factor)이며 POU 계열의 구성원으로 미분화 상태를 유지하는데 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 만능세포에서 Oct4의 발현을 억제했을 때 자가 복제 능력을 상실하고 영양배엽으로 분화된다(Nichols, J., Zevnik, B. 1998. Cell 95, 379-391). 상기 4가지 유전자들의 발현은 역분화 과정을 유도하고 후성적인 방법에 의해 발현이 억제된다. 한편, 이러한 역분화 기술은 배아줄기세포의 논쟁대상이 되는 생명윤리에 대한 문제를 배제 시킬 수 있고, 자신의 성체세포에서 분리된 세포로 제작이 가능하여 면역거부반응에 대한 문제가 발생하지 않으므로, 배아줄기세포와 유사성을 가진 새로운 세포치료제로서의 가능성을 높여주고 있다(Zaehres, H., and Scholer, H.R. 2007. Cell 131, 834-835).

상기와 같이 유도만능줄기세포는 환자로부터 유래된 세포를 이용하여 환자 맞춤형 질병치료에 획기적인 기술로 각광 받고 있으나, 세포치료를 위한 임상적용에 활용되기 위해서는 아직 극복해야 할 여러 가지 문제점들이 있다. 특히, c-Myc 등 종양을 유발할 수 있는 유전자의 과발현을 통하여 제작된 유도만능줄기세포는 안전성을 위협하는 한계점으로 작용하고 있다. 이에 따라, 최근 연구들은 역분화의 효율을 높이기 위하여, c-myc을 대체하는 새로운 역분화 전사인자의 발굴에 초점을 맞추고 있다.

한편, 렙틴(Reptin)은 RVBs 구성원으로, ATP-의존 DNA 헬리카제(ATP-dependent DNA helicase)이며, 전사 조절, 히스톤 변형(histone modification) 및 DNA 손상(DNA damage)등의 세포 과정에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 주로 많이 알려져 있는 렙틴의 결합 파트너는 폰틴(Pontin)이며 두 단백질은 복합체로서 결합하여 전사 조절에 중요한 작용을 한다. 종래 보고에 따르면, 렙틴 발현의 억제가 배아줄기세포의 세포생존(cell viability)을 감소시키고 평평한 형태로 바뀌는 것으로 확인하였다(Fazzio TG, Huff JT, Panning B. 2008. Cell. 134, 162-174). 하지만, 체세포에서 유도만능줄기세포로의 역분화 과정에서 렙틴의 역할은 밝혀진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 종양을 유발할 수 있는 c-myc 유전자를 대체할 수 있는 신규한 유도만능줄기세포로의 역분화 인자에 대해 연구하던 중, 렙틴 유전자를 체세포에 도입하여 렙틴 단백질을 과발현시킨 결과, 체세포에서 유도만능줄기세포로 안정적이고 효율적으로 역분화가 이루어지고, 이의 역분화 유도 효율이 향상되며, 상기 유도만능줄기세포는 만능성 또는 분화능력을 가지고 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 렙틴 단백질 또는 렙틴 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 렙틴 유전자를 체세포에 도입하는 단계;를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 렙틴 단백질 또는 렙틴 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 렙틴 유전자를 체세포에 도입하는 단계;를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도방법을 제공한다.

본 발명에 따른 렙틴 단백질을 이용하여 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화를 유도할 경우, 종래 종양 유발 가능성이 있다고 알려진 c-myc 유전자 등을 이용하지 않아 안정적이며, 상기 유도만능줄기세포는 만능성 또는 분화능력이 우수하여 이를 심근세포, 인슐린 생산세포, 또는 신경세포 등의 세포로 분화시켜 심부전, 인슐린 의존성 당뇨병, 파킨슨병이나 척수손상 등 다양한 질환에 대한 줄기세포 이식요법에 이용할 수 있다.

도 1은 shRNA에 의해 체세포에서 렙틴의 단백질 발현이 감소하는 것을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 마우스 체세포에서 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 과발현과 동시에 렙틴의 발현을 억제할 때, 유도만능줄기세포의 형성 정도를 알칼리 포스파타제 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 shRNA에 의해 렙틴의 발현이 억제된 유도만능줄기세포에서 만능성 특이 마커들의 RNA 발현이 감소함을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 렌티 바이러스에 의해 렙틴 단백질 발현이 증가되는 것을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 마우스 체세포에서 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 Reptin을 동시에 과 발현 시, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율이 증가됨을 알칼리 포스파타제 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 마우스 체세포에 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 Reptin을 동시에 과 발현 시, 리프로그래밍(reprogramming) 효율을 수치화한 결과를 나타낸 도이다
도 7은 렙틴의 발현이 증가된 유도만능줄기세포에서 만능성 특이 마커들의 RNA 발현이 증가함을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 렙틴을 이용하여 역분화된 유도만능줄기세포의 만능성을 Oct4, Sox2, Nanog 및 SSEA-1을 이용한 면역염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 렙틴을 이용하여 역분화된 유도만능줄기세포의 분화능력을 기형종 형성(teratoma formation)을 통해 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 마우스 체세포에 c-Myc을 제외한 Oct4, Sox2 및 Klf4의 과 발현과 동시에 렙틴의 발현을 억제 시, 유도만능줄기세포가 형성되지 않음을 알칼리 포스파타제 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 마우스 체세포에 c-Myc을 제외한 Oct4, Sox2, Klf4 및 렙틴을 동시에 과발현 시, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율이 증가됨을 알칼리 포스파타제 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 렙틴 단백질 또는 렙틴 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS cell, iPSC)" 는 전분화성을 가지는 세포를 의미하며, 유도만능줄기세포는 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가-재생산 및 3종류의 모든 배아 층으로부터 유래된 어떠한 세포로 발달할 수 있는 능력을 포함하는 배아줄기세포의 특성이 있음을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유도만능줄기세포는 배아줄기세포 유사세포, 또는 유도된 전분화성 줄기세포로도 기술되기도 한다.

본 발명에서 "역분화 (dedifferentiation)"는 부분 또는 최종 분화된 세포를 만능 또는 다능과 같은 미분화 상태로 되돌려서, 새로운 분화 조직의 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행 과정을 의미한다. 이러한 역분화 현상은 세포 유전체의 후성학적인 변형(epigenetic changes)들이 고정되어 있는 것이 아니라 지워지고 다시 형성될 수 있는 가역적인 과정이기 때문에 가능하다. 역분화는 "재프로그램화(reprogramming)"라고도 불리며, 부분 또는 최종 분화된 세포의 유전적 및 표현적 프로필을 배아줄기세포의 그것과 비슷하도록 변화시키는 과정에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 변화는 메틸화 패턴의 변화, 줄기세포성 유전자의 발현률 변화 등을 포함한다.

상기 랩틴 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 랩틴 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 렙틴 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 렙틴 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 랩틴 단백질의 변이체란 렙틴 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 렙틴 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명의 렙틴 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 코딩될 수 있으며, 상기 염기서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명에 있어서, 렙틴 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 렙틴 게놈 DNA를 주형으로 목적한 렙틴 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 렙틴 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 상기 렙틴 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 렙틴 단백질을 코딩하는 유전자는 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달하거나(Wolff et al. Science,1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포 내로 전달할 수 있다.

상기 렙틴 단백질을 코딩하는 유전자는, 바람직하게는 발현벡터에 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adenoassociatedvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하며, 본 발명의 일실시예에서는 pLOVE lentiviral 벡터를 이용하였으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물은 렙틴 이외에 Oct4, Sox2 및 Klf4으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 상기 단백질을 코딩하는 1종 이상의 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 체세포(somatic cell)는 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말 또는 소로부터 유래될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 체세포의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 렙틴 단백질을 코딩하고 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 유전자; 및 Oct4, Sox2 또는 Klf4 유전자 각각을 발현 벡터에 삽입하고, 이를 패키징 세포주에 형질감염한 후, 상기 형질 감염된 세포에서 생성된 렌티 바이러스 및 레트로 바이러스를 수득하고, 상기 바이러스 용액을 체세포에 처리하여 배양하였다. 상기 방법에 의하여 체세포로부터 역분화된 유도만능줄기세포는 c-myc 유전자를 이용하지 않아, 종양 유발 가능성이 낮아 이에 대한 안정성이 있고, 만능성 또는 분화능력이 있어 다양한 질환에 대한 줄기세포 이식요법에 이용할 수 있다.

상기 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도를 위해, 렙틴 유전자 이외에 Oct4, Sox2 및 Klf4으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 더 체세포에 도입할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 렙틴 단백질을 코딩하고 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 유전자; Oct4, Sox2 또는 Klf4 유전자 각각을 삽입한 발현 벡터를 패키징 세포주에 형질감염(transfection)하여 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스를 생성하고, 상기 바이러스 용액을 체세포에 처리하여 배양함으로써, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화를 유도하였다.

본 발명에 있어서, "배양" 용어는 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.

상기 체세포는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 뉴트리엔트 브로스(Nutrient broth) 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 본 발명의 체세포는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 렙틴(Reptin)에 대한 shRNA의 제조 및 이를 이용한 형질감염

렙틴의 발현 저해를 위하여 렙틴에 대한 shRNA을 제조하고, 이를 마우스 체세포에 형질감염하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 마우스 체세포에서 렙틴의 전사를 억제하기 위하여, 렙틴에 대한 shRNA(CCGGCCGAGAACAGATCAATGCAAACTCGAGTTTGCATTGATCTGTTCTCGGTTTTTG,TRCN0000047035, sigma, 미국)를 사용하였고, 대조군으로 pLKO-puro lentiviral 벡터를 사용하여 바이러스를 만든 후, 이를 마우스 체세포에 각각 형질감염하였다. 먼저, 렌티바이러스를 만들기 위해서 상기 렙틴에 대한 shRNA와 lentiviral packaging mix(pLP1, pLP2, pLP-VSV-G, Invitrogen Life Technologies)를 HEK293 세포에 형질주입 시킨 후, 48시간 후에 바이러스를 회수하였다. 형질주입 시, 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine-Plus(Invitrogen Life Technologies)를 사용하였다. 상기 형질주입 혼합물과 10ug/ml 폴리브레인(polybrene, sigma, 미국)이 포함된 배지에서 마우스 체세포를 18시간동안 배양한 후, 배지를 교체하였다. 배양 72시간 후 상기 세포를 수집하고, 웨스턴블롯팅(western blotting)을 통해 단백질 발현을 확인하였다. 항체는 Reptin(ab36569, abcam, Cambridge) 및 GAPDH(MAB374, EMD Millipore Corp, Billerica, MA)에 대한 1차 항체를 사용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 렙틴에 대한 shRNA에 의해 마우스 체세포에서 렙틴의 단백질 발현이 정상적으로 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 2. 렙틴의 발현 저해에 따른 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율 및 상기 세포에 대한 특이적 마커들의 발현 분석

2-1. 렙틴 유전자 발현 억제가 유도만능줄기세포로의 역분화 유도에 미치는 영향 분석

렙틴의 유전자 발현 억제가 유도만능줄기세포로의 역분화 유도에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 역분화 전사인자들을 마우스 체세포에 레트로 바이러스를 사용하여 도입하였다. Plat-GP 세포에 각 pMXs-Oct4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4 또는 pMXs-c-Myc 유전자와 rentroviral packaging mix(VSV, gag-pol)을 사용하여 각각의 레트로바이러스를 수집하였다. 수집된 4가지 바이러스 용액을 1:1:1:1의 비율로 섞어준 후 10mg/ml 폴리브레인을 처리하여 섬유 모세포에 18시간 동안 반응 시킨 후 배지(DMEM+10%FBS)를 교체하였다. 2일 후, 마이토마이신 C가 처리된 섬유 모세포 위에 상기 역분화 전사인자들이 도입된 세포 5x10⁴를 배양하고 관찰하였다. 상기 실험과 같은 조건에서 상기 실시예 1에서 제작한 렙틴 shRNA를 사용하여 렌티바이러스를 만든 후, 이를 4가지 역분화 전사 인자들과 동일한 비율로 동시에 형질주입 하였다. 대조군과 렙틴의 발현을 억제한 조건에서 유도되는 유도만능줄기세포의 형성은 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, AP)염색법에 의해 구분되었고, 이를 위해 28일 경과 후 알칼리 포스파타제에 의해 염색되는 콜로니들을 수치화하여 분석하였다. 알칼리 포스파타제는 유도만능줄기세포의 미분화 특성을 규명하기 위한 표지인자로서 널리 사용되고 있는 방법이며 염색은 제조사의 지시에 따라 Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I(Alkaline Phosphatase Kit(86R, sigma, 미국)) 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 마우스 체세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 과발현과 동시에 shRNA를 이용하여 렙틴의 발현을 억제 시키면, 유도만능줄기세포로의 역분화가 저해됨을 확인하였다.

2-2. 렙틴 유전자 발현 억제가 유도만능줄기세포 특이적 마커들의 발현에 미치는 영향 분석

렙틴 유전자 발현 억제가 유도만능줄기세포 특이적 마커들의 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 형성된 유도만능줄기세포를 배양 28일 경과 후 수집하고 이로부터 RNA를 분리하여 렙틴, Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현 정도를 qRT-PCR(quantitative-real time PCR)로 확인하였다. qRT-PCR을 위해 2μg의 총 RNA 시료, 0.5μg의 oligo(dT) 15 프라이머, molomo murine leukemia virus 역전사 효소(invitrogen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 제1가닥-cDNA를 합성하였다. 이후 2x SYBR Green PCR master mix(Applied Biosystems) 및 10 pM의 각 특이 프라이머 (Reptin: 5'-TCCTAGCCGATTTCCGTTTC-3'(서열번호 3), 5'-GGATCTCAGGGACTTTGGTG-3'(서열번호 4)); Oct4: 5'-GGAAAGCAACTCAGAGGGAA-3'(서열번호 5), 5'-TTCTAGCTCCTTCTGCAGGG-3'(서열번호 6); Sox2: 5'-GCGGAGTGGAAACTTTTGTC-3'(서열번호 7), 5'-TATTTATAATCCGGGTGCTCCTT-3'(서열번호 8); Nanog: 5'-CACCCACCCATGCTAGTCTT-3'(서열번호 9), 5'-ACCCTCAAACTCCTGGTCCT-3'(서열번호 10); Zfp42: 5'-AGTGTGCAGTGCAGCCAG-3'(서열번호 11), 5'-TGCTTTCTTCTGTGTGCAGG-3'(서열번호 12); β-actin: 5'-GTGGGCCGCTCTAGACACCA-3'(서열번호 13), 5'-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGGG-3'(서열번호 14))가 함유된 20μl의 반응용액을 이용하여 동량의 cDNA를 증폭시킨 후, 각 마커의 발현량을 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, shRNA에 의해 렙틴의 발현이 억제된 유도만능줄기세포에서 만능성 특이 마커인 Oct4, Sox2 및 Nanog의 RNA 발현이 감소됨을 확인하였다.

따라서, 렙틴 유전자의 발현이 억제되면, 체세포에서 유도만능줄기세포로의 역분화 유도가 억제됨을 확인하였다.

실시예 3. 렙틴의 과발현에 따른 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율에 미치는 영향

3-1. 렙틴의 과발현을 위한 형질감염

렙틴의 과발현을 위한 형질감염을 수행하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, pLOVE lentiviral 벡터에 도입되어 있는 렙틴을 HEK293 세포에 형질 주입 후, 마우스 체세포에 감염시켜 웨스턴 블롯팅을 통해 렙틴의 단백질 발현양을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 렌티바이러스에 의해 렙틴이 과발현되어 마우스 체세포 내에서 렙틴의 발현이 정상적으로 증가 되는 것을 확인하였다.

3-2. 과발현된 렙틴이 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율에 미치는 영향 분석

과발현된 렙틴이 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 pMXs-Oct4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4 및 pMXs-c-Myc과 동시에 pLOVE-Reptin을 형질 주입하여 유도만능줄기세포의 형성을 유도하였다. 역분화 유도 과정 21일 경과 후, 알칼린 포스파타제에 의해 염색되는 콜로니들을 수치화 하여 분석하였고, 상기 세포를 회수 하여 만능성 특이 마커들의 RNA 발현 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 마우스 체세포에 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 Reptin을 동시에 과 발현 시, 유도만능줄기세포로 유도되는 수가 증가함을 확인하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 렙틴의 과발현에 의해 유도만능줄기세포에 대한 특이 마커인 Oct4, Sox2, Zfp42 및 Nanog의 RNA발현이 높게 발현됨을 확인하였다.

따라서, 마우스 체세포에 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 렙틴을 동시에 과발현하면 체세포에서 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율이 증가함을 확인하였다.

실시예 4. 배아줄기세포와 유사한 유도만능줄기세포의 특성(characterization) 확인

상기 실시예 3-2에서 수득한 유도만능줄기세포의 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 3-2에서 수득한 유도만능줄기세포의 형성 28일 경과 후, 만능성과 분화능력의 정도를 면역염색법과 기형종 형성 방법으로 평가하였다. 면역염색법(immunostaining)을 위해 24웰 배양 디쉬(dish)에 커버글라스(cover glass)를 부착시키고 1% 젤라틴(sigma, 미국)으로 코팅한 뒤, 유도만능줄기세포를 배양하였다. 세포를 수집하여 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 10분간 넣어 둔 후, 인산완충용액(PBS)으로 2회 세척하고, 2% Bovine serum albumin(BSA, sigma, 미국)로 1시간 동안 블로킹하였다. 배아줄기세포 만능성의 표지 마커인 SSEA-1(Santa Cruz, CA), Oct4(Santa Cruz, CA), Sox2(Abcam, Cambridge) 및 Nanog(Cell signaling, Danvers) 항체를 1시간동안 반응시키고, alexa-fluor488과 alexa-luor568(Invitrogen) 이차 항체를 통해 형광표지 하였다. 이 후 세포 핵의 형광 표지를 위하여 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)가 포함된 Vectashield medium(Vector laboratories)을 사용하여 마운팅 하였다. 면역형광 염색된 세포는 무작위 영역을 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Olympus fluoview FV1000)으로 800배의 배율로 촬영하여 발현 정도를 확인하였다.

이하 모든 실험은 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정에 의거하여 수행하였다. 기형종 형성(teratoma formation)을 위하여, 먼저 balb/c nude 마우스(오리엔트 바이오)에 2,2,2-트리브로모에탄올(Avertin, sigma)을 400mg/kg의 농도로 복강에 주사하여 마취시켰다. DMEM에 희석된 상기 실시예 3-2의 유도만능줄기세포 세포 1x10⁶를 마트리겔(matrigel, BD, CA)과 섞은 후, 100μl씩 피하조직에 투여하였다. 투여 4주 경과 후, 기형종이 형성된 마우스를 CO₂흡입으로 희생시켜 기형종 부위를 분리하여 4% 파라포름알데하이드 용액에 넣어두었다. 인산완충용액으로 세척한 이후, 제조사의 지시에 따라 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색을 하였다. 이상의 실험 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 배아줄기세포의 특징인 만능성의 표지 마커 SSEA-1, Oct4, Sox2 및 Nanog가 발현됨을 확인하여, 상기 실시예 3-2의 역분화가 유도된 유도만능줄기세포는 배아줄기세포의 만능성 특징을 갖고 있음을 확인하였다.

또한, 도 9에서 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3-2의 역분화가 유도된 유도만능줄기세포가 투여된 마우스의 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm) 및 외배엽(ectoderm)에서 기형종이 형성됨을 확인하여, 상기 실시예 3-2의 역분화가 유도된 유도만능줄기세포는 배아줄기세포의 특징인 분화 능력을 갖고 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 상기 실시예 3-2의 방법에 의해 역분화된 유도만능줄기세포는 배아줄기세포의 특징인 만능성 및 분화능력을 갖고 있음을 확인하였다.

실시예 5. c-Myc의 사용을 배재하고 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 시, 렙틴의 영향 분석

c-Myc의 사용을 배재하고 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 시, 렙틴의 영향을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 2와 같은 방법으로, 마우스 체세포에 c-Myc의 발현을 배재한 상태에서 Oct4, Sox2 및 Klf4의 과발현과 동시에 렙틴의 발현을 억제하여 유도만능줄기세포로의 역분화를 유도하였다. 또한, 상기 실시예 3과 같은 방법으로, 마우스 체세포에 c-Myc의 발현을 배재한 상태에서 Oct4, Sox2 및 Klf4의 과발현과 동시에 렙틴을 과발현하여 유도만능줄기세포로의 역분화를 유도하였다. 상기와 같은 2가지 방법으로 체세포에서 유도만능줄기세포로의 역분화 과정 42일 경과 후, 알칼리 포스파타제 염색에 의해 염색되는 콜로니들을 수치화하여 분석하였다. 그 결과를 도 10 내지 도 11에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 마우스 체세포에 c-Myc을 제외한 Oct4, Sox2 및 Klf4의 과발현과 동시에 렙틴의 발현을 억제시키면 유도만능줄기세포로의 역분화 유도가 되지 않음을 확인하였다.

또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 마우스 체세포에 c-Myc을 제외한 Oct4, Sox2, Klf4 및 렙틴을 동시에 과발현하면 체세포에서 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율이 증가되는 것을 확인하였다.

따라서, c-Myc의 발현을 배재하여도 렙틴의 과발현은 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율을 증가시키며, 렙틴의 발현이 억제되면 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율이 감소되는 것을 확인하였다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Composition for inducing dedifferentiation for induced pluripotent stem cells with Reptin and method for inducing induced pluripotent stem cells using the same <130> pnu1-200 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Amino acid sequence of Reptin <400> 1 Met Ala Thr Val Thr Ala Thr Thr Lys Val Pro Glu Ile Arg Asp Val 1 5 10 15 Thr Arg Ile Glu Arg Ile Gly Ala His Ser His Ile Arg Gly Leu Gly 20 25 30 Leu Asp Asp Ala Leu Glu Pro Arg Gln Ala Ser Gln Gly Met Val Gly 35 40 45 Gln Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ala Gly Val Val Leu Glu Met Ile Arg 50 55 60 Glu Gly Lys Ile Ala Gly Arg Ala Val Leu Ile Ala Gly Gln Pro Gly 65 70 75 80 Thr Gly Lys Thr Ala Ile Ala Met Gly Met Ala Gln Ala Leu Gly Pro 85 90 95 Asp Thr Pro Phe Thr Ala Ile Ala Gly Ser Glu Ile Phe Ser Leu Glu 100 105 110 Met Ser Lys Thr Glu Ala Leu Thr Gln Ala Phe Arg Arg Ser Ile Gly 115 120 125 Val Arg Ile Lys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Glu Gly Glu Val Val Glu 130 135 140 Ile Gln Ile Asp Arg Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ser Lys Val Gly Lys 145 150 155 160 Leu Thr Leu Lys Thr Thr Glu Met Glu Thr Ile Tyr Asp Leu Gly Thr 165 170 175 Lys Met Ile Glu Ser Leu Thr Lys Asp Lys Val Gln Ala Gly Asp Val 180 185 190 Ile Thr Ile Asp Lys Ala Thr Gly Lys Ile Ser Lys Leu Gly Arg Ser 195 200 205 Phe Thr Arg Ala Arg Asp Tyr Asp Ala Met Gly Ser Gln Thr Lys Phe 210 215 220 Val Gln Cys Pro Asp Gly Glu Leu Gln Lys Arg Lys Glu Val Val His 225 230 235 240 Thr Val Ser Leu His Glu Ile Asp Val Ile Asn Ser Arg Thr Gln Gly 245 250 255 Phe Leu Ala Leu Phe Ser Gly Asp Thr Gly Glu Ile Lys Ser Glu Val 260 265 270 Arg Glu Gln Ile Asn Ala Lys Val Ala Glu Trp Arg Glu Glu Gly Lys 275 280 285 Ala Glu Ile Ile Pro Gly Val Leu Phe Ile Asp Glu Val His Met Leu 290 295 300 Asp Ile Glu Ser Phe Ser Phe Leu Asn Arg Ala Leu Glu Ser Asp Met 305 310 315 320 Ala Pro Val Leu Ile Met Ala Thr Asn Arg Gly Ile Thr Arg Ile Arg 325 330 335 Gly Thr Ser Tyr Gln Ser Pro His Gly Ile Pro Ile Asp Leu Leu Asp 340 345 350 Arg Leu Leu Ile Val Ser Thr Thr Pro Tyr Ser Glu Lys Asp Thr Lys 355 360 365 Gln Ile Leu Arg Ile Arg Cys Glu Glu Glu Asp Val Glu Met Ser Glu 370 375 380 Asp Ala Tyr Thr Val Leu Thr Arg Ile Gly Leu Glu Thr Ser Leu Arg 385 390 395 400 Tyr Ala Ile Gln Leu Ile Thr Ala Ala Ser Leu Val Cys Arg Lys Arg 405 410 415 Lys Gly Thr Glu Val Gln Val Asp Asp Ile Lys Arg Val Tyr Ser Leu 420 425 430 Phe Leu Asp Glu Ser Arg Ser Thr Gln Tyr Met Lys Glu Tyr Gln Asp 435 440 445 Ala Phe Leu Phe Asn Glu Leu Lys Gly Glu Thr Met Asp Thr Ser 450 455 460 <210> 2 <211> 1392 <212> DNA <213> nucleotide sequence of Reptin gene <400> 2 atggcaaccg ttacagccac aaccaaagtc ccggagatcc gtgatgtaac aaggattgag 60 cgaatcggtg cccactccca catccgggga ctggggctgg acgatgcctt ggagcctcgg 120 caggcttcgc aaggcatggt gggtcagctg gcggcacggc gggcggctgg cgtggtgctg 180 gagatgatcc gggaagggaa gattgccggt cgggcagtcc ttattgctgg ccagccgggc 240 acggggaaga cggccatcgc catgggcatg gcgcaggccc tgggccctga cacgccattc 300 acagccatcg ccggcagtga aatcttctcc ctggagatga gcaagaccga ggcgctgacg 360 caggccttcc ggcggtccat cggcgttcgc atcaaggagg agacggagat catcgaaggg 420 gaggtggtgg agatccagat tgatcgacca gcaacaggga cgggctccaa ggtgggcaaa 480 ctgaccctca agaccacaga gatggagacc atctacgacc tgggcaccaa gatgattgag 540 tccctgacca aggacaaggt ccaggccggg gacgtgatca ccatcgacaa ggcgacgggc 600 aagatctcca agctgggccg ctccttcaca cgcgcccgcg actacgacgc tatgggctcc 660 cagaccaagt tcgtgcagtg cccagatggg gagctccaga aacgcaagga ggtggtgcac 720 accgtgtccc tgcacgagat cgacgtcatc aactctcgca cccagggctt cctggcgctc 780 ttctcaggtg acacagggga gatcaagtca gaagtccgtg agcagatcaa tgccaaggtg 840 gctgagtggc gcgaggaggg caaggcggag atcatccctg gagtgctgtt catcgacgag 900 gtccacatgc tggacatcga gagcttctcc ttcctcaacc gggccctgga gagtgacatg 960 gcgcctgtcc tgatcatggc caccaaccgt ggcatcacgc gaatccgggg caccagctac 1020 cagagccctc acggcatccc catagacctg ctggaccggc tgcttatcgt ctccaccacc 1080 ccctacagcg agaaagacac gaagcagatc ctccgcatcc ggtgcgagga agaagatgtg 1140 gagatgagtg aggacgccta cacggtgctg acccgcatcg ggctggagac gtcactgcgc 1200 tacgccatcc agctcatcac agctgccagc ttggtgtgcc ggaaacgcaa gggtacagaa 1260 gtgcaggtgg atgacatcaa gcgggtctac tcactcttcc tggacgagtc ccgctccacg 1320 cagtacatga aggagtacca ggacgccttc ctcttcaacg aactcaaagg cgagaccatg 1380 gacacctcct ga 1392 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer of Reptin <400> 3 tcctagccga tttccgtttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Reptin <400> 4 ggatctcagg gactttggtg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer of Oct4 <400> 5 ggaaagcaac tcagagggaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Oct4 <400> 6 ttctagctcc ttctgcaggg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer of Sox2 <400> 7 gcggagtgga aacttttgtc 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Sox2 <400> 8 tatttataat ccgggtgctc ctt 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer of Nanog <400> 9 cacccaccca tgctagtctt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Nanog <400> 10 accctcaaac tcctggtcct 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer of Zfp42 <400> 11 agtgtgcagt gcagccag 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Zfp42 <400> 12 tgctttcttc tgtgtgcagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer of beta-actin <400> 13 gtgggccgct ctagacacca 20 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of beta-actin <400> 14 cggttggcct tagggttcag gggggg 26

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 렙틴(Reptin) 단백질, Oct4 단백질, Sox2 단백질 및 Klf4 단백질; 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 렙틴 유전자, Oct4 유전자, Sox2 유전자 및 Klf4 유전자를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 배지 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 렙틴 유전자는 발현벡터에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 배지 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 유도만능줄기세포는 만능성 또는 분화능력을 갖는 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 배지 조성물.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 렙틴(Reptin) 단백질, Oct4 단백질, Sox2 단백질 및 Klf4 단백질; 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 렙틴 유전자, Oct4 유전자, Sox2 유전자 및 Klf4 유전자를 생체 외의 체세포에 도입하는 단계;를 포함하는, 체세포로부터 유도만능줄기세포로의 역분화 유도방법.