KR20130048192A - 인플루엔자 핵산 분자 및 이로부터 생산된 백신 - Google Patents

인플루엔자 핵산 분자 및 이로부터 생산된 백신 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는 HA 헤마글루티닌의 신규 공통 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 뿐만 아니라 유전자 구성물/벡터 및 서열을 발현시키는 백신이 제공된다. 또한 본 명세서에는 제공된 백신을 사용하여 하나 이상의 인플루엔자 A 혈청형에 대항하여 면역 반응을 생성하는 방법이 제공된다.

Description

인플루엔자 핵산 분자 및 이로부터 생산된 백신 {INFLUENZA NUCLEIC ACID MOLECULES AND VACCINES MADE THEREFROM}
본 발명은 개량된 인플루엔자 바이러스 백신, 인플루엔자에 대항하여 면역 반응을 유도하기 위한 개량된 방법, 예방접종된 대 감염된 인플루엔자 포유동물 숙주를 진단하기 위한 및 인플루엔자에 대항하여 사람을 예방적 및/또는 치료적으로 면역화시키기 위한 개량된 방법에 관한 것이다.
플루로 통상 불리는 인플루엔자는, 오소믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae )의 RNA 바이러스에 의해 야기된 감염성 질환이다. 인플루엔자 또는 플루 바이러스는 새 및 포유동물을 감염시킨다. 오소믹소바이러스의 5개의 속 중 3개는 인플루엔자 바이러스: 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 인플루엔자 C이다. 이들 중에서,인플루엔자 A가 가장 일반적이다.
인플루엔자는 기침 또는 재채기에 의해 생산되고 바이러스 또는 오염 표면을 함유하는 체액과의 직접적인 접촉에 의해 생산된 에어로졸에서 공기를 통해 전형적으로 전달된다. 인플루엔자의 계절적 유행병은 전세계적으로 일어나고 결국 매년 수십만 명이 죽는다. 몇 년 내에, 감염병이 생겨서 수백만 명이 죽는다. 또한, 가축, 특히 가금류 및 돼지는 수많은 동물 죽음 및 금전적 손실을 야기하는 매년의 유행병 및 우발적인 감염병에 또한 걸리기 쉽다.
구조적으로, 인플루엔자 바이러스들은 유사하고, 유사한 분자 성분으로 만들어진 약 80-120 nm의 일반적으로 구형 또는 섬유같은 바이러스 입자를 갖는다. 바이러스 단백질 및 바이러스 RNA를 포함하는 중심 코아는 2개의 상이한 당단백질, 및 바이러스 입자가 그 안에 생산되는 세포로부터 유래된 지질 코팅물로 구성된 바이러스 외피로 덮는다. 2개의 추가 상이한 당단백질은 바이러스 외피 내에 고정되고, 표면을 향하여 돌출하는 부분을 포함한다.
인플루엔자 바이러스 RNA 게놈은 11개의 단백질 (HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2)을 인코딩하는 게놈의 11개의 바이러스 유전자를 구성하는 8개의 상이한 단일가닥의 음성 센스 RNA 세그먼트로서 전형적으로 제공된다. 8개의 RNA 세그먼트는 하기와 같다: 1) 헤마글루티닌을 인코딩하는 HA (약 500개 분자의 헤마글루티닌은 하나의 바이리온을 만들기 위해 필요하다); 2) 뉴라미니다제를 인코딩하는 NA (약 100개 분자의 뉴라미니다제는 하나의 바이리온을 만들기 위해 필요하다); 3) 핵단백질을 인코딩하는 NP; 4) 동일한 RNA 세그먼트로부터 상이한 해독 프레임을 사용하여 2개의 매트릭스 단백질 (M1 및 M2)을 인코딩하는 M (약 3000 매트릭스 단백질 분자는 하나의 바이리온을 만들기 위해 필요하다); 5) 동일한 RNA 세그먼트로부터 상이한 해독 프레임을 사용하여 2개의 별개의 비-구조 단백질 (NS1 및 NEP)를 인코딩하는 NS; 6) RNA 폴리머라제를 인코딩하는 PA; 7) 동일한 RNA 세그먼트로부터 상이한 해독 프레임을 사용하여 (아폽토시스를 유도하는) RNA 폴리머라제 및 PB1-F2 단백질을 인코딩하는 PB1; 및 8) RNA 폴리머라제를 인코딩하는 PB2.
이들 11개의 단백질 중에서, 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)는 바이러스 외피에 고정되고 바이러스 입자의 외부 표면 상에 존재하는 2개의 큰 당단백질이다. 이들 단백질은 인플루엔자에 대항하여 면역 반응을 위한 면역원으로서 쓰인다. 바이러스의 표적 세포에의 결합 및 바이러스 게놈의 표적 세포로의 진입을 매기하는 렉틴인 HA는 단일 유전자 생산물, HA0로서 발현되고, 인플루엔자 바이러스 입자의 표면 상에 복합물을 함께 형성하는 2개의 서브유닛, HA1 및 HA2를 생산하기 위해 숙주 프로테아제에 의해 나중에 소유된다. NA 감염된 세포에서 생산된 새로 생산된 성숙 바이러스 입자의 방출과 연관된다.
인플루엔자 바이러스에 대한 16개의 공지된 HA 혈청형 및 9개의 공지된 NA 혈청형이 있다. 바이러스 입자에 존재하는 상이한 혈청형의 동일성은 전형적으로 바이러스를 기재하기 위해 사용된다. 예를 들면, H1N1은 HA 혈청형 H1 및 NA 혈청형 N1을 갖는 인플루엔자 바이러스이고; H5N1은 HA 혈청형 H5 및 NA 혈청형 N1을 갖는 인플루엔자 바이러스이다. 오직 H1, H2 및 H3 혈청형, 및 N1 및 N2 혈청형은 대개 인간을 감염시킨다.
인플루엔자 균주는 일반적으로 종(species) 또는 속(genus) 특이적이다; 즉 돼지를 감염시킬 수 있는 인플루엔자 균주 (돼지 인플루엔자 바이러스)는 전형적으로 인간 또는 조류를 감염시키지 못하고; 조류를 감염시킬 수 있는 인플루엔자 균주 (조류 인플루엔자 바이러스)는 인간 또는 돼지를 감염시키지 못하고; 인간을 감염시킬 수 있는 인플루엔자 균주 (인간 인플루엔자 바이러스)는 조류 또는 돼지를 감염시키지 못한다. 그러나, 인플루엔자 균주는 돌연변이되고 하나의 종으로부터 다른 종으로 감염될 수 있다. 예를 들면, 돼지만을 감염시키는 균주, 즉 돼지 인플루엔자는 인간 오직 또는 이들 돼지 및 인간 모두를 감염시킬 수 있는 균주가 되도록 돌연변이되거나 재조합될 수 있다. "돼지 플루"로 일반적으로 불리는 플루 바이러스는 인간을 감염시킬 수 있고 돼지에 대해 이전에 특이적이었던 균주로부터 유래된 인플루엔자 바이러스 균주, 예컨대 H1N1 균주이다 (즉 돼지 플루 바이러스는 돼지 기원 인간 인플루엔자 또는 돼지 유래 인간 인플루엔자이다). "조류 플루"로 일반적으로 불리는 플루 바이러스는 인간을 감염시킬 수 있고 조류에 대해 이전에 특이적이었던 균주로부터 유래된 인플루엔자 바이러스 균주, 예컨대 H5N1 균주이다 (즉 조류 플루 바이러스 조류 기원 인간 인플루엔자 또는 조류 유래 인간 인플루엔자).
인플루엔자에 대항하는 예방접종은 개발도상국가에서 많은 인간 및 때때로 가축에게 계절적으로 제공된다. 사용된 백신이 그의 보호 결과에서 제한적인 것은, 백신에 의해 유도된 면역 반응이 어떤 하위유형의 바이러스에 대해 특이적이기 때문이다. 상이한 인플루엔자 백신이 개발되었고, 바이러스의 유형 및 균주가 주어진 해(year)에서 순환할 것이라는 과학자들의 판단 및 국제적 감시를 기반으로 매년 투여된다. 바이러스는 세르먼트의 돌연변이, 재조합 및 분류에 의해 상당히 변한다. 따라서, 한 해에 주어진 백신은 다음 해에 광범위하게 이동하는 계절적 균주에 대항하여 보호적인 것이라고 생각되지 않는다.
미국 질환 관리 본부(U.S. Centers for Disease Control and Prevention)에서 일반적으로 조장된 "플루 주사(flu shot)"는 대개 3개의 사멸/불활성화 인플루엔자 바이러스를 함유한다: 하나의 A (H3N2) 바이러스, 하나의 A (H1N1) 바이러스, 및 하나의 B 바이러스. 따라서, 예방접종이 하위유형의 예측, 및 그 하위유형에 대한 특정 백신의 이용가능성으로 한정된다는 것은 분명하다.
동물 및 인간 질환에 대항하여 예방접종하기 위한 핵산 서열의 직접적인 투여가 연구되었고, 많은 노력은 원하는 항원의 필요한 발현을 생성하기 위해 핵산 전달의 효과적이고 능률적인 수단에 초점이 맞추어 졌고, 이로써, 면역원 반응 및 궁극적으로 이 기술의 성공으로 귀결되었다.
DNA 백신은 더 많은 종래의 예방접종 방법, 예컨대 생약독화 바이러스 및 재조합 단백질 기반 백신에 대해 많은 개념적 이점을 갖는다. DNA 백신은 안전하고, 안정되며, 쉽게 생성되며, 플라스미드 통합의 증거를 거의 나타내지 않는 전임상시험을 갖는 인간에서 내성이 있다 [Martin, T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. 또한, DNA 백신은, 백신의 효능이 백신에 대한 이미 존재하는 항체 역가에 의해 영향을 받지 않는다는 사실에 기인하여 반복된 투여 아주 적합하다 [Chattergoon, M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. 그러나, DNA 백신의 임상 채택에 대한 하나의 주요 장애물은, 큰 동물에 이동할 때 플랫폼의 면역원성에서 증가가 있었다 [Liu, M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40]. DNA 백신 면역원의 조작에서 최신 기술 진보, 예컨대 코돈 최적화, RNA 최적화 및 면역글로불린 선도 서열의 부가는 하기를 갖는다: DNA 백신 개량된 발현 및 면역원성 [Andre, S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Deml, L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], 뿐만 아니라, 플라스미드 전달 시스템에서 최근 개발된 기술, 예컨대 전기천공 [Hirao, L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T 세포. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53]. 또한, 연구는, 공통 면역원의 사용이 선천성 항원 단독과 비교하면 세포 면역 반응의 폭을 증가시킬 수 있다는 것을 제안했다 [Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81(16): p. 8507-14].
핵산 서열, 예컨대 플라스미드 DNA을 전달하기 위한 하나의 방법은 전기천공 (EP) 기술이다. 이 기술은 항암 약물, 예컨대 블레오마이신을 전달하기 위한 인간 임상시험에서, 그리고 다수의 동물 종에 대한 많은 전임상 연구에서 사용되었다.
면역원성 인플루엔자 공통 헤마글루티닌 단백질, 그와 같은 단백질을 인코딩하는 핵산 구성물 및 인플루엔자의 다중 균주에 대항하여 면역 반응을 유도하는데 유용한 조성물에 대한 필요성이 남아 있다. 사람을 치료하기 위해 수많은 인플루엔자 하위유형에 걸쳐 경제적이고 효과적인 인플루엔자에 대항하는 효과적인 백신에 대한 필요성이 남아 있다.
발명의 요약
본 명세서에는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다: 서열번호:1, 서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:1의 단편; 서열번호:1의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:3; 서열번호:3과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:3의 단편; 서열번호:3의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:6; 서열번호:6과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:6의 단편; 서열번호:6의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:9, 서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:9의 단편; 서열번호:9의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:11, 서열번호:11과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:11의 단편; 서열번호:11의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:13; 서열번호:13과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:13의 단편; 서열번호:13의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 및 서열번호:15; 서열번호:15와 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:15의 단편; 서열번호:15의 단편과 95% 동종인 핵산 서열.
또한 하기를 포함하는 조성물이 제공된다: a) 하기 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제1 핵산 서열: 서열번호:1, 서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:1의 단편; 서열번호:1의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:3; 서열번호:3과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:3의 단편; 서열번호:3의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:6; 서열번호:6과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:6의 단편; 서열번호:6의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:9; 서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:9의 단편; 서열번호:9의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:11; 서열번호:11과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:11의 단편; 및 서열번호:11의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:13; 서열번호:13과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:13의 단편; 서열번호:13의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:15; 서열번호:15와 95% 동종인 핵산 서열; 서열번호:15의 단편; 및 서열번호:15의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 및 b) 하기 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 단백질을 인코딩하는 핵산 서열: 인플루엔자 A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌, 뉴라미니다제 및 그의 단편.
본 발명의 일부 측면은 사람에게 그와 같은 핵산 분자 및/또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응의 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 측면은 감염에 대항하여 사람을 보호하는 방법을 제공한다. 본 방법은 그와 같은 핵산 서열 또는 조성물의 핵산 분자를 예방적 유효량으로 상기 사람에게 투여하는 단계를 포함하고; 여기서 상기 핵산 서열은 상기 사람의 세포에서 발현되고, 보호 면역 반응은 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질에 대항하여 유도된다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 돼지 기원 인간 인플루엔자에 대항하는 보호 면역 반응이다.
본 발명의 일부 측면에서, 본 방법은 인플루엔자에 의해 감염된 사람을 치료하기 위해 제공된다. 본 방법은 그와 같은 핵산 분자 및/또는 조성물을 치료적 유효량으로 상기 사람에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 반응은 돼지 기원 인간 인플루엔자에 대항하는 치료 면역 반응이다.
도 1은 2999 염기쌍 뼈대 벡터 플라스미드 pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad CA)의 지도를 보여준다. CMV 프로모터는 염기 137-724에서 위치된다. T7 프로모터/프라이밍(priming) 부위는 염기 664-683에서이다. 다중 클로닝 부위는 염기 696-811에서이다. 솟과 동물 GH 폴리아데닐화 신호는 염기 829-1053에서이다. 카나마이신 내성 유전자는 염기 1226-2020에서이다. pUC 기원은 염기 2320-2993에서이다.
Invitrogen으로부터 이용가능한 pVAX1의 서열을 기반으로 하여, 하기 돌연변이는 pGX2009에 대한 뼈대로서 사용된 pVAX1의 서열에서 발견되었다:
C>G 241 CMV 프로모터에서
C>T 1942 뼈대, 솟과 동물 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호의 다운스트림 (bGHpolyA)
A> - 2876 뼈대, 카나마이신 유전자의 다운스트림
C>T 3277 복제 (Ori) 높은 복제수 돌연변이의 pUC 기원에서 (참조, Nucleic Acid Research 1985)
G>C 3753 RNASeH 부위의 pUC Ori 업스트림의 최말단에서
염기쌍 2, 3 및 4는 CMV 프로모터의 뼈대, 업스트림에서 ACT로부터 CTG로 변한다.
도 2는 pH1HA09로도 불리는 플라스미드 pGX2009의 2개의 지도를 보여준다. 플라스미드 pGX2009의 핵산 서열 (서열번호:5)은 C 말단에서 HA 태그 (서열번호:18)에 연결된 공통 H1 아미노산 서열(서열번호:1에 의해 인코딩된 아미노산 서열번호:2)의 N 말단에 연결된 IgE 선도(아미노산 서열번호:17)을 포함하는 공통 H1 단백질 구조물 (서열번호:3에 의해 인코딩된 아미노산 서열번호:4)에 대한 코딩 서열을 포함한다. 공통 H1 단백질 (서열번호:3에 의해 인코딩된 아미노산 서열번호:4)는 표지된 SwiHum Con HA 및 H1HA09이다.
도은 플라스미드 pGX2006의 지도를 보여준다. 플라스미드 pGX2006의 핵산 서열 (서열번호:8)은 표지된 H2HA인 공통 H2 단백질 (서열번호:6에 의해 인코딩된 아미노산 서열번호:7)에 대한 코딩 서열을 포함한다.
도 4는 면역된 페렛(ferret)으로부터 혈청으로 수행된 적혈구응집반응 억제 검정으로부터의 데이타를 보여준다.
도 5는 신규 H1N1 균주를 갖는 면역 및 비면역된(unimmunized) 페렛의 도전의 결과를 보여준다.
상세한 설명
각각의 인플루엔자 A H1 및 H2의 공통 아미노산 서열 (이하, 각각 "공통 H1" (서열번호:2) 및 "공통 H2" (서열번호:7)이라 칭함), 뿐만 아니라 신규 합성 하이브리드 공통 H1 인플루엔자 A 헤마글루티닌 아미노산 서열 (이하, "공통 U2" (서열번호:10) 이라 칭함) 및 인플루엔자 B 헤마글루티닌의 공통 아미노산 서열 (이하, "공통 BHA" (서열번호:13) 이라 칭함)이 제공되고, 인플루엔자에 대항하여 포유동물의 보호를 제공할 수 있다. 또한, 공통 H1 아미노산 서열, 공통 H2 아미노산 서열, 공통 U2 아미노산 서열 및/또는 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 제공된다. 일부 측면에서, 핵산 서열이 제공되고, 이 서열은 공통 H1 아미노산 서열을 포함하는 단백질 (예를 들면 (서열번호:1) 또는 (서열번호:3)), 공통 H2 아미노산 서열 (예를 들면 (서열번호:6)), 공통 U2 아미노산 서열(예를 들면 (서열번호:9) 또는 (서열번호:11)), 및/또는 공통 BHA 아미노산 서열(예를 들면 (서열번호:13) 또는 (서열번호:15))을 인코딩한다.
과학 이론에 의해 구속되지 않지만, 다중 인플루엔자 하위유형에 대항하여 면역 반응 (체액, 세포, 또는 이들 모두)을 널리 끌어내기 위해 사용될 수 있는 백신은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 1) 공통 H1 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 2) 공통 H1 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 3) 공통 H2 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 4) 공통 H2 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 5) 공통 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 6) 공통 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 7) 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 및 8) 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
면역화 방법이 수행될 수 있고, 하기 구성요소 중 2개 이상을 사용하고/하거나 조합하는 백신이 제조될 수 있다: 1) 공통 H1 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 2) 공통 H1 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 3) 공통 H2 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 4) 공통 H2 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 5) 공통 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 6) 공통 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 7) 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 및 8) 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질. 인플루엔자에 대항하는 더 넓은 기반 치료에 대해, 면역화 방법이 수행될 수 있고, 하나 이상의 다른 인플루엔자 단백질, 예컨대 인플루엔자 A H1-H16, 인플루엔자 A N1-N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌, 인플루엔자 B 뉴라미니다제 및/또는 하기 성분 중 하나 이상과 함께 이들 단백질을 인코딩하는 유전자: 1) 공통 H1 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 2) 공통 H1 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 3) 공통 H2 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 4) 공통 H2 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 5) 공통 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 6) 공통 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 7) 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 및 8) 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 사용하고/하거나 조합하는 백신이 제조될 수 있다.
1. 정의.
본 명세서에 사용된 전문용어는 특정 구현예만을 기재하기 위한 것이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 명세서 및 부가되는 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명확하게 지시되지 않으면 복수 지시물을 포함한다.
본 명세서의 수치 범위의 열거에 대해, 동일한 정도의 정확도의 사이의 각각의 개재 수가 명백하게 고려된다. 예를 들면, 6-9의 범위에 대해, 수들 7 및 8은 6 및 9에 추가하여 고려되고, 범위 6.0-7.0에 대해, 수들 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6,9, 및 7.0이 명백하게 고려된다.
a. 항진제
"항진제"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, DNA 플라스미드 및 나중에 기재된 인코딩 핵산 서열에 의해 인코딩된 항원의 면역원성을 향상시키기 위해 본 명세서에 기재된 DNA 플라스미드 백신에 부가된 어떤 분자를 의미한다.
b. 항체
"항체"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 또는 단편, 단편 또는 그의 유도체의 항체를 의미하고, 이는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단쇄 항체, 디아바디(diabody), 이중특이적 항체, 이중기능성 항체 및 그의 유도체를 포함한다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 대한 충분한 결합 특이성을 나타내는, 포유동물의 혈청 샘플, 다클론성 항체, 친화 정제된 항체, 또는 그의 혼합물로부터 단리된 항체일 수 있다.
c. 코딩 서열
"코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 코딩 서열, 핵산이 투여되는 사람 또는 포유동물의 세포에서 발현을 이끌 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종료 신호를 추가로 포함할 수 있다.
d. 상보
"상보" 또는 "상보적"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사물 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) (예, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기 쌍짓기를 의미할 수 있다는 것을 의미한다.
e. 공통 또는 공통 서열
"공통" 또는 "공통 서열"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 다중 하위유형의 특정 인플루엔자 항원의 정렬의 분석을 기반으로 한 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 공통 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산 서열이 제조될 수 있다. 단백질을 인코딩하는 공통 서열 및/또는 핵산 분자를 포함하는 단백질을 포함하는 백신은 다중 하위유형 또는 혈청형의 특정 인플루엔자 항원에 대항하여 넓은 면역을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 공통 인플루엔자 항원은 인플루엔자 A 공통 헤마글루티닌 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이 서열은 예를 들면 공통 H1, 공통 H2, 또는 인플루엔자 B 공통 헤마글루티닌 아미노산 서열을 포함한다.
f. 일정 전류
"일정 전류"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 동일 조직에 전달되는 전기 펄스의 기간에 걸쳐, 조직, 또는 상기 조직을 마련하는 세포에 의해 수집 또는 경험되는 전류를 의미한다. 전기 펄스는 본 명세서에 기재된 전기천공 장치로부터 전달된다. 이 전류가 전기 펄스의 수명에 걸쳐 상기 조직에서 일정 전류량으로 남아 있는 것은, 본 명세서에 제공된 전기천공 장치가 피드백 요소를 갖기 때문이고, 이는 바람직하게는 순간적인 피드백을 갖는다. 피드백 요소는 펄스의 기간 내내 조직 (또는 세포)의 내성을 측정하고 전기천공 장치가 그의 전기 에너지 출력을 변경 (예, 전압을 증가)시킬 수 있고, 이로써 동일한 조직에서의 전류는 (마이크로초와 같은) 전기 펄스 내내, 및 펄스로부너 펄스로 일정하게 유지된다. 일부 구현예에서, 피드백 요소는 컨트롤러를 포함한다.
g. 전류 피드백 또는 피드백
"전류 피드백" 또는 "피드백"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 제공된 전기천공 장치의 활동 반응을 의미하는데, 이 장치는 전극 사이의 조직에서 전류를 측정하고, 일정 수준으로 전류를 유지하는 것에 알맞게 EP 장치에 의해 전달된 에너지 출력을 변경시키는 것을 포함한다. 이러한 일정 수준 펄스 서열 또는 전기 처리의 개시 전에 사용자에 의해 미리설정된다. 피드백은 전기천공 장치의 전기천공 구성요소, 예, 컨트롤러에 의해 달성될 수 있는데, 그것 내의 전기 회로는 전극 사이의 조직에서 전류를 계속해서 모니터링하고 그 모니터된 전류 (또는 조직 내의 전류)을 미리설정된 전류와 비교하고 계속해서 에너지-출력 조정이 미리설정된 수준에서 모니터된 전류를 유지할 수 있다. 피드백 루프는, 유사물 패루프 피드백에서와 같이 순간적일 수 있다.
h. 분산된 전류
"분산된(decentralized) 전류"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 전기천공 장치의 다양한 니들(바늘) 전극 어레이로부터 전달된 전류의 패턴을 의미하고, 여기서 상기 패턴은 전기천공된 조직의 어떤 면적 상의 전기천공 관련된 열사병(heat stress)의 발생을 최소화, 또는 바람직하게는 제거한다.
i. 전기천공
본 명세서에서 상효교환적으로 사용되는 "전기천공", "전기침투" 또는 "동전기적 증대" ("EP")는 생체막에서 현미경 경로 (공극)을 유도하기 위한 막관통 전기장 펄스의 사용을 의미하고; 그의 존재로 생체분자, 예컨대 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약물, 이온, 및 물은 세포막의 한족 면으로부터 다른 면으로 통과하게 된다.
j. 피드백 메카니즘
"피드백 메카니즘"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 소프트웨어 또는 하드웨어 (또는 펌웨어)에 의해 수행된 공정을 의미하고, 여기서, 그 공정은 현존 값을 갖는 (에너지의 펄스의 전달 전, 동안, 및/또는 후)의 원하는 조직의 임피던스, 바람직하게는 전류을 수용하고 비교하고, 현존 값을 달성하기 위해 전달된 에너지의 펄스를 조정한다. 피드백 메카니즘은 유사물 폐루프 회로에 의해 수행될 수 있다.
k. 단편
핵산 서열에 대해 본 명세서에 사용된 "단편"은 핵산 서열 또는 그의 부분을 의미하고, 이는 전체 길이 야생형 균주 인플루엔자 항원과 교차 반응하는 포유동물에서 면역 반응을 끌어낼 수 있고, 상기 항원은, 예를 들면, 인플루엔자 A H1 헤마글루티닌, 인플루엔자 A H2 헤마글루티닌 또는 인플루엔자 B 헤마글루티닌을 포함한다. 단편은 서열번호:1, 3, 6, 9, 11 13 및 15을 포함하는, 공통 아미노산 서열 및 그와 같은 서열을 포함하는 구성물을 인코딩하는 다양한 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다. DNA 단편은 IgE 또는 IgG 서열과 같은, 면역글로불린 선도를 위한 코딩 서열을 포함할 수 있다. DNA 단편은 그 길이가 30개 이상의 뉴클레오티드, 그 길이가 45개 이상, 60개 이상, 75개 이상, 90개 이상, 120개 이상, 150개 이상, 180개 이상, 210개 이상, 240개 이상, 270개 이상, 300개 이상, 360개 이상, 420개 이상, 480개 이상, 540개 이상, 600개 이상, 660개 이상, 720개 이상, 780개 이상, 840개 이상, 900개 이상, 960개 이상, 1020개 이상, 1080개 이상, 1140개 이상, 1200개 이상, 1260개 이상, 1320개 이상, 1380개 이상, 1440개 이상, 1500개 이상, 1560개 이상, 1620개 이상, 1680개 이상, 1740개 이상, 1800개 이상, 1860개 이상, 1820개 이상, 1880개 이상, 1940개 이상, 2000개 이상, 2600개 이상, 2700개 이상, 2800개 이상, 2900개 이상, 2910개 이상, 2920개 이상, 2930개 이상, 2931개 이상, 2932개 이상, 2933개 이상, 2934개 이상, 2935개 이상, 2936개 이상, 2937개 이상, 또는 2938개 이상일 수 있다. DNA 단편은 10개 미만 뉴클레오티드, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만, 75 미만, 90개 미만, 120개 미만, 150개 미만, 180개 미만, 210개 미만, 240개 미만, 270개 미만, 300개 미만, 360개 미만, 420개 미만, 480개 미만, 540개 미만, 600개 미만, 660개 미만, 720개 미만, 780개 미만, 840개 미만, 900개 미만, 960개 미만, 1020개 미만, 1080개 미만, 1140개 미만, 1200개 미만, 1260개 미만, 1320개 미만, 1380개 미만, 1440개 미만, 1500개 미만, 1560개 미만, 1620개 미만, 1680개 미만, 또는 1740개 미만 뉴클레오티드, 1800개 미만, 1860개 미만, 1820, 1880개 미만, 1940개 미만, 2000개 미만, 2600개 미만, 2700개 미만, 2800개 미만, 2900개 미만, 2910개 미만, 2920개 미만, 2930개 미만, 2931개 미만, 2932개 미만, 2933개 미만, 2934개 미만, 2935개 미만, 2936개 미만, 2937개 미만, 또는 2938개 미만일 수 있다.
폴리펩타이드 서열에 대해 "단편"은, 예를 들면, 인플루엔자 A H1 헤마글루티닌, 인플루엔자 A H2 헤마글루티닌 또는 인플루엔자 B 헤마글루티닌을 포함하는, 전체 길이 야생형 균주 인플루엔자 항원과 교차 반응하는 포유동물에서 면역 반응을 끌어낼 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 단편은 서열번호:2, 4, 7, 10, 12, 14 및 16을 포함하는 본 발명의 다양한 폴리펩타이드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리펩타이드 단편일 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 공개적으로 이용가능한 데이타, 예컨대 Los Alamos National Laboratory's HA Sequence 데이타베이스에 의해 제공되는 바와 같이 적어도 하나의 항원 에피토프를 접촉시키기 위해 분석될 수 있다. 폴리펩타이드 HA 단편은 IgE 또는 IgG와 같은 면역글로불린 선도에 대한 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 그 길이가 30개 이상 아미노산, 그 길이가 45개 이상, 60개 이상, 75개 이상, 90개 이상, 120개 이상, 150개 이상, 180개 이상, 210개 이상, 240개 이상, 270개 이상, 300개 이상, 360개 이상, 420개 이상, 480개 이상, 540개 이상, 600개 이상, 660개 이상, 또는 710개 이상 아미노산일 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 그 길이가 10개 미만 아미노산, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만, 75 미만, 90개 미만, 120개 미만, 150개 미만, 180개 미만, 210개 미만, 240개 미만, 270개 미만, 300개 미만, 360개 미만, 420개 미만, 480개 미만, 540개 미만, 600개 미만, 660개 미만, 700개 미만, 701개 미만, 702개 미만, 703개 미만, 704개 미만, 705개 미만, 706개 미만, 707개 미만, 708개 미만, 709개 미만, 또는 710개 미만 아미노산일 수 있다.
l. 유전자 구성물
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 구성물"은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 코딩 서열은 핵산 분자가 투여되는 사람의 세포에서 발현을 이끌 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종료 신호를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "발현가능한 형태"는 단백질을 인코딩하는 코딩 서열에 작동가능하게 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 구성물을 의미하고, 이로써 사람의 세포에서 존재할 때, 코딩 서열이 발현될 것이다.
m. 동일한
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 문맥에서 사용된 "동일한" 또는 "동일성"은, 서열이 특이 영역에 걸쳐 동일한 잔기 특정 백분율을 갖는다는 것을 의미한다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 특이 영역에 걸쳐 2개의 서열을 비교하고, 동일한 잔기가 매칭된 위치의 수를 산출하도록 서열 모두에서 일어나는 위치들의 수를 측정하고, 매칭된 위치의 수를 특이 영역에서 위치의 총수로 나누고, 서열 동일성을 산출하기 위해 그 결과에 100을 곱하여 계산될 수 있다. 2개의 서열은 그 길이가 상이하거나 정렬은 하나 이상의 엇갈린 말단을 생산하고, 비교의 특이 영역은 단일 서열만을 포함하는 경우에, 단일 서열의 잔기는 계산의 분자가 아니라 분모에 포함된다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민 (T) 및 우라실 (U)은 동등한 것으로 고려될 수 있다. 동일성은 손으로 또는 컴퓨터 서열 알고리듬, 예컨대 BLAST 또는 BLAST 2.0을 사용하여 수행될 수 있다.
n. 임피던스
"임피던스"는 피드백 메카니즘을 논의할 때 사용될 수 있고 오옴(Ohm) 법칙에 따라 전류 값으로 전환될 수 있고, 따라서, 예정 전류와의 비교가 가능하다.
o. 면역 반응
"면역 반응"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항원, 예컨대 인플루엔자 헤마글루티닌 공통 항원의 도입에 반응하는, 숙주, 예, 포유동물의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포 또는 체액 반응, 또는 이들 모두의 형태일 수 있다.
p. 핵산
"핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 적어도 2개의 함께 공유결합된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적인 가닥의 서열을 마련한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적인 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체는 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한, 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 조합을 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열로 혼성화할 수 있는 프로브(probe)를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화되는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있거나, 이중가닥 및 단일가닥 서열 모두의 부분을 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈과 cDNA 모두, RNA, 또는 하이브리드일 수 있고, 여기서, 상기 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포크산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학 합성 방법 또는 재조합 방법으로 얻을 수 있다.
q. 작동가능하게 연결된
"작동가능하게 연결된 "는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자의 발현이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있다는 것을 의미한다. 프로모터는 제어 하에서 유전자의 5' (업스트림) 또는 3' (다운스트림)에 위치할 수 있디. 프로모터와 유전자 사이의 거리는, 프로모터가 유도되는 유전자에서 제어하는 프로모터와 유전자 사이의 거리와 대략적으로 동일할 수 있다. 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 이 거리에서의 변형은 프로모터 기능의 손실없이 도모될 수 있다.
r. 프로모터
"프로모터"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 상승시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미한다. 프로모터는 상승 발현을 상승 및/또는 그 프로모터의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 추가로 변경시키기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 전사의 개시 부위로부터 몇 천 개의 염기쌍 만큼 위치할 수 있는 말초 인핸서 또는 억제물질 요소를 또한 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 또는, 발현이 일어나는 발생 단계에 대해, 또는 외부 자극, 예컨대 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도 제제에 반응하여 유전자의 발현 구성요소를 구성적으로 또는 분화적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, 락(lac) operator-프로모터, 택(tac) 프로모터, SV40 말기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 말기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
s. 엄격한 혼성화 조건
"엄격한 혼성화 조건"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 제1 핵산 서열 (예, 프로브)이 핵산의 복합 혼합물에서와 같이 제2 핵산 서열 (예, 표적)로 혼성화될 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 한정된 이온 세기 pH에서 특이적 서열에 대해 열적 융점 (Tm)보다 약 5-10℃ 낮게 선택될 수 있다. Tm은 표적에 대해 상보적인 프로브의 50%가 하이브리드 평형에서 표적 서열에 혼성화하는 (한정된 이온 세기, pH, 및 핵 농도 하의) 온도일 수 있다 (표적 서열은 Tm에서 과잉으로 존재하기 때문에, 프로브의 50%가 평형에서 차지한다). 엄격한 조건은, 염 농도가 pH 7.0-8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 예컨대 약 0.01-1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고 온도는 짧은 프로브(예, 약 10-50개의 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브 (예, 약 50 초과의 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 60℃인 것일 수 있다. 엄격한 조건은 탈안정제, 예컨대 포름아마이드의 부가와 함께 또한 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화에 대해, 양성 신호는 적어도 2 내지 10회 백그라운드 혼성화일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기를 포함한다: 50% 포름아마이드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이팅, 또는, 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이팅, 0.2x SSC에서 세정, 및 65℃에서 0.1% SDS.
t. 실질적으로 상보적인
"실질적으로 상보적인"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 제1 서열은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 제2 서열의 상보성과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 2개의 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화된다는 것을 의미한다.
u. 실질적으로 동일한
"실질적으로 동일한"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 제1 및 제2 서열이, 제1 서열이, 제2 서열의 상보성에 실질적으로 상보적이면 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐, 또는 핵산에 대해, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미한다.
v. 하위유형 또는 혈청형
"하위유형" 또는 "혈청형"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상호교환적으로, 및 인플루엔자 바이러스를 참조하여, 인플루엔자 바이러스의 유전자 변이체를 의미하고 이로써 하나의 하위유형은 상이한 하위유형과는 별도로 면역계에 의해 인식된다.
w. 변이체
핵산에 대해 본 명세서에 사용된 "변이체"는 (i) 참조 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 단편; (ⅱ) 참조 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분의 보충물; (ⅲ) 참조 핵산 또는 그의 보충물과 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조 핵산, 그의 보충물, 또는 그와 실질적으로 동일한 서열에 대한 엄격한 조건 하에서 혼성화된 핵산을 의미한다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열에서 차이가 있지만, 적어도 하나의 생물 활성을 보유한다. 변이체는 또한, 적어도 하나의 생물 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 또한 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성 (예, 전하 영역의 친수성, 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 부분 변경을 전형적으로 수반하는 당해 기술에서 인식된다. 이들 부분 변경은 당해 기술에서 이해되는 바와 같이 아미노산 수치료 지수(hydropathic index)를 고려하여 부분적으로 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 수치료 지수는 그의 소수성 및 변화의 고려를 기반으로 한다. 유사한 수치료 지수의 아미노산은 치환될 수 있고, 여전히 단백질 기능을 보유한다는 것은 당해 기술에 공지되어 있다. 일 측면에서, ±2의 수치료 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 생물학적 기능을 갖는 단백질을 어는 치환을 나타내기 위해 또한 사용될 수 있다. 펩타이드의 문맥에서 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 관련되는 것으로 보고된 유용한 측정인, 그 펩타이드의 최고 국소 평균 친수성의 계산을 허용한다. 미국 특허 번호 4,554,101, 이는 참조로 본 명세서에 완전히 통합되어 있다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은, 당해 기술에서 이해된 바와 같아, 생물 활성, 예를 들면 면역원성을 보유하는 펩타이드가 생성될 수 있다. 치환은 서로의 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 모두는 그 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그 관찰과 일치하기 때문에, 생물학적 기능과 양립가능한 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 변화, 크기, 및 다른 특성에 의해 드러난 바와 같이, 아미노산의 상대 유사성, 및 특히 그 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다.
x. 벡터
"벡터"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 복제의 기원을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 벡터, 박테리오파아지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는, DNA 플라스미드이다.
2. 인플루엔자 항원
본 명세서에는 하나 이상의 인플루엔자 혈청형에 대항하여 포유둥물에서 면역 반응을 끌어낼 수 있는 항원이 제공된다. 항원은 하나 이상의 감염병 균주, 예컨대 2009 H1N1 돼지 기원의 인플루엔자에 대항하는 것을 포함하는 하나 이상의 인플루엔자 혈청형에 대항하여 포유동물에서 면역 반응을 끌어낼 수 있다. 항원은 돼지 유래 인간 인플루엔자의 하나 이상의 균주에 대항하는 것을 포함하는 하나 이상의 인플루엔자 혈청형에 대항하여 포유동물에서 면역 반응을 끌어낼 수 있다. 항원은 항-인플루엔자 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적인 에피토프를 포함할 수 있다.
항원은 전체 길이 번역 생산물 HA0, 서브유닛 HA1, 서브유닛 HA2, 그의 변이체, 그의 단편 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 인플루엔자 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자의 다중 균주 A 혈청형 H1으로부터 유래된 공통 서열, 인플루엔자의 다중 균주 A 혈청형 H2로부터 유래된 공통 서열, 인플루엔자의 다중 균주 A 혈청형 H1의 상이한 세트로부터 유래된 2개의 상이한 공통 서열의 부분을 함유하는 하이브리드 서열 또는 인플루엔자의 다중 균주 B로부터 유래된 공통 서열일 수 있다. 인플루엔자 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자 B로부터 유래될 수 있다. 항원은, 면역 반응이 유도될 수 있는 특정 인플루엔자 면역원에 대항하여 효과적일 수 있는 적어도 하나의 항원 에피토프를 함유할 수 있다. 항원은 원래대로의 인플루엔자 바이러스에 존재하는 면역원 부위 및 에피토프의 전체 레퍼토리를 제공할 수 있다. 항원은 하나의 혈청형의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주, 예컨대 혈청형 H1 또는 혈청형 H2의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주로부터의 헤마글루티닌 항원 서열로부터 유래될 수 있는 공통 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다. 항원은 2개의 상이한 공통 헤마글루티닌 항원 서열 또는 그의 부분의 조합으로부터 유래될 수 있는 하이브리드 공통 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다. 각각의 2개의 상이한 공통 헤마글루티닌 항원 서열은 하나의 혈청형의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주, 예컨대 혈청형 H1의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주의 상이한 세트로부터 유래될 수 있다. 항원은 복수의 인플루엔자 B 바이러스 균주로부터의 헤마글루티닌 항원 서열로부터 유래될 수 있는 공통 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다.
공통 헤마글루티닌 항원은 서열번호:2 (공통 H1 아미노산 서열)을 포함하는 단백질일 수 있고, 여기서 아미노산 1-343은 전구체 HA0 공통 H1 아미노산 서열의 HA1 서브유닛에 해당하고 아미노산 344-566은 HA0 공통 H1 아미노산 서열의 HA2 서브유닛에 해당한다. 공통 헤마글루티닌 항원은 서열번호:7 (공통 H2 아미노산 서열)을 포함하는 단백질일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 항원은 다른 것으로부터의 서열의 상이한 세트로부터 각각 유래되는 2개의 상이한 공통 H1 서열의 부분들을 포함하는 합성 하이브리드 공통 H1 서열일 수 있다. 합성 하이브리드 공통 H1 단백질인 공통 HA 항원의 예는 서열번호:10 (U2 아미노산 서열)을 포함하는 단백질이다. 공통 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자 B 균주로부터의 헤마글루티닌 서열로부터 유래된 공통 헤마글루티닌 단백질, 예컨대 서열번호:14 (공통 BHA 아미노산 서열)을 포함하는 단백질일 수 있다.
공통 헤마글루티닌 항원은 하나 이상의 추가 아미노산 서열 요소를 추가로 포함할 수 있다. 공통 헤마글루티닌 항원은 그의 N-말단 상에서 IgE 또는 IgG 선도 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. IgE 선도 아미노산 서열은 서열번호:17일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 항원은 쉽게 이용가능한 항체에 의해 탐지될 수 있는 독특한 면역원 에피토프인 면역원 태그를 추가로 포함할 수 있다. 그와 같은 면역원 태그의 예는 공통 헤마글루티닌 C 말단 상에 연결될 수 있는9 아미노산 인플루엔자 HA 태그다. HA 태그 아미노산 서열은 서열번호:18일 수 있다. 일부 구현예에서, 공통 헤마글루티닌 항원은 그의 N-말단 상에서 IgE 또는 IgG 선도 아미노산 서열을 그리고 그의 C 말단 상에서 HA 태그를 추가로 포함할 수 있다.
공통 헤마글루티닌 항원은 공통 인플루엔자 아미노산 서열 또는 그의 단편 및 변이체로 이루어진 공통 헤마글루티닌 단백질일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 항원은 비-인플루엔자 단백질 서열 및 인플루엔자 단백질 서열 또는 그의 단편 및 변이체를 포함하는 공통 헤마글루티닌 단백질일 수 있다.
공통 H1 단백질의 예는 공통 H1 아미노산 서열 (서열번호:2)로 이루어질 수 있는 것 또는 추가 요소, 예컨대 IgE 선도 서열, 또는 HA 태그 또는 IgE 선도 서열 및 HA 태그 이들 모두를 추가로 포함할 수 있는 것을 포함한다. IgE 선도 서열 및 HA 태그 이들 모두를 포함하는 공통 H1 단백질의 예는 서열번호:4이고, 이는 그의 N 말단에서 IgE 선도 아미노산 서열 (서열번호:17)에 연결되고 그의 C 말단에서 HA 태그 (서열번호:18)에 연결된 공통 H1 아미노산 코딩 서열 (서열번호:2)를 포함한다.
공통 H2 단백질의 예는 공통 H2 아미노산 서열 (서열번호:7)로 이루어진 것 또는 선도 서열, 또는 HA 태그, 또는 IgE 선도 서열 및 HA 태그 이들 모두를 추가로 포함하는 것을 포함한다.
하이브리드 공통 H1 단백질의 예는 공통 U2 아미노산 서열 (서열번호:10)으로 이루어진 것 또는 IgE 선도 서열, 또는 HA 태그, 또는 IgE 선도 서열 및 HA 태그 이들 모두를 추가로 포함하는 것을 포함한다. 공통 U2 단백질의 예는 서열번호:12이고, 이는 그의 N 말단에서 IgE 선도 아미노산 서열 (서열번호:17)에 연결되고 그의 C 말단에서 HA 태그 (서열번호:18)에 연결된 공통 U2 아미노산 서열 (서열번호:10)을 포함한다.
하이브리드 공통 인플루엔자 B 헤마글루티닌 단백질의 예는 공통 BHA 아미노산 서열 (서열번호:14)로 이루어질 수 있는 것을 포함하거나, IgE 선도 서열, 또는 HA 태그, 또는 IgE 선도 서열 및 HA 태그 이들 모두을 포함할 수 있다. 공통 BHA 단백질의 예는 서열번호:16이고, 이는 그의 N 말단에서 IgE 선도 아미노산 서열 (서열번호:17)에 연결되고 그의 C 말단에서 HA 태그 (서열번호:18)에 연결된 공통 BHA 아미노산 서열 (서열번호:14)을 포함한다.
공통 헤마글루티닌 단백질은 공통 헤마글루티닌 핵산, 그의 변이체 또는 그의 단편에 의해 인코딩될 수 있다. 상이한 균주 및 변이체로부터의 복수의 상이한 헤마글루티닌 서열로부터 유래된 공통 서열일 수 있는 공통 헤마글루티닌 단백질과는 달리, 공통 헤마글루티닌 핵산은 공통 단백질 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 의미하고 사용된 코딩 서열은, 공통 헤마글루티닌 단백질 서열이 유래되는 복수의 상이한 헤마글루티닌 서열에서 특정 아미노산 서열을 인코딩하기 위해 사용된 것과는 상이할 수 있다. 공통 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있고/있거나 RNA 최적화될 수 있다. 공통 헤마글루티닌 핵산 서열은 5' 비번역 영역에서 코작(Kozak) 서열을 포함할 수 있다. 공통 헤마글루티닌 핵산 서열은 선도 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. N 말단 선도 서열의 코딩 서열은 헤마글루티닌 코딩 서열의 5'이다. N-말단 선도는 분비를 용이하게 할 수 있다. N-말단 선도는 IgE 선도 또는 IgG 선도일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 핵산 서열은 면역원 태그를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 면역원 태그는 단백질의 C 말단 상에 있을 수 있고, 그것을 인코딩하는 서열은 HA 코딩 서열의 3'이다. 면역원 태그는 쉽게 이용가능한 항체가 있는 독특한 에피토프를 제공하고, 이로써 그와 같은 항체는 단백질의 발현을 탐지 및 확인하기 위해 검정에서 사용될 수 있다. 면역원 태그는 단백질의 C-말단에서 H 태그일 수 있다.
공통 헤마글루티닌 핵산은 서열번호:2, 서열번호:7, 서열번호:10 또는 서열번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 서열번호:2, 서열번호:7, 서열번호:10 또는 서열번호:14를 인코딩하는 공통 헤마글루티닌 핵산은 서열번호:1, 서열번호:6, 서열번호:9 또는 서열번호:13 각각일 수 있다. 공통 헤마글루티닌 핵산은 IgE 선도 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 HA 태그 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이들 모두를 추가로 포함할 수 있다. 서열번호:17은 IgE 선도 폴리펩타이드 서열이다. 서열번호:18은 HA 태그 폴리펩타이드 서열이다. IgE 선도 서열 및 HA 태그를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 헤마글루티닌 공통 핵산의 예는 서열번호:4, 서열번호:12 또는 서열번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 서열번호:4, 서열번호:12 또는 서열번호:16을 인코딩하는 공통 헤마글루티닌 핵산은 서열번호:3, 서열번호:11 또는 서열번호:15 각각일 수 있다.
3. 유전자 구성물 및 플라스미드
본 명세서에는 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있는 유전자 구성물이 제공된다. 유전자 구성물은 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 기능성 염색체외 분자로서 세포에서 존재할 수 있다. 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 구성물은 센트로머(centromere), 텔로머(telomer) 또는 플라스미드 또는 코스미드(cosmid)를 포함하는 선형 미니염색체일 수 있다.
유전자 구성물은 또한, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관 바이러스 및 재조합 우두를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 게놈의 일부일 수 있다. 유전자 구성물은 생약독화 미생물, 또는 세포에서 살아 있는 재조합 미생물 벡터에서 유전 물질의 일부일 수 있다.
유전자 구성물은 헤마글루티닌 핵산의 유전자 발현에 대한 조절 요소를 포함할 수 있다. 조절 요소는 프로모터, 인핸서 개시 코돈, 정지 코돈, 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
조성물은 인플루엔자 A 공통 헤마글루티닌 H1 항원, 인플루엔자 A 공통 헤마글루티닌 H2 항원, 인플루엔자 A 공통 헤마글루티닌 U2 항원, 및 인플루엔자 B 공통 헤마글루티닌 단백질 BHA중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 헤마글루티닌 공통 항원을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함할 수 있고, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 단백질 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 (BHA) 및 인플루엔자 B 뉴라미니다제 (BNA)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질(들)을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열(들)을 추가로 포함할 수 있다. 제1 및 추가 핵산 서열은 동일한 핵산 분자 또는 상이한 핵산 분자 상에 존재할 수 있다. 제1 및 추가 핵산 서열은 인간 세포에서 기능하는 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다. 추가 코딩 서열은 인플루엔자의 균주 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, BHA 및 BNA를 인코딩할 수 있고, 또는 혈청형을 갖는 복수의 균주로부터 유래된 공통, 또는 2개 이상의 공통 서열로부터의 서열을 포함하는 하이브리드일 수 있다.
핵산 서열은 벡터일 수 있는 유전자 구성물을 만들 수 있다. 벡터는 포유동물에서 면역 반응을 끌어 내는데 효과적인 양으로 포유동물의 세포에서 공통 헤마글루티닌 항원을 발현시킬 수 있다. 벡터는 재조합일 수 있다. 벡터는 공통 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 이종 핵산을 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드일 수 있다. 벡터는, 형질전환된 숙주 세포가 배양되고 공통 헤마글루티닌 항원의 발현이 일어나는 조건 하에서 유지되는 공통 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 핵산으로 세포를 전달감염시키는데 유용할 수 있다.
벡터는 공통 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 이종 핵산을 포함할 수 있고, 공통 헤마글루티닌 코딩 서열의 업스트림일 수 있는 개시 코돈, 및 공통 헤마글루티닌 코딩 서열의 다운스트림일 수 있는 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 개시 및 종료 코돈은 공통 헤마글루티닌 코딩 서열을 갖는 프레임에 있을 수 있다. 벡터는 또한, 공통 헤마글루티닌 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 공통 헤마글루티닌 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 유인원 바이러스 40 (SV40)으로부터의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 프로모터, 예컨대 솟과 동물 면역결핍 바이러스 (BIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, 몰로니(Moloney) 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 (ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉시 초기 프로모터, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 (EBV) 프로모터, 또는 로우스(Rous) 육종 바이러스 (RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 액틴, 인간 마이오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한, 조직 특이적 프로모터, 예컨대 근육 또는 피부 특이적 프로모터, 천연 또는 합성일 수 있다. 그와 같은 프로모터의 예는 미국 특허 출원 공개 번호 US20040175727에 기재되어 있고, 이들의 내용은 그 전체가 본 명세서에 통합되어 있다.
벡터는 HA 코딩 서열의 다운스트림인 폴리아데닐화 신호를 또한 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 솟과 동물 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 벡터로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다 (Invitrogen, San Diego, CA).
벡터는 공통 헤마글루티닌 코딩의 인핸서 업스트림을 또한 포함할 수 있다. 인핸서는 DNA 발현에 필요할 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 마이오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스 인핸서, 예컨대 CMV, HA, RSV 또는 EBV로부터의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 기능 상승은 미국 특허 번호 5,593,972, 5,962,428, 및 WO94/016737에 기재되어 있고, 각각의 내용은 참고로 완전히 통합되어 있다.
벡터는 벡터를 염색체외적으로 유지하고 세포에서 벡터의 다중 복제물을 생산하기 위해 복제의 포유동물 기원을 또한 포함할 수 있다. 벡터는 pVAX1 (도 1), pCEP4 또는 pREP4 (Invitrogen (San Diego, CA))일 수 있고, 이는 통합없이 높은 카피(copy) 에피솜 복제를 생산할 수 있는, 복제 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역의 엡스타일 바르(Epstein Barr) 바이러스 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 상기 섹션의 도면의 간단한 설명에서 도 1을 참조하는 단락에 기재된 것과 같은 변화가 있는 pVAX1일 수 있다. 벡터의 뼈대는 pAV0242일 수 있다. 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5 (Ad5) 벡터일 수 있다.
벡터는, 벡터가 투여되는 포유동물 또는 인간 세포에서 유전자 발현에 잘 적합될 수 있는 조절 서열을 또한 포함할 수 있다. 공통 헤마글루티닌 코딩 서열은 숙주 세포에서 코딩 서열의 더 능률적인 절사를 허용할 수 있는 코돈을 포함할 수 있다.
벡터는 pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 대장균 (E.coli)에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 벡터는 또한 pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 효모의 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 벡터는 또한 MAXBACTM 완전 배큘로 바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 곤충 세포에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 벡터는 또한 pcDNA I 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난포세포(Chinese hamster ovary; CHO)에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 벡터는 하기를 포함하는 일상적인 기술 및 쉽게 이용가능한 개시 물질에 의해 단백질을 생산하기 위해 발현 벡터 및 시스템일 수 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning an Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989), 이는 참조로 완전히 통합되어 있다.
벡터는 pGX2009 또는 pGX2006일 수 있고, 이는 공통 헤마글루티닌 항원을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 벡터 pGX2009 (4739 bp, 도 2; 서열번호:5)는 공통 H1 아미노산 서열 (서열번호:1에 의해 인코딩된 아미노산 서열번호:2)에 연결된 IgE 선도 서열 (서열번호:11에 의해 인코딩된 아미노산 서열번호:12)을 포함하는 공통 H1 단백질 (서열번호:3에 의해 인코딩된 아미노산 서열번호:4)을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 변형 pVAX1 플라스미드이다. 벡터 pGX2006 (4628 bp; 도 3, 서열번호:8)은 공통 H2 단백질 (서열번호:6에 의해 인코딩된 아미노산 서열번호:7)을 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 pVAX1 플라스미드이다.
공통 헤마글루티닌 코딩 서열을 포함하는 본 명세서에 개시된 유전자 구성물 및 구성요소는 또한, 다른 인플루엔자 단백질, 예컨대 인플루엔자 A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있고, 이로써 인플루엔자 A 단백질 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제 단백질을 위한 코딩 서열은 공통 헤마글루티닌 코딩 서열 대신에 포함된다.
4. 약제학적 조성물
본 명세서에는 약 1 나노그램 내지 약 10 mg의 DNA를 포함하는 본 발명에 따른 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 1) 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 나노그램, 또는 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 또는 1000 마이크로그램, 또는 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg 이상; 및 2) 최대 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 나노그램, 또는 최대 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 또는 1000 마이크로그램, 또는 최대 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg의 사이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 10 mg의 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 25 나노그램 내지 약 5 mg의 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 50 나노그램 내지 약 1 mg의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 5 내지 약 250 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 10 내지 약 200 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 15 내지 약 150 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 20 내지 약 100 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 75 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 30 내지 약 50 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 35 내지 약 40 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램 DNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 10 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 20 마이크로그램 내지 약 80 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 25 마이크로그램 내지 약 60 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 30 나노그램 내지 약 50 마이크로그램의 DNA. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 35 나노그램 내지 약 45 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램 DNA를 함유한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 사용될 투여 방식에 따라 제형된다. 약제학적 조성물이 주사가능 약제학적 조성물인 경우에, 멸균되어 있고, 발열인자 및 미립자가 없다. 등장 제형이 사용되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 나트륨 클로라이드, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 등장 용액, 예컨대 포스페이트 완충 식염수가 바람직하다. 안정제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈관수축제가 제형에 첨가된다.
바람직하게는 약제학적 조성물은 백신이고, 및 더 바람직하게는 DNA 백신이다.
본 명세서에는 하나 이상의 인플루엔자 혈청형에 대항하여 면역 반응을 포유동물에서 생성할 수 있는 백신에 제공된다. 백신은 상기에서 논의된 바와 같이 유전자 구성물을 포함할 수 있다. 백신은 하나 이상의 인플루엔자 A 혈청형, 예컨대 H1-H16 인플루엔자 B 헤마글루티닌 또는 그의 조합으로 인도되는 복수의 벡터 각각을 포함할 수 있다. 백신은 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 백신이 하나 초과의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 포함할 때, 모든 그와 같은 서열은 단일 핵산 분자 상에 존재할 수 있거나 그와 같은 서열 각각은 상이한 핵산 분자 상에 존재할 수 있다. 대안적으로, 하나 초과의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 포함하는 백신은 단일 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 갖는 핵산 분자 및 하나 초과의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 갖는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 포함하는 백신은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 및 인플루엔자 B 뉴라미니제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 위한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 단백질을 포함할 수 있다. 일부 백신은 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원, 예컨대 H1, H2, U2 및 BHA을 포함할 수 있다. 백신은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 및 인플루엔자 B 뉴라미니다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 다른 단백질을 포함할 수 있다. 백신은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 다른 단백질과 조합하여 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원을 포함할 수 있다.
백신은 DNA 백신일 수 있다. DNA 백신은 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 포함하는 복수의 동일 또는 상이한 플라스미드를 포함할 수 있다. DNA 백신은 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. DNA 백신이 하나 초과의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 포함할 때, 모든 그와 같은 서열은 단일 플라스미드 상에 존재할 수 있거나, 그와 같은 서열 각각은 상이한 플라스미드 상에 존재할 수 있거나, 일부 플라스미드는 단일 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 포함할 수 있고, 한편 다른 플라스미드는 하나 초과의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 갖는다. 또한, DNA 백신은 인플루엔자 A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 및 뉴라미다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 위한 하나 이상의 공통 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 그와 같은 추가 코딩 서열은 서로 것 및 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열을 포함하는 플라스미드와 동일 또는 상이한 플라스미드 상에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 인플루엔자 항원와 조합하여 인플루엔자 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원, 예컨대 H1, H2, U2 및 BHA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 인플루엔자 A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 및 뉴라미다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 하나 이상의 다른 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 백신은 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원, 예컨대 H1, H2, U2 및 BHA를 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 인플루엔자 A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 및 뉴라미다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 하나 이상의 다른 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 백신은 하나 이상의 H1, H2, U2 및 BHA을 인코딩하는 것을 포함하는3개 이상의 공통 헤마글루티닌 핵산 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 공통 U2, 공통 BHA 및 H3 헤마글루티닌을 인코딩하는 것을 포함하는 3개 이상의 헤마글루티닌 핵산 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 공통 BHA, H1 헤마글루티닌 및 H3 헤마글루티닌을 인코딩하는 것을 포함하는 3개 이상의 헤마글루티닌 핵산 서열의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 미국 시리즈 번호 12/375,518 (이는 참고로 본 명세서에 통합되어 있다) 및/또는 미국 시리즈 번호 12/269,824 (이는 참고로 본 명세서에 통합되어 있다)에서 개시된 하나 이상의 인플루엔자 항원을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 서열번호:20 (이는 서열번호:36 및 서열번호:37 각각으로서 미국 시리즈 번호 12/375,518에서 개시된 H1 헤마글루티닌이다)을 인코딩하는 핵산 서열 서열번호:19 및/또는 서열번호:22 (이는 서열번호:9 및 서열번호:10 각각으로서 미국 시리즈 번호 12/269,824에서 개시된 H1 헤마글루티닌이다)을 인코딩하는 핵산 서열 서열번호:21을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 서열번호:24 (이는 서열번호:11 및 서열번호:12 각각으로서 미국 시리즈 번호 12/269,824에서 개시된 H3 헤마글루티닌이다)을 인코딩하는 핵산 서열 서열번호:23을 포함한다.
일부 구현예에서, 백신은 하나 이상의 H1, H2, U2 및 BHA을 포함하는 3개 이상의 공통 헤마글루티닌 단백질의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 공통 U2, 공통 BHA 및 H3 헤마글루티닌을 포함하는 3개 이상의 헤마글루티닌 단백질의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 공통 BHA, H1 헤마글루티닌 및 H3 헤마글루티닌을 포함하는 3개 이상의 헤마글루티닌 단백질의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 미국 시리즈 번호 12/375,518 및/또는 미국 시리즈 번호 12/269,824로부터 하나 이상의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 서열번호:20 및/또는 서열번호:22 및/또는 서열번호:24를 포함한다.
일부 구현예에서, 백신은 1) 공통 헤마글루티닌 U2 단백질 및/또는 공통 헤마글루티닌 U2 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 2) 공통 헤마글루티닌 BHA 단백질 및/또는 공통 헤마글루티닌 BHA 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 및 3) 서열번호:24에서 개시된 헤마글루티닌 H3 단백질의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 백신은 1) 공통 헤마글루티닌 BHA 단백질 및/또는 공통 헤마글루티닌 BHA 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 2) 서열번호:20 및/또는 서열번호:22를 갖는 헤마글루티닌 H1 단백질 및/또는 헤마글루티닌 H1 단백질 인코딩 핵산 서열 서열번호:19 및/또는 서열번호:21, 및 3) 서열번호:24를 갖는 헤마글루티닌 H3 단백질 및/또는 헤마글루티닌 H3 단백질 인코딩 핵산 서열 서열번호:23의 조합을 포함한다.
DNA 백신은 미국특허번호 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055, 및 5,676,594에 개시되어 있고, 이는 참고로 완전히 본 명세서에 통합되어 있다. DNA 백신은, 염색체에 염색체에 통합되지 않도록 하는 요소 또는 반응자(reagent)를 추가로 포함할 수 있다. 백신은 헤마글루티닌 항원의 RNA일 수 있다. RNA 백신은 세포에 도입될 수 있다.
백신은 상기에 기재된 유전자 구성물 또는 항원을 포함하는 재조합 백신일 수 있다. 백신은 하나 이상의 단백질 서브유닛, 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원을 포함하는 하나 이상의 사멸된 인플루엔자 입자, 또는 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원을 포함하는 하나 이상의 약독화 인플루엔자 입자의 형태로 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원을 또한 포함할 수 있다. 약독화 백신은 약독화 생백신, 하나 이상의 공통 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 이질적인 것 유전자를 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 백신 및 사열된 백신, 뿐만 아니라 서브유닛 및 당단백질 백신일 수 있다. 약독화 생백신의 예, 이질적인 것 항원을 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 것, 서브유닛 백신 및 당단백질 백신은 미국 특허 번호: 4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,3 64; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 및 6,589,529에 기재되어 있고, 이들 각각은 참고로 본 명세서에 통합되어 있다.
백신은 전세계의 특정 지역, 예를 들면, 아시아로부터 인플루엔자 A 혈청형으로 인도되는 벡터 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 백신은 인간을 이제 감염시키는 돼지 기원의 인플루엔자 A 혈청형에 대항하여 또한 인도될 수 있다. 백신은 전세계의 특정 영역으로부터 인플루엔자 B로 인도되는 벡터 및/또는 단백질를 포함할 수 있다. 백신은 인간을 감염시키는 인플루엔자 B에 대항하여 또한 인도될 수 있다. 백신은 인플루엔자 A 및/또는 B의 하나 이상의 균주로 인도되는 하나 이상의 벡터 및/또는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.
제공된 백신은 치료 또는 예방 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 항체 및/또는 킬러(killer) T 세포가 생성될 수 있고, 그 세포는 공통 헤마글루티닌 항원으로 인도되고 또한 널리 다중 하위유형의 인플루엔자 바이러스를 가로질 수 있다. 그와 같은 항체 및 세포는 단리될 수 있다.
백신은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 비히클, 항진제, 담체, 또는 희석제로서 기능성 분자일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 전달감염 촉진제일 수 있고, 이 촉진제는 표면활성제, 예컨대 면역 자극 복합체 (ISCOMS), 프로이드(Freund) 불완전 항진제, 모노포스포릴 지질 A, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사물, 소포, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함하는 LPS 유사물, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 전달감염 촉진제를 포함할 수 있다.
전달감염 촉진제는 다중음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)을 포함하는 다중양이온, 또는 지질이다. 전달감염 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 바람직하게는, 폴리-L-글루타메이트 6 mg/ml 미만의 농도에서 백신에 존재한다. 전달감염 촉진제는 표면활성제, 예컨대 면역 자극 복합체 (ISCOMS), 프로이드 불완전 항진제, 모노포스포릴 지질 A, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사물 및 소포, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함하는 LPS 유사물를 포함할 수 있고, 히알루론산은 유전자 구성물과 공동으로 투여되기 위해 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 벡터 백신은 전달감염 촉진제, 예컨대 지질, 레시틴 리포좀 또는, DNA-리포좀 혼합물 (참조 예를 들면 W09324640)로서 당해분야에 공지된 다른 리포좀을 포함하는 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 전달감염 촉진제를 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 전달감염 촉진제는 다중음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중양이온, 또는 지질이다. 백신 중 전달감염제의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.
약제학적으로 허용가능한 부형제는 항진제일 수 있다. 항진제는 대안적인 플라스미드에서 발현되거나 백신에서 상기 플라스미드와 조합하여 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 항진제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: α-인터페론(IFN-α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), 상피 T 세포 유인 케모카인 (CTACK), 상피 흉선 발현 케모카인 (TECK), 점막 여관 상피 케모카인 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, 결실된 신호 서열을 갖는 IL-15를 포함하고 IgE로부터 신호 펩타이드를 임의로 포함하는 CD86. 항진제는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 그의 조합일 수 있다.
유용한 항진제일 수 있는 다른 유전자는 하기를 인코딩하는 것을 포함한다: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 그의 기능성 단편.
백신은, 참고로 완전히 통합되어 있는 미국 시리즈 번호 021,579 (1994년 4월 1일 출원)에 기재된 바와 같은 유전자 백신 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.
5. 전달 방법
본 명세서에는, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역 반응이 유도될 수 있는 특정 효과적인 면역원을 만드는 에피토프를 포함하는 헤마글루티닌 항원의 유전자 구성물 및 단백질을 제공하기 위한 약제학적 제형, 바람직하게는 백신의 전달 방법이 제공된다. 백신의 전달 방법, 또는 예방접종은 치료 및/또는 예방 면역 반응을 유도하기 위해 제공될 수 있다. 예방접종 과정은 H1N1 혈청형, 예컨대 2009 돼지 기원 H1N1, 또는 다른 계절적 및/또는 대유행 다양성을 포함하는 복수의 인플루엔자 하위유형에 대항하는 면역 반응을 포유동물에서 생성할 수 있다. 백신은 포유동물의 면역계의 활성을 조절하고, 면역 반응을 향상시키기 위해 사람에게 전달될 수 있다. 백신의 전달은 세포에서 발현되는 핵산 분자로서 HA 항원의 전달감염일 수 있고, 면역계가 인식되고 세포, 체액, 또는 세포 및 체액 반응을 유도하는 세포의 표면에 전달될 수 있다. 백신의 전달은 포유동물에게 본 명세서에서 논의된 백신을 포유동물에게 투여하여 복수의 인플루엔자 바이러스에 대항하여 포유둥물에서 면역반응을 유도하거나 이끌어 내기 위해 사용될 수 있다.
백신의 포유동물에의 전달시, 및 벡터의 포유동물의 세포에서 전달시, 전달감염된 세포는 발현될 것이고, 상응하는 인플루엔자 단백질을 분비할 것이고, 이 단백질은 적어도 하나의 공통 항원, 및 바람직하게는 H1, H2, U2, 및 BHA를 포함한다. 이들 분비된 단백질, 또는 합성 항원은, 항원에 대항하여 만들어진 항체, 및 항원에 특이적으로 대항하는 및 T-세포 반응을 포함하는 면역 반응을 올려 놓을 것인 면역계에 의해 이질적인 것으로서 인식될 것이다. 일부 실시예에서, 본 명세서에서 논의된 백신으로 예방접종된 포유동물은 프라이밍된(primed) 면역계를 가질 수 있고, 인플루엔자 바이러스 균주로 도전될 때, 프라이밍된 면역계는 체액, 세포, 또는 이들 모두를 통해서든지 차후의 인플루엔자 바이러스의 빠른 소거를 허용할 것이다. 백신은 사람의 면역계의 활성을 조절하기 위해 사람에게 전달될 수 있고, 이로써 면역 반응을 향상시킨다.
백신은 DNA 백신 형태로 전달될 수 있고, DNA 백신의 전달 방법은 참고로 완전히 통합되어 있는 미국 특허 번호 4,945,050 및 5,036,006에 기재되어 있다.
백신은 포유동물에서 면역 반응을 끌어내기 위해 포유동물에게 투여될 수 있다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 암소, 돼지, 양, 염소, 영양, 아메리카들소, 물소, 소, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마(llama), 알파카(alpaca), 마우스, 랫트, 또는 닭일 수 있고, 바람직하게는 인간, 암소, 돼지, 또는 닭이다.
a. 병용 치료
약제학적 조성물, 바람직하게는 백신은 하나 이상의 다른 인플루엔자 단백질 또는 유전자 인코딩 인플루엔자 A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 및 뉴라미다제와 병용하여 투여될 수 있다. 백신은 단백질 또는 유전자 인코딩 항진제와 병용하여 투여될 수 있고, 이 항진제는 하기를 포함한다: α-인터페론(IFN-α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, 또는 TAP2, 또는 그의 기능성 단편.
b. 투여 경로
백신은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 점막, 국소, 흡입을 통해, 뺨 투여를 통해, 늑막강, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내 경막내, 및 관절내 또는 그의 조합를 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의 용도에 대해, 조성물은 보통의 수의 실시에 따라 적당하게 허용가능한 제형으로서 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 대해 가장 적합한 복용 계획 및 투여 방식을 쉽게 결정할 수 있다. 백신은 주사 장치가 필요 없는 종래의 주사기, "미세입자투사법 곤 건스 (microprojectile bombardment gone guns)", 또는 다른 물리적 방법, 예컨대 전기천공 ("EP"), "유체역학적 방법", 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.
백신의 벡터는 생체내 전기천공, 매개된 리포좀, 촉진된 나노입자, 재조합 벡터, 예컨대 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관 바이러스 및 재조합 우두(vaccinia)와 함께 또는 없이 DNA 주사 (DNA 예방접종이라 칭함)를 포함하는 몇 개의 공지된 기술에 의해 포유동물에 전달될 수 있다. HA 항원은 DNA 주사를 통해 및 생체내 전기천공과 함게 전달될 수 있다.
c. 전기천공
백신의 플라스미드의 전기천공을 통한 백신의 투여는, 가역 공극이 세포막에서 형성하는데 효과적인 에너지의 펄스를 포유동물의 원하는 조직에 전달하도록 구성된 전기천공 장치를 사용하여 달성될 수 있고, 바람직하게는 에너지의 펄스는 사용자에 의한 미리설정된 전류 입력과 유사한 일정 전류이다. 전기천공 장치는 전기천공 구성요소 및 전극 어셈블리를 포함할 수 있거나 어셈블리를 다룰 수 있다. 전기천공 구성요소는 하기를 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소 중 하나 이상을 포함하고 혼입할 수 있다: 컨트롤러, 전류 파형 제너레이터, 임피던스 테스터, 파형 로저(logger), 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 구성요소, 전원, 및 파워 스위치. 전기천공은 플라스미드에 의한 세포의 전달감염을 촉진하기 위해 생체내 전기천공 장치, 예를 들면 CELLECTRA? EP 시스템 (VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) 또는 엘젠 전기천공기 (Elgen electroporator; Genetronics, San Diego, CA)를 사용하여 달성될 수 있다.
전기천공 구성요소는 전기천공 장치의 하나의 요소로서 기능할 수 있고, 다른 요소는 전기천공 구성요소와 통신하는 별개의 요소 (또는 구성요소)이다. 전기천공 구성요소는 전기천공 구성요소와는 별개인 전기천공 장치의 또 다른 요소와 통신할 수 있는 전기천공 장치의 하나 초과의 요소로서 기능할 수 있다. 하나의 전기기계적 또는 기계적 장치의 일부로서 존재하는 전기천공 장치의 요소는, 그 요소가 하나의 다른 것과 통신하는 하나의 장치 또는 별개의 요소로서 기능하는한 제한될 수 없다. 전기천공 구성요소는 원하는 조직에서 일정 전류를 생산하고 피드백 메커니즘을 포함하는 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 전극 어셈블리는 공간적 정렬에서 복수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함할 수 있고, 여기서 전극 어셈블리는 전기천공 구성요소로부터 에너지의 펄스를 수신하고, 전극을 통해 원하는 조직에 전달한다. 복수의 전극 중 적어도 하나는 에너지의 펄스의 전달 동안 중성이고, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 전기천공 구성요소에 전달한다. 피드백 메카니즘은 측정된 임피던스를 수신할 수 있고, 일정 전류를 유지하기 위해 전기천공 구성요소에 의해 전달된 에너지의 펄스를 조정할 수 있다.
복수의 전극은 탈중심적 패턴에서 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 복수의 전극은 프로그램된 서열 하에서 전극의 제어를 통해 탈중심적 패턴에서 에너질의 펄스를 전달할 수 있고, 프로그램된 서열은 사용자에 의해 전기천공 구성요소에 입력된다. 프로그램된 서열은 서열에서 전달된 복수의 펄스를 포함할 수 있고, 여기서 복수의 펄스 중 각 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되고, 여기서 복수의 펄스의 후속 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활동 전극 중 상이한 하나에 의해 전달된다.
피드백 메카니즘은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 피드백 메카니즘은 유사물 폐루프 회로에 의해 수행될 수 있다. 피드백은 50 μs, 20 μs, 10 μs 또는 1 μs 마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백 또는 순간적이다 (즉, 반응 시간을 측정하기 위한 이용가능 기술에 의해 측정되는 바와 같이 실질적으로 순간적인). 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정할 수 있고, 임피던스를 피드백 메커니즘에 전달하고, 피드백 메카니즘은 임피던스에 응답하고 예정 전류와 유사한 값에서 일정 전류를 유지하기 위해 에너지의 펄스를 조정한다. 피드백 메카니즘은 에너지의 펄스의 전달 동안에 계속해서 그리고 순간적으로 일정 전류를 유지할 수 있다.
본 발명의 DNA 백신의 전달을 촉진할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 번호 7,245,963 (Draghia-Akli, et al.), 미국 특허 공보 2005/0052630 (Smith, et al. 제출)에서 기재된 것을 포함하고, 이들의 내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 통합되어 있다. DNA 백신의 전달을 촉진하기 위해 사용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법은 공-계류중 및 공유 미국 특허 출원 시리즈 번호 11/874072 (2007년 10월 17일 출원)에서 제공된 것을 포함하고, 상기 출원은 35 USC 119(e) 하에서 미국 가출원 시리즈 번호 60/852,149 (2006년 10월 17일 출원), 및 60/978,982 (2007년 10월 10일 출원)을 우선권으로 주장하며, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 통합되어 있다.
미국 특허 번호 7,245,963(Draghia-Akli, et al.)은 신체 또는 식물에서 생분자의 선택된 조직의 세포에의 도입을 촉진하기 위한 모둘형 전극 시스템 및 그의 용도를 기재하고 있다. 모듈형 전극 시스템은 하기를 포함할 수 있다: 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그램가능 일정 전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극까지의 전도성 링크를 제공하는 전기 컨넥터; 및 전원. 오퍼레이터는 지지체 구조 상에 실장되는 복수의 바늘 전극을 붙잡을 수 있고, 신체 또는 식물에서 선택된 조직에 확고하게 삽입할 수 있다. 그 다음, 생체분자는 피하 바늘을 통해 선택된 조직에 전달된다. 프로그램가능 일정 전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고 일정 전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 적용된다. 적용된 일정 전류 전기 펄스는 복수의 전극의 사이에 생분자의 세포에의 도입을 촉진한다. 미국 특허 번호 7,245,963의 전체 내용은 참고로 본 명세서에 통합되어 있다.
미국 특허 공보 2005/0052630 (Smith, et al. 제출)은 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포에의 도입을 효과적으로 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기재한다. 전기천공 장치는 전기동력학적 장치 ("EKD 장치")를 포함하고, 그 장치의 작동은 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 구체화된다. EKD 장치는 펄스 파라미터의 사용자 제어 및 입력을 기반으로 하는 어레이 중 전극 사이의 일련의 프로그램가능 일정 전류 펄스 패턴을 생산하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한, 바늘 전극의 어레이를 갖는 대체가능 전극 디스크, 주사 바늘용 중심 주사 채널, 및 제거가능 가이드 디스크를 포함한다. 미국 특허 공보 2005/0052630의 전체 내용은 참고로 본 명세서에 통합되어 있다.
미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공보 2005/0052630에서 기재된 전극 어레이 및 방법은 조직, 예컨대 근육뿐만 아니라, 다른 조직 또는 기관에 깊은 침투를 위해 적응될 수 있다. 전극 어레이의 배치 때문에, (선택된 생분자를 전달하기 위한) 주사 바늘은 표적 기관에 완전히 삽입되고, 주사는 전극에 의해 미리 윤곽이 그려진 면적에서, 표적 조직에 수직으로 투여된다. 미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공보 2005/005263에서 기재된 전극은 바람직하게는 길이 20 mm 및 21 게이지이다.
또한, 전기천공 장치 및 그의 용도를 포함하는 일부 구현예를 고려하면, 하기 특허들에 기재된 것인 전기천공 장치가 있다: 미국 특허 5,273,525(1993년 12월 28일 발행), 미국 특허 6,110,161(2000년 8월 29일 발행), 6,261,281(2001년 7월 17일 발행), 및 6,958,060(2005년 10월 25일 발행), 및 미국 특허 6,939,862 (2005년 9월 6일 발행). 더욱이, 다양한 장치 중 어떤 것을 사용하는 DNA의 전달에 관한 미국 특허 6,697,669(2004년 2월 24일), 및 DNA를 주입하는 방법에 관한 미국 특허 7,328,064 (2008년 2월 5일 발행)에서 제공된 요지를 포함하는 특허들이 본 명세서에서 고려된다. 상기 특허들은 그 전체가 참고로 통합되어 있다.
d. 백신 제조 방법
본 명세서에는 본 명세서에서 논의된 DNA 백신을 포함하는 DNA 플라스미드를 제조하는 방법이 제공된다. DNA 플라스미드는, 포유동물 발현 플라스미드로의 최종 서브클로닝 단계 후, 당해 기술에서의 공지된 방법을 사용하여 대규모 발효 탱크에서 세포 배양을 예방접촉하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 EP 장치에 사용하기 위한 DNA 플라스미드는 공지된 장치 및 기술의 조합을 사용하여 제형 또는 제조될 수 있지만, 바람직하게는 인가된, 공-계류중 미국 가출원 미국 시리즈 번호 60/939,792 (2007년 5월 23일 출원)에서 기재된 최적화된 플라스미드 제조 기술을 사용하여 제조된다. 일부 실시예에서, 이들 연구에서 사용된 DNA 플라스미드는 10 mg/mL 이상의 농도에서 제형될 수 있다. 제조 기술은 또한, 인가된 특허, 미국 특허 번호 7,238,522 (2007년 7월 3일 출원)에서 기재된 것을 포함하는, 미국 시리즈 번호 60/939792에서 기재된 것 외에 당해분야의 숙련가에게 일반적으로 공지된 다양항 장치 및 프로토콜을 포함 또는 혼입한다. 상기 참조된 출원 및 특허, 미국 시리즈 번호 60/939,792 및 미국 특허 번호 7,238,522, 각각은 그 전체가 본 명세서에 통합되어 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만 단지 설명을 위해 주어진다는 것을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당해분야의 숙련가는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 용도 및 조건에 적용할 수 있도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본 명세서에 보여지고 기재된 것 외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 기재로부터 당해분야의 숙련가에게 분명해질 것이다. 그와 같은 변형은 부가되는 특허청구범위 내에 있는 것으로 또한 의도된다.
실시예 1
2009 H1N1 인플루엔자 (돼지 플루 ) 헤마글루티닌 항원을 인코딩하는 pGX2009 (pH1HA09) - 플라스미드
pGX2009 (H1HA09)의 뼈대는 사이토메갈로바이러스 조기발현 (CMV) 프로모터의 제어 하, 변형된 발현 벡터 pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 최초 pVAX1은 Invitrogen (Catalog number V260-20)로부터 구매되어, -20 ℃에서 유지되었다. 상기에서 주목된 바와 같이, 서열 분석은 pGX2009의 뼈대로서 사용된 pVAX1의 서열과 Invitrogen로부터 이용가능한 pVAX1 서열 사이의 차이를 드러내었다. 그 차이는 상기에 나타나 있다.
pH1HA09로도 불리는 플라스미드 pGX2009는 공통 2009 H1N1 인플루엔자 (돼지 플루) 헤마글루티닌 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 공통 서열을 생성하기 위해 사용된 79 일차 서열은 인플루엔자 서열 데이타베이스(Influenza Sequence Database)로부터 선택되었다.
다양한 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1 단백질 뿐만에 대한 아미노산 서열 아니라 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 등록번호는 하기 등록번호에 해당하는 유전자은행(GenBank) 데이타베이스에 있다. 괄호가 없는 등록번호는 뉴클레오티드 서열 및 이 서열에 의해 인코딩된 추가 목록 아미노산 서열을 개시한다. 괄호가 있는 등록번호는 유전자은행의 단백질 데이타베이스에서 상응하는 아미노산 서열의 등재를 위한 것이다.
등록번호는 하기와 같다: GQ323579.1 (ACS72657.1), GQ323564.1 (ACS72654.1), GQ323551.1 (ACS72652.1), GQ323530.1 (ACS72651.1), GQ323520.1 (ACS72650.1), GQ323495.1 (ACS72648.1), GQ323489.1 (ACS72647.1), GQ323486.1 (ACS72646.1), GQ323483.1 (ACS72645.1), GQ323455.1 (ACS72641.1), GQ323451.1 (ACS72640.1), GQ323443.1 (ACS72638.1), GQ293077.1 (ACS68822.1), GQ288372.1 (ACS54301.1), GQ287625.1 (ACS54262.1), GQ287627.1 (ACS54263.1), GQ287623.1 (ACS54261.1), GQ287621.1 (ACS54260.1), GQ286175.1 (ACS54258.1), GQ283488.1 (ACS50088.1), GQ280797.1 (ACS45035.1), GQ280624.1 (ACS45017.1), GQ280121.1 (ACS45189.1), GQ261277.1 (ACS34968.1), GQ253498.1 (ACS27787.1), GQ323470.1 (ACS72643.1), GQ253492.1 (ACS27780.1), FJ981613.1 (ACQ55359.1), FJ971076.1 (ACP52565.1), FJ969540.1 (ACP44189.1), FJ969511.1 (ACP44150.1), FJ969509.1 (ACP44147.1), GQ255900.1 (ACS27774.1),GQ255901.1 (ACS27775.1), FJ966974.1 (ACP41953.1), GQ261275.1 (ACS34967.1), FJ966960.1 (ACP41935.1),FJ966952.1 (ACP41926.1), FJ966082.1 (ACP41105.1),GQ255897.1 (ACS27770.1), CY041645.1 (ACS27249.1), CY041637.1 (ACS27239.1),CY041629 (ACS27229.1), GQ323446.1 (ACS72639.1), CY041597.1 (ACS27189.1), CY041581.1 (ACS14726.1),CY040653.1 (ACS14666.1), CY041573.1 (ACS14716.1),CY041565.1 (ACS14706.1), CY041541.1 (ACS14676.1), GQ258462.1 (ACS34667.1), CY041557.1 (ACS14696.1), CY041549.1 (ACS14686.1), GQ283484.1 (ACS50084.1), GQ283493.1 (ACS50095.1), GQ303340.1 (ACS71656.1), GQ287619.1 (ACS54259.1), GQ267839.1 (ACS36632.1), GQ268003.1 (ACS36645.1), CY041621.1 (ACS27219.1), CY041613.1 (ACS27209.1), CY041605.1 (ACS27199.1), FJ966959.1 (ACP41934.1), FJ966982.1 (ACP41963.1), CY039527.2 (ACQ45338.1), FJ981612.1 (ACQ55358.1), FJ981615.1 (ACQ55361.1), FJ982430.1 (ACQ59195.1), FJ998208.1 (ACQ73386.1), GQ259909.1 (ACS34705.1), GQ261272.1 (ACS34966.1), GQ287621.1 (ACS54260.1), GQ290059.1 (ACS66821.1), GQ323464.1 (ACS72642.1), GQ323473.1 (ACS72644.1), GQ323509.1 (ACS72649.1), GQ323560.1 (ACS72653.1), GQ323574.1 (ACS72655.1), 및 GQ323576.1 (ACS72656.1). 아미노산 서열은 NCBI 서열 데이타베이스로부터 다운로드되었고, 정렬 및 공통 서열은 Clustal X를 사용하여 생성되었다. 아주 능률적인 선도 서열, 즉 IgE 선도는 발현을 촉진하기 위해 개시 코돈의 프레임 업스트림에서 융합되었다. 높은 수준의 발현을 갖기 위해서, 이러한 융합 유전자의 코돈 사용방식은 호모사피엔스 유전자의 코돈 바이어스에 적응되었다. 또한, RNA 최적화가 또한 수행되었다: 초고 (>80%) 또는 초저 (<30%) GC 함량의 영역 및 시스 활동 (cis-acting) 서열 모티프, 예컨대 내부 TATA 박스, 카이(chi) 부위 및 리보솜 진입 부위는 회피되었다. 전체 서열은 Geneart (Regensburg, Germany)에서 합성으로 생산되었다. 합성 조작된 H1HA09 유전자는 그 길이가 1818 bp (서열번호:1)이고, Geneart에서 BamHI 및 XhoI 부위에서 pVAX1로 클로닝되었다 (도 2).
실시예 2
A/ Mexico / InDRE4487 /2009를 갖는 인플루엔자 pGX2009 면역된 페렛(Ferret)의 도전( challenge )
도전 실험은 인플루엔자에 대한 바람직한 모델인 페렛을 사용하여 수행되었다. 페렛은 플라스미드 pGX2009를 사용하여 면역되었다.
동물: 4 그룹 x 5 동물/그룹, 플러스 4마리의 동물을 갖는 하나의 대조군 그룹 = 총 24마리의 페렛 (수컷)
기간: 18 주 (도전 포함)
용량: .2mg 플라스미드
프로토콜 요약: 페렛은 DNA 백신 그룹으로 부작위로 배분되었다. 동물은 연구 0일째, 28일째, 및 56일째에 면역되었다. 동물은 승인된 마취 프로토콜 케타민/미다졸람 칵테일, 이소플루란 또는 동등물로 마취되었고, 인플루엔자 DNA 백신 조합으로 IM 예방접되었다. 그룹 1 및 2은 0.5 Amp, 52 밀리초 펄스, 펄스 사이 0.2 sec, 4 sec 착화 지연(firing delay), 3 총 펄스에서 CELLECTRA? 적응성 일정 전류 전기천공 (EP) 장치를 사용하여 즉시 전기천공되었다. 대조군 동물은 순수(naive) 대조군이었다 (플라스미드도 EP도 없음). 페렛은 그의 우리에서 마취로부터 회복되었고 완전한 회복을 위해 24시간 동안 면밀히 모니터링되었다.
음식 및 물은 연구 내내 임의로 이용가능했다. 84일째에, 동물은 1 ml의 MX10 (A/Mexico/InDRE4487/2009; 5 x 105 PFU/ml)를 갖는 비강내 감염에 의해 도전되었다. 동물은 확립되고 승인된 채점표를 사용하여 임상 증상 (체중, 온도 등)에 대해 매일 모니터링되었다. 1, 3, 6, 9 및 15 dpi에, 코 세정물 및 직장 면봉이 수집되었다. 폐는 15일째에 수집되었다. 샘플은, 적절할 때 실시간 PCR에 의한 바이러스 로딩을 위한 RNAlater, 감염성 바이러스 (TCDI50)을 위한 배지 및 미세구조(histology)를 위한 포르말린에서 보관되었다.
도 4는 면역된 페렛으로부터 혈청으로 수행된 적혈구응집반응(적혈구응집반응) 억제 검정을 보여준다 (3 면역화). >1:40의 역가는 "보호된"으로 생각된다. 점선은 1:40 마크를 나타낸다. 모든 동물 3면역화 후 1:40 마크 초과였다. 도 5는 신규 H1N1 균주 MX10 (A/Mexico/InDRE4487/2009)를 갖는 면역 및 미면역된 페렛의 도전의 결과는 보여준다. 모든 면역된 페렛은 생존했고, 한편 순수 페렛의 75%는 15일 기간 내에 죽었다.
<110> The Trustees of the University of Pennsylvania David, Weiner B. Yan, Jian Morrow, Matthew P. <120> INFLUENZA NUCLEIC ACID MOLECULES AND VACCINES MADE THEREFROM <130> E12-9129 <150> 12/694,238 <151> 2010-01-26 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza H1 DNA sequence <400> 1 atgaaggcta tcctcgtcgt gctgctgtac accttcgcca ccgccaacgc cgataccctg 60 tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gacaccgtgg ataccgtgct ggaaaagaac 120 gtgaccgtga cccacagcgt gaacctgctg gaagataagc acaacggcaa gctgtgcaag 180 ctgagaggcg tggcccctct gcacctgggc aagtgcaata tcgccggctg gattctgggc 240 aaccccgagt gcgagagcct gtctaccgct agctcctggt cctacatcgt ggagacaagc 300 agcagcgaca acggcacctg ttaccccggc gacttcatcg actacgagga actgcgggag 360 cagctgagca gcgtgtccag cttcgagcgg ttcgagatct tccccaagac cagctcctgg 420 cccaaccacg acagcaacaa gggcgtgacc gccgcctgtc ctcacgctgg cgccaagagc 480 ttctacaaga acctgatctg gctggtcaag aagggcaaca gctaccccaa gctgagcaag 540 agctacatca acgacaaggg caaagaggtc ctcgtcctct ggggcatcca ccaccctagc 600 accagcgccg accagcagag 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aacaacacca accaggaaga tctgctggtc ctgtggggca tccaccaccc caacgacgcc 600 gccgagcaga ccaagctgta ccagaacccc accacctaca tcagcgtggg caccagcacc 660 ctgaaccagc ggctggtgcc ccggatcgcc acccggtcca aggtgaacgg ccagagcggc 720 cggatggaat tcttctggac catcctgaag cccaacgatg ccatcaactt cgagagcaac 780 ggcaacttca tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc 840 atgaagagcg agctggaata cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc catgggcgcc 900 atcaacagca gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag 960 tacgtgaaga gcaacaggct ggtgctggcc accggcctgc ggaacagccc ccagcgggag 1020 cggcgggccg ccgcccgggg cctgttcggc gccatcgccg gcttcatcga gggcggctgg 1080 cagggcatgg tggacgggtg gtacggctac caccacagca atgagcaggg cagcggctac 1140 gccgccgaca aagagagcac ccagaaggcc atcgacggcg tcaccaacaa ggtgaacagc 1200 atcatcgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtgggcc gggagttcaa caacctggaa 1260 cggcggatcg agaacctgaa caagaaaatg gaagatggct tcctggacgt gtggacctac 1320 aacgccgagc tgctggtgct gatggaaaac gagcggaccc tggacttcca cgacagcaac 1380 gtgaagaacc 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Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 21 <211> 1728 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza DNA H1 Sequence <400> 21 ggtaccaagc ttgccaccat gaaggtgaaa ctgctggtgc tgctgtgcac cttcaccgcc 60 acctacgccg acaccatctg catcggctac cacgccaaca acagcaccga caccgtggat 120 accgtgctgg aaaagaacgt gaccgtgacc cacagcgtga acctgctgga agatagccac 180 aacggcaagc tgtgcctgct gaaaggcatc gcccccctgc agctgggcaa ctgcagcgtg 240 gccggctgga tcctgggcaa ccccgagtgc gagctgctga tttccaaaga aagctggtcc 300 tacatcgtgg agacccccaa ccccgagaac ggcacctgct accccggcta cttcgccgac 360 tacgaggaac tgcgggagca gctgtccagc gtgagcagct tcgagcggtt cgagatcttc 420 cccaaagaga gcagctggcc caaccacacc gtgaccggcg tgagcgccag ctgctcccac 480 aatggcaaga gcagcttcta ccggaacctg ctgtggctga ccggcaagaa cggcctgtac 540 cccaacctga gcaagagcta cgccaataac aaagaaaagg aagtgctggt gctgtggggc 600 gtgcaccacc cccccaacat cggcgaccag cgggccctgt accacaccga gaacgcctac 660 gtgagcgtgg tgtccagcca ctacagccgg cggttcaccc ccgagatcgc caagcggccc 720 aaagtgcggg accaggaagg ccggatcaac tactactgga ccctgctgga acccggcgac 780 accatcatct tcgaggccaa cggcaacctg atcgccccca gatacgcctt cgccctgagc 840 cggggcttcg gcagcggcat catcaccagc aacgccccca tggacgagtg cgacgccaag 900 tgccagaccc ctcagggagc tattaacagc agcctgccct tccagaacgt gcaccccgtg 960 accatcggcg agtgccccaa gtacgtgcgg agcgccaagc tgcggatggt gaccggcctg 1020 cggaacatcc ccagcatcca gagcaggggc ctgttcggcg ccatcgccgg cttcatcgag 1080 ggcggctgga ccggcatggt ggacgggtgg tacggctacc accaccagaa cgagcagggc 1140 agcggctacg ccgccgacca gaagagcacc cagaacgcca tcaacggcat caccaacaag 1200 gtgaacagcg tgatcgagaa gatgaacacc cagttcaccg ccgtgggcaa agagttcaac 1260 aagctggaac ggcggatgga aaacctgaac aagaaggtgg acgacggctt cctggacatc 1320 tggacctaca acgccgagct gctggtgctg ctggaaaacg agcggaccct ggacttccac 1380 gacagcaacg tgaagaacct gtacgagaag gtgaaaagcc agctgaagaa caacgccaaa 1440 gagatcggca acggctgctt cgagttctac cacaagtgca acgacgagtg catggaaagc 1500 gtgaagaatg gcacctacga ctaccccaag tacagcgagg aaagcaagct gaaccgggag 1560 aagatcgacg gcgtgaagct ggaaagcatg ggcgtgtacc agatcctggc catctacagc 1620 accgtcgctt ccagcctcgt cctgctcgtg tccctgggcg ccatctcctt ttggatgtgc 1680 agcaacggca gcctgcagtg ccggatctgc atctgatgac tcgagctc 1728 <210> 22 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza Protein H1 Sequence <400> 22 Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175 Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu 180 185 190 Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Leu Tyr 195 200 205 His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220 Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu 225 230 235 240 Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255 Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala 260 265 270 Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285 Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 23 <211> 1731 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza DNA H3 Sequence <400> 23 ggtaccaagc ttgccaccat gaaaaccatc atcgccctga gctacatcct gtgcctggtg 60 ttcgcccaga agctgcccgg caacgacaac agcaccgcca ccctgtgtct gggccaccac 120 gccgtgccca acggcaccat cgtgaaaaca atcaccaacg accagatcga ggtgaccaac 180 gccaccgagc tggtgcagag cagcagcacc ggcggcatct gcgacagccc ccaccagatc 240 ctggacggcg agaactgcac cctgatcgac gccctgctgg gcgaccctca gtgcgacggc 300 ttccagaaca aaaagtggga cctgttcgtg gagcggagca aggcctacag caactgctac 360 ccctacgacg tgcccgacta cgccagcctg cggagcctgg tggccagcag cggcaccctg 420 gaattcaaca acgagagctt caactggacc ggcgtgaccc agaacggcac cagcagcgcc 480 tgcaagcggc ggagcaacaa cagcttcttt tccagactga actggctgac ccacctgaag 540 ttcaagtacc ccgccctgaa cgtgaccatg cccaacaatg agaagttcga caagctgtac 600 atctggggcg tgcaccaccc cggcaccgac aatgaccaga tcagcctgta cgcccaggcc 660 agcggccgga tcaccgtgag caccaagcgg agccagcaga ccgtgatccc caacatcggc 720 agccggccca gagtgagaga catccccagc cggatcagca tctactggac aatcgtgaag 780 cccggcgaca tcctgctgat caactccacc ggcaacctga tcgcccccag gggctacttc 840 aagatcagaa gcggcaagag cagcatcatg cggagcgacg cccccatcgg caagtgcaac 900 agcgagtgca tcacccccaa tggcagcatc cccaacgaca agcccttcca gaacgtgaac 960 cggatcacct acggcgcctg ccccagatac gtgaagcaga acaccctgaa gctggccacc 1020 ggcatgcgga acgtgcccga gaagcagacc cggggcatct tcggcgccat cgccggcttc 1080 atcgagaacg gctgggaggg catggtggac gggtggtacg gcttccggca ccagaactcc 1140 gagggcatcg gccaggccgc cgacctgaag agcacccagg ccgccatcaa ccagatcaac 1200 ggcaagctga accggctgat cggcaagacc aacgagaagt tccaccagat cgaaaaagaa 1260 ttcagcgagg tggagggccg gatccaggac ctggaaaagt acgtggagga caccaagatc 1320 gacctgtgga gctacaacgc cgagctgctg gtcgccctgg aaaaccagca caccatcgac 1380 ctgaccgaca gcgagatgaa caagctgttc gagcggacca agaagcagct gcgggagaac 1440 gccgaggaca tgggcaacgg ctgctttaag atctaccaca agtgcgacaa cgcctgcatc 1500 ggcagcatcc ggaacggcac ctacgaccac gacgtgtacc gggacgaggc cctgaacaac 1560 cggttccaga tcaagggcgt ggagctgaag agcggctaca aggactggat cctgtggatc 1620 agcttcgcca tcagctgctt tctgctgtgc gtggccctgc tgggattcat catgtgggcc 1680 tgccagaagg gcaacatccg ctgcaacatc tgcatctgat gactcgagct c 1731 <210> 24 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza Protein H3 Sequence <400> 24 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 35 40 45 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 50 55 60 Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys 65 70 75 80 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95 Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn 100 105 110 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val 115 120 125 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr 130 135 140 Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn 145 150 155 160 Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys 165 170 175 Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys 180 185 190 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Asn Asp Gln Ile 195 200 205 Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg 210 215 220 Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Val Arg 225 230 235 240 Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 245 250 255 Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 260 265 270 Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285 Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 290 295 300 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335 Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Ile Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400 Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415 Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 450 455 460 Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser 485 490 495 Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 500 505 510 Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525 Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540 Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile 545 550 555 560 Arg Cys Asn Ile Cys Ile 565

Claims (38)

  1. 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자:
    a) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:1, 서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:1의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열의 단편;
    b) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:3, 서열번호:3과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:3의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:3의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    c) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:6, 서열번호:6과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:6의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:6의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    d) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:9, 서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:9의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:9의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    e) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:11, 서열번호:11과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:11의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:11의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    f) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:13, 서열번호:13과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:13의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:13의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 및
    g) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:15, 서열번호:15와 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:15의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:15의 단편과 95% 동종인 핵산 서열.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:6, 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13 및 서열번호:15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  3. 청구항 1에 있어서, 서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:3과 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:6과 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:11과 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:13과 95% 동종인 핵산 서열, 및 서열번호:15와 95% 동종인 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  4. 청구항 1에 있어서, 서열번호:1과 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:3과 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:6과 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:9와 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:11과 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:13과 98% 동종인 핵산 서열, 및 서열번호:15와 98% 동종인 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  5. 청구항 1에 있어서, 서열번호:1, 서열번호:6, 서열번호:9, 서열번호:13, 및 서열번호:15, 및 IgE 선도 서열을 인코딩하는 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  6. 조절 요소에 작동가능하게 연결된 청구항 1의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  7. 인간 세포에서 기능적인 조절 요소에 작동가능하게 연결된 청구항 1의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드인 발현 벡터.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 발현 벡터는 pGX2009인 발현 벡터.
  10. 하기를 포함하는 조성물:
    a) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 복수의 하나 이상의 핵산 분자:
    i) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:1, 서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:1의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열의 단편;
    ⅱ) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:3, 서열번호:3과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:3의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:3의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    ⅲ) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:6, 서열번호:6과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:6의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:6의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    iv) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:9, 서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:9의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:9의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    v) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:11, 서열번호:11과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:11의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:11의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    vi) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:13, 서열번호:13과 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:13의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:13의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 및
    vⅱ) 핵산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 서열번호:15, 서열번호:15와 95% 동종인 핵산 서열; 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:15의 단편, 및 적어도 60개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호:15의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 및
    b) 하기 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열: 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H2, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3, 인플루엔자 A H4 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A N1...인플루엔자 A 헤마글루티닌 H6, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H7, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H6, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H7, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H8, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H9, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H10, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H11, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H12, 인플루엔자 A H13 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H14, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H15, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H16, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N1, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N2, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N3, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N4, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N5, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N6, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N7, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N8, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 및 인플루엔자 B 뉴라미니다제.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 핵산 서열은 섹션 a)에서 설명된 복수의 핵산 분자로부터의 복수의 하나 이상의 상이한 핵산 분자 상에 있는 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 섹션 a)에서 설명된 복수의 핵산 분자는 서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:6, 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13 및 서열번호:15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 섹션 a)에서 설명된 복수의 핵산 분자는 서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:3과 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:6과 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:11과 95% 동종인 핵산 서열, 서열번호:13과 95% 동종인 핵산 서열, 및 서열번호:15와 95% 동종인 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 섹션 a)에서 설명된 복수의 핵산 분자는 서열번호:1과 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:3과 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:6과 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:9와 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:11과 98% 동종인 핵산 서열, 서열번호:13과 98% 동종인 핵산 서열, 및 서열번호:15와 98% 동종인 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  15. 청구항 10에 있어서, 상기 a) 및 b)에서 설명된 핵산 서열 각각은 조절 요소에 작동가능하게 연결된 조성물.
  16. 청구항 10에 있어서, 상기 a) 및 b)에서 설명된 핵산 서열 각각은 인간 세포에서 기능적인 조절 요소에 작동가능하게 연결된 조성물.
  17. 청구항 10에 있어서, 상기 a) 및 b)에서 설명된 핵산 서열은 하나 이상의 발현 벡터의 일부인 조성물.
  18. 청구항 10에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 벡터는 플라스미드인 조성물.
  19. 청구항 10에 있어서, pGX2009 및/또는 pGX2006을 포함하는 조성물.
  20. 청구항 10에 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 조성물:
    서열번호:1을 포함하는 핵산 서열;
    서열번호:6을 포함하는 핵산 서열;
    서열번호:9를 포함하는 핵산 서열;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 서열;
    인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1을 인코딩하는 핵산 서열; 및
    인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3을 인코딩하는 핵산 서열.
  21. 청구항 10에 있어서, 상기 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호:21을 포함하고, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호:23을 포함하는 조성물.
  22. 청구항 20에 있어서, 하기를 포함하는 조성물:
    서열번호:9를 포함하는 핵산 분자;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 분자; 및
    서열번호:23을 포함하는 핵산 분자.
  23. 청구항 22에 있어서,
    서열번호:9를 포함하는 핵산 분자는 플라스미드이고;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 분자는 플라스미드이고;
    서열번호:23을 포함하는 핵산 분자는 플라스미드인 조성물.
  24. 청구항 1의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응의 유도 방법.
  25. 청구항 10의 조성물을 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응의 유도 방법.
  26. 청구항 23의 조성물을 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응의 유도 방법.
  27. 서열번호:1,
    서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:1의 단편,
    서열번호:1의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:9,
    서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:9의 단편, 및
    서열번호:9의 단편과 95% 동종인 핵산 서열
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 사람에게 예방적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 기원 인간 인플루엔자 A 균주에 의한 감염에 대항하는 사람의 보호 방법으로서;
    상기 핵산 서열은 상기 사람의 세포에서 발현되고, 상기 단백질에 대항하는 면역 반응이 유도되고, 그 반응은 돼지 기원 인간 인플루엔자 A에 대항하는 보호 면역 반응인 방법.
  28. a) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제1 핵산 서열:
    서열번호:1,
    서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:1의 단편,
    서열번호:1의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:9,
    서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:9의 단편, 및
    서열번호:9의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 및
    b) 하기 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열: 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H2, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3, 인플루엔자 A H4 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A N1...인플루엔자 A 헤마글루티닌 H6, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H7, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H6, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H7, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H8, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H9, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H10, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H11, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H12, 인플루엔자 A H13 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H14, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H15, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H16, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N1, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N2, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N3, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N4, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N5, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N6, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N7, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N8, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 및 인플루엔자 B 뉴라미니다제
    를 포함하는 조성물을 사람에게 예방적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 기원 인간 인플루엔자 A 균주에 의한 감염에 대항하여 사람을 보호하는 방법으로서,
    상기 제1 핵산 서열은 상기 사람의 세포에서 발현되고, 상기 제1 단백질에 대항하는 면역 반응이 유도되고 그 반응은 돼지 기원 인간 인플루엔자 A에 대항하는 보호 면역 반응이며 하나 이상의 추가 핵산 서열은 상기 사람의 세포에서 발현되고 상기 하나 이상의 제2 단백질에 대항하는 면역 반응이 유도되는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    서열번호:1을 포함하는 핵산 서열;
    서열번호:9를 포함하는 핵산 서열;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 서열;
    인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1을 인코딩하는 핵산 서열; 및
    인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3을 인코딩하는 핵산 서열.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호:21을 포함하고, 상기 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호:23을 포함하는 방법.
  31. 청구항 28에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    서열번호:9를 포함하는 핵산 분자;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 분자; 및
    서열번호:23을 포함하는 핵산 분자.
  32. 청구항 31에 있어서,
    서열번호:9를 포함하는 핵산 분자는 플라스미드이고;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 분자는 플라스미드이고;
    서열번호:23을 포함하는 핵산 분자는 플라스미드인 방법.
  33. 서열번호:1,
    서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:1의 단편,
    서열번호:1의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:9,
    서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:9의 단편, 및
    서열번호:9의 단편과 95% 동종인 핵산 서열
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 사람에게 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 기원 인간 인플루엔자 A 균주에 의해 감염된 사람의 치료 방법으로서,
    상기 핵산 서열은 상기 사람의 세포에서 발현되고, 상기 단백질에 대항하는 면역 반응이 유도되고, 그 반응은 돼지 기원 인간 인플루엔자 A에 대항하는 보호 면역 반응인 방법.
  34. a) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제1 핵산 서열:
    서열번호:1,
    서열번호:1과 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:1의 단편,
    서열번호:1의 단편과 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:9,
    서열번호:9와 95% 동종인 핵산 서열;
    서열번호:9의 단편, 및
    서열번호:9의 단편과 95% 동종인 핵산 서열; 및
    b) 하기 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열: 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H2, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3, 인플루엔자 A H4 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A N1...인플루엔자 A 헤마글루티닌 H6, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H7, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H5, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H6, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H7, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H8, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H9, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H10, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H11, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H12, 인플루엔자 A H13 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H14, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H15, 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H16, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N1, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N2, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N3, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N4, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N5, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N6, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N7, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N8, 인플루엔자 A 뉴라미니다제 N9, 인플루엔자 B 헤마글루티닌 및 인플루엔자 B 뉴라미니다제
    를 포함하는 조성물을 사람에게 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 돼지 기원 인간 인플루엔자 A 균주에 의해 감염된 사람의 치료 방법으로서,
    상기 제1 핵산 서열은 상기 사람의 세포에서 발현되고, 상기 제1 단백질에 대항하는 면역 반응이 유도되고 그 반응은 돼지 기원 인간 인플루엔자 A에 대항하는 보호 면역 반응이며, 하나 이상의 추가 핵산 서열은 상기 사람의 세포에서 발현되고 상기 하나 이상의 제2 단백질에 대항하는 면역 반응이 유도되는 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    서열번호:1을 포함하는 핵산 서열;
    서열번호:9를 포함하는 핵산 서열;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 서열;
    인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1을 인코딩하는 핵산 서열; 및
    인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3을 인코딩하는 핵산 서열.
  36. 청구항 34에 있어서, 상기 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H1을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호:21을 포함하고, 상기 인플루엔자 A 헤마글루티닌 H3을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호:23을 포함하는 방법.
  37. 청구항 34에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    서열번호:9를 포함하는 핵산 분자;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 분자; 및
    서열번호:23을 포함하는 핵산 분자.
  38. 청구항 37에 있어서,
    서열번호:9를 포함하는 핵산 분자는 플라스미드이고;
    서열번호:13을 포함하는 핵산 분자는 플라스미드이고;
    서열번호:23을 포함하는 핵산 분자는 플라스미드인 방법.
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