EA031321B1 - Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки вируса гриппа, композиции на их основе и способы профилактики и лечения - Google Patents

Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки вируса гриппа, композиции на их основе и способы профилактики и лечения Download PDF

Info

Publication number
EA031321B1
EA031321B1 EA201201025A EA201201025A EA031321B1 EA 031321 B1 EA031321 B1 EA 031321B1 EA 201201025 A EA201201025 A EA 201201025A EA 201201025 A EA201201025 A EA 201201025A EA 031321 B1 EA031321 B1 EA 031321B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
influenza
virus
hemagglutinin
nucleic acid
seq
Prior art date
Application number
EA201201025A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201201025A1 (ru
Inventor
Дэвид Б. Уэйнер
Цзянь Янь
Мэттью П. Морроу
Original Assignee
Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44309124&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA031321(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания filed Critical Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания
Publication of EA201201025A1 publication Critical patent/EA201201025A1/ru
Publication of EA031321B1 publication Critical patent/EA031321B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7008—Compounds having an amino group directly attached to a carbon atom of the saccharide radical, e.g. D-galactosamine, ranimustine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к кодирующим белки вируса гриппа молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеиновые кислоты векторам, включающим молекулы нуклеиновой кислоты композициям и основанным на них способам профилактики и лечения инфекций вирусом гриппа.

Description

Изобретение относится к кодирующим белки вируса гриппа молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеиновые кислоты векторам, включающим молекулы нуклеиновой кислоты композициям и основанным на них способам профилактики и лечения инфекций вирусом гриппа.
031321 Bl
Область техники
Настоящее изобретение относится к улучшенным вакцинам против вируса гриппа, улучшенным способам стимуляции иммунного ответа против гриппа, улучшенным способам для диагностирования вакцинированных в сравнении с зараженными гриппом млекопитающими хозяевами и для профилактической и/или терапевтической иммунизации индивидуумов против гриппа.
Уровень техники
Инфлюэнца, как правило, называемая гриппом, представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое РНК-содержащими вирусами семейства Ортомиксовирусы. Грипп или вирусы гриппа инфицируют птиц и млекопитающих. Три из пяти родов Ортомиксовирусов являются вирусами гриппа: вирус гриппа A, вирус гриппа B и вирус гриппа C. Из них вирус гриппа A является наиболее распространенным.
Грипп, как правило, передается по воздуху в аэрозолях, которые образуются при кашле или чихании и при непосредственном контакте с биологическими жидкостями организма, содержащими вирус или при контакте с загрязненными поверхностями. Сезонные эпидемии гриппа случаются во всем мире и ежегодно приводят в результате к сотням тысяч смертей. В некоторые годы случаются пандемии и вызывают миллионы смертей. Кроме того, домашний скот, в частности, птицы и свиньи, также подвержены ежегодным эпидемиям и периодическим пандемиям, которые вызывают гибель большого количества животных и денежные потери.
Структурно вирусы гриппа являются похожими, как правило, имеющими сферические или нитевидные частицы вируса размером около 80-120 нм, состоящие из сходных молекулярных компонентов. Центральное ядро, включающее вирусные белки и РНК вируса, покрыто вирусной оболочкой, состоящей из двух различных гликопротеинов и липидным слоем, происходящим из клеток, в которых продуцируется вирусная частица. Два дополнительных различных гликопротеина закреплены в пределах вирусной оболочки и включают части, которые выступают наружу на поверхности.
РНК-геном вируса гриппа, как правило, предоставляется в виде восьми различных одноцепочечных, негативных смысловых РНК сегментов, которые вместе составляют одиннадцать вирусных генов генома, которые кодируют одиннадцать белков (HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2). Восемь сегментов РНК представляют собой: 1) HA, который кодирует гемагглютинин (для создания одного вириона необходимо около 500 молекул гемагглютинина); 2) NA, который кодирует нейраминидазу (для создания одного вириона необходимо около 100 молекул нейраминидазы); 3) NP, который кодирует нуклеопротеид; 4) M, который кодирует два матричных белка (M1 и M2) с помощью использования различных рамок считывания из одного и того же сегмента РНК (для создания одного вириона необходимо около 3000 матричных белковых молекул); 5) NS, который кодирует два различных неструктурных белка (NS1 и NEP) с помощью использования различных рамок считывания из одного и того же сегмента РНК;
6) PA, который кодирует РНК-полимеразу; 7) PB1, который кодирует РНК-полимеразу и PB1-F2 белок (индуцирует апоптоз) с помощью использования различных рамок считывания из одного и того же сегмента РНК; и 8) PB2, который кодирует РНК-полимеразу.
Из этих одиннадцати белков гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA) представляют собой два больших гликопротеина, закрепленных в вирусной оболочке и присутствующих на наружной поверхности вирусных частиц. Эти белки служат в качестве иммуногенов для иммунного ответа против гриппа. HA, который является лектином, опосредующим связывание вируса с клетками-мишенями и вход вирусного генома в клетку-мишень, экспрессируется в виде отдельного продукта, гена HA0, а затем обрабатывается протеазами хозяина для получения двух субъединиц, HA1 и HA2, которые вместе образуют комплекс на поверхности частиц вируса гриппа. NA принимает участие в высвобождении недавно произведенных зрелых вирусных частиц в инфицированных клетках.
Существует шестнадцать известных серотипов HA и девять известных серотипов NA для вирусов гриппа A. Идентичность различных серотипов, присутствующих в вирусной частице, обычно используется для описания вируса. Например, H1N1 представляет собой вирус гриппа с HA серотипом H1 и NA серотипом N1, H5N1 представляет собой вирус гриппа с HA серотипом H5 и NA серотипом N1. Людей обычно инфицируют только H1, H2 и H3 серотипы и N1 и N2 серотипы.
Штаммы вируса гриппа, как правило, являются видоспецифичными или родоспецифичными, т.е. штамм гриппа, который может инфицировать свиней (вирус свиного гриппа), как правило, не инфицирует людей или птиц; штамм гриппа, который может инфицировать птиц (вирус птичьего гриппа), не инфицирует людей или свиней; а штамм гриппа, который может инфицировать людей (вирус человеческого гриппа) не заражает птиц и свиней. Штаммы вируса гриппа однако могут мутировать и передавать инфекцию от одного вида к другому. Например, штамм, который инфицирует только свиней, свиной грипп, может мутировать или рекомбинировать, чтобы стать штаммом, который может инфицировать только людей, или как свиней, так и людей. Вирус гриппа, который обычно называют свиной грипп является штаммом вируса гриппа, таким как штамм H1N1, который может инфицировать людей и который был получен из штамма, который ранее был специфичным для свиней (например, вирус свиного гриппа представляет собой грипп человека свиного происхождения или полученный от свиньи грипп человека). Вирус гриппа, который обычно называют птичий грипп является штаммом вируса гриппа,
- 1 031321 таким как штамм H5N1, который может инфицировать людей, и который был получен из штамма, который ранее был специфичным для птиц (например, вирус птичьего гриппа представляет собой грипп человека птичьего происхождения или полученный от птиц грипп человека).
В развитых странах предусмотрены сезонные вакцинации против гриппа для многих людей, а иногда и для скота. Используемые вакцины ограничены в своих защитных результатах, поскольку иммунные реакции, индуцированные вакцинами, являются специфическими для определенных подтипов вируса. Различные вакцины разрабатываются и вводятся ежегодно на основе международного наблюдения и мнения ученых о том, какие типы и штаммы вирусов будут циркулировать в данном году. Вирус существенно меняется в результате мутации, рекомбинации и реассортации сегментов. Таким образом, вакцина, предоставленная для одного года, не считается защитной против сезонных штаммов, которые широко передаются в следующем году.
Прививка от гриппа, обычно продвигаемая Центрами США по контролю и профилактике заболеваний, как правило, состоит из трех убитых/инактивированных вирусов гриппа: одного A (H3N2) вируса, одного A (H1N1) вируса, и одного B вируса. Таким образом, является очевидным, что вакцинация ограничивается прогнозами подтипов, а также наличием специфической вакцины к этому подтипу.
Для вакцинации против заболеваний человека и животных было изучено прямое введение последовательности нуклеиновых кислот, и много усилий было сосредоточено на эффективных и действенных средствах доставки нуклеиновых кислот для того, чтобы получить необходимую экспрессию желаемых антигенов, что приводит к иммуногенному ответу и, в конечном счете, к успеху этой техники.
ДНК-вакцины имеют много концептуальных преимуществ по сравнению с более традиционными методами вакцинации, такими, как живые ослабленные вирусы и рекомбинантные вакцины на основе белков. ДНК-вакцины являются безопасными, стабильными, легко производимыми, и хорошо переносимыми людьми с доклиническими исследованиями, демонстрирующими мало доказательств интеграции плазмиды [Martin, T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. Кроме того, ДНК-вакцины хорошо подходят для повторного введения в связи с тем фактом, что на эффективность вакцины не оказывает влияния уже существующие титры антител к вектору [Chattergoon, M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. Однако основным препятствием для клинического утверждения ДНК-вакцин было снижение иммуногенности платформы при переходе к более крупным животным [Liu, M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40]. Последние технологические достижения в области иммуногенной инженерии ДНК-вакцины, такие как оптимизация кодона, оптимизация РНК и присоединение последовательностей лидеров иммуноглобулина, улучшили экспрессию и иммуногенность ДНКвакцин [Andre, S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Deml L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against aviinfluenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], a также недавно разработанные технологии в системах доставки плазмиды, такие как электропорация [Hirao, L.A., et al., Внутрикожная/подкожная иммунизация при помощи электропорации улучшает доставку плазмидной вакцины и мощность у свиней и макак-резус. Vaccine, 2008. 26(3): р. 440-8; Luckay A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J. Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo электропорация повышает иммуногенность неструктурных 3/4A ДНК вируса гепатита C при помощи увеличениея потребления локальной ДНК, экспрессии белка, воспаления и инфильтрации CD3 + T-клеток. J. Immunol, 2007. 179(7): p. 474153]. Кроме того, исследования выдвинули в качестве предположения, что использование консенсусных иммуногенов может быть способным увеличить широту клеточного иммунного ответа по сравнению с природным антигеном самим по себе [Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J. Virol, 2007. 81(16): p. 8507-14].
Одним из способов для доставки последовательностей нуклеиновых кислот, таких как плазмидные ДНК, является техника электропорации (ЭП). Техника была использована в клинических исследованиях у людей, чтобы доставлять противораковые лекарственные средства, такие как блеомицин, и во многих доклинических исследованиях у большого количества видов животных.
Остается потребность в иммуногенном консенсусном белке вируса гриппа гемагглютинине для конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки и для композиций, пригодных для того, чтобы вызвать иммунный ответ против нескольких штаммов гриппа. Остается потребность в эффективных вакцинах против гриппа, которые являются экономичными и эффективными для многочисленных
- 2 031321 подтипов гриппа для лечения индивидуумов.
Сущность изобретения
Предоставленными в настоящем документе являются отдельные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 1; фрагмента SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 3; фрагмента SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 6; фрагмента SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9, последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 9; фрагмента SEQ ID NO: 9; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11, последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 11; фрагмента SEQ ID NO: 11; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 13; фрагмента SEQ ID NO: 13; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 13; и SEQ ID NO: 15; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 15; фрагмента SEQ ID NO: 15; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 15.
Кроме того, представлены композиции, включающие: а) первую последовательность нуклеиновых кислот, выбранную из группы, состоящей из одной или нескольких из SEQ ID NO: 1, последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 1; фрагмента SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 3; фрагмента SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 6; фрагмента SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 9; фрагмента SEQ ID NO: 9; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 11; фрагмента SEQ ID NO: 11; и последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 13; фрагмента SEQ ID NO: 13; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной SEQ ID NO: 15; фрагмента SEQ ID NO: 15; и последовательности нуклеиновой кислоты, которая является на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 15; и б) вторую последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из одного или нескольких из: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 вируса гриппа A, гемагглютинина, нейраминидазы вируса гриппа B и их фрагментов.
Некоторые аспекты изобретения обеспечивают способы индуцирования иммунного ответа, включающие этап введения индивидууму таких молекул нуклеиновых кислот и/или композиций.
Дополнительные аспекты изобретения обеспечивают способы защиты индивидуума от инфекции. Способы включают этап введения указанному индивидууму профилактически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей такую последовательность нуклеиновой кислоты или композиции, где последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетках указанного индивидуума и индуцируется защитный иммунный ответ против белков, которые кодируются вышеупомянутой последовательностью нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах изобретения иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ против человеческого гриппа свиного происхождения.
В некоторых аспектах изобретения предоставлены способы для лечения человека, который был инфицирован гриппом. Способы включают этап введения указанному индивидууму терапевтически эффективного количества такой молекулы нуклеиновой кислоты и/или композиции. В некоторых вариантах иммунный ответ представляет собой терапевтический иммунный ответ против человеческого гриппа свиного происхождения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 приведена карта 2999 пар оснований остова плазмидного вектора pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad СА). Промотор CMV находится на основаниях 137-724. T7 промотор/сайт примирования находится на основаниях 664-683. Несколько сайтов клонирования находятся на основаниях 696-811. Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (GH) находится на основаниях 829-1053. Ген устойчивости
- 3 031321 к канамицину находится на основаниях 1226-2020. Начало pUC находится на основаниях 2320-2993.
Исходя из последовательности pVAX1, коммерчески доступной от компании Invitrogen, следующие мутации были обнаружены в последовательности pVAX1, которая была использована в качестве остова для pGX2009:
C>G 241 в CMV промоторе
С>Т 1942 остов, ниже от сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста (bGHpolyA)
А> - 2876 остов, ниже от гена Канамицина
ОТ 3277 в начале репликации (Ori) pUC высокого числа копий мутации (см. Нуклеиновая кислота Research 1985)
G>C 3753 в самом конце pUC Ori выше от сайта RNASeH .
Пары оснований 2, 3 и 4 изменяются с ACT на CTG в остове, выше от CMV промотора.
На фиг. 2 продемонстрированы две карты плазмиды pGX2009, которую также называют pH1HA09. Последовательность нуклеиновых кислот плазмиды pGX2009 (SEQ ID NO: 5) включает в себя кодирующую последовательность консенсусной H1 белковой конструкции (аминокислотная SEQ ID NO: 4 кодируемая SEQ ID NO: 3), которая включает лидерный IgE (аминокислотная SEQ ID NO: 17), связанный с N терминалом консенсусной H1 аминокислотной последовательности (аминокислотная SEQ ID NO: 2 кодируется SEQ ID NO: 1), который связан в своем C терминале с HA Tag (SEQ ID NO: 18). Консенсусный H1 белок (аминокислотная SEQ ID NO: 4 кодируемая SEQ ID NO: 3) обозначена SwiHum Con HA и H1HA09.
На фиг. 3 продемонстрированы карты плазмиды pGX2006. Последовательность нуклеиновых кислот плазмиды pGX2006 (SEQ ID NO: 8) включает в себя кодирующую последовательность консенсусного белка H2 (аминокислотная SEQ ID NO: 7 кодируемая SEQ ID NO: 6) которая обозначена H2HA.
Фиг. 4 демонстрирует данные анализа ингибирования гемагглютинации, выполненного с сывороткой от иммунизированных хорьков.
Фиг. 5 демонстрирует результаты контрольного заражения иммунизированных и неиммунизированных хорьков новым штаммом H1N1.
Подробное описание
Предоставляются консенсусные аминокислотные последовательности каждого из H1 и H2 вируса гриппа A (далее по тексту консенсусная H1 (SEQ ID NO: 2) и консенсусная H2 (SEQ ID NO: 7), соответственно), а также новая синтетическая гибридная консенсусная гемагглютининовая аминокислотная последовательность H1 вируса гриппа A (далее по тексту консенсусная U2 (SEQ ID NO: 10)) и консенсусная аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа B (далее по тексту консенсусная ВНА (SEQ ID NO: 13)), которые могут обеспечить защиту млекопитающих от гриппа. Кроме того, предоставлены белки, которые содержат консенсусную H1 аминокислотную последовательность, консенсусную H2 аминокислотную последовательность, консенсусную U2 аминокислотную последовательность и/или консенсусную ВНА аминокислотную последовательность. В некоторых аспектах изобретения, предоставлены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, содержащие консенсусную H1 аминокислотную последовательность (например, (SEQ ID NO: 1) или (SEQ ID NO: 3)), консенсусную H2 аминокислотную последовательность (например, (SEQ ID NO: 6)), консенсусную U2 аминокислотную последовательность (например, (SEQ ID NO: 9) или (SEQ ID NO: 11)), и/или консенсусную ВНА аминокислотную последовательность (например, (SEQ ID NO: 13) или (SEQ ID NO: 15)). Не будучи связанными научной теорией, вакцина, которая может быть использована для вызывания иммунного ответа (гуморального, клеточного или обоих) в целом против нескольких подтипов гриппа, может включать один или несколько из следующих пунктов: 1) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную H1 аминокислотную последовательность; 2) белок, содержащий консенсусную H1 аминокислотную последовательность; 3) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную H2 аминокислотную последовательность; 4) белок, содержащий консенсусную H2 аминокислотную последовательность; 5) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную U2 аминокислотную последовательность; 6) белок, содержащий консенсусную U2 аминокислотную последовательность; 7) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную ВНА аминокислотную последовательность; и 8) белок, содержащий консенсусную ВНА аминокислотную последовательность.
Могут быть выполнены способы иммунизации и могут быть изготовлены вакцины, которые используют и/или объединяют два или более из следующих компонентов: 1) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную H1 аминокислотную последовательность; 2) белок, содержащий консенсусную H1 аминокислотную последовательность; 3) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную H2 аминокислотную
- 4 031321 последовательность, 4) белок, содержащий консенсусную H2 аминокислотную последовательность; 5) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную U2 аминокислотную последовательность, 6) белок, содержащий консенсусную U2 аминокислотную последовательность, 7) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную ВНА аминокислотную последовательность, и 8) белок, содержащий консенсусную ВНА аминокислотную последовательность. Для более широко обоснованного лечения от гриппа могут быть выполнены способы иммунизации и могут быть изготовлены вакцины, которые используют и/или объединяют один или несколько других белков вируса гриппа, таких как белки H1-H16 вируса гриппа A, N1-N9 вируса гриппа A, гемагглютинин вируса гриппа B, нейраминидазу вируса гриппа B и/или гены, кодирующие эти белки вместе с одним или несколькими из следующих компонентов: 1) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную H1 аминокислотную последовательность; 2) белок, содержащий консенсусную H1 аминокислотную последовательность; 3) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную H2 аминокислотную последовательность, 4) белок, содержащий консенсусную H2 аминокислотную последовательность; 5) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную U2 аминокислотную последовательность, 6) белок, содержащий консенсусную U2 аминокислотную последовательность, 7) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий консенсусную ВНА аминокислотную последовательность, и 8) белок, содержащий консенсусную ВНА аминокислотную последовательность.
1. Определения.
Терминология, используемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов и не предназначена для ограничения. Как используется в спецификации и формуле изобретения, формы единственного числа включают также формы множественного числа обозначаемых объектов, если контекст явно не диктует иное.
Для перечисления числовых диапазонов в настоящем документе, каждое промежуточное число в промежуточном интервале является однозначно предусмотренным с той же степенью точности. Например, для диапазона 6-9, числа 7 и 8 предусмотрены в дополнение к 6 и 9, а в диапазоне 6,0-7,0, числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0 являются однозначно предусмотренными.
а) Адъювант
Термин адъювант, используемый в настоящем документе, означает любую молекулу, добавленную в ДНК плазмидные вакцины, описанные здесь для повышения иммуногенности антигенов, кодируемых ДНК плазмидами и кодирующих последовательности нуклеиновых кислот, описанных ниже.
б) Антитело
Термин антитело, используемый в настоящем документе, означает антитела классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, или фрагменты, фрагменты или их производные, в том числе Fab, F(ab')2, Fd, и одноцепочечные антитела, диатела, биспецифичные антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антитела могут быть антителами, выделенными из образцов сыворотки млекопитающих, поликлональными антителами, родственными очищенными антителами, или их смесями, которые демонстрируют достаточную специфичность связывания с заданным эпитопом или последовательностью, полученной из них.
в) Кодирующая последовательность
Термины кодирующая последовательность или кодирующая нуклеиновая кислота, как используются в настоящем документе, означают нуклеиновые кислоты (молекулы РНК или ДНК), которые включают последовательность нуклеотидов, кодирующую белок. Кодирующая последовательность может дополнительно включать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включающими промотор и сигнал полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках индивидуума или млекопитающего, которым вводят нуклеиновую кислоту.
г) Комплемент
Термины комплемент или комлементарный, как используются в настоящем документе, означают нуклеиновую кислоту, которая имеет возможность спаривания оснований между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами молекул нуклеиновых кислот в соответствии со стандартными правилами Уотсона-Крика (например, A-T/U и C-G) или Хугстена.
д) Консенсусный или консенсусная последовательность
Консенсусный или консенсусная последовательность, как используется здесь, означает полипептидную последовательность на основе анализа выравнивания нескольких подтипов определенного антигена вируса гриппа. Последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют консенсусную полипептидную последовательность, могут быть изготовлены. Вакцины, содержащие белки, которые содержат консенсусные последовательности и/или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие белки, могут быть использованы, чтобы индуцировать широкий иммунитет против множества подтипов или серотипов определенного антигена гриппа. Консенсусные антигены гриппа могут включать консенсусную аминокислотную последовательность гемагглютинина вируса гриппа A, в том числе, например, консенсусную H1, консенсусную H2, или консенсусную аминокислотную последовательность гемагглю
- 5 031321 тинина вируса гриппа B.
е) Постоянный ток
Постоянный ток, как используется в настоящем документе, означает, ток, который получают или испытывают ткани или клетки, определяющие вышеупомянутые ткани, в течение периода времени доставки электрического импульса в те же ткани. Электрический импульс поступает из устройств электропорации, описанных в настоящем документе. Этот ток остается на уровне постоянного ампеража в указанной ткани в течение периода жизни электрического импульса, так как устройство электропорации, предоставленное в настоящем документе имеет элемент обратной связи, предпочтительно обладающий мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи может измерять сопротивление тканей (или клеток) в течение длительности импульса и служить причиной изменения выделения электрической энергии (например, увеличения напряжения) устройства электропорации, так что ток в той же ткани остается постоянным на всем протяжении электрического импульса (порядка микросекунды), и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах элемент обратной связи включает контроллер.
ж) Обратная связь по току или обратная связь
Термины обратная связь по току или обратная связь могут быть использованы как взаимозаменяемые и означают активный ответ предоставленного устройства электропорации, который включает измерение тока в ткани между электродами и изменение выделения энергии, поставляемой устройством ЭП соответственно для того, чтобы поддерживать ток на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем перед началом последовательности импульсов или перед электролечением. Обратная связь может быть достигнута при помощи компонента электропорации, например, контроллера устройства электропорации, так как электрическая схема в нем может постоянно контролировать ток в ткани между электродами и сравнивать этот проконтролированный ток (или ток в ткани) с заданным током и постоянно проводить изменения выделения энергии с целью поддержания контролируемого тока на заданных уровнях. Петля обратной связи может быть мгновенной, так как она представляет собой аналоговую обратную связь с замкнутой петлей.
з) Децентрализованный ток
Децентрализованный ток как используется в настоящем документе, означает модель электрического тока, доставляемого из множества различных игольчатых электродов устройств электропорации, описанных здесь, где модель минимизирует, или предпочтительно исключает возникновение теплового напряжения, связанного с электропорацией на любом участке ткани, которая находилась под воздействием электропорации.
и) Электропорация
Термины электропорация, электропермеабилизация или электрокинетическое усиление (ЭП), которые в настоящем документе используются как взаимозаменяемые, означают использование трансмембранного импульса электрического поля для индуцирования микроскопических путей (пор) в биологической мембране; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарственные средства, ионы и вода проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
к) Механизм обратной связи
Механизм обратной связи, как используется в настоящем документе, означает процесс, осуществляемый при помощи либо программного или аппаратного обеспечения (или программно-аппаратного), и этот процесс получает и сравнивает импеданс заданной ткани (до, во время и/или после доставки импульсов энергии) с текущим уровнем, предпочтительно током, и регулирует импульс энергии, поставляемой для достижения заданного значения. Механизм обратной связи может осуществляться при помощи аналоговой схемы замкнутой петли.
л) Фрагмент
Термин фрагмент, используемый в настоящем документе в отношении последовательностей нуклеиновых кислот, означает последовательность нуклеиновой кислоты или ее часть, которая кодирует полипептид, способную вызывать иммунный ответ у млекопитающих, которые перекрестно реагируют с антигеном полной длины дикого типа штамма вируса гриппа, включая, например, H1 гемагглютинин вируса гриппа A, H2 гемагглютинин вируса гриппа A или гемагглютинин вируса гриппа B. Фрагменты могут быть фрагментами ДНК, выбранными по меньшей мере из одной из различных нуклеотидных последовательностей, кодирующих консенсусные аминокислотные последовательности и конструкции, содержащие такие последовательности, включая SEQ ID под номерами: 1, 3, 6, 9, 11, 13 и 15. Фрагменты ДНК могут содержать кодирующие последовательности для лидерного иммуноглобулина, такие, как IgE и IgG последовательности. Фрагменты ДНК могут составлять 30 или более нуклеотидов в длину, 45 или более, 60 или более, 75 или более, 90 или более, 120 или более, 150 или более, 180 или более, 210 или более, 240 или более, 270 или более, 300 или более, 360 или более, 420 или более, 480 или более, 540 или более, 600 или более, 660 или более, 720 или более, 780 или более, 840 или более, 900 или более, 960 или более, 1020 или более, 1080 или более, 1140 или более, 1200 или более, 1260 или более, 1320 или более, 1380 или более, 1440 или более, 1500 или более, 1560 или более, 1620 или более, 1680 или более, 1740 или более, 1800 или более, 1860 или более, 1820 или более, 1880 или более, 1940 или более, 2000 или
- 6 031321 более, 2600 или более, 2700 или более, 2800 или более, 2900 или более, 2910 или более, 2920 или более, 2930 или более, 2931 или более, 2932 или более, 2933 или более, 2934 или более, 2935 или более, 2936 или более, 2937 или более, или 2938 или более в длину Фрагменты ДНК могут быть меньше, чем 10 нуклеотидов, меньше чем 20, меньше чем 30, меньше чем 40, меньше чем 50, меньше чем 60, меньше чем 75, меньше чем 90, меньше чем 120, меньше чем 150, меньше чем 180, меньше чем 210, меньше чем 240, меньше чем 270, меньше чем 300, меньше чем 360, меньше чем 420, меньше чем 480, меньше чем 540, меньше чем 600, меньше чем 660, меньше чем 720, меньше чем 780, меньше чем 840, меньше чем 900, меньше чем 960, меньше чем 1020, меньше чем 1080, меньше чем 1140, меньше чем 1200, меньше чем 1260, меньше чем 1320, меньше чем 1380, меньше чем 1440, меньше чем 1500, меньше чем 1560, меньше чем 1620, меньше чем 1680, или меньше чем 1740 нуклеотидов, меньше чем 1800, меньше чем 1860, меньше чем 1820, меньше чем 1880, меньше чем 1940, меньше чем 2000, меньше чем 2600, меньше чем 2700, меньше чем 2800, меньше чем 2900, меньше чем 2910, меньше чем 2920, меньше чем 2930, меньше чем 2931, меньше чем 2932, меньше чем 2933, меньше чем 2934, меньше чем 2935, меньше чем 2936, меньше чем 2937, или меньше чем 2938.
Фрагмент в отношении полипептидных последовательностей означает полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающих, которые перекрестно реагируют с антигеном полной длины дикого типа штамма вируса гриппа, включая, например, H1 гемагглютинин вируса гриппа A, H2 гемагглютинин вируса гриппа A или гемагглютинин вируса гриппа B. Фрагмент может представлять собой полипептидный фрагмент выбранный, по меньшей мере, из одной из различных полипептидных последовательностей настоящего изобретения, включая SEQ ID под номерами: 2, 4, 7, 10, 12, 14 и 16. Полипептидные фрагменты могут быть продуманы, чтобы контактировать, по меньшей мере, с одним антигенным эпитопом, как это предоставлено общедоступной базой данных, такой как база данных последовательностей HA Лос-Аламосской национальной лаборатории. Фрагменты полипептидов HA могут дополнительно содержать аминокислотные последовательности для лидерного иммуноглобулина, как например IgE или IgG. Полипептидные фрагменты могут составлять 30 или более аминокислот в длину, 45 или более, 60 или более, 75 или более, 90 или более, 120 или более, 150 или более, 180 или более, 210 или более, 240 или более, 270 или более, 300 или более, 360 или более, 420 или более, 480 или более, 540 или более, 600 или более, 660 или более, или 710 аминокислот или более в длину. Полипептидные фрагменты могут быть меньше чем 10 аминокислот, меньше чем 20, меньше чем 30, меньше чем 40, меньше чем 50, меньше чем 60, меньше чем 75, меньше чем 90, меньше чем 120, меньше чем 150, меньше чем 180, меньше чем 210, меньше чем 240, меньше чем 270, меньше чем 300, меньше чем 360, меньше чем 420, меньше чем 480, меньше чем 540, меньше чем 600, меньше чем 660, меньше чем 700, меньше чем 701, меньше чем 702, меньше чем 703, меньше чем 704, меньше чем 705, меньше чем 706, меньше чем 707, меньше чем 708, меньше чем 709, или меньше чем 710 аминокислот в длину.
м) Г енетическая конструкция
Используемый здесь термин генетическая конструкция относится к ДНК или РНК молекулам, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность включает сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включающими промотор и сигнал полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках индивидуума, которому вводят нуклеиновую кислоту. Используемый здесь термин экспрессируемая форма относится к генным конструкциям, которые содержат необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, которая кодирует белок таким образом, что когда она находится в клетке индивидуума, будет экспрессироваться кодирующая последовательность.
н) Идентичные
Термины идентичные или идентичность, используемые в настоящем документе, в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей, означают, что последовательности имеют определенный процент остатков, которые являются одинаковыми на протяжении определенного региона. Процент может быть вычислен путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей на протяжении указанного региона, определения количества позиций, в которых идентичные остатки встречаются в обеих последовательностях, что дает число совпадающих позиций, с последующим делением числа совпадающих позиций на общее количество позиций в указанном регионе, и умножением результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательности. В случаях, когда две последовательности имеют различную длину или выравнивание служит причиной одного или более смещенных концов и указанный регион сравнения включает только одну последовательность, остатки одной последовательности включают в знаменатель, но не в числитель расчета. При сравнении ДНК и РНК, тимин (T) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентичность может выполняться вручную или с помощью компьютерного алгоритма последовательности, такого как, например, BLAST или BLAST 2.0.
о) Импеданс
Термин импеданс может быть использован при обсуждении механизма обратной связи и может быть преобразован в значение тока в соответствии с законом Ома, что дает возможность сравнения с за
- 7 031321 данным током.
п) Иммунный ответ
Иммунный ответ как используется в настоящем документе, означает активацию иммунной системы хозяина, например, иммунной системы млекопитающих, в ответ на введение антигена, такого как консенсусный антиген гемагглютинин вируса гриппа. Иммунный ответ может быть в форме клеточного или гуморального иммунного ответа, или обоих.
р) Нуклеиновая кислота
Термины нуклеиновая кислота или олигонуклеотид или полинуклеотид, как используются в настоящем документе, означают по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных друг с другом. Отображение одной нити также определяет последовательность комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает комплементарную цепь для отображенной одной цепи. Много вариантов нуклеиновой кислоты могут быть использованы для тех же целей, что и данная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота также охватывает по существу идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементы. Одна цепь предоставляет зонд, который может гибридизировать с целевой последовательностью при строгих условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает и зонд, который гибридизируется при строгих условиях гибридизации.
Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, или могут содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, как геномную, так и кДНК, РНК или гибрид, где нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов, и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены способами химического синтеза или с помощью рекомбинантных способов.
с) Функционально связанный
Термин функционально связанный как используется в настоящем документе, означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может быть расположен в положении 5'(выше) или 3'(ниже) гена, находящегося под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть примерно таким же, как расстояние между тем промотором и геном, который он контролирует в гене, из которого указанный промотор получен. Как известно, в данной области техники варьирование этого расстояния может быть подогнано без потери функции промотора.
т) Промотор
Термин промотор, как используется в настоящем документе, означает полученную синтетическим или естественным путем молекулу, которая способна передавать, активизировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может состоять из одной или нескольких специфичных транскрипционных регуляторных последовательностей для дальнейшего усиления экспрессии и/или изменения пространственной экспрессии и/или временной экспрессии одного и того же. Промотор может также содержать элементы дистального энхансера или репрессора, которые могут располагаться через несколько тысяч пар оснований от сайта начала транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включающих вирусные, бактериальные, грибковые, растительные источники, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию компонента гена конститутивно или дифференцированно по отношению к клетке, ткани или органу, в котором происходит экспрессия, или по отношению к стадии развития, при которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы, патогенные микроорганизмы, ионы металлов, или индуцирующие вещества. Типичные примеры промоторов включают промотор бактериофага T7, промотор бактериофага T3, SP6 промотор, lac оператор-промотор, tac промотор, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, RSVLTR промотор, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV IE.
у) Строгие условия гибридизации
Термин строгие условия гибридизации как используется в настоящем документе, означает условия, при которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет гибридизироваться со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, целевой), например, в сложной смеси нуклеиновых кислот. Строгие условия зависят от последовательности и будут отличаться в различных обстоятельствах. Строгие условия могут быть выбраны такими, чтобы быть приблизительно на 5-10°C ниже, чем температура плавления (Tm) для определенной последовательности при определенной ионной силе pH. Показатель Tm может представлять собой температуру (при определенной ионной силе, pH и нуклеиновой концентрации), при которой 50% комплементарных к цели зондов гибридизируется с целевой последовательностью в равновесном состоянии (так как целевые последовательности присутствует в избытке, при Tm, 50% зондов заняты в равновесном состоянии). Строгие условия могут быть такими, в которых концентрация солей составляет менее чем приблизительно 1,0 М ионов натрия, например, приблизительно 0,01-1,0 М концентрации ионов натрия (или других солей) при уровне pH от 7,0 до 8,3, и при температуре, равной по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких зондов (например, около
- 8 031321
10-50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, равной приблизительно 60°C для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Строгие условия могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих веществ, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации, позитивный сигнал может составлять, по меньшей мере, от 2 до 10 раз от фоновой гибридизации. Примерные строгие условиях гибридизации включают следующее: 50% формамида, 5х SSC (хлорида натрия и цитрата натрия буфер), и 1% SDS (додецилсульфата натрия), инкубация при температуре 42°C, или, 5х SSC, 1% SDS, инкубация при температуре 65°C, с промыванием в 0,2х SSC и 0,1% SDS при температуре 65°C.
ф) По существу, комплементарная
Термин по существу, комплементарная как используется в настоящем документе, означает, что первая последовательность является по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной комплементу второй последовательности на протяжении региона из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизируются при строгих условиях гибридизации.
х) По существу, идентичная
Термин по существу, идентичная как используется в настоящем документе, означает, что первая и вторая последовательности являются по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными на протяжении региона из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070 или более нуклеотидов или аминокислот, или в отношении нуклеиновых кислот, если первая последовательность является по существу комплементарной комплементу второй последовательности.
ц) Подтип или серотип
Термины подтип или серотип, используемые в настоящем документе как синонимы, и в связи с вирусом гриппа, означают такие генетические варианты вируса гриппа, что один подтип распознается иммунной системой отдельно от другого подтипа.
Ч) вариант
Термин вариант, используемый в настоящем документе в отношении нуклеиновой кислоты означает (i) часть или фрагмент упомянутой нуклеотидной последовательности; (ii) комплемент упомянутой нуклеотидной последовательности или ее части; (iii) нуклеиновую кислоту, которая, по существу, является идентичной упомянутой нуклеиновой кислоте или ее комплементу, или (iv), нуклеиновую кислоту, гибридизирующуюся при строгих условиях к указанной нуклеиновой кислоте, ее комплементу, или последовательности, по существу, ей идентичной.
Вариант по отношению к пептиду или полипептиду, который отличается по аминокислотной последовательности вследствие инсерции, делеции или консервативного замещения аминокислот, но сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Вариант может также означать белок с аминокислотной последовательностью, которая является, по существу, идентичной упомянутому белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Консервативное замещение аминокислот, то есть замещение аминокислоты на другую аминокислоту с аналогичными свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных регионов) признаны в данной области техники как приводящие к незначительным изменениям. Эти незначительные изменения могут быть определены, в частности, при помощи принятия во внимание индекса гидрофобности аминокислот, как понимается в данной области техники. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидрофобности аминокислот основан на анализе их гидрофобности и заряда. Как известно, в данной области техники, аминокислоты с похожими индексами гидрофобности могут быть замещены и все еще сохранять белковую функцию. В одном аспекте аминокислоты, обладающие индексами гидрофобности, равными ±2, являются замещенными. Гидрофильность аминокислот может также быть использована для выявления замещений, что приведет в результате к белкам, сохраняющим биологическую функцию. Анализ гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет вычислить наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, пригодный критерий, который, как сообщается, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4554101, включенный в настоящий документ полностью посредством ссылки. Замещение аминокислот, имеющих одинаковые значения гидрофильности, может привести в результате к пептидам, сохраняющим биологическую активность, например, иммуногенность, как это понимается в данной области техники. Замещения могут быть выполнены с аминокислотами, имеющими значения гидрофильности в пределах ±2 в сравнении друг с другом. Оба показателя, индекс гидрофобности и значение гидрофильности аминокислот, находятся под влиянием специфичной боковой цепи указанной аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением, аминокислотные замещения, которые совместимы с биологической функцией, как понимается, зависят от относительного сходства аминокислот, и особенно боковых цепей этих аминокислот, как продемонстрированно гидрофобностью, гидрофильностью, зарядом, размером и другими
- 9 031321 свойствами.
ш) Вектор
Термин вектор, как используется в настоящем документе, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащий источник репликации. Вектор может представлять собой вектор, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть ДНК или РНК вектором. Вектор может быть самовоспроизводящимся внехромосомным вектором и предпочтительно является ДНК плазмидой.
2. Антиген гриппа
В настоящем документе предоставлены антигены, способные вызывать иммунный ответ у млекопитающих против одного или более серотипов вируса гриппа. Антиген может быть способен вызывать иммунный ответ у млекопитающих против одного или более серотипов вируса гриппа, в том числе против одного или более пандемических штаммов, например вируса гриппа 2009 H1N1 свиного происхождения. Антиген может быть способен вызывать иммунный ответ у млекопитающих против одного или более серотипов вируса гриппа, в том числе против одного или более штаммов свиного происхождения, гриппа человека. Антиген может содержать эпитопы, что делает их особенно эффективными в качестве иммуногенов, против которых могут быть индуцированны противогриппозные иммунные реакции.
Антиген может содержать полной длины продукт трансляции HA0, субъединицу HA1, субъединицу HA2, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Гемагглютининовый антиген вируса гриппа, может представлять собой консенсусную последовательность, полученную из нескольких штаммов вируса гриппа A серотипа H1, консенсусную последовательность, полученную из нескольких штаммов вируса гриппа A серотипа H2, гибридную последовательность, содержащую части двух различных консенсусных последовательностей, полученных из различных наборов нескольких штаммов вируса гриппа A серотипа H1 или консенсусной последовательности, полученной из нескольких штаммов вируса гриппа B. Гемагглютининовый антиген вируса гриппа может быть от вируса гриппа B. Антиген может содержать по меньшей мере один антигенный эпитоп, который может быть эффективным против отдельных иммуногенов гриппа, против которых может быть индуцирован иммунный ответ. Антиген может обеспечить весь репертуар иммуногенных сайтов и эпитопов, присутствующих в интактном вирусе гриппа. Антиген может быть консенсусной последовательностью гемагглютининового антигена, которая может быть получена из последовательности гемагглютининового антигена из множества штаммов вируса гриппа A одного серотипа, такого как множество штаммов вируса гриппа A серотипа H1 или серотипа H2.
Антиген может быть гибридной консенсусной последовательностью гемагглютининового антигена, которая может быть получена из сочетания двух различных консенсусных последовательностей гемагглютининового антигена или их частей. Каждая из двух разных консенсусных последовательностей гемагглютининового антигена могут быть получены из различных наборов множества штаммов вируса гриппа А одного серотипа, такого как множество штаммов вируса гриппа A серотипа H1. Антиген может быть консенсусной последовательностью гемагглютининового антигена, которая может быть получена из последовательности гемагглютининового антигена из множества штаммов вируса гриппа B.
Консенсусный гемагглютининовый антиген может представлять собой белок, включающий SEQ ID NO: 2 (консенсусную аминокислотную последовательность H1), в которой аминокислоты 1-343 соответствуют субъединице HA1 предшественника HA0 консенсусной аминокислотной последовательности H1, а аминокислоты 344-566 соответствуют HA2 субъединице HA0 консенсусной аминокислотной последовательности H1. Консенсусный гемагглютининовый антиген может представлять собой белок, включающий SEQ ID NO: 7 (консенсусную аминокислотную последовательность H2). Консенсусный гемагглютининовый антиген может представлять собой синтетические гибридные консенсусные H1 последовательности, включающие части двух разных консенсусных H1 последовательностей, каждая из которых получена из отличающегося от другого набора последовательностей. Примером консенсусного HA антигена, который представляет собой синтетический гибридный консенсусный белок H1, является белок, включающий SEQ ID NO: 10 (аминокислотная последовательность U2). Консенсусный гемагглютининовый антиген может представлять собой консенсусный белок гемагглютинин, полученный из последовательностей гемагглютинина из штаммов вируса гриппа B, таких как белок, включающий SEQ ID NO: 14 (консенсусную ВНА аминокислотную последовательность).
Консенсусный гемагглютининовый антиген может также включать в себя один или более дополнительных элементов последовательности аминокислот. Консенсусный гемагглютининовый антиген может дополнительно содержать на своем N-терминале IgE или IgG лидерную аминокислотную последовательность. Лидерной аминокислотной последовательностью IgE может быть SEQ ID NO: 17. Консенсусный гемагглютининовый антиген может дополнительно содержать иммуногенную метку (tag), которая является уникальным иммуногенным эпитопом, который может быть без труда обнаружен пригодным антителом. Примером такой иммуногенной метки является 9 аминокислот вируса гриппа HA Tag, которые могут быть связаны с C-концом консенсусного гемагглютинина. Аминокислотная последовательность HA Tag может представлять собой SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах, консенсусный гемагглютининовый антиген может дополнительно содержать на своем N-конце лидерную аминокислотную последовательность IgE или IgG и на своем C-конце HA метку.
- 10 031321
Консенсусный гемагглютининовый антиген может представлять собой консенсусный гемагглютининовый белок, который состоит из консенсусных аминокислотных последовательностей вируса гриппа или его фрагментов и вариантов. Консенсусный гемагглютининовый антиген может представлять собой консенсусный гемагглютининовый белок, который содержит белковую последовательность не вируса гриппа и белковую последовательность вируса или его фрагменты и варианты.
Примеры консенсусного H1 белка включают те, которые могут состоять из консенсусной H1 аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2) или те, которые дополнительно содержат дополнительные элементы, такие как лидерная последовательность IgE, или HA Tag, или обе, как IgE лидерная последовательность, так и HA Tag. Примером консенсусного H1 белка, который включает в себя как IgE лидерную последовательность, так и HA Tag является SEQ ID NO: 4, которая содержит консенсусную H1 аминокислотную кодирующую последовательность (SEQ ID NO: 2), связанную с лидерной аминокислотной последовательностью IgE (SEQ ID NO: 17) на своем N-конце и связанную с HA Tag (SEQ ID NO: 18) на своем C-конце.
Примеры консенсусных H2 белков включают те, которые могут состоять из консенсусной H2 аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 7) или те, которые дополнительно содержат лидерную последовательность IgE, или HA Tag, или обе, как лидерную последовательность IgE, так и HA Tag.
Примеры гибридных консенсусных H1 белков включают те, которые могут состоять из консенсусной U2 аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 10) или те, которые дополнительно содержат лидерную последовательность IgE, или HA Tag, или обе, как лидерную последовательность IgE, так и HA Tag. Примером консенсусного U2 белка является SEQ ID NO: 12, которая содержит консенсусную U2 аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 10), связанную с лидерной аминокислотной последовательностью IgE (SEQ ID NO: 17) на своем N-конце и связанную с HA Tag (SEQ ID NO: 18) на своем C-конце.
Примеры гибридных консенсусных белков гемагглютинина вируса гриппа B включают те, которые могут состоять из консенсусной ВНА аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 14) или те, которые могут содержать лидерную последовательность IgE, или HA Tag, или обе, как лидерную последовательность IgE, так и HA Tag. Примером консенсусного ВНА белка является SEQ ID NO: 16, которая содержит консенсусную ВНА аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 14), связанную с лидерной аминокислотной последовательностью IgE (SEQ ID NO: 17) на своем N-конце и связанную с HA Tag (SEQ ID NO: 18) на своем C-конце.
Консенсусный белок гемагглютинин может быть кодирован консенсусной гемагглютининовой нуклеиновой кислотой, ее вариантом или ее фрагментом. В отличие от консенсусного белка гемагглютинина, который может представлять собой консенсусную последовательность, полученную из множества различных гемагглютининовых последовательностей из различных штаммов и вариантов, консенсусная гемагглютининовая нуклеиновая кислота относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей консенсусную белковую последовательность и использованные кодирующие последовательности могут отличаться от тех, которые используются для кодирования специфических аминокислотных последовательностей во множестве различных гемагглютининовых последовательностей, из которых происходит консенсусная последовательность белка гемагглютинина. Консенсусная последовательность нуклеиновой кислоты может быть кодон оптимизированной и/или РНК оптимизированной. Консенсусная последовательность нуклеиновой кислоты гемагглютинина может включать последовательность Козака в 5' нетранслируемом регионе. Консенсусная последовательность нуклеиновой кислоты гемагглютинина может включать последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют лидерную последовательность. Кодирующая последовательность N-конца лидерной последовательности представляет собой 5' кодирующей последовательности гемагглютинина. N-концевой лидер может способствовать секреции. N-концевой лидер может быть IgE лидером или IgG лидером. Консенсусная последовательность нуклеиновой кислоты гемагглютинина может содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные метки.
Иммуногенная метка может находиться на C-конце белка, а последовательности, кодирующие ее, представляют собой 3' кодирующие последовательности HA. Иммуногенная метка предоставляет уникальный эпитоп, для которых легко доступны антитела, так что такие антитела могут быть использованы в исследованиях для выявления и подтверждения экспрессии белка. Иммуногенная метка может представлять собой H Tag на C-конце белка.
Консенсусная нуклеиновая кислота гемагглютинина может иметь полинуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 14. Консенсусная нуклеиновая кислота гемагглютинина, кодирующая SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 14 может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 13, соответственно. Консенсусная нуклеиновая кислота гемагглютинина может дополнительно содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную аминокислотную последовательность IgE, или полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность HA Tag, или обе. SEQ ID NO: 17 представляет собой лидерную полипептидную последовательность IgE. SEQ ID NO: 18 представляет собой
- 11 031321 полипептидную последовательность HA Tag. Примеры консенсусных нуклеиновых кислот гемагглютинина, которые дополнительно содержат полинуклеотидные последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE и HA Tag, включают молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белки, которые содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO: 16. Консенсусная нуклеиновая кислота гемагглютинина, кодирующая SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 16 может представлять собой SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 15 соответственно.
3. Г енетические конструкции и плазмиды
В настоящем документе предоставлены генетические конструкции, которые могут содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген гемагглютинин. Генетическая конструкция может присутствовать в клетке в виде функционирующей внехромосомной молекулы, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген гемагглютинин. Генетическая конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген гемагглютинин может быть линейной минихромасомой, включающей центромер, теломеры или плазмиды или космиды.
Генетическая конструкция может также быть частью генома рекомбинантного вирусного вектора, в том числе рекомбинантного аденовируса, рекомбинантного вируса, связанного с аденовирусом и рекомбинантной вакцины. Генетическая конструкция может быть частью генетического материала в ослабленных живых микроорганизмах или в рекомбинантных микробных векторах, которые живут в клетках.
Г енетические конструкции могут содержать регуляторные элементы для экспрессии генов нуклеиновой кислоты гемагглютинина. Регуляторные элементы могут представлять собой промотор, энхансер, кодон инициирования, стоп-кодон или сигнал полиаденилирования.
Композиции могут включать первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует консенсусный гемагглютининовый антиген, выбранный из группы, состоящей из одного или более из перечисленного: консенсусный гемагглютининовый антиген H1 вируса гриппа A, консенсусный гемагглютининовый антиген H2 вируса гриппа А, консенсусный гемагглютининовый антиген U2 вируса гриппа A, и консенсусный гемагглютининовый белок ВНА вируса гриппа B, и может также включать в себя одну или более дополнительную последовательность (последовательностей) нуклеиновых кислот, кодирующую один или более белок (белков) выбранных из группы, состоящей из: белков гемагглютинина H1 H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 вируса гриппа A, нейраминидазы N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 вируса гриппа A, гемагглютинина вируса гриппа B (ВНА) и нейраминидазы вируса гриппа B (BNA). Первая и дополнительная последовательности нуклеиновых кислот могут находиться на одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты или на различных молекулах нуклеиновых кислот. Первая и дополнительная последовательности нуклеиновых кислот могут находиться под контролем регуляторных элементов, которые функционируют в клетке человека. Дополнительная кодирующая последовательность может кодировать один или более H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, ВНА и BNA из одного или более штаммов вируса гриппа, или являться консенсусной, полученной от нескольких штаммов, имеющих серотип, или представлять собой гибрид, который включает в себя последовательности из двух или более консенсусных последовательностей.
Последовательности нуклеиновых кислот могут составить генетическую конструкцию, которая может представлять собой вектор. Вектор может быть способен экспрессировать консенсусный гемагглютининовый антиген в клетке млекопитающего в количестве, эффективном для того, чтобы вызывать иммунный ответ в организме млекопитающего. Вектор может быть рекомбинантным. Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую консенсусный гемагглютининовый антиген. Вектор может представлять собой плазмиду. Вектор может быть пригодным для трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей консенсусный гемагглютининовый антиген, где трансформированную клетку хозяина культивируют и сохраняют в условиях, в которых имеет место экспрессия консенсусного гемагглютининового антигена.
Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую консенсусный гемагглютининовый антиген, и может дополнительно содержать кодон инициирования, которые могут находиться выше консенсусной гемагглютининовой кодирующей последовательности, и стоп-кодон, который может находиться ниже консенсусной гемагглютининовой кодирующей последовательности. Кодон инициирования и терминации может быть в рамке с консенсусной гемагглютининовой кодирующей последовательностью. Вектор может также включать промотор, который функционально связан с консенсусной гемагглютининовой кодирующей последовательностью. Промотор, функционально связанный с консенсусной гемагглютининовой кодирующей последовательностью, может представлять собой промотор от обезьяньего вируса 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (HIV), промотор, такой как, например, бычьего вируса иммунодефицита (BIV), промотор длинного концевого повтора (LTR), промотор вируса Молони, промотор вируса птичьего лейкоза (ALV), промотор цитомегаловируса (CMV), промотор, такой как непосредственно ранний промотор CMV, промотор вируса Эпштейна-Барра (EBV), или промотор вируса саркомы Рауса (RSV). Промотор может также являться промотором из гена человека, такого как актин
- 12 031321 человека, миозин человека, гемоглобин человека, креатин мышцы человека, или металлотионеин человека. Промотор может также являться ткань-специфичным промотором, таким как мышечноспецифичным или кожеспецифичным промотором, природным или синтетическим. Примеры таких промоторов описаны в заявке на публикацию патента США № US20040175727, содержание которой включено в настоящий документ в полном объеме.
Вектор может также включать сигнал полиаденилирования, который может находиться ниже кодирующей последовательности HA. Сигнал полиаденилирования может представлять собой сигнал полиаденилирования SV40, сигнал полиаденилирования LTR, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигнал полиаденилирования гормона роста человека (hGH), или сигнал полиаденилирования человеческого β-глобина. Сигнал полиаденилирования SV40 может являться сигналом полиаденилирования pCEP4 вектора (Invitrogen, San Diego, CA).
Вектор может также включать энхансер выше кодирования консенсусного гемагглютинина. Энхансер может быть необходимым для экспрессии ДНК. Энхансер может представлять собой актин человека, миозин человека, гемоглобин человека, креатин мышцы человека, или вирусный энхансер, такой, как один из CMV, HA, RSV или EBV. Усиления полинуклеотидных функций описаны в патентах США под номерами 5593972, 5962428, и WO 94/016737, содержание каждого из которых полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.
Вектор может также включать начало репликации млекопитающих, чтобы сохранить вектор внехромосомно и производить множественные копии вектора в клетке. Вектор может представлять собой pVAX1 (фиг. 1), pCEP4 или pREP4 от компании Invitrogen (San Diego, CA), который может включать начало репликации вируса Эпштейна-Барра и кодирующий регион ядерного антигена EBNA-1, которые могут производить высококачественные копии эписомной репликации без интеграции. Вектор может представлять собой pVAX1 с изменениями, такими, как описано в параграфе, относящемся к фиг. 1 в вышеизложенном разделе Краткое описание фигур. Основой вектора может представлять собой pAV0242. Вектор может быть дефектным по репликации аденовирусным типа 5 (Ad5) вектором.
Вектор может также включать регуляторную последовательность, которая может быть хорошо подходящей для экспрессии генов в клетках млекопитающих и человека, в которые вводится вектор. Консенсусная последовательность, кодирующая гемагглютинин может содержать кодон, который может предоставить возможность более эффективной транскрипции кодирующей последовательности в клеткехозяине.
Вектор может представлять собой pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), который может быть использован для производства белка в Escherichia coli (E.coli). Вектор может также представлять собой pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), который может быть использован для производства белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вектор может также представлять собой полную систему экспрессии бакуловируса MAXBAC™ (Invitrogen, San Diego, Calif.), которая может быть использована для производства белка в клетках насекомых. Вектор может также представлять собой рсДНК1 или рсДНК3 (Invitrogen, San Diego, Calif), которые могут быть использованы для производства белка в клетках млекопитающих, таких как клетки яичников китайского хомяка (CHO). Вектор может представлять собой векторы экспрессии и системы для производства белка при помощи рутинных способов и легко доступных исходных материалов, включая описанные в работе Sambrook et al., Molecular Cloning an Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989), которая включена полностью по ссылке.
Вектор может представлять собой pGX2009 или pGX2006, который может быть использован для экспрессии консенсусного гемагглютининового антигена. Вектор pGX2009 (4739 пар оснований, фиг. 2; SEQ ID NO: 5) представляет собой модифицированную pVAX1 плазмиду с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей консенсусный белок H1 (аминокислота SEQ ID NO: 4, кодируемая посредством SEQ ID NO: 3) которая содержит лидерную последовательность IgE (аминокислота SEQ ID NO: 12, кодируемая посредством SEQ ID NO: 11) связанная с консенсусной H1 аминокислотной последовательностью (аминокислота SEQ ID NO: 2 кодируемая посредством SEQ ID NO: 1). Вектор pGX2006 (4628 пар оснований; фиг. 3, SEQ ID NO: 8) представляет собой pVAX1 плазмиду с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует консенсусный H2 белок (аминокислота SEQ ID NO: 7 кодируемая SEQ ID NO: 6).
Генетические конструкции и компоненты, раскрытые в настоящем документе, которые включают консенсусные последовательности, кодирующие гемагглютинин, могут быть использованы для экспрессии других белков вируса гриппа, таких как H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 вируса гриппа А, белков гемагглютинина или нейраминидазы вируса гриппа В при помощи кодирующих последовательностей для белков H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 вируса гриппа A, белков гемагглютинина или нейраминидазы вируса гриппа B включенных в место консенсусных последовательностей, кодирующих гемагглютинин.
4. Фармацевтические композиции
В настоящем документе представлены фармацевтические композиции по настоящему изобретению, которые содержат приблизительно от 1 нг до приблизительно 10 мг ДНК. В некоторых вариантах, фар- 13 031321 мацевтические композиции по настоящему изобретению содержат ДНК в диапазоне от: 1) по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг или по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250,
255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360,
365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470,
475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680,
685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790,
795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900,
905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 мкг, или по меньшей мере 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 мг или более; и 2) вплоть до и включая 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг, или вплоть до и включая 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235,
240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345,
350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455,
460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665,
670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775,
780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885,
890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, или 1000 мкг, или вплоть до и включая 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 мг. В некоторых вариантах фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат приблизительно от 5 нг до приблизительно 10 мг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат приблизительно от 25 нг до приблизительно 5 мг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 50 нг до приблизительно 1 мг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 0,1 до приблизительно 500 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 1 до приблизительно 350 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 5 до приблизительно 250 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 10 до приблизительно 200 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 15 до приблизительно 150 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 20 до приблизительно 100 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 25 до приблизительно 75 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 30 до приблизительно 50 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 35 до приблизительно 40 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 100 до приблизительно 200 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 10 до приблизительно 100 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 20 до приблизительно 80 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 25 до приблизительно 60 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 30 нг до приблизительно 50 мкг ДНК. В некоторых вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 35 нг до приблизительно 45 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 0,1 до приблизительно 500 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 1 до приблизительно 350 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 25 до приблизительно 250 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах фармацевтические композиции содержат приблизительно от 100 до приблизительно 200 мкгДНК.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению сформулированы в соответствии со способом введения, который будет использоваться. В случаях, когда фармацевтические композиции являются инъекционными фармацевтическими композициями, они стерильны, апирогенны и свободны от твердых частиц. Предпочтительнее использовать изотоническую форму лекарственного средства. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях являются предпочтительными изотонические растворы, такие как фосфатный буферный солевой раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах, в форму лекарственного средства добавляется вещество суживающее сосуды.
Предпочтительно фармацевтическая композиция представляет собой вакцину, и более предпочтительно ДНК вакцину.
В настоящем документе предоставлены вакцины, способные генерировать в организме млекопитающего иммунный ответ против одного или более серотипов гриппа. Вакцина может содержать генетическую конструкцию, как описано выше. Вакцина может содержать множество векторов, каждый направленный на один или более серотипов вируса гриппа A, такие как H1-H16, гемагглютинин вируса
- 14 031321 гриппа B или их комбинации. Вакцина может содержать одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют один или более консенсусных гемагглютининовых антигенов. Когда вакцина состоит более чем из одной консенсусной гемагглютининовой последовательности нуклеиновых кислот, все такие последовательности могут находиться на одной молекуле нуклеиновой кислоты или каждая такая последовательность может находиться на различных молекулах нуклеиновой кислоты. Кроме того, вакцины, которые содержат более одной консенсусной гемагглютининовой последовательности нуклеиновых кислот, могут содержать молекулы нуклеиновых кислот с одной консенсусной гемагглютининовой последовательностью нуклеиновых кислот и молекулы нуклеиновых кислот с более чем одной консенсусной гемагглютининовой последовательностью нуклеиновых кислот. Кроме того, вакцины, содержащие одну или более консенсусных гемагглютининовых последовательностей нуклеиновых кислот, могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для одного или более белков, выбранные из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 и нейраминидазы вируса гриппа B.
В некоторых вариантах, вакцины могут содержать белки. Некоторые вакцины могут содержать один или более консенсусных гемагглютининовых антигенов, таких как H1, H2, U2 и ВНА. Вакцины могут содержать один или более других белков выбранных из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 и нейраминидазы вируса гриппа В. Вакцины могут содержать один или более других белков, выбранных из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа B.
Вакцина может представлять собой ДНК-вакцину. ДНК-вакцина может содержать множество одинаковых или различных плазмид, содержащих одну или более из консенсусных гемагглютининовых последовательностей нуклеиновых кислот. ДНК-вакцины могут содержать одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют один или более консенсусных гемагглютининовых антигенов. Когда ДНК-вакцина состоит из более чем одной консенсусной гемагглютининовой последовательности нуклеиновых кислот, все такие последовательности могут находиться на одной плазмиде, или каждая такая последовательность может находиться на различных плазмидах, или некоторые плазмиды могут включать одну консенсусную гемагглютининовую последовательность нуклеиновых кислот, в то время как другие плазмиды обладают более чем одной консенсусной гемагглютининовой последовательностью нуклеиновых кислот. Кроме того, ДНК-вакцина может дополнительно включать одну или более консенсусных кодирующих последовательностей для одного или более белков, выбранных из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 вируса гриппа A, гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа B. Такие дополнительные кодирующие последовательности могут находиться на одной и той же плазмиде или каждая на разных плазмидах и на плазмидах, отличных от тех, которые содержат одну или более из консенсусных гемагглютининовых последовательностей нуклеиновых кислот.
В некоторых вариантах, вакцины могут содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют антигены гриппа в сочетании с антигенами вируса гриппа. В некоторых вариантах, последовательности нуклеиновых кислот кодируют один или более консенсусных гемагглютининовых антигенов, таких как H1, H2, U2 и ВНА. В некоторых вариантах, последовательности нуклеиновых кислот кодируют один или более других белков, выбранных из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 вируса гриппа A, гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа B. В некоторых вариантах, вакцины содержат один или более консенсусных гемагглютининовых антигенов, таких как H1, H2, U2 и ВНА. В некоторых вариантах, вакцины содержат один или более других белков, выбранных из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 вируса гриппа A, гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа B.
В некоторых вариантах, вакцины содержат комбинацию из трех или более консенсусных гемагглютининовых последовательностей нуклеиновых кислот, включая те, которые кодируют одну или более из H1, H2, U2 и ВНА. В некоторых вариантах, вакцины содержат комбинацию из трех или более гемагглютининовых последовательностей нуклеиновых кислот включая те, которые кодируют консенсусный U2, консенсусный ВНА и H3 гемагглютинин. В некоторых вариантах, вакцины содержат комбинацию из трех или более гемагглютининовых последовательностей нуклеиновых кислот, включая те, которые кодируют консенсусный ВНА, H1 гемагглютинин и H3 гемагглютинин. В некоторых вариантах, вакцины содержат одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют один или более антигенов вируса гриппа, раскрытых в заявке на патент США серийный № 12/375518, которая включена в настоящий документ посредством ссылки и/или в заявке на патент США серийный № 12/269824, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах вакцины содержат последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19, которая кодирует SEQ ID NO: 20 (которая представляет собой гемагглютинин H1, раскрытый в заявке на патент США серийный № 12/375518 как SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37 соответственно в том документе) и/или последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21, которая кодирует SEQ ID NO: 22 (которая представляет собой гемагглюти
- 15 031321 нин H1, раскрытый в заявке на патент США серийный № 12/269824 как SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 соответственно в том документе). В некоторых вариантах, вакцины содержат последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23, которая кодирует SEQ ID NO: 24 (которая представляет собой гемагглютинин H3, раскрытый в заявке на патент США серийный № 12/269,824 как SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно в том документе).
В некоторых вариантах вакцины содержат комбинацию из трех или более консенсусных белков гемагглютинина, включающих один или более из H1, H2, U2 и ВНА. В некоторых вариантах вакцины содержат комбинацию из трех или более белков гемагглютинина, включающих консенсусный U2, консенсусный ВНА и H3 гемагглютинин. В некоторых вариантах вакцины содержат комбинацию из трех или более белков гемагглютинина, включающих консенсусный ВНА, H1 гемагглютинин и H3 гемагглютинин. В некоторых вариантах, вакцины содержат один или более антигенов из заявки на патент США серийный № 12/375518 и/или из заявки на патент США серийный № 12/269824. В некоторых вариантах, вакцины содержат SEQ ID NO: 20 и/или SEQ ID NO: 22 и/или SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах, вакцины содержат комбинацию из: 1) консенсусного гемагглютининового U2 белка и/или последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих консенсусный гемагглютининовый U2 белок, 2) консенсусного гемагглютининового ВНА белка и/или последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих консенсусный гемагглютининовый ВНА белок, и 3) белок гемагглютинина H3, раскрытый в SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах, вакцины содержат комбинацию из: 1) консенсусного гемагглютининового ВНА белка и/или последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих консенсусный гемагглютининовый ВНА белок, 2) белок гемагглютинин H1 имеющий SEQ ID NO: 20 и/или SEQ ID NO:22 и/или белок гемагглютинин H1, кодирующий последовательности нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 19 и/или SEQ ID NO:21, и 3) белок гемагглютинин H3 имеющий SEQ ID NO:24 и/или белок гемагглютинин H3 кодирующий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23).
ДНК вакцины раскрыты в патентах США под номерами 5593972, 5739118, 5817637, 5830876, 5962428, 5981505, 5580859, 5703055, и 5676594, содержание которых включено в настоящий документ в полном объеме в качестве ссылки. ДНК-вакцины могут дополнительно содержать элементы или реагенты, которые препятствуют их интеграции в хромосомы. Вакцина может представлять собой РНК гемагглютининового антигена. Вакцина РНК может быть введена в клетку.
Вакцина может представлять собой рекомбинантную вакцину, содержащую генетическую конструкцию или антиген, описанные выше. Вакцина может также содержать один или более консенсусных гемагглютининовых антигенов в виде одной или более белковых субъединиц, одну или более убитых частиц гриппа, содержащих один или более консенсусных гемагглютининовых антигенов, или одну или более ослабленных частиц гриппа, содержащих один или более консенсусных гемагглютининовых антигенов. Ослабленные вакцины могут представлять собой ослабленные живые вакцины, убитые вакцины и вакцины, которые используют рекомбинантные векторы для доставки чужеродных генов, которые кодируют одну или более консенсусных гемагглютининовых антигенов, а также субъединичных и гликопротеиновых вакцин. Примеры ослабленных живых вакцин, тех, которые используют рекомбинантные векторы, чтобы доставить чужеродные антигены, субъединичные вакцины и гликопротеиновые вакцины, описаны в патентах США под номерами: 4510245; 4797368; 4722848; 4790987; 4920209; 5017487; 5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310668; 5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 5453364; 5462734; 5470734; 5474935; 5482713; 5591439; 5643579; 5650309; 5698202; 5955088; 6034298; 6042836; 6156319 и 6589529, содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Вакцина может содержать векторы и/или белки, направленные на серотипы вируса гриппа A из отдельных регионов в мире, например из Азии. Вакцина может быть также направлена против серотипов вируса гриппа A свиного происхождения, которые в настоящее время инфицируют людей. Вакцина может содержать векторы и/или белки, направленные на вирус гриппа B из отдельных регионов мира. Вакцина может быть также направлена против вируса гриппа B, который инфицирует людей. Эта вакцина может включать один или более векторов и/или один или более белков, направленных на один или более штаммов вируса гриппа A и/или B.
Предоставляемая вакцина может быть использована, чтобы вызвать иммунные ответы, в том числе терапевтические или профилактические иммунные ответы. Могут быть сгенерированы антитела и/или Tклетки киллеры, которые направлены на консенсусный гемагглютининовый антиген, а также широко на множественные перекрестные подтипы вирусов гриппа. Такие антитела и клетки могут быть выделены.
Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может представлять собой функциональные молекулы, такие как транспортные средства, адъюванты, носители или разбавители. Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может быть веществом, облегчающим трансфекцию, которое может включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМы), неполный адъювант Фрейда, аналоги ЛПС (липополисахаридов), включая монофосфориллипид A, мурамиловые пептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален и сквален, гиалуроновая кислота,
- 16 031321 липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы, или наночастицы, или другие известные вещества облегчающие трансфекцию.
Вещество облегчающее трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая полиL-глутамат (LGS), или липид. Вещество облегчающее трансфекцию, представляет собой поли-Lглутамат и более предпочтительно поли-Ь-глутамат присутствует в вакцине в концентрации меньше чем 6 мг/мл. Вещество облегчающее трансфекцию может также включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМы), неполный адъювант Фрейда, аналог ЛПС, включая монофосфориллипид A, мурамиловые пептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален, и сквален, и гиалуроновая кислота, могут также использоваться для введения в соединении с генетической конструкцией. В некоторых вариантах, ДНК векторные вакцины могут также включать вещества, облегчающие трансфекцию, такие как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, как ДНК-липосомные смеси (см., например, WO9324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы, или наночастицы, или другие известные вещества, облегчающие трансфекцию. Предпочтительно, вещество облегчающее трансфекцию представляет собой полианион, поликатион, включая поли-Ь-глутамат (LGS), или липид. Концентрация вещества, облегчающего трансфекцию, в вакцине составляет меньше чем 4 мг/мл, меньше чем 2 мг/мл, меньше чем 1 мг/мл, меньше чем 0,750 мг/мл, меньше чем 0,500 мг/мл, меньше чем 0,250 мг/мл, меньше чем 0,100 мг/мл, меньше чем 0,050 мг/мл, или меньше чем 0,010 мг/мл.
Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может являться адъювантом. Адъювантом могут быть и другие гены, которые экспрессируются в альтернативной плазмиде или доставляются как белки в сочетании с вышеуказанной плазмидой в вакцине. Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из: α-интерферона (IFN-α), β-интерферона (IFN-β), γ-интерферона, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), TNFa, TNF[k GM-CSF, эпидермального фактора роста (EGF), кожного хемокина, привлекающего T-клетки (CTACK), эпителиального хемокина, экспрессируемого тимусом (TECK), эпителиального хемокина, связанного со слизистой оболочкой (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80,CD86 включая IL15, с удаленной сигнальной последовательностью и, факультативно включающий сигнальный пептид из IgE. Адъювантом могут быть IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFmmm, TNF]]], GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, или их комбинация.
Другие гены, которые могут оказаться полезными адъювантами включают те, которые кодируют: MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, сосудистый фактор роста, фактор роста фибробластов, IL-7, фактор роста нервов, сосудистый эндотелиальный фактор роста, Fas, TNF рецептор, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспаза ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивный NIK, SAP K, SAP1, INK, гены интерферонового ответа, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAILR4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
Эта вакцина может дополнительно содержать вещество-помощник генетической вакцины, как описано в заявке на патент США серийный № 021579 поданной 1 апреля, 1994 года, содержание которой включено в настоящий документ в полном объеме в качестве ссылки.
5. Способы доставки
В настоящем документе предоставлен способ доставки фармацевтических лекарственных средств, предпочтительно вакцин, для предоставления генетических конструкций и белков гемагглютининового антигена, которые содержат эпитопы, что делает их особенно эффективными иммуногенами, против которых может быть вызван иммунный ответ на вирусные инфекции гриппа. Способ доставки вакцины, или вакцинация, может быть предоставлен, чтобы вызвать терапевтический и/или профилактический иммунный ответ. Процесс вакцинации может генерировать в организме млекопитающего иммунный ответ против множества подтипов гриппа, включая серотип H1N1, такой, как H1N1 свиной грипп 2009, или другие сезонные и/или пандемические разновидности. Вакцина может быть доставлена индивидууму, чтобы модулировать активность иммунной системы млекопитающих и усиливать иммунный ответ. Доставкой вакцины может быть трансфекция антигена HA, как молекулы нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется в клетке, и доставлена на поверхность клетки, с которой иммунная система распознает и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответ. Доставку вакцины можно использовать, чтобы индуцировать или вызывать иммунный ответ и у млекопитающих против множества вирусов гриппа, путем введения вакцины млекопитающим, как описано в настоящем документе.
После доставки вакцины млекопитающим, и в связи с этим вектора в клетки млекопитающих, трансфицированные клетки будут экспрессировать и секретировать соответствующий белок вируса гриппа, в том числе, по меньшей мере, один из консенсусных антигенов, и, предпочтительно, H1, H2, U2, и ВНА. Эти секретируемые белки или синтетические антигены, будут распознаваться иммунной системой как чужеродные, и она будет подготавливать иммунный ответ, который может включать в себя: ан
- 17 031321 титела, произведенные против антигенов, и T-клеточный ответ специфичный против антигена. В некоторых примерах, млекопитающие, вакцинированные вакциной, обсуждаемой здесь, будут иметь праймированную иммунную систему и, когда столкнутся со штаммами вируса гриппа, праймированная иммунная система предоставит возможность быстрого устранения последующих вирусов гриппа, будь то посредством гуморального, клеточного, или обоих видов иммунитета. Вакцина может быть доставлена индивидууму, чтобы модулировать активность иммунной системы индивидуума и тем самым усиливая иммунный ответ.
Вакцина может быть доставлена в виде ДНК-вакцины и способы доставки ДНК-вакцин описаны в патентах США под номерами 4945050 и 5036006, содержание обоих включено в настоящий документ в полном объеме в качестве ссылки.
Вакцину можно вводить млекопитающим, чтобы вызвать иммунный ответ у млекопитающих. Млекопитающим может быть человек, приматы, не являющиеся людьми, корова, свинья, овца, коза, антилопа, бизон, водяной буйвол, полорогие, олень, ежи, слоны, лама, альпака, мыши, крысы, или куры, и, желательно, человек, корова, свинья или курица.
а) Комбинированные виды лечения
Фармацевтические композиции, предпочтительно вакцины можно вводить в комбинации с одним или более другими белками гриппа или генами, кодирующими H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 вируса гриппа A, гемагглютинин и нейраминидазу вирусам гриппа B. Вакцину можно вводить в сочетании с белками или генами, кодирующими адъюванты, которые могут включать α-интерферон (IFN-α), β-интерферон (IFN-β), γинтерферон, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFa, TNF[< GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, сосудистый фактор роста, фактор роста фибробластов, IL-7, фактор роста нервов, сосудистый эндотелиальный фактор роста, Fas, TNF рецептор, Flt, Apo-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазу ICE, Fos, cjun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивный NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены интерферонового ответа, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, или ТАР2, или их функциональные фрагменты.
б) Пути введения
Вакцину можно вводить различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, через слизистую, местный, ингаляционный, буккальный, внутриплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный интратекальный и внутрисуставный или их комбинации. Для применения в ветеринарии, композицию можно вводить в соответствующей приемлемой форме лекарственного средства в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить схему дозирования и способ применения, которые являются наиболее подходящими для конкретного животного. Вакцину можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольного устройства для инъекций, генной пушки для микропроекционной бомбардировки, или другими физическими способами, такими как электропорация (ЭП), гидродинамический способ, или ультразвук.
Вектор этой вакцины может быть доставлен млекопитающему при помощи нескольких хорошо известных технологий, включая ДНК-инъекцию (также называемую ДНК-вакцинацией) с электропорацией in vivo и без нее, опосредованной липосомами, облегченной наночастицами, рекомбинантных векторов, таких как рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный вирус, связанный с аденовирусом и рекомбинантные вакцины. Антиген HA может быть доставлен посредством ДНК инъекции, и вместе с электропорацией in vivo.
в) Электропорация
Введение вакцины посредством электропорации плазмид вакцины может быть выполнено с помощью устройства электропорации, которое может быть сконфигурировано таким образом, чтобы доставлять в заданные ткани млекопитающих импульс энергии, эффективный для того, чтобы служить причиной образования обратимых пор в мембранах клеток, и предпочтительно импульс энергии представляет собой постоянный ток, похожий на заранее заданный пользователем ток. Устройство электропорации может содержать компонент электропорации и электродный узел или узел управления. Компонент электропорации может включать в себя и объединять один или более различных элементов устройства электропорации, в том числе контроллер, генератор сигналов тока специальной формы, тестер импеданса, регистратор сигнала, входной элемент, элемент отчетов о состоянии, коммуникационный порт, компонент памяти, источник питания и выключатель питания. Электропорация может быть выполнена с использованием устройства электропорации in vivo, например CELLECTRA® EP system (VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) или электропоратор Elgen (Genetronics, San Diego, CA), чтобы облегчить трансфекцию клеток плазмидой.
- 18 031321
Компонент электропорации может функционировать как один из элементов устройства электропорации, а другие элементы являются отдельными элементами (или компонентами) во взаимодействии с компонентом электропорации. Компонент электропорации может функционировать как несколько элементов устройства электропорации, которые могут быть во взаимодействии с еще другими элементами устройства электропорации отдельно от компонента электропорации. Элементы устройства электропорации, существующие как части одного электромеханического или механического устройства, возможно, не ограничены, так как эти элементы могут функционировать как одно устройство, либо как отдельные элементы во взаимодействии друг с другом. Компонент электропорации может быть способным доставлять импульс энергии, который производит постоянный ток в заданную ткань, и включает механизм, обратной связи. Электродный узел может включать матрицу, где электродный узел получает импульс энергии от компонента электропорации и доставляет его таким же к заданной ткани через электроды. По меньшей мере один из множества электродов является нейтральным во время доставки импульса энергии и измеряет импеданс в заданной ткани и сообщает импеданс компоненту электропорации. Механизм обратной связи может получать измеренный импеданс и может регулировать импульс энергии, доставленный компонентом электропорации, чтобы поддерживать постоянный ток.
Множество электродов может доставлять импульс энергии по децентрализованному принципу. Множество электродов может передать импульс энергии по децентрализованному принципу при помощи контроля электродов в запрограммированной последовательности, и запрограммированная последовательность вводится пользователем в компонент электропорации. Запрограммированная последовательность может содержать множество импульсов, доставляемых в последовательности, в которой каждый импульс из множества импульсов доставляется по меньшей мере двумя активными электродами с одним нейтральным электродом, который измеряет импеданс, и где последующий импульс из множества импульсов доставляется одним отличным из по меньшей мере двух активных электродов с одним нейтральным электродом, который измеряет импеданс.
Механизм обратной связи может осуществляться либо при помощи аппаратного обеспечения или посредством программного обеспечения. Механизм обратной связи может осуществляться при помощи аналоговой схемы замкнутой петли. Обратная связь происходит через каждые 50, 20, 10 или 1 мкс, но предпочтительно представляет собой обратную связь в режиме реального времени или немедленную (т.е., по существу немедленную, как определяется имеющимися способами для определения времени ответа). Нейтральный электрод может измерять импеданс в заданной ткани и передавать импеданс к механизму обратной связи, а механизм обратной связи реагирует на импеданс и регулирует энергетический импульс, чтобы поддерживать постоянный ток на уровне, подобном заданному току. Механизм обратной связи может поддерживать постоянный ток непрерывно и немедленно во время доставки импульса энергии.
Примеры устройства электропорации и способов электропорации, которые могут облегчать доставку ДНК-вакцин настоящего изобретения, включают те, которые описаны в патенте США № 7245963 по Draghia-Akli et al., патентной публикации США 2005/0052630 представленной Smith et al., содержание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте. Другие устройства электропорации и способы электропорации, которые могут быть использованы для облегчения доставки ДНК-вакцин, включают те, которые предоставлены в находящейся в процессе одновременного рассмотрения и сообладания патентной заявке США серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., которая заявляет приоритет в соответствии с параграфом 119 (e) 35 U.S.G'. предварительных заявок на патент США под серийными номерами 60/852149, поданной 17 октября 2006 г. и 60/978982, поданный 10 октября 2007 г., каждая из которых включена в настоящий документ во всей своей полноте.
Патент США № 7245963 по Draghia-Akli, et al. описывает модульные системы электродов и их использование для облегчения введения биомолекул в клетки выбранной ткани в теле человека или животного, или в растении. Модульные системы электродов могут содержать множество игольчатых электродов; иглу для подкожных инъекций; электрический разъем, который обеспечивает проводящую связь от программируемого контроллера импульса постоянного тока к множеству игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может захватывать множество игольчатых электродов, которые установлены на опорный элемент и надежно вставить их в выбранную ткань в теле человека или животного или в растении. Биомолекулы затем доставляются через иглу для подкожных инъекций в выбранные ткани. Программируемый контроллер импульса постоянного тока активируется и электрический импульс постоянного тока подается на множество игольчатых электродов. Применение электрических импульсов постоянного тока способствует внедрению биомолекулы в клетку между множеством электродов. Полное содержание патента США № 7245963 включено в настоящий документ посредством ссылки.
Патентная публикация США 2005/0052630 представленная Smith, et al., описывает устройство электропорации, которое может быть использовано для эффективного облегчения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани в теле человека или животного или в растении. Устройство электропорации содержит электрокинетическое устройство (ЭКУ устройство), управление которым осуществляется при помощи программного обеспечения или встроенных программ. ЭКУ устройство производит серию моделей программируемых импульсов постоянного тока между электродами в матрице на основе контроля
- 19 031321 пользователя и ввода параметров импульса, а также предоставляет возможность запоминания и получения данных о форме сигнала тока. Устройство электропорации также включает сменный диск электродов, имеющий матрицу игольчатых электродов, центральный канал для инъекционной иглы, и съемный установочный диск. Полное содержание патентной публикации США 2005/0052630 включено в настоящий документ посредством ссылки.
Электродные матрицы и способы, описанные в патенте США № 7245963 и патентной публикации США 2005/0052630 могут быть адаптированы для глубокого проникновения не только в такие ткани как мышцы, но и в другие ткани или органы. Вследствие конфигурации электродной матрицы инъекционная игла (для доставки биомолекулы выбора) также вставляется полностью в орган-мишень и инъекцию вводят перпендикулярно к целевой ткани, в области, форма и размер которой предварительно определена электродами. Электроды описаны в патенте США № 7245963 и в патентной публикации США 2005/005263, предпочтительно с длиной 20 мм и калибром 21.
Кроме того, в некоторых вариантах, которые включают устройства электропорации и используют их, предусматриваются устройства электропорации, которые описаны в следующих патентах: патент США под номером 5273525, выданный 28 декабря 1993 г., патенты США № 6110161, выданный 29 августа 2000 г., № 6261281 выданный 17 июля 2001 г. и № 6958060 выданный 25 октября 2005 г., и патент США № 6939862 выданный 6 сентября 2005 г.. Кроме того, патенты, относящиеся к предмету обсуждения, предоставлены в патенте США № 6697669 выданном 24 февраля 2004 г., который описывает доставку ДНК с помощью любого из разнообразия устройств, а также в патенте США № 7328064, выданном 5 февраля 2008 г., представляющем способ инъецирования ДНК, рассматриваемый в настоящем документе. Вышеуказанные патенты включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте.
г) Способ приготовления вакцины
В настоящем документе предоставлены способы получения ДНК плазмид, которые содержат ДНКвакцины, обсуждаемые здесь. ДНК плазмиды, после финального этапа субклонирования в экспрессирующей плазмиде млекопитающих, могут быть использованы для инокулирования культуры клеток в крупномасштабный резервуар ферментации, с использованием известных способов в данной области техники.
ДНК плазмиды для использования с устройством ЭП по настоящему изобретению могут быть сформулированы или изготовлены с использованием комбинации известных устройств и способов, но предпочтительно они производятся с использованием оптимизированной технологии производства плазмиды, описанной в лицензированной, находящейся в процессе одновременного рассмотрения предварительной заявки США серийный № 60/939792, которая была подана 23 мая 2007 г. В некоторых примерах ДНК плазмиды, используемые в этих исследованиях, могут быть сформулированы в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технология изготовления также включает или объединяет различные устройства и протоколы, которые, как правило, известны обычным специалистам в этой области техники, в дополнение к тем, которые описаны в патенте США серийный № 60/939792, включая те, которые описаны в лицензированном патенте, патенте США № 7238522, который выдан 3 июля 2007 г. Вышеупомянутые заявка и патент США серийный № 60/939792 и патент США № 7238522, соответственно, включены в настоящий документ во всей их полноте.
Примеры
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами. Следует понимать, что эти примеры, показывающие предпочтительные варианты осуществления изобретения, даны только в качестве иллюстрации. Исходя из вышеизложенного и из этих примеров, специалист в данной области техники может установить основные характеристики этого изобретения, и, не отходя от их сути и объема, может сделать различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным видам применения и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые продемонстрированы и описаны в настоящем документе, будут очевидны специалистам в данной области техники из предшествующего описания. Такие изменения также предназначены для того, чтобы находиться в пределах рамок формулы изобретения.
Пример 1. pGX2009 (pH1HA09) - плазмида, кодирующая гемагглютининовый антиген гриппа 2009 H1N1 (свиного гриппа)
Остовом pGX2009 (H1HA09) является модифицированный вектор экспрессии pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) под контролем цитомегаловирусного (CMV) предраннего промотора. Исходный pVAX1 приобретали в компании Invitrogen (номер по каталогу V260-20) и хранили при температуре -20°C. Как отмечалось выше, анализ последовательностей продемонстрировал различия между последовательностью pVAX1, которую используют в качестве остова pGX2009 и pVAX1 последовательностью, коммерчески доступной в компании Invitrogen. Различия изложены выше.
Плазмида pGX2009, также известная как pH1HA09, включает в себя последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует консенсусную молекулу гемагглютинина гриппа 2009 H1N1 (свиного гриппа).79 первичных последовательностей, используемых для генерирования консенсусной последовательности, были отобраны из базы данных последовательностей гриппа.
Регистрационные номера для нуклеотидных последовательностей, кодирующих последователь
- 20 031321 ность аминокислот для различных белков гемагглютинина H1 вируса гриппа A, а также аминокислотных последовательностей, кодируемых нуклеотидными последовательностями, находятся в базе данных GenBank соответственно следующим регистрационным номерам. Регистрационные номера приведенные не в круглых скобках раскрывают нуклеотидные последовательности и дополнительный список аминокислотных последовательностей, кодируемых ими. Регистрационные номера приведенные в скобках предназначены для записи соответствующей аминокислотной последовательности в базе данных белков GenBank. Регистрационные номера являются следующими:
GQ323579.1 (ACS72657.1), GQ323564.1 (ACS72654.1), GQ323551.1 (ACS72652.1), GQ323530.1 (ACS72651.1), GQ323520.1 (ACS72650.1),
GQ323495.1 (ACS72648.1), GQ323489.1 (ACS72647.1), GQ323486.1 (ACS72646.1), GQ323483.1 (ACS72645.1), GQ323455.1 (ACS72641.1), GQ323451.1 (ACS72640.1), GQ323443.1 (ACS72638.1), GQ293077.1 (ACS68822.1), GQ288372.1 (ACS54301.1), GQ287625.1 (ACS54262.1), GQ287627.1 (ACS54263.1), GQ287623.1 (ACS54261.1), GQ287621.1 (ACS54260.1), GQ286175.1 (ACS54258.1), GQ283488.1 (ACS50088.1), GQ280797.1 (ACS45035.1), GQ280624.1 (ACS45017.1), GQ280121.1 (ACS45189.1), GQ261277.1 (ACS34968.1), GQ253498.1 (ACS27787.1), GQ323470.1 (ACS72643.1), GQ253492.1 (ACS27780.1), FJ981613.1 (ACQ55359.1), FJ971076.1 (АСР52565 1), FJ969540.1 (АСР44189.1), FJ969511.1 (АСР44150.1), FJ969509.1 (АСР44147.1), GQ255900.1 (ACS27774.1), GQ255901.1 (ACS27775.1), FJ966974.1 (АСР41953.1), GQ261275.1 (ACS34967.1), FJ966960.1 (ACP41935.1),FJ966952.1 (АСР41926.1), FJ966082.1 (АСР41105.1), GQ255897.1 (ACS27770.1), CY041645.1 (ACS27249.1), CY041637.1 (ACS27239.1), CY041629 (ACS27229.1), GQ323446.1 (ACS72639.1), CY041597.1 (ACS27189.1), CY041581.1 (ACS14726.1),CY040653.1 (ACS14666.1), CY041573.1 (ACS14716.1), CY041565.1 (ACS14706.1), CY041541.1 (ACS14676.1),GQ258462.1 (ACS34667.1), CY041557.1 (ACS14696.1), CY041549.1 (ACS14686.1), GQ283484.1 (ACS50084.1), GQ283493.1 (ACS50095.1), GQ303340.1 (ACS71656.1), GQ287619.1 (ACS54259.1), GQ267839.1 (ACS36632.1), GQ268003.1 (ACS36645.1), CY041621.1 (ACS27219.1), CY041613.1 (ACS27209.1), CY041605.1 (ACS27199.1), FJ966959.1 (АСР41934.1), FJ966982.1 (АСР41963.1), CY039527.2 (ACQ45338.1), FJ981612.1 (ACQ55358.1), FJ981615.1 (ACQ55361.1), FJ982430.1 (ACQ59195.1), FJ998208.1 (ACQ73386.1), GQ259909.1 (ACS34705.1), GQ261272.1 (ACS34966.1), GQ287621.1 (ACS54260.1), GQ290059.1 (ACS66821.1), GQ323464.1 (ACS72642.1), GQ323473.1 (ACS72644.1), GQ323509.1 (ACS72649.1), GQ323560.1 (ACS72653.1), GQ323574.1 (ACS72655.1), и GQ323576.1 (ACS72656.1).
Аминокислотные последовательности были загружены из базы данных последовательностей NCBI и выравнивание и консенсусные последовательности были сгенерированы с использованием Clustal X. Высокоэффективная лидерная последовательность, лидерный IgE, был расплавлен в рамке выше инициирующего кодона для облегчения экспрессии. Для того чтобы иметь более высокий уровень экспрессии, использование кодонов этого расплавленного гена было адаптировано к смещению кодона генов Homo Sapiens. Кроме того, также была проведена РНК оптимизация: регионов с очень высоким (>80%) или очень низким (<30%) содержанием GC и действующих в цис-положении мотивов последовательности, таких как внутренние TATA боксы, хи-сайты и сайты рибосомного входа удалось избежать. Весь процесс был синтетически произведен на Geneart (Regensburg, Germany). Синтетически сконструированный ген H1HA09 составил в длину 1818 пар оснований (SEQ ID NO: 1) и был клонирован в pVAX1 в BamHI и XhoI сайтах при помощи Geneart (фиг. 2).
Пример 2. Контрольное введение A/Mexico/InDRE4487/2009 хорькам, иммунизированным гриппом pGX2009
Эксперименты контрольного заражения проводились с использованием хорьков, предпочтительной моделью для гриппа. Хорьки были привиты с использованием плазмиды pGX2009
Животные: 4 группы х 5 животных/на группу, плюс одна контрольная группа с 4 животными = 24 хорька всего (самцов)
Продолжительность: 18 недель (включая контрольное заражение)
Доза: .2 мг плазмиды
Краткое изложение протокола:
Хорьки были случайным образом распределены по группам ДНК-вакцинации. Животные были привиты в дни исследования: День 0, День 28, День 56. Животные были анестезированы коктейлем кетамин/мидазол, изофлуран или эквивалент в соответствии с утвержденными протоколами анестезии и вакцинированы ВМ (внутримышечно) комбинациями ДНК-вакцин гриппа. Группам 1 и 2 тотчас же провели электропорацию с использованием устройства электропорации (ЭП) адаптивного постоянного тока CELLECTRA® со следующими показателями: 0,5 A, импульсы 52 мс, 0,2 с между импульсами, 4 с задержка разряда импульсов, всего 3 импульса. Контрольные животные представляли собой наивный (не подвергнутый какому-либо воздействию) контроль (без введения плазмиды, без проведения ЭП). Хорь
- 21 031321 кам была предоставлена возможность прийти в себя после анестезии в своих клетках и за ними внимательно наблюдали в течение 24 ч, чтобы обеспечить полное выздоровление.
Пища и вода были доступны без ограничений на протяжении всей продолжительности исследования. На день 84 животные были контрольно заражены интраназальной инфекцией с 1 мл MX10 (A/Mexico/InDRE4487/2009, 5 χ 105 БОЕ/мл). Животные находились под ежедневным наблюдением за клиническими признаками (масса тела, температура и т.д.), с помощью установленного и утвержденного оценочного листа. На 1, 3, 6, 9 и 15 дни после инфицирования были собраны промывные воды носа и ректальные тампоны. Легкие были собраны на 15-й день. Образцы хранились в RNAlater (стабилизатор РНК в тканях) для вирусной нагрузки ПЦР в реальном времени, среде для инфекционных вирусов (TCDI50) и формалине для гистологии, когда предназначено.
Фиг. 4 демонстрирует анализ ингибирования гемагглютинации, который производится с сыворотками от иммунизированных хорьков (3 иммунизации). Титр > 1:40 считается защитным. Пунктирная линия указывает на метку 1:40. Все животные после 3-х прививок имели показатели выше метки 1:40. На фиг. 5 продемонстрированы результаты контрольного заражения иммунизированных и неиммунизированных хорьков новым H1N1 штаммом MX10 (A/Mexico/InDRE4487/2009). Все иммунизированные хорьки выжили, в то время как 75% наивных хорьков умерли в течение 15-дневного периода.
Перечень последовательностей <110> The Trustees of the University of Pennsylvania
David, Weiner B.
Yan, Jian Morrow, Matthew P.
<120> НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩИЕ БЕЛКИ ВИРУСА ГРИППА, КОМПОЗИЦИИ НА ИХ
ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ <130> 133172.03002 <150> 12/694,238 <151> 2010-01-26 <160> 24 <170> Патентная Версия 3.5 <210> 1 <211> 1695 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность ДНК Вируса гриппа Н1 <400> 1
atgaaggcta tcctcgtcgt gctgctgtac accttcgcca ccgccaacgc cgataccctg 60
tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gacaccgtgg ataccgtgct ggaaaagaac 120
gtgaccgtga cccacagcgt gaacctgctg gaagataagc acaacggcaa gctgtgcaag 180
ctgagaggcg tggcccctct gcacctgggc aagtgcaata tcgccggctg gattctgggc 240
aaccccgagt gcgagagcct gtctaccgct agctcctggt cctacatcgt ggagacaagc 300
agcagcgaca acggcacctg ttaccccggc gacttcatcg actacgagga actgcgggag 360
cagctgagca gcgtgtccag cttcgagcgg ttcgagatct tccccaagac cagctcctgg 420
cccaaccacg acagcaacaa gggcgtgacc gccgcctgtc ctcacgctgg cgccaagagc 480
ttctacaaga acctgatctg gctggtcaag aagggcaaca gctaccccaa gctgagcaag 540
agctacatca acgacaaggg caaagaggtc ctcgtcctct ggggcatcca ccaccctagc 600
accagcgccg accagcagag cctgtaccag aacgccgacg cctacgtgtt cgtgggctca 660
tctcggtaca gcaagaagtt caagcccgag atcgccatca gacccaaagt gcgggaccag 720
gaaggccgga tgaactacta ctggaccctg gtggagcccg gcgacaagat caccttcgag 780
gccaccggca atctggtggt gcccagatac gccttcgcca tggaaagaaa cgccggcagc 840
ggcatcatca tcagcgacac ccccgtgcac gactgcaaca ccacctgtca gacccccaag 900
ggcgccatca acaccagcct gcccttccag aacatccacc ccatcaccat cggcaagtgc 960
cctaagtacg tgaagtccac taagctcaga ctggccaccg gcctgagaaa cgtgcccagc 1020
atccagagca gaggcctgtt tggcgccatt gccggcttta tcgagggcgg ctggaccgga 1080
- 22 031321
atggtggacg ggtggtacgg ctaccaccac cagaatgagc agggcagcgg ctacgccgcc 1140
gacctgaagt ccacacagaa cgccatcgac gagatcacca acaaagtgaa cagcgtgatc 1200
gagaagatga acacccagtt caccgccgtg ggcaaagagt tcaaccacct ggaaaagcgg 1260
atcgagaacc tgaacaagaa ggtggacgac ggcttcctgg acatctggac ctacaacgcc 1320
gagctgctgg tgctgctgga aaacgagcgg accctggact accacgactc caacgtgaag 1380
aatctgtacg agaaagtgcg gagccagctg aagaacaacg ccaaagagat cggcaacggc 1440
tgcttcgagt tctaccacaa gtgcgacaac acctgtatgg aaagcgtgaa gaacggcacc 1500
tacgactacc ccaagtacag cgaggaagcc aagctgaacc gggaagagat cgacggcgtg 1560
aagctggaaa gcacccggat ctaccagatc ctggccatct actctactgt ggccagctca 1620
ctggtgctgg tggtgtccct gggcgccatc tccttttgga tgtgctccaa cggcagcctg 1680
cagtgccgga tctgc 1695
<210> 2 <211> 566 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность Белка Вируса гриппа Hl <400> 2
Met 1 Lys Ala Ile Leu 5 Val Val
Ala Asp Thr Leu 20 Cys Ile Gly
Val Asp Thr 35 Val Leu Glu Lys
Leu Leu 50 Glu Asp Lys His Asn 55
Ala 65 Pro Leu His Leu Gly 70 Lys
Asn Pro Glu Cys Glu 85 Ser Leu
Val Glu Thr Ser 100 Ser Ser Asp
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg
Leu Leu Tyr 10 Thr Phe Ala Thr Ala 15 Asn
Tyr His 25 Ala Asn Asn Ser Thr 30 Asp Thr
Asn 40 Val Thr Val Thr His 45 Ser Val Asn
Gly Lys Leu Cys Lys 60 Leu Arg Gly Val
Cys Asn Ile Ala 75 Gly Trp Ile Leu Gly 80
Ser Thr Ala 90 Ser Ser Trp Ser Tyr 95 Ile
Asn Gly 105 Thr Cys Tyr Pro Gly 110 Asp Phe
Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
- 23 031321
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
- 24 031321
His His 370 Gln Asn Glu Gln Gly 375 Ser Gly Tyr Ala Ala 380 Asp Leu Lys Ser
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565 <210> 3 <211> 1818 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность ДНК Антигена IgE-Hl-HAT <400> 3 ttaattaagg atccgccacc atggactgga cctggattct gttcctggtg gctgctgcca 60
- 25 031321
ctagagtgca cagcatgaag gctatcctcg tcgtgctgct gtacaccttc gccaccgcca 120
acgccgatac cctgtgcatc ggctaccacg ccaacaacag caccgacacc gtggataccg 180
tgctggaaaa gaacgtgacc gtgacccaca gcgtgaacct gctggaagat aagcacaacg 240
gcaagctgtg caagctgaga ggcgtggccc ctctgcacct gggcaagtgc aatatcgccg 300
gctggattct gggcaacccc gagtgcgaga gcctgtctac cgctagctcc tggtcctaca 360
tcgtggagac aagcagcagc gacaacggca cctgttaccc cggcgacttc atcgactacg 420
aggaactgcg ggagcagctg agcagcgtgt ccagcttcga gcggttcgag atcttcccca 480
agaccagctc ctggcccaac cacgacagca acaagggcgt gaccgccgcc tgtcctcacg 540
ctggcgccaa gagcttctac aagaacctga tctggctggt caagaagggc aacagctacc 600
ccaagctgag caagagctac atcaacgaca agggcaaaga ggtcctcgtc ctctggggca 660
tccaccaccc tagcaccagc gccgaccagc agagcctgta ccagaacgcc gacgcctacg 720
tgttcgtggg ctcatctcgg tacagcaaga agttcaagcc cgagatcgcc atcagaccca 780
aagtgcggga ccaggaaggc cggatgaact actactggac cctggtggag cccggcgaca 840
agatcacctt cgaggccacc ggcaatctgg tggtgcccag atacgccttc gccatggaaa 900
gaaacgccgg cagcggcatc atcatcagcg acacccccgt gcacgactgc aacaccacct 960
gtcagacccc caagggcgcc atcaacacca gcctgccctt ccagaacatc caccccatca 1020
ccatcggcaa gtgccctaag tacgtgaagt ccactaagct cagactggcc accggcctga 1080
gaaacgtgcc cagcatccag agcagaggcc tgtttggcgc cattgccggc tttatcgagg 1140
gcggctggac cggaatggtg gacgggtggt acggctacca ccaccagaat gagcagggca 1200
gcggctacgc cgccgacctg aagtccacac agaacgccat cgacgagatc accaacaaag 1260
tgaacagcgt gatcgagaag atgaacaccc agttcaccgc cgtgggcaaa gagttcaacc 1320
acctggaaaa gcggatcgag aacctgaaca agaaggtgga cgacggcttc ctggacatct 1380
ggacctacaa cgccgagctg ctggtgctgc tggaaaacga gcggaccctg gactaccacg 1440
actccaacgt gaagaatctg tacgagaaag tgcggagcca gctgaagaac aacgccaaag 1500
agatcggcaa cggctgcttc gagttctacc acaagtgcga caacacctgt atggaaagcg 1560
tgaagaacgg cacctacgac taccccaagt acagcgagga agccaagctg aaccgggaag 1620
agatcgacgg cgtgaagctg gaaagcaccc ggatctacca gatcctggcc atctactcta 1680
ctgtggccag ctcactggtg ctggtggtgt ccctgggcgc catctccttt tggatgtgct 1740
ccaacggcag cctgcagtgc cggatctgca tctaccccta cgacgtgccc gactacgcct 1800
gatgactcga ggcgcgcc 1818
<210> 4 <211> 593
- 26 031321 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность Антигена IgE-Hl-HAT <400> 4
Met Asp 1 Trp Thr Trp 5 Ile Leu Phe Leu Val 10 Ala Ala Ala Thr Arg 15 Val
His Ser Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr
20 25 30
Ala Asn Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr
35 40 45
Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser
50 55 60
Val Asn Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile
85 90 95
Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser
100 105 110
Tyr Ile Val Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly
115 120 125
Asp Phe Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser
130 135 140
Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn
145 150 155 160
His Asp Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala
165 170 175
Lys Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser
180 185 190
Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val
195 200 205
Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln
210 215 220
- 27 031321
Ser 225 Leu Tyr Gln Asn Ala Asp Ala 230 Tyr Val Phe 235 Val Gly Ser Ser Arg 240
Туг Ser Lys Lys Phe Lys Pro Glu lie Ala lie Arg Pro Lys Val Arg
245 250 255
Asp Gln Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly
260 265 270
Asp Lys lie Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr
275 280 285
Ala Phe Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly lie lie lie Ser Asp
290 295 300
Thr Pro Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala
305 310 315 320
lie Asn Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn lie His Pro lie Thr lie Gly
325 330 335
Lys Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly
340 345 350
Leu Arg Asn Val Pro Ser lie Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie
355 360 365
Ala Gly Phe lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
370 375 380
Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Lys Ser Thr Gln Asn Ala lie Asp Glu lie Thr Asn Lys Val Asn Ser
405 410 415
Val lie Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe
420 425 430
Asn His Leu Glu Lys Arg lie Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp
435 440 445
Gly Phe Leu Asp lie Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu
450 455 460
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
465 470 475 480
- 28 031321
Tyr Glu Lys Val Arg 485 Ser Gln Leu Lys Asn 490 Asn Ala Lys Glu Ile 495 Gly
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu
500 505 510
Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala
515 520 525
Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg
530 535 540
Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val
545 550 555 560
Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly
565 570 575
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
580 585 590
Ala <210> 5 <211> 4739 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> pGX2009 <400> 5
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
- 29 031321
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccgccac catggactgg acctggattc tgttcctggt ggctgctgcc 780
actagagtgc acagcatgaa ggctatcctc gtcgtgctgc tgtacacctt cgccaccgcc 840
aacgccgata ccctgtgcat cggctaccac gccaacaaca gcaccgacac cgtggatacc 900
gtgctggaaa agaacgtgac cgtgacccac agcgtgaacc tgctggaaga taagcacaac 960
ggcaagctgt gcaagctgag aggcgtggcc cctctgcacc tgggcaagtg caatatcgcc 1020
ggctggattc tgggcaaccc cgagtgcgag agcctgtcta ccgctagctc ctggtcctac 1080
atcgtggaga caagcagcag cgacaacggc acctgttacc ccggcgactt catcgactac 1140
gaggaactgc gggagcagct gagcagcgtg tccagcttcg agcggttcga gatcttcccc 1200
aagaccagct cctggcccaa ccacgacagc aacaagggcg tgaccgccgc ctgtcctcac 1260
gctggcgcca agagcttcta caagaacctg atctggctgg tcaagaaggg caacagctac 1320
cccaagctga gcaagagcta catcaacgac aagggcaaag aggtcctcgt cctctggggc 1380
atccaccacc ctagcaccag cgccgaccag cagagcctgt accagaacgc cgacgcctac 1440
gtgttcgtgg gctcatctcg gtacagcaag aagttcaagc ccgagatcgc catcagaccc 1500
aaagtgcggg accaggaagg ccggatgaac tactactgga ccctggtgga gcccggcgac 1560
aagatcacct tcgaggccac cggcaatctg gtggtgccca gatacgcctt cgccatggaa 1620
agaaacgccg gcagcggcat catcatcagc gacacccccg tgcacgactg caacaccacc 1680
tgtcagaccc ccaagggcgc catcaacacc agcctgccct tccagaacat ccaccccatc 1740
accatcggca agtgccctaa gtacgtgaag tccactaagc tcagactggc caccggcctg 1800
agaaacgtgc ccagcatcca gagcagaggc ctgtttggcg ccattgccgg ctttatcgag 1860
ggcggctgga ccggaatggt ggacgggtgg tacggctacc accaccagaa tgagcagggc 1920
agcggctacg ccgccgacct gaagtccaca cagaacgcca tcgacgagat caccaacaaa 1980
gtgaacagcg tgatcgagaa gatgaacacc cagttcaccg ccgtgggcaa agagttcaac 2040
cacctggaaa agcggatcga gaacctgaac aagaaggtgg acgacggctt cctggacatc 2100
tggacctaca acgccgagct gctggtgctg ctggaaaacg agcggaccct ggactaccac 2160
gactccaacg tgaagaatct gtacgagaaa gtgcggagcc agctgaagaa caacgccaaa 2220
gagatcggca acggctgctt cgagttctac cacaagtgcg acaacacctg tatggaaagc 2280
gtgaagaacg gcacctacga ctaccccaag tacagcgagg aagccaagct gaaccgggaa 2340
gagatcgacg gcgtgaagct ggaaagcacc cggatctacc agatcctggc catctactct 2400
actgtggcca gctcactggt gctggtggtg tccctgggcg ccatctcctt ttggatgtgc 2460
tccaacggca gcctgcagtg ccggatctgc atctacccct acgacgtgcc cgactacgcc 2520
- 30 031321
tgatgactcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct 2580
agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc 2640
actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt 2700
cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat 2760
agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttcta ctgggcggtt ttatggacag 2820
caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag 2880
taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agctctgatc 2940
aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc 3000
cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct 3060
ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg 3120
acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca 3180
cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc 3240
tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga 3300
aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc 3360
cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc 3420
ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg 3480
ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct 3540
gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc 3600
tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc 3660
ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc 3720
agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aattattaac gcttacaatt 3780
tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atcaggtggc 3840
acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 3900
atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa 3960
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 4020
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 4080
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 4140
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 4200
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 4260
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 4320
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 4380
- 31 031321
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 4440
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 4500
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 4560
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 4620
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 4680
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttctt 4739
<210> <211> <212> <213> 6 1719 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК Антигена к Вирусу гриппа Н2 <400> 6
ggtaccaagc ttgccaccat ggccatcatc tacctgatcc tgctgttcac cgccgtgcgg 60
ggcgaccaga tctgcatcgg ctaccacgcc aacaacagca ccgagaaggt ggacaccatc 120
ctggaacgga acgtgaccgt gacccacgcc aaggacatcc tggaaaagac ccacaacggc 180
aagctgtgca agctgaacgg catccccccc ctggaactgg gcgactgcag cattgccggc 240
tggctgctgg gcaaccccga gtgcgaccgg ctgctgtccg tgcccgagtg gagctacatc 300
atggaaaaag agaacccccg ggacggcctg tgctaccccg gcagcttcaa cgactacgag 360
gaactgaagc acctgctgtc cagcgtgaag cacttcgaga aggtgaaaat cctgcccaag 420
gaccggtgga cccagcacac caccaccggc ggcagcagag cctgtgccgt gagcggcaac 480
cccagcttct tccggaacat ggtgtggctg accaagaagg gcagcaacta ccccgtggcc 540
aagggcagct acaacaacac ctccggagaa cagatgctga tcatctgggg cgtgcaccac 600
cccaacgacg agacagagca gcggaccctg taccagaacg tgggcaccta cgtgagcgtg 660
ggcaccagca ccctgaacaa gcggagcacc cccgagatcg ccacccggcc caaggtgaac 720
ggcctgggca gccggatgga attcagctgg accctgctgg acatgtggga caccatcaac 780
ttcgagagca ccggcaacct gatcgccccc gagtacggct tcaagatcag caagcggggc 840
agcagcggca tcatgaaaac cgagggcacc ctggaaaact gcgagacaaa gtgccagacc 900
cccctgggcg ccatcaacac caccctgccc ttccacaacg tgcaccccct gaccatcggc 960
gagtgcccca agtacgtgaa gagcgagaag ctggtgctgg ccaccggcct gcggaacgtg 1020
ccccagatcg agagcagggg cctgttcggc gccattgccg gattcatcga gggcggctgg 1080
cagggcatgg tggacgggtg gtacggctac caccacagca acgaccaggg cagcggctac 1140
gccgccgaca aagagagcac ccagaaggcc ttcgacggca tcaccaacaa ggtgaacagc 1200
gtgatcgaga agatgaacac ccagttcgag gccgtgggca aagagttcag caacctggaa 1260
- 32 031321
cggcggctgg aaaacctgaa caagaaaatg gaagatggct tcctggacgt gtggacctac 1320
aacgccgagc tgctggtgct gatggaaaac gagaggaccc tggacttcca cgacagcaac 1380
gtgaagaacc tgtacgacaa agtgcggatg cagctgcggg acaacgtgaa agagctgggc 1440
aacggctgct tcgagttcta ccacaagtgc gacgacgagt gcatgaactc cgtgaagaac 1500
ggcacctacg actaccctaa gtacgaggaa gagtccaagc tgaaccggaa cgagatcaag 1560
ggcgtgaagc tgtccagcat gggcgtgtac cagatcctgg ccatctacgc caccgtggcc 1620
ggcagcctga gcctggctat tatgatggct ggcatcagct tttggatgtg cagcaacggc 1680
agcctgcagt gccggatctg catctgatga ctcgagctc 1719
<210> 7 <211> 562 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность Вируса гриппа Н2 <400> 7
Met 1 Ala Ile Ile Tyr 5 Leu Ile Leu Leu Phe 10 Thr Ala Val Arg Gly 15 Asp
Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp
20 25 30
Thr Ile Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro
65 70 75 80
Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu
85 90 95
Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp
100 105 110
Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys
115 120 125
Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly
130 135 140
- 33 031321
Gly 145 Ser Arg Ala Cys Ala 150 Val Ser Gly Asn Pro 155 Ser Phe Phe Arg Asn 160
Met Val Trp Leu Thr Lys Lys Gly Ser Asn Tyr Pro Val Ala Lys Gly
165 170 175
Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val
180 185 190
His His Pro Asn Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val
195 200 205
Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr
210 215 220
Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Leu Gly Ser Arg Met
225 230 235 240
Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu
245 250 255
Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys
260 265 270
Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys
275 280 285
Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro
290 295 300
Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val
305 310 315 320
Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln
325 330 335
Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly
340 345 350
Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn
355 360 365
Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala
370 375 380
Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn
385 390 395 400
- 34 031321
Thr Gln Phe Glu Ala 405 Val Gly Lys Glu Phe 410 Ser Asn Leu Glu Arg 415 Arg
Leu Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp
420 425 430
Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu
435 440 445
Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met
450 455 460
Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe
465 470 475 480
Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr
485 490 495
Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu
500 505 510
Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala
515 520 525
Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala
530 535 540
Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile
545 550 555 560
Cys Ile <210> 8 <211> 4628 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность ДНК pGX2006 <400> 8
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
- 35 031321
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttgcc 720
accatggcca tcatctacct gatcctgctg ttcaccgccg tgcggggcga ccagatctgc 780
atcggctacc acgccaacaa cagcaccgag aaggtggaca ccatcctgga acggaacgtg 840
accgtgaccc acgccaagga catcctggaa aagacccaca acggcaagct gtgcaagctg 900
aacggcatcc cccccctgga actgggcgac tgcagcattg ccggctggct gctgggcaac 960
cccgagtgcg accggctgct gtccgtgccc gagtggagct acatcatgga aaaagagaac 1020
ccccgggacg gcctgtgcta ccccggcagc ttcaacgact acgaggaact gaagcacctg 1080
ctgtccagcg tgaagcactt cgagaaggtg aaaatcctgc ccaaggaccg gtggacccag 1140
cacaccacca ccggcggcag cagagcctgt gccgtgagcg gcaaccccag cttcttccgg 1200
aacatggtgt ggctgaccaa gaagggcagc aactaccccg tggccaaggg cagctacaac 1260
aacacctccg gagaacagat gctgatcatc tggggcgtgc accaccccaa cgacgagaca 1320
gagcagcgga ccctgtacca gaacgtgggc acctacgtga gcgtgggcac cagcaccctg 1380
aacaagcgga gcacccccga gatcgccacc cggcccaagg tgaacggcct gggcagccgg 1440
atggaattca gctggaccct gctggacatg tgggacacca tcaacttcga gagcaccggc 1500
aacctgatcg cccccgagta cggcttcaag atcagcaagc ggggcagcag cggcatcatg 1560
aaaaccgagg gcaccctgga aaactgcgag acaaagtgcc agacccccct gggcgccatc 1620
aacaccaccc tgcccttcca caacgtgcac cccctgacca tcggcgagtg ccccaagtac 1680
gtgaagagcg agaagctggt gctggccacc ggcctgcgga acgtgcccca gatcgagagc 1740
aggggcctgt tcggcgccat tgccggattc atcgagggcg gctggcaggg catggtggac 1800
gggtggtacg gctaccacca cagcaacgac cagggcagcg gctacgccgc cgacaaagag 1860
agcacccaga aggccttcga cggcatcacc aacaaggtga acagcgtgat cgagaagatg 1920
aacacccagt tcgaggccgt gggcaaagag ttcagcaacc tggaacggcg gctggaaaac 1980
ctgaacaaga aaatggaaga tggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc cgagctgctg 2040
gtgctgatgg aaaacgagag gaccctggac ttccacgaca gcaacgtgaa gaacctgtac 2100
gacaaagtgc ggatgcagct gcgggacaac gtgaaagagc tgggcaacgg ctgcttcgag 2160
- 36 031321
ttctaccaca agtgcgacga cgagtgcatg aactccgtga agaacggcac ctacgactac 2220
cctaagtacg aggaagagtc caagctgaac cggaacgaga tcaagggcgt gaagctgtcc 2280
agcatgggcg tgtaccagat cctggccatc tacgccaccg tggccggcag cctgagcctg 2340
gctattatga tggctggcat cagcttttgg atgtgcagca acggcagcct gcagtgccgg 2400
atctgcatct gatgactcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact 2460
gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 2520
gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 2580
agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 2640
gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt 2700
tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 2760
cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 2820
gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 2880
caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 2940
tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 3000
tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 3060
ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 3120
gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 3180
ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 3240
ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 3300
aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 3360
aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 3420
gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 3480
gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 3540
ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 3600
ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg 3660
cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 3720
tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 3780
cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatagcac 3840
gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 3900
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 3960
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 4020
- 37 031321
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 4080
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 4140
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 4200
ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 4260
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 4320
ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 4380
acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 4440
gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 4500
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 4560
aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 4620
atgttctt 4628 <210> 9 <211> 1695
<212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Последовательность ДНК Вируса гриппа U2
<400> 9 aaggccaagc tgctggtgct gctgtgcacc ttcgccgcca ccaacgccga caccatctgc 60
atcggctacc acgccaacaa cagcaccgac accgtggata ccgtgctgga aaagaacgtg 120
accgtgaccc acagcgtgaa cctgctggaa gataagcaca acggcaagct gtgcaagctg 180
aagggaatcg cccccctgca gctgggcaag tgcaatatcg ccggctggat tctgggcaac 240
cccgagtgcg agagcctgag cagcaagagc agctggtcct acatcgtgga aacccccaac 300
agcgagaacg gcacctgtta ccccggcgac ttcgccgact acgaggaact gcgcgagcag 360
ctgagcagcg tgtccagctt cgagagattc gagatcttcc ccaagaccag cagctggccc 420
aaccacgacg tgaccaaggg cgtgaccgct agctgtagcc acgcaggcgc cagcagcttc 480
tacaagaacc tgctgtggct gaccaagaag aacggcagct accccaagct gagcaagagc 540
tacatcaaca acaaagaaaa agaggtgctg gtcctctggg gcgtccacca ccccagcaca 600
atcgccgacc agcagagcct gtaccagaac gagaacgcct acgtgtccgt gggcagcagc 660
cactacagcc ggaagttcac ccccgagatc gccaagcggc ccaaagtgcg ggaccaggaa 720
ggccggatca actactactg gaccctgctg gaacccggcg acaccatcat cttcgaggcc 780
aacggcaacc tgatcgcccc cagatacgcc ttcgccctga gcagaggctt cggcagcggc 840
atcatcatca gcaacgcccc catgcacgac tgcgacacca agtgccagac ccctcagggc 900
gccatcaaca gcagcctgcc cttccagaac atccaccccg tgaccatcgg cgagtgcccc 960
- 38 031321
aaatacgtgc ggagcaccaa gctgcggatg gccaccggcc tgcggaacat ccccagcatc 1020
cagagcagag gcctgttcgg cgccattgcc ggcttcatcg agggcggctg gaccggaatg 1080
gtggacgggt ggtacggcta ccaccaccag aatgagcagg gcagcggcta cgccgccgac 1140
cagaagtcca cccagaacgc catcgacggc atcaccaaca aagtgaacag cgtgatcgag 1200
aagatgaaca cccagttcac cgccgtgggc aaagagttca acaagctgga aaagcggatg 1260
gaaaacctga acaagaaggt ggacgacggc ttcctggaca tctggaccta caacgccgaa 1320
ctgctcgtgc tgctggaaaa cgagcggacc ctggacttcc acgacagcaa cgtgaagaac 1380
ctgtacgaga aagtgaagtc ccagctgaag aacaacgcca aagagatcgg caacggctgc 1440
ttcgagttct accacaagtg caacaacgag tgcatggaaa gcgtgaagaa cggaacctac 1500
gactacccca agtacagcga ggaaagcaag ctgaaccggg aagagatcga cggcgtgaag 1560
ctggaatcca tgggcgtgta ccagatcctg gccatctaca gcaccgtggc tagcagcctg 1620
gtgctgctgg tgtccctggg cgccatctcc ttttggatgt gctccaacgg cagcctgcag 1680
tgccggatct gcatc 1695
<210> 10 <211> 565 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность Вируса гриппа U2 <400> 10
Lys Ala 1 Lys Leu Leu Val 5 Leu Leu Cys Thr 10 Phe Ala Ala Thr Asn Ala 15
Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val
20 25 30
Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu
35 40 45
Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile Ala
50 55 60
Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Ser Lys Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ala
- 39 031321
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu
115 120 125
Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp Val
130 135 140
Thr Lys Gly Val Thr Ala Ser Cys Ser His Ala Gly Ala Ser Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Asn Gly Ser Tyr Pro Lys
165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Ile Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr
195 200 205
Gln Asn Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Lys Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu
225 230 235 240
Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile
245 250 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
His Asp Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Ala Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
340 345 350
lie Glu Gly 355 Gly Trp Thr Gly Met 360 Val Asp Gly Trp Tyr 365 Gly Tyr His
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
370 375 380
Gln Asn Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu
420 425 430
Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
450 455 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
515 520 525
Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
530 535 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545 550 555 560
Cys Arg Ile Cys Ile
565 <210> 11 <211> 1809 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность ДНК Антигена IgE-U2-HAT
- 41 031321 <400> 11
ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtcgc cgctgctacc 60
cgggtgcact ctaaggccaa gctgctggtg ctgctgtgca ccttcgccgc caccaacgcc 120
gacaccatct gcatcggcta ccacgccaac aacagcaccg acaccgtgga taccgtgctg 180
gaaaagaacg tgaccgtgac ccacagcgtg aacctgctgg aagataagca caacggcaag 240
ctgtgcaagc tgaagggaat cgcccccctg cagctgggca agtgcaatat cgccggctgg 300
attctgggca accccgagtg cgagagcctg agcagcaaga gcagctggtc ctacatcgtg 360
gaaaccccca acagcgagaa cggcacctgt taccccggcg acttcgccga ctacgaggaa 420
ctgcgcgagc agctgagcag cgtgtccagc ttcgagagat tcgagatctt ccccaagacc 480
agcagctggc ccaaccacga cgtgaccaag ggcgtgaccg ctagctgtag ccacgcaggc 540
gccagcagct tctacaagaa cctgctgtgg ctgaccaaga agaacggcag ctaccccaag 600
ctgagcaaga gctacatcaa caacaaagaa aaagaggtgc tggtcctctg gggcgtccac 660
caccccagca caatcgccga ccagcagagc ctgtaccaga acgagaacgc ctacgtgtcc 720
gtgggcagca gccactacag ccggaagttc acccccgaga tcgccaagcg gcccaaagtg 780
cgggaccagg aaggccggat caactactac tggaccctgc tggaacccgg cgacaccatc 840
atcttcgagg ccaacggcaa cctgatcgcc cccagatacg ccttcgccct gagcagaggc 900
ttcggcagcg gcatcatcat cagcaacgcc cccatgcacg actgcgacac caagtgccag 960
acccctcagg gcgccatcaa cagcagcctg cccttccaga acatccaccc cgtgaccatc 1020
ggcgagtgcc ccaaatacgt gcggagcacc aagctgcgga tggccaccgg cctgcggaac 1080
atccccagca tccagagcag aggcctgttc ggcgccattg ccggcttcat cgagggcggc 1140
tggaccggaa tggtggacgg gtggtacggc taccaccacc agaatgagca gggcagcggc 1200
tacgccgccg accagaagtc cacccagaac gccatcgacg gcatcaccaa caaagtgaac 1260
agcgtgatcg agaagatgaa cacccagttc accgccgtgg gcaaagagtt caacaagctg 1320
gaaaagcgga tggaaaacct gaacaagaag gtggacgacg gcttcctgga catctggacc 1380
tacaacgccg aactgctcgt gctgctggaa aacgagcgga ccctggactt ccacgacagc 1440
aacgtgaaga acctgtacga gaaagtgaag tcccagctga agaacaacgc caaagagatc 1500
ggcaacggct gcttcgagtt ctaccacaag tgcaacaacg agtgcatgga aagcgtgaag 1560
aacggaacct acgactaccc caagtacagc gaggaaagca agctgaaccg ggaagagatc 1620
gacggcgtga agctggaatc catgggcgtg taccagatcc tggccatcta cagcaccgtg 1680
gctagcagcc tggtgctgct ggtgtccctg ggcgccatct ccttttggat gtgctccaac 1740
ggcagcctgc agtgccggat ctgcatctac ccctacgacg tgcccgacta cgcctgatga 1800
ctcgagctc 1809
- 42 031321 <210> 12 <211> 592 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность Антигена IgE-U2-HAT <400> 12
Met 1 Asp Trp Thr Trp 5 lie Leu Phe Leu Val 10 Ala Ala Ala Thr Arg 15 Val
His Ser Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Ala Ala Thr
20 25 30
Asn Ala Asp Thr lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp
35 40 45
Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val
50 55 60
Asn Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly
65 70 75 80
lie Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn lie Ala Gly Trp lie Leu
85 90 95
Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Ser Lys Ser Ser Trp Ser Tyr
100 105 110
lie Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp
115 120 125
Phe Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser
130 135 140
Phe Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His
145 150 155 160
Asp Val Thr Lys Gly Val Thr Ala Ser Cys Ser His Ala Gly Ala Ser
165 170 175
Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Asn Gly Ser Tyr
180 185 190
Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr lie Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu
195 200 205
- 43 031321
Val Leu 210 Trp Gly Val His His 215 Pro Ser Thr Ile Ala 220 Asp Gln Gln Ser
Leu Tyr Gln Asn Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser His Tyr
225 230 235 240
Ser Arg Lys Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp
245 250 255
Gln Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp
260 265 270
Thr Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala
275 280 285
Phe Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asn Ala
290 295 300
Pro Met His Asp Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile
305 310 315 320
Asn Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu
325 330 335
Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Ala Thr Gly Leu
340 345 350
Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
355 360 365
Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
370 375 380
Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys
385 390 395 400
Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val
405 410 415
Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn
420 425 430
Lys Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly
435 440 445
Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu
450 455 460
- 44 031321
Asn 465 Glu Arg Thr Leu Asp 470 Phe His Asp Ser Asn 475 Val Lys Asn Leu Tyr 480
Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn
485 490 495
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser
500 505 510
Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys
515 520 525
Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val
530 535 540
Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu
545 550 555 560
Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser
565 570 575
Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
580 585 590
<210> 13 <211> 1749 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность ДНК ВНА <400> 13
aaggccatca tcgtgctgct gatggtggtc acaagcaacg ccgaccggat ctgcaccggc 60
atcaccagca gcaacagccc ccacgtggtc aaaaccgcca cccagggcga agtgaacgtg 120
accggcgtga tccccctgac caccaccccc accaagagcc acttcgccaa cctgaagggc 180
accaagaccc ggggaaagct gtgccccaag tgcctgaact gcaccgacct ggacgtggcc 240
ctgggcagac ctatgtgcgt gggcaccacc cctagcgcca aggccagcat cctgcacgaa 300
gtgcggcccg tgaccagcgg ctgcttcccc atcatgcacg accggaccaa gatccggcag 360
ctccccaacc tgctgcgggg ctacgagaac atccggctga gcacccagaa cgtgatcaac 420
gccgagaagg cccctggcgg cccttacaga ctgggcacaa gcggctcttg ccccaacgcc 480
accagcaaga gcggcttttt cgccacaatg gcctgggccg tgcccaagga caacaacaag 540
accgccacca accccctgac cgtggaagtg ccctacatct gcaccgaggg cgaggaccag 600
- 45 031321
atcaccgtgt ggggcttcca cagcgataac aagacccaga tgaagaacct gtacggcgac 660
agcaaccccc agaagttcac cagctccgcc aacggcgtga ccacccacta cgtgtcccag 720
atcggcggct tccccgacca gacagaggat ggcggcctgc cccagagcgg cagaatcgtg 780
gtggactaca tggtgcagaa gcccggcaag accggcacca tcgtgtacca gcggggcatc 840
ctgctgcccc agaaagtgtg gtgcgccagc ggccggtcca aagtgatcaa gggcagcctg 900
cctctgatcg gcgaggccga ttgcctgcac gagaagtacg gcggcctgaa caagagcaag 960
ccctactaca ccggcgagca cgccaaagcc atcggcaact gccccatctg ggtcaaaacc 1020
cccctgaagc tggccaacgg caccaagtac cggcctcccg ccaagctgct gaaagagcgg 1080
ggcttcttcg gcgctatcgc cggctttctg gaaggcggct gggagggcat gatcgccggc 1140
tggcacggct acacatctca cggcgctcat ggcgtggccg tggccgctga tctgaagtcc 1200
acccaggaag ccatcaacaa gatcaccaag aacctgaaca gcctgagcga gctggaagtg 1260
aagaatctgc agcggctgag cggcgccatg gacgagctgc acaacgagat cctggaactg 1320
gacgagaagg tggacgacct gcgggccgac accatctcca gccagatcga gctggccgtg 1380
ctgctgtcca acgagggcat catcaacagc gaggacgagc atctgctggc cctggaacgg 1440
aagctgaaga agatgctggg ccctagcgcc gtggacatcg gcaacggctg cttcgagaca 1500
aagcacaagt gcaaccagac ctgcctggac cggatcgctg ccggcacctt caacgccggc 1560
gagttcagcc tgcccacctt cgacagcctg aacatcaccg ccgccagcct gaacgacgac 1620
ggcctggaca accacaccat cctgctgtac tacagcaccg cagcctccag cctggccgtg 1680
accctgatga tcgccatctt catcgtgtac atggtgtctc gggacaacgt gtcctgcagc 1740
atctgcctg1749 <210>14 <211>583 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминоксилотная последовательность BHA <400> 14
Lys 1 Ala Ile Ile Val 5 Leu Leu Met Val Val 10 Thr Ser Asn Ala Asp 15 Arg
Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr
20 25 30
Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr
35 40 45
- 46 031321
Thr Pro 50 Thr Lys Ser His Phe 55 Ala Asn Leu Lys Gly 60 Thr Lys Thr Arg
Gly Lys Leu Cys Pro Lys Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala
65 70 75 80
Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser
85 90 95
Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met
100 105 110
His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr
115 120 125
Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asn Ala Glu Lys Ala
130 135 140
Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ala
145 150 155 160
Thr Ser Lys Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Lys
165 170 175
Asp Asn Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro Tyr
180 185 190
Ile Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser
195 200 205
Asp Asn Lys Thr Gln Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro Gln
210 215 220
Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gln
225 230 235 240
Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln Ser
245 250 255
Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gln Lys Pro Gly Lys Thr Gly
260 265 270
Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Ile Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp Cys
275 280 285
Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly
290 295 300
- 47 031321
Glu 305 Ala Asp Cys Leu His 310 Glu Lys Tyr Gly Gly 315 Leu Asn Lys Ser Lys 320
Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile
325 330 335
Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro
340 345 350
Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly
355 360 365
Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr
370 375 380
Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser
385 390 395 400
Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser
405 410 415
Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu
420 425 430
Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg
435 440 445
Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn
450 455 460
Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg
465 470 475 480
Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn Gly
485 490 495
Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile
500 505 510
Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp
515 520 525
Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn
530 535 540
His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val
545 550 555 560
- 48 031321
Thr Leu Met Ile Ala 565 Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn
570 575
Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580
<210> 15
<211> 1865
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность ДНК Антигена IgE-BHA-HAT <400> 15
ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtggc cgctgccaca 60
cgggtgcaca gcaaggccat catcgtgctg ctgatggtgg tcacaagcaa cgccgaccgg 120
atctgcaccg gcatcaccag cagcaacagc ccccacgtgg tcaaaaccgc cacccagggc 180
gaagtgaacg tgaccggcgt gatccccctg accaccaccc ccaccaagag ccacttcgcc 240
aacctgaagg gcaccaagac ccggggaaag ctgtgcccca agtgcctgaa ctgcaccgac 300
ctggacgtgg ccctgggcag acctatgtgc gtgggcacca cccctagcgc caaggccagc 360
atcctgcacg aagtgcggcc cgtgaccagc ggctgcttcc ccatcatgca cgaccggacc 420
aagatccggc agctccccaa cctgctgcgg ggctacgaga acatccggct gagcacccag 480
aacgtgatca acgccgagaa ggcccctggc ggcccttaca gactgggcac aagcggctct 540
tgccccaacg ccaccagcaa gagcggcttt ttcgccacaa tggcctgggc cgtgcccaag 600
gacaacaaca agaccgccac caaccccctg accgtggaag tgccctacat ctgcaccgag 660
ggcgaggacc agatcaccgt gtggggcttc cacagcgata acaagaccca gatgaagaac 720
ctgtacggcg acagcaaccc ccagaagttc accagctccg ccaacggcgt gaccacccac 780
tacgtgtccc agatcggcgg cttccccgac cagacagagg atggcggcct gccccagagc 840
ggcagaatcg tggtggacta catggtgcag aagcccggca agaccggcac catcgtgtac 900
cagcggggca tcctgctgcc ccagaaagtg tggtgcgcca gcggccggtc caaagtgatc 960
aagggcagcc tgcctctgat cggcgaggcc gattgcctgc acgagaagta cggcggcctg 1020
aacaagagca agccctacta caccggcgag cacgccaaag ccatcggcaa ctgccccatc 1080
tgggtcaaaa cccccctgaa gctggccaac ggcaccaagt accggcctcc cgccaagctg 1140
ctgaaagagc ggggcttctt cggcgctatc gccggctttc tggaaggcgg ctgggagggc 1200
atgatcgccg gctggcacgg ctacacatct cacggcgctc atggcgtggc cgtggccgct 1260
gatctgaagt ccacccagga agccatcaac aagatcacca agaacctgaa cagcctgagc 1320
- 49 031321
gagctggaag tgaagaatct gcagcggctg agcggcgcca tggacgagct gcacaacgag 1380
atcctggaac tggacgagaa ggtggacgac ctgcgggccg acaccatctc cagccagatc 1440
gagctggccg tgctgctgtc caacgagggc atcatcaaca gcgaggacga gcatctgctg 1500
gccctggaac ggaagctgaa gaagatgctg ggccctagcg ccgtggacat cggcaacggc 1560
tgcttcgaga caaagcacaa gtgcaaccag acctgcctgg accggatcgc tgccggcacc 1620
ttcaacgccg gcgagttcag cctgcccacc ttcgacagcc tgaacatcac cgccgccagc 1680
ctgaacgacg acggcctgga caaccacacc atcctgctgt actacagcac cgcagcctcc 1740
agcctggccg tgaccctgat gatcgccatc ttcatcgtgt acatggtgtc tcgggacaac 1800
gtgtcctgca gcatctgcct gtacccctac gacgtgcccg actacgctga tgactcgagc 1860
tcctc 1865 <210> 16 <211> 610 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность Антигена IgE-BHA-HAT <400> 16
Met 1 Asp Trp Thr Trp 5 Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala 10 Ala Thr Arg 15 Val
His Ser Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala
20 25 30
Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val
35 40 45
Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu
50 55 60
Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp
85 90 95
Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys
100 105 110
Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro
115 120 125
- 50 031321
lie Met His 130 Asp Arg Thr Lys 135 Ile Arg Gln Leu Pro 140 Asn Leu Leu Arg
Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asn Ala Glu
145 150 155 160
Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro
165 170 175
Asn Ala Thr Ser Lys Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val
180 185 190
Pro Lys Asp Asn Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val
195 200 205
Pro Tyr Ile Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe
210 215 220
His Ser Asp Asn Lys Thr Gln Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn
225 230 235 240
Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val
245 250 255
Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro
260 265 270
Gln Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gln Lys Pro Gly Lys
275 280 285
Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Ile Leu Leu Pro Gln Lys Val
290 295 300
Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu
305 310 315 320
Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys
325 330 335
Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys
340 345 350
Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr
355 360 365
Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile
370 375 380
- 51 031321
Ala 385 Gly Phe Leu Glu Gly 390 Gly Trp Glu Gly Met 395 Ile Ala Gly Trp His 400
Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu
405 410 415
Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser
420 425 430
Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met
435 440 445
Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp
450 455 460
Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu
465 470 475 480
Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu
485 490 495
Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly
500 505 510
Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp
515 520 525
Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr
530 535 540
Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu
545 550 555 560
Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu
565 570 575
Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg
580 585 590
Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
595 600 605
Tyr Ala
610 <210> 17 <211> 18
- 52 031321 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> IgE Лидерная аминокислотная последовательность <400>17
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 15 1015
His Ser <210> 18 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> HA tag аминокислотная последовательность <400>18
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala <210>19 <211>1707 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность ДНК Вируса гриппа Hl <400> 19
atggaaaaga tcgtgctgct gttcgccatc gtgagcctgg tgaagagcga ccagatctgc 60
atcggctacc acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccatcatgga aaaaaacgtg 120
accgtgaccc acgcccagga catcctggaa aagacccaca acggcaagct gtgcgacctg 180
gacggcgtga agcccctgat cctgcgggac tgcagcgtgg ccggctggct gctgggcaac 240
cccatgtgcg acgagttcat caacgtgccc gagtggagct acatcgtgga gaaggccaac 300
cccgtgaacg acctgtgcta ccccggcgac ttcaacgact acgaggaact gaagcacctg 360
ctgtcccgga tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ccaagagcag ctggtccagc 420
cacgaggcca gcctgggcgt gagcagcgcc tgcccatacc agggcaagtc cagcttcttc 480
cggaacgtgg tgtggctgat caagaagaac agcacctacc ccaccatcaa gcggagctac 540
aacaacacca accaggaaga tctgctggtc ctgtggggca tccaccaccc caacgacgcc 600
gccgagcaga ccaagctgta ccagaacccc accacctaca tcagcgtggg caccagcacc 660
ctgaaccagc ggctggtgcc ccggatcgcc acccggtcca aggtgaacgg ccagagcggc 720
cggatggaat tcttctggac catcctgaag cccaacgatg ccatcaactt cgagagcaac 780
- 53 031321
ggcaacttca tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc 840
atgaagagcg agctggaata cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc catgggcgcc 900
atcaacagca gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag 960
tacgtgaaga gcaacaggct ggtgctggcc accggcctgc ggaacagccc ccagcgggag 1020
cggcgggccg ccgcccgggg cctgttcggc gccatcgccg gcttcatcga gggcggctgg 1080
cagggcatgg tggacgggtg gtacggctac caccacagca atgagcaggg cagcggctac 1140
gccgccgaca aagagagcac ccagaaggcc atcgacggcg tcaccaacaa ggtgaacagc 1200
atcatcgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtgggcc gggagttcaa caacctggaa 1260
cggcggatcg agaacctgaa caagaaaatg gaagatggct tcctggacgt gtggacctac 1320
aacgccgagc tgctggtgct gatggaaaac gagcggaccc tggacttcca cgacagcaac 1380
gtgaagaacc tgtacgacaa agtgcggctg cagctgcggg acaacgccaa agagctgggc 1440
aacggctgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggaaag cgtgcggaac 1500
ggcacctacg actaccccca gtacagcgag gaagcccggc tgaagcggga ggaaatcagc 1560
ggcgtgaaac tggaaagcat cggcatctac cagatcctga gcatctacag caccgtggcc 1620
agcagcctgg ccctggccat catggtggcc ggcctgagcc tgtggatgtg cagcaacggc 1680
agcctgcagt gccggatctg catctag 1707
<210> 20 <211> 568 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность Белка Вируса гриппа Hl
<400> : 20
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
- 54 031321
Pro Met Cys Asp Glu 85 Phe Ile Asn Val Pro 90 Glu Trp Ser Tyr Ile 95 Val
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser
130 135 140
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
- 55 031321
Pro Gln Arg Glu 340 Arg Arg Ala Ala Ala 345 Arg Gly Leu Phe Gly 350 Ala Ile
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
355 360 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
370 375 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385 390 395 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
405 410 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
420 425 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
435 440 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
450 455 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465 470 475 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
485 490 495
Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
500 505 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly
515 520 525
Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
530 535 540
Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545 550 555 560
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 21
- 56 031321 <211> 1728 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность ДНК Вируса гриппа Hl <400> 21
ggtaccaagc ttgccaccat gaaggtgaaa ctgctggtgc tgctgtgcac cttcaccgcc 60
acctacgccg acaccatctg catcggctac cacgccaaca acagcaccga caccgtggat 120
accgtgctgg aaaagaacgt gaccgtgacc cacagcgtga acctgctgga agatagccac 180
aacggcaagc tgtgcctgct gaaaggcatc gcccccctgc agctgggcaa ctgcagcgtg 240
gccggctgga tcctgggcaa ccccgagtgc gagctgctga tttccaaaga aagctggtcc 300
tacatcgtgg agacccccaa ccccgagaac ggcacctgct accccggcta cttcgccgac 360
tacgaggaac tgcgggagca gctgtccagc gtgagcagct tcgagcggtt cgagatcttc 420
cccaaagaga gcagctggcc caaccacacc gtgaccggcg tgagcgccag ctgctcccac 480
aatggcaaga gcagcttcta ccggaacctg ctgtggctga ccggcaagaa cggcctgtac 540
cccaacctga gcaagagcta cgccaataac aaagaaaagg aagtgctggt gctgtggggc 600
gtgcaccacc cccccaacat cggcgaccag cgggccctgt accacaccga gaacgcctac 660
gtgagcgtgg tgtccagcca ctacagccgg cggttcaccc ccgagatcgc caagcggccc 720
aaagtgcggg accaggaagg ccggatcaac tactactgga ccctgctgga acccggcgac 780
accatcatct tcgaggccaa cggcaacctg atcgccccca gatacgcctt cgccctgagc 840
cggggcttcg gcagcggcat catcaccagc aacgccccca tggacgagtg cgacgccaag 900
tgccagaccc ctcagggagc tattaacagc agcctgccct tccagaacgt gcaccccgtg 960
accatcggcg agtgccccaa gtacgtgcgg agcgccaagc tgcggatggt gaccggcctg 1020
cggaacatcc ccagcatcca gagcaggggc ctgttcggcg ccatcgccgg cttcatcgag 1080
ggcggctgga ccggcatggt ggacgggtgg tacggctacc accaccagaa cgagcagggc 1140
agcggctacg ccgccgacca gaagagcacc cagaacgcca tcaacggcat caccaacaag 1200
gtgaacagcg tgatcgagaa gatgaacacc cagttcaccg ccgtgggcaa agagttcaac 1260
aagctggaac ggcggatgga aaacctgaac aagaaggtgg acgacggctt cctggacatc 1320
tggacctaca acgccgagct gctggtgctg ctggaaaacg agcggaccct ggacttccac 1380
gacagcaacg tgaagaacct gtacgagaag gtgaaaagcc agctgaagaa caacgccaaa 1440
gagatcggca acggctgctt cgagttctac cacaagtgca acgacgagtg catggaaagc 1500
gtgaagaatg gcacctacga ctaccccaag tacagcgagg aaagcaagct gaaccgggag 1560
aagatcgacg gcgtgaagct ggaaagcatg ggcgtgtacc agatcctggc catctacagc 1620
accgtcgctt ccagcctcgt cctgctcgtg tccctgggcg ccatctcctt ttggatgtgc 1680
- 57 031321 agcaacggca gcctgcagtg ccggatctgc atctgatgac tcgagctc 1728 <210> 22 <211> 565 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность Белка Вируса гриппа Hl <400> 22
Met 1 Lys Val Lys Leu 5 Leu Val Leu Leu Cys 10 Thr Phe Thr Ala Thr 15 Tyr
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
130 135 140
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Leu Tyr
- 58 031321
195 200 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Arg Phe Thr Pro Glu lie Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu
225 230 235 240
Gly Arg lie Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr lie
245 250 255
lie Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu lie Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly lie lie Thr Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala lie Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr lie Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
lie Pro Ser lie Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe
340 345 350
lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
370 375 380
Gln Asn Ala lie Asn Gly lie Thr Asn Lys Val Asn Ser Val lie Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu
420 425 430
Asp lie Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
- 59 031321
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp 455 Ser Asn Val Lys Asn 460 Leu Tyr Glu Lys
450
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
515 520 525
Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
530 535 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545 550 555 560
Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 23
<211> 1731 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Последовательность ДНК Вируса гриппа H3
<400> 23 ggtaccaagc ttgccaccat gaaaaccatc atcgccctga gctacatcct gtgcctggtg 60
ttcgcccaga agctgcccgg caacgacaac agcaccgcca ccctgtgtct gggccaccac 120
gccgtgccca acggcaccat cgtgaaaaca atcaccaacg accagatcga ggtgaccaac 180
gccaccgagc tggtgcagag cagcagcacc ggcggcatct gcgacagccc ccaccagatc 240
ctggacggcg agaactgcac cctgatcgac gccctgctgg gcgaccctca gtgcgacggc 300
ttccagaaca aaaagtggga cctgttcgtg gagcggagca aggcctacag caactgctac 360
ccctacgacg tgcccgacta cgccagcctg cggagcctgg tggccagcag cggcaccctg 420
gaattcaaca acgagagctt caactggacc ggcgtgaccc agaacggcac cagcagcgcc 480
tgcaagcggc ggagcaacaa cagcttcttt tccagactga actggctgac ccacctgaag 540
ttcaagtacc ccgccctgaa cgtgaccatg cccaacaatg agaagttcga caagctgtac 600
atctggggcg tgcaccaccc cggcaccgac aatgaccaga tcagcctgta cgcccaggcc 660
- 60 031321
agcggccgga tcaccgtgag caccaagcgg agccagcaga ccgtgatccc caacatcggc 720
agccggccca gagtgagaga catccccagc cggatcagca tctactggac aatcgtgaag 780
cccggcgaca tcctgctgat caactccacc ggcaacctga tcgcccccag gggctacttc 840
aagatcagaa gcggcaagag cagcatcatg cggagcgacg cccccatcgg caagtgcaac 900
agcgagtgca tcacccccaa tggcagcatc cccaacgaca agcccttcca gaacgtgaac 960
cggatcacct acggcgcctg ccccagatac gtgaagcaga acaccctgaa gctggccacc 1020
ggcatgcgga acgtgcccga gaagcagacc cggggcatct tcggcgccat cgccggcttc 1080
atcgagaacg gctgggaggg catggtggac gggtggtacg gcttccggca ccagaactcc 1140
gagggcatcg gccaggccgc cgacctgaag agcacccagg ccgccatcaa ccagatcaac 1200
ggcaagctga accggctgat cggcaagacc aacgagaagt tccaccagat cgaaaaagaa 1260
ttcagcgagg tggagggccg gatccaggac ctggaaaagt acgtggagga caccaagatc 1320
gacctgtgga gctacaacgc cgagctgctg gtcgccctgg aaaaccagca caccatcgac 1380
ctgaccgaca gcgagatgaa caagctgttc gagcggacca agaagcagct gcgggagaac 1440
gccgaggaca tgggcaacgg ctgctttaag atctaccaca agtgcgacaa cgcctgcatc 1500
ggcagcatcc ggaacggcac ctacgaccac gacgtgtacc gggacgaggc cctgaacaac 1560
cggttccaga tcaagggcgt ggagctgaag agcggctaca aggactggat cctgtggatc 1620
agcttcgcca tcagctgctt tctgctgtgc gtggccctgc tgggattcat catgtgggcc 1680
tgccagaagg gcaacatccg ctgcaacatc tgcatctgat gactcgagct c 1731
<210> 24 <211> 566 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Непоследовательность Белка Вируса гриппа НЗ <400> 24
Met 1 Lys Thr Ile Ile 5 Ala Leu Ser Tyr Ile 10 Leu Cys Leu Val Phe 15 Ala
Gln Lys Leu Pro 20 Gly Asn Asp Asn Ser 25 Thr Ala Thr Leu Cys 30 Leu Gly
His His Ala 35 Val Pro Asn Gly Thr 40 Ile Val Lys Thr Ile 45 Thr Asn Asp
Gln Ile 50 Glu Val Thr Asn Ala 55 Thr Glu Leu Val Gln 60 Ser Ser Ser Thr
Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
- 61 031321
70 75 80
Thr Leu Ile Asp Ala 85 Leu Leu Gly Asp Pro 90 Gln Cys Asp Gly Phe 95 Gln
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn
145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys
165 170 175
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys
180 185 190
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Asn Asp Gln Ile
195 200 205
Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Val Arg
225 230 235 240
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
- 62 031321
Cys Pro Arg Tyr Val 325 Lys Gln Asn Thr Leu 330 Lys Leu Ala Thr Gly 335 Met
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Ile Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
370 375 380
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
385 390 395 400
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
405 410 415
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
420 425 430
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
435 440 445
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
450 455 460
Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
485 490 495
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
500 505 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
515 520 525
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
530 535 540
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
545 550 555 560
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565

Claims (23)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуногенный белок, включающий гемагглютинин H1 вируса гриппа A, для применения в вакцине, содержащая нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 3.
  2. 2. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1, функционально связанную с регуляторными элементами.
  3. 3. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1, функционально связанную с регуляторными элементами, активными в клетках человека.
  4. 4. Вектор экспрессии по п.3, представляющий собой плазмиду.
  5. 5. Вектор экспрессии по п.4, представляющий собой плазмиду pGX2009.
  6. 6. Композиция для индукции иммунного ответа против вируса гриппа, включающая:
    а) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по п.1 и
    б) по меньшей мере одну дополнительную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, выбранный из гемагглютинина H1 вируса гриппа A, гемагглютинина H2 вируса гриппа A, гемагглютинина H3 виру
    - 63 031321 са гриппа A, гемагглютинина H4 вируса гриппа A, гемагглютинина H5 вируса гриппа A, гемагглютинина H6 вируса гриппа A, гемагглютинина H7 вируса гриппа A, гемагглютинина H8 вируса гриппа A, гемагглютинина H9 вируса гриппа A, гемагглютинина H10 вируса гриппа A, гемагглютинина H11 вируса гриппа A, гемагглютинина H12 вируса гриппа A, гемагглютинина H13 вируса гриппа A, гемагглютинина H14 вируса гриппа A, гемагглютинина H15 вируса гриппа A, гемагглютинина H16 вируса гриппа A, нейраминидазы N1 вируса гриппа A, нейраминидазы N2 вируса гриппа A, нейраминидазы N3 вируса гриппа A, нейраминидазы N4 вируса гриппа A, нейраминидазы N5 вируса гриппа A, нейраминидазы N6 вируса гриппа A, нейраминидазы N7 вируса гриппа A, нейраминидазы N8 вируса гриппа A, нейраминидазы N9 вируса гриппа A, гемагглютинина вируса гриппа B и нейраминидазы вируса гриппа B.
  7. 7. Композиция по п.6, где каждая из нуклеиновых кислот, указанных в подпунктах а) и б), функционально связана с регуляторными элементами.
  8. 8. Композиция по п.7, где каждая из нуклеиновых кислот, указанных в подпунктах а) и б), функционально связана с регуляторными элементами, активными в клетках человека.
  9. 9. Композиция по п.6, где нуклеиновые кислоты, указанные в подпунктах а) и б), входят в состав одного или более векторов экспрессии.
  10. 10. Композиция по п.9, где указанные один или более векторов экспрессии представляют собой плазмиды.
  11. 11. Композиция по п.6, где нуклеиновые кислоты, указанные в подпунктах а) и б), входят в состав плазмиды pGX2009.
  12. 12. Композиция по п.6, включающая:
    (i) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1; и (ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин H1 вируса гриппа A, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин H3 вируса гриппа A.
  13. 13. Композиция по п.6, где нуклеиновая кислота, кодирующая гемагглютинин H1 вируса гриппа A, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 21, а нуклеиновая кислота, кодирующая гемагглютинин H3 вируса гриппа A, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 23.
  14. 14. Способ индуцирования иммунного ответа против вируса гриппа, включающий введение индивидууму нуклеиновой кислоты по п.1.
  15. 15. Способ индуцирования иммунного ответа против вируса гриппа, включающий введение индивидууму композиции по п.6.
  16. 16. Способ защиты индивидуума от инфекции, вызываемой штаммом вируса гриппа A человека свиного происхождения, включающий введение указанному индивидууму профилактически эффективного количества нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, которая экспрессируется в клетках указанного индивидуума, в результате чего индуцируется иммунный ответ против вируса гриппа A человека свиного происхождения.
  17. 17. Способ защиты индивидуума от инфекции, вызываемой штаммом вируса гриппа A человека свиного происхождения, включающий введение указанному индивидууму профилактически эффективного количества композиции, включающей нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одну дополнительную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, выбранный из гемагглютинина H1 вируса гриппа A, гемагглютинина H2 вируса гриппа A, гемагглютинина H3 вируса гриппа A, гемагглютинина H4 вируса гриппа A, гемагглютинина H5 вируса гриппа A, гемагглютинина H6 вируса гриппа A, гемагглютинина H7 вируса гриппа A, гемагглютинина H8 вируса гриппа A, гемагглютинина H9 вируса гриппа A, гемагглютинина H10 вируса гриппа A, гемагглютинина H11 вируса гриппа A, гемагглютинина H12 вируса гриппа A, гемагглютинина H13 вируса гриппа A, гемагглютинина H14 вируса гриппа A, гемагглютинина H15 вируса гриппа A, гемагглютинина H16 вируса гриппа A, нейраминидазы N1 вируса гриппа A, нейраминидазы N2 вируса гриппа A, нейраминидазы N3 вируса гриппа A, нейраминидазы N4 вируса гриппа A, нейраминидазы N5 вируса гриппа A, нейраминидазы N6 вируса гриппа A, нейраминидазы N7 вируса гриппа A, нейраминидазы N8 вируса гриппа A, нейраминидазы N9 вируса гриппа A, гемагглютинина вируса гриппа B и нейраминидазы вируса гриппа B; причем все указанные нуклеиновые кислоты экспрессируются в клетках указанного индивидуума, в результате чего индуцируется иммунный ответ против вируса гриппа A человека свиного происхождения и указанных белков.
  18. 18. Способ по п.17, где композиция включает:
    (i) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1; и (ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин H1 вируса гриппа A, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин H3 вируса гриппа A.
  19. 19. Способ по п.17, где нуклеиновая кислота, кодирующая гемагглютинин H1 вируса гриппа A, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 21, а нуклеиновая кислота, кодирующая гемагглютинин H3 вируса гриппа A, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 23.
  20. 20. Способ лечения индивидуума, инфицированного штаммом вируса гриппа A человека свиного происхождения, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, которая экс
    - 64 031321 прессируется в клетках указанного индивидуума, в результате чего индуцируется иммунный ответ против вируса гриппа A человека свиного происхождения.
  21. 21. Способ лечения индивидуума, инфицированного штаммом вируса гриппа A человека свиного происхождения, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, включающей нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере одну дополнительную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, выбранный из гемагглютинина H1 вируса гриппа A, гемагглютинина H2 вируса гриппа A, гемагглютинина H3 вируса гриппа A, гемагглютинина H4 вируса гриппа A, гемагглютинина H5 вируса гриппа A, гемагглютинина H6 вируса гриппа A, гемагглютинина H7 вируса гриппа A, гемагглютинина H8 вируса гриппа A, гемагглютинина H9 вируса гриппа A, гемагглютинина H10 вируса гриппа A, гемагглютинина H11 вируса гриппа A, гемагглютинина H12 вируса гриппа A, гемагглютинина H13 вируса гриппа A, гемагглютинина H14 вируса гриппа A, гемагглютинина H15 вируса гриппа A, гемагглютинина H16 вируса гриппа A, нейраминидазы N1 вируса гриппа A, нейраминидазы N2 вируса гриппа A, нейраминидазы N3 вируса гриппа A, нейраминидазы N4 вируса гриппа A, нейраминидазы N5 вируса гриппа A, нейраминидазы N6 вируса гриппа A, нейраминидазы N7 вируса гриппа A, нейраминидазы N8 вируса гриппа A, нейраминидазы N9 вируса гриппа A, гемагглютинина вируса гриппа B и нейраминидазы вируса гриппа B; причем все указанные нуклеиновые кислоты экспрессируются в клетках указанного индивидуума, в результате чего индуцируется иммунный ответ против вируса гриппа A человека свиного происхождения и указанных белков.
  22. 22. Способ по п.21, где композиция включает:
    (i) нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1; и (ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин H1 вируса гриппа A, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин H3 вируса гриппа А.
  23. 23. Способ по п.21, где нуклеиновая кислота, кодирующая гемагглютинин H1 вируса гриппа A, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 21, а нуклеиновая кислота, кодирующая гемагглютинин H3 вируса гриппа A, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 23.
    - 65 031321
    Фиг. 3
    HAI (геммагглютинин гриппа А) к свиному вирусу A/Mexico/lnDRE4487/2009
    Фиг. 4
    Фиг. 5
EA201201025A 2010-01-26 2011-01-26 Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки вируса гриппа, композиции на их основе и способы профилактики и лечения EA031321B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/694,238 US8298820B2 (en) 2010-01-26 2010-01-26 Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
PCT/US2011/022642 WO2011094358A1 (en) 2010-01-26 2011-01-26 Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201201025A1 EA201201025A1 (ru) 2013-01-30
EA031321B1 true EA031321B1 (ru) 2018-12-28

Family

ID=44309124

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891712A EA201891712A3 (ru) 2010-01-26 2011-01-26 Молекулы нуклеиновых кислот гриппа и вакцины, изготовленные из них
EA201201025A EA031321B1 (ru) 2010-01-26 2011-01-26 Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки вируса гриппа, композиции на их основе и способы профилактики и лечения

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891712A EA201891712A3 (ru) 2010-01-26 2011-01-26 Молекулы нуклеиновых кислот гриппа и вакцины, изготовленные из них

Country Status (15)

Country Link
US (4) US8298820B2 (ru)
EP (2) EP2528626B1 (ru)
JP (2) JP5992337B2 (ru)
KR (2) KR101912330B1 (ru)
CN (2) CN102753200B (ru)
AU (1) AU2011209626B2 (ru)
BR (1) BR112012018587A2 (ru)
CA (1) CA2786901A1 (ru)
EA (2) EA201891712A3 (ru)
ES (1) ES2600890T3 (ru)
HK (1) HK1249139A1 (ru)
IN (1) IN2012DN06289A (ru)
MX (3) MX357191B (ru)
WO (1) WO2011094358A1 (ru)
ZA (1) ZA201307844B (ru)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010117786A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
KR20120132506A (ko) * 2010-02-18 2012-12-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 질환의 예방 및 치료에 사용되는 백신
EP3248615A1 (en) 2010-03-30 2017-11-29 Mount Sinai School of Medicine of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
AU2011302360B2 (en) 2010-09-14 2015-01-29 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for influenza
CN103442732B (zh) 2011-02-11 2017-04-12 宾夕法尼亚大学托管会 编码乙型肝炎病毒核心蛋白的核酸分子和包含其的疫苗
US9238679B2 (en) 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
CA2839995A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza
WO2013019603A2 (en) * 2011-07-29 2013-02-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Linear expression cassettes and uses thereof
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CA2863981A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for h3n2, h2n2, and b influenza viruses
CN107188934A (zh) 2012-02-13 2017-09-22 高等教育联邦系统-匹兹堡大学 以计算方式优化的人和禽h5n1流感的广泛反应性抗原
CN104395336B (zh) 2012-03-30 2018-01-23 高等教育联邦系统-匹兹堡大学 以计算方式优化的h5n1和h1n1流感病毒的广泛反应性抗原
JP2015514132A (ja) 2012-04-10 2015-05-18 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒト呼吸器合胞体ウイルスコンセンサス抗原、核酸構築物、およびそれらから作製されるワクチン、ならびにその使用方法
CN104797594A (zh) 2012-11-27 2015-07-22 高等教育联邦系统-匹兹堡大学 计算优化的广泛反应性h1n1流感抗原
BR112015013004B1 (pt) 2012-12-13 2022-09-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Molécula de ácido nucleico isolada, proteína e seus usos, bem como composição e vacina
KR20230156146A (ko) 2012-12-13 2023-11-13 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 Ｄｎａ 항체 작제물 및 그 이용 방법
BR112015014482A2 (pt) 2012-12-18 2017-11-21 Icahn School Med Mount Sinai vacinas para vírus influenza e seus usos
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
US10316294B2 (en) 2013-03-15 2019-06-11 The Research Foundation For The State University Of New York Attenuated influenza viruses and vaccines
AU2014235556A1 (en) * 2013-03-15 2015-07-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
WO2015023461A2 (en) * 2013-08-06 2015-02-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
CN105744953B (zh) * 2013-10-07 2020-01-17 宾夕法尼亚大学理事会 具有作为佐剂的白介素-33的疫苗
WO2016054003A1 (en) * 2014-10-01 2016-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines having an antigen and interleukin-21 as an adjuvant
MX2017007187A (es) 2014-12-01 2018-01-30 Univ Pennsylvania Construcciones de anticuerpos de adn y metodo para utilizarlas.
WO2016118937A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
JP2018510156A (ja) * 2015-03-20 2018-04-12 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア アジュバントとしてｃｄ４０リガンドを有するワクチン
US20190022209A1 (en) * 2016-01-15 2019-01-24 Etubics Corporation Methods and compositions for influenza vaccination
CN117887735A (zh) * 2016-05-05 2024-04-16 宾夕法尼亚大学理事会 丝状病毒共有抗原、核酸构建体和由其制成的疫苗及其使用方法
CN105999257A (zh) * 2016-05-11 2016-10-12 长春海基亚生物技术股份有限公司 无针注射流感疫苗系统与应用
JP7237344B2 (ja) 2016-06-15 2023-03-13 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質及びその使用
EP3606555A4 (en) 2017-04-07 2021-08-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS TYPE B ANTI-NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND THEIR USES
CA3113647A1 (en) * 2018-09-21 2020-03-26 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods of making and using universal centralized influenza vaccine genes
CN111514287A (zh) * 2020-04-29 2020-08-11 河南大学 甲型流感通用型dna疫苗及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080299151A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Statens Serum Institut Influenza vaccines
US20090169505A1 (en) * 2007-11-12 2009-07-02 Ruxandra Draghia-Akli Novel vaccines against multiple subtypes of influenza virus

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US21579A (en) 1858-09-21 Rotary valve fob steam-engines
US5077044A (en) 1980-05-19 1991-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting shigella live vaccines
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US5643579A (en) 1984-11-01 1997-07-01 American Home Products Corporation Oral vaccines
ZA858044B (en) 1984-11-01 1987-05-27 American Home Prod Oral vaccines
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US5223424A (en) 1985-09-06 1993-06-29 Prutech Research And Development Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence
US4790987A (en) 1985-11-15 1988-12-13 Research Corporation Viral glycoprotein subunit vaccine
US5310668A (en) 1986-06-20 1994-05-10 Merck & Co., Inc. Varicella-zoster virus as a live recombinant vaccine
US5242829A (en) 1986-09-23 1993-09-07 Therion Biologics Corporation Recombinant pseudorabies virus
IL86583A0 (en) 1987-06-04 1988-11-15 Molecular Eng Ass Vaccine containing a derivative of a microbe and method for the production thereof
US5294441A (en) 1987-06-04 1994-03-15 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi
US5387744A (en) 1987-06-04 1995-02-07 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi
US5112749A (en) 1987-10-02 1992-05-12 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for the malaria circumsporozoite protein
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
CH682669A5 (fr) 1989-03-08 1993-10-29 Health Research Inc Virus recombinant modifié pour exprimer un produit de gènes chez un hôte, procédés et vaccin correspondants.
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
EP0465560B1 (en) 1989-03-31 1996-06-05 Washington University VACCINES CONTAINING AVIRULENT phoP-TYPE MICROORGANISMS
ES2070997T3 (es) 1989-12-04 1995-06-16 Akzo Nobel Nv Virus de herpes recombinante de pavos y vacunas vector vivas derivadas de los mismos.
US5294548A (en) 1990-04-02 1994-03-15 American Biogenetic Sciences, Inc Recombianant Hepatitis a virus
AU7906691A (en) 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5462734A (en) 1990-11-02 1995-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Bovine herpesvirus vaccine and method of using same
US5240703A (en) 1991-03-01 1993-08-31 Syntro Corporation Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof
US6034298A (en) 1991-08-26 2000-03-07 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
US5955088A (en) 1992-02-03 1999-09-21 Cedars-Sinai Medical Center Pharmaceutical compsition of herpes simplex virus type-1 (HSV-1), glycoproteins
WO1993025673A1 (en) 1992-06-04 1993-12-23 The Regents Of The University Of California In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
PT681483E (pt) 1993-01-26 2005-11-30 Wyeth Corp Composicoes e metodos para distribuicao de material genetico
US5981505A (en) 1993-01-26 1999-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for delivery of genetic material
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
AU700371B2 (en) 1993-06-07 1999-01-07 Genentech Inc. Hiv envelope polypeptides
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US6156319A (en) 1994-07-25 2000-12-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Soluble herpesvirus glycoprotein complex vaccine
NL9401820A (nl) 1994-11-02 1996-06-03 Meyn Maschf Inrichting voor het bewerken van aan zijn poten opgehangen gevogelte.
US5962428A (en) 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5650309A (en) 1995-05-16 1997-07-22 The Regents Of The University Of California Viral vectors
US5698202A (en) 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
CA2285056C (en) 1997-04-03 2004-12-14 Iacob Mathiesen Method for introducing pharmaceutical drugs and nucleic acids into skeletal muscle
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
JP2002507985A (ja) 1997-06-30 2002-03-12 ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー 横紋筋に核酸を導入する改良法およびその組合せ
EP2428249B1 (en) 1998-07-13 2015-10-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field
US6589529B1 (en) 1998-10-30 2003-07-08 Children's Hospital Medical Center Rotavirus subunit vaccine
EP1322338A4 (en) 2000-10-04 2005-04-13 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE OF THE CAPSID PROTEIN FROM FLAVIVIRES OR PESTVIRUSES
JP3543326B2 (ja) 2001-08-30 2004-07-14 ソニー株式会社 情報処理装置および方法、情報処理システム、情報配信装置、記録媒体、並びにプログラム
US7245963B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Advisys, Inc. Electrode assembly for constant-current electroporation and use
US8209006B2 (en) 2002-03-07 2012-06-26 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Constant current electroporation device and methods of use
US7328064B2 (en) 2002-07-04 2008-02-05 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
CA2504593C (en) 2002-11-04 2016-08-09 Advisys, Inc. Synthetic muscle promoters with activities exceeding naturally occurring regulatory sequences in cardiac cells
US8080642B2 (en) * 2003-05-16 2011-12-20 Vical Incorporated Severe acute respiratory syndrome DNA compositions and methods of use
ES2748130T3 (es) 2003-05-30 2020-03-13 Vgxi Inc Dispositivos y métodos para la producción de un biomaterial
EP1633312A4 (en) 2003-06-16 2012-09-26 Medimmune Llc INFLUENZA HEMAGGLUTININE AND NEURAMINIDASE VARIANTS
US7527800B2 (en) 2004-05-25 2009-05-05 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CN101107428B (zh) 2005-01-18 2010-09-15 博格华纳公司 通过快速作用凸轮轴相位器操作的气门事件减小
EP1851238A4 (en) * 2005-02-24 2008-12-31 Univ Massachusetts FLUID NUCLEIC ACIDS, POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
WO2007100584A2 (en) * 2006-02-16 2007-09-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antiviral agents and vaccines against influenza
US20070286873A1 (en) 2006-05-23 2007-12-13 Williams John V Recombinant Influenza H5 Hemagluttinin Protein And Nucleic Acid Coding Therefor
EP3489251B1 (en) 2006-07-28 2021-03-17 The Trustees of the University of Pennsylvania Hiv consensus proteins and vaccines made therefrom
CN105457157B (zh) 2006-10-17 2020-04-14 因诺维奥制药公司 电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法
EP2111233A2 (en) 2006-12-29 2009-10-28 Institut Pasteur Of Shanghai Lentivirus pseudotyped with influenza hemagglutinin and methods of use
WO2008124331A1 (en) 2007-04-03 2008-10-16 Cytogenix, Inc. Novel sequences and dna vaccines against avian flu
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
WO2009026397A2 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Fraunhofer Usa, Inc. Prophylactic and therapeutic influenza vaccines, antigens, compositions, and methods
WO2010060430A2 (en) * 2008-11-28 2010-06-03 Statens Serum Institut Optimized influenza vaccines
CA2653478A1 (en) 2009-01-23 2010-07-23 Gregg Martin Automated wash system for industrial vehicles
AU2011213559B2 (en) 2010-02-08 2015-05-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecules encoding RANTES, and compositions comprising and methods of using the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080299151A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Statens Serum Institut Influenza vaccines
US20090169505A1 (en) * 2007-11-12 2009-07-02 Ruxandra Draghia-Akli Novel vaccines against multiple subtypes of influenza virus

Also Published As

Publication number Publication date
US8298820B2 (en) 2012-10-30
US20180133307A1 (en) 2018-05-17
US20130052222A1 (en) 2013-02-28
CN102753200B (zh) 2017-11-21
EP2528626A4 (en) 2013-07-17
KR101912330B1 (ko) 2018-10-26
EP2528626A1 (en) 2012-12-05
US20160030548A1 (en) 2016-02-04
AU2011209626A1 (en) 2012-08-09
JP2016105728A (ja) 2016-06-16
MX2018008135A (es) 2021-11-16
MX2012008651A (es) 2012-08-23
JP2013517800A (ja) 2013-05-20
KR20180118244A (ko) 2018-10-30
US20120064116A9 (en) 2012-03-15
EA201891712A3 (ru) 2019-05-31
HK1249139A1 (zh) 2018-10-26
CN107739736A (zh) 2018-02-27
WO2011094358A9 (en) 2012-01-05
US10363302B2 (en) 2019-07-30
EA201891712A2 (ru) 2019-01-31
KR20130048192A (ko) 2013-05-09
JP5992337B2 (ja) 2016-09-14
US9884106B2 (en) 2018-02-06
ZA201307844B (en) 2015-12-23
ES2600890T3 (es) 2017-02-13
US9192660B2 (en) 2015-11-24
BR112012018587A2 (pt) 2020-09-01
EA201201025A1 (ru) 2013-01-30
MX357191B (es) 2018-06-29
EP2528626B1 (en) 2016-09-28
IN2012DN06289A (ru) 2015-09-25
EP3173103A1 (en) 2017-05-31
CN102753200A (zh) 2012-10-24
WO2011094358A1 (en) 2011-08-04
US20110182938A1 (en) 2011-07-28
CA2786901A1 (en) 2011-08-04
AU2011209626B2 (en) 2013-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101912330B1 (ko) 인플루엔자 핵산 분자 및 이로부터 생산된 백신
KR101255419B1 (ko) 인플루엔자 바이러스의 다중 아형에 대한 신규 백신
KR20150127586A (ko) 인플루엔자 핵산 분자 및 이로부터 제조된 백신
KR102131276B1 (ko) 공통 전립선 항원, 이것을 암호화하는 핵산 분자, 그리고 이것을 포함하는 백신 및 용도
CN112979829B (zh) 融合蛋白及其在制备靶向新冠病毒sars-cov-2的疫苗中的应用
KR20180097631A (ko) 핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법
JP2023036921A (ja) 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための物質および方法
KR102455340B1 (ko) 최적화된 핵산 항체 작제물
US11925685B2 (en) DNA antibody constructs encoding anti-ZIKV envelope antibodies
US20220307054A1 (en) Modulation of t cell responses by ul18 of human cytomegalovirus
CN114573716A (zh) 一种含ccl1的融合蛋白、制备方法及应用
CN103333900A (zh) 一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用
WO2022112790A1 (en) Virus-like particles and methods of production thereof
KR20220082033A (ko) 레트로바이러스의 계내 생성을 위한 생산자 바이러스
JP2021527080A (ja) インビボ翻訳後修飾のための組成物および方法
CN111936513A (zh) 用于抗呼吸道合胞病毒的核酸抗体构筑体
WO2021173965A1 (en) Identification of variable influenza residues and uses thereof
OA20580A (en) Modulation of T cell responses by UL18 of human cytomegalovirus.
Karkashan Generation of influenza A virus vectors for the delivery of antigenic proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU