BR112012018587A2 - móleculas de ácido nucleico de influenza e vacinas feitas das mesmas - Google Patents

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Abstract

  MÓLECULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE INFLUENZA E VACINAS FEITAS DAS MESMAS. São fornecidas aqui sequências de ácido nucleico que codificam novas sequência consenso de aminoácido de hemaglutinina HA, bem como constructos/vetores genéticos e vacinas que expressam as sequências. Ainda são fornecidos aqui métodos para gerar uma resposta imune contra um ou mais sorotipos de Influenza A usando as vacinas que são fornecidas.

Description

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE INFLUENZA E VACINAS FEITAS DAS MESMAS
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a vacinas virais melhoradas contra influenza, : métodos melhorados para a indução de respostas imunes contra influenza, métodos melhorados para o diagnóstico de hospedeiros mamíferos de influenza vacinados versus infectados e para profilaticamente e/ou terapeuticamente imunizar indivíduos contra influenza.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Influenza, comumente referida como gripe, é àma doença infecciosa causada pelo vírus de RNA da família Orthomyxoviridae. Os virus da influenza ou gripe infectam aves e mamíferos. Três dos cinco gêneros de Orthomyxoviridae são vírus de influenza: Influenza * A, Influenza B e Influenza C. Destes, Influenza À é a mais comum.
A Influenza é tipicamente transmitida através do ar em aerossóis produzidos pela tosse ou espirros e pelo contato direto com fluidos corporais contendo o vírus ou superfícies contaminadas. Epidemias sazonais de influenza ocorrem em todo o mundo e resultam em centenas de milhares de mortes anualmente. Em alguns anos, as pandemias ocorrem e causam milhões de mortes. Além disso, os animais, especialmente aves e suínos, também são suscetíveis a epidemias anuais e pandemias ocasionais que causam um grande —númerodemortesde animais e perdas monetárias.
Estruturalmente, os vírus da influenza são semelhantes, contendo partículas de vírus, geralmente esféricas ou filamentosas de cerca de 80-120 nm constituídos de componente molecular semelhante. Um núcleo central que compreende proteínas virais e RNA viral é coberto por um envelope viral composto de duas glicoproteínas diferentes e um revestimento lipídico derivado da célula em que a partícula viral é produzida. Duas outras glicoproteinas diferentes estão ancoradas dentro do envelope viral e incluem porções que se projetam para fora sobre a superfície.
O genoma RNA do vírus influenza é normalmente fornecido como oito diferentes segmentos RNA de senso negativos de fita simples que juntos compõem os onze genes virais do genoma que codificam as onze proteínas (HA, NA, NP, MI, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB!-F2, PB2). Os oito segmentos de RNA são: 1) HA, que codifica hemaglutininas (cerca de 500 moléculas de hemaglutinina são necessárias para criar um vírion); 2) NA, que codifica neuraminidase (cerca de 100 moléculas de neuraminidase são necessárias para criar um vírion); 3) NP, que codifica nucleoproteína; 4) M, que codifica duas proteinas de matriz (Ml e M2) usando diferentes fases de leituras a partir do mesmo segmento estrutural RNA (cerca de 3000 moléculas de proteína de matriz são necessárias para criar um vírion); 5) NS, que codifica duas proteínas distintas não estruturais (NS1 e NEP) usando diferentes fases de leituras a partir do mesmo segmento de RNA; 6) PA, que codifica uma RNA polimerase; 7) PB1, que codifica uma RNA polimerase e proteína PB1- F2 (induz apoptose) usando diferentes regiões de leitura a partir do mesmo segmento de RNA; e 8) PB2, que codifica uma RNA polimerase.
Destas onze proteínas, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são duas —glicoproteínas ancoradas no envelope viral e presentes na superfície externa das partículas virais.
Estas proteínas servem como imunógenos para as respostas imunes contra influenza.
HA, que é uma lectina que medeia a ligação do vírus às células alvo e entrada do genoma viral na célula alvo, é expressa como um produto de gene único, HAO, e posteriormente processadas por proteases hospedeiras para produzir duas subunidades, HA] e HA2, que em conjunto formam um complexo sobre a superfície das partículas virais de influenza.
NA está envolvida na liberação de recém-produzidas partículas virais maduras produzidas em células infectadas.
Há dezesseis sorotipos conhecidos de HA e nove sorotipos NA conhecidos de vírus influenza A.
A identidade dos diferentes sorotipos presentes em uma partícula viral é tipicamente usada para descrever um vírus.
Por exemplo, HIN] é um vírus influenza com HA sorotipo H1 e N1 sorotipo NA; HSNI é um vírus influenza com HA sorotipo H5 e NA sorotipo N1. Apenas sorotipos H1, H2 e H3, e sorotipos N1 e N2 normalmente infectam seres humanos.
Cepas de influenza são geralmente específicas de espécie ou gênero, ou seja, uma —cepade influenza que pode infectar suínos (um vírus da influenza suína) normalmente não infecta seres humanos ou aves; uma cepa de influenza que pode infectar aves (vírus da influenza aviária) não infecta humanos ou suínos e uma cepa de influenza que pode infectar os seres humanos (um vírus de influenza humana) não infecta aves e suínos.
Cepas de influenza, no entanto, podem sofrer mutação e se tornar infecciosas a partir de uma espécie para outra.
Por exemplo, uma cepa que infecta apenas suínos, uma influenza suína, pode mutar ou recombinar-se para se tornar uma cepa que podem infectar os seres humanos apenas ou ambos os porcos e os seres humanos.
Um vírus da gripe comumente referenciado como “gripe suína” é uma cepa do vírus influenza, como uma cepa HINI,
que pode infectar humanos e que foi derivada de uma cepa que foi anteriormente específica para suínos (ou seja, um vírus da gripe suína é uma influenza humana de origem suína, ou influenza humana derivada de suíno). Um vírus da gripe comumente referenciado como “gripe aviária” é uma cepa do vírus influenza, como uma cepa HSNI1, que pode infectar —humanoseque foi derivada de uma cepa que foi anteriormente específica para pássaros (ou seja, um vírus da gripe aviária é uma influenza humana de origem aviária, ou influenza humana derivada de ave). Vacinação contra a influenza é fornecida para muitos seres humanos nos países desenvolvidos e às vezes a animais. As vacinas utilizadas são limitadas em seus resultados de proteção porque as respostas imunes induzidas pelas vacinas são específicas para certos subtipos de vírus. Diferentes vacinas contra a influenza são desenvolvidas e administradas anualmente com base na vigilância internacional e as estimativas dos cientistas de que tipos e cepas do vírus que circulam em um determinado ano. O vírus muda significativamente por recombinação, mutação e rearranjo dos segmentos. Assim, vacinas dadas em um ano não são consideradas de proteção contra as cepas sazonais que são amplamente transmitidas no ano seguinte.
Um “flu shot” comumente promovido por U.S. Centers for Disease Control and Prevention geralmente contém três vírus de influenza mortos/inativados: um vírus À (H3N2), um vírus A (HINÍ), e um vírus B. Assim, é aparente que as vacinas são limitadas —aprevisões de subtipos, e a disponibilidade de uma vacina específica para aquele subtipo.
A administração direta de sequências de ácido nucleico para vacinar contra doenças animais e humanas foi estudada e muito esforço é focado em meios efetivos e eficientes de liberação de ácido nucleico para gerar expressão necessária dos antígenos desejados, resultando em resposta imunogênica e, por fim, desta técnica.
Às vacinas de DNA têm muitas vantagens sobre os métodos mais conceituais de vacinação tradicional, como vírus vivos atenuados e vacinas bascadas em proteínas recombinantes. As vacinas de DNA são seguras, estáveis, facilmente produzidas, e bem toleradas em seres humanos com ensaios pré-clínicos indicando pouca evidência de integração do plasmídeo [Martin, T., et al, Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for —genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W,, et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-91. Além disso, as vacinas de DNA são bem estudadas para administração repetida devido ao fato de que a eficácia da vacina não é influenciada por títulos de anticorpos pré-existentes ao vetor [Chattergoon, M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. No entanto, um principal obstáculo para a adoção clínica de vacinas de DNA foi uma redução na imunogenicidade de plataforma quando transferindo para animais maiores [Liu, M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40]. Avanços de tecnologia recente na engenharia de imunógeno de vacina de DNA, como otimização de códon, otimização de RNA e adição de sequências líderes de imunoglobulina melhoraram a expressão e imunogenicidade de vacinas de DNA [Andre, S., et al.,, Increascd immune response elicited by DNA —vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Dem], L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J, et al, Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaceines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], bem como, tecnologia recentemente desenvolvida em sistemas de liberação de plasmídeos como cletroporação [Hirao, L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves —plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA —uptakc, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol,
2007. 179(7): p. 4741-53]. Além disso, os estudos sugeriram que o uso de imunógenos de consenso pode ser capaz de aumentar a largura da resposta imune celular como comparada aos antígenos nativos sozinhos [Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol —Ther,2007.15(2):p. 411-21; Rolland, M,, et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81(16): p.
8507-14]. Um método para a liberação de sequências de ácido nucleico como o DNA de plasmídeo é a técnica de eletroporação (EP). A técnica tem sido utilizada em ensaios clínicos humanos para liberar drogas anticâncer, como bleomicina, e em muitos estudos pré-clínicos em um grande número de espécies animais. Permanece uma necessidade para uma proteína de hemaglutinina de consenso de — influenza imunogênica, para constructos de ácido nucleico que codifica dita proteína para composições úteis para induzir respostas imunes contra várias cepas de influenza. Há ainda uma necessidade de vacinas eficazes contra influenza que são econômicas e eficazes em numerosos subtipos de influenza para tratar indivíduos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO São fornecidas aqui moléculas de ácido nucleicó compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:1; um fragmento de SEQ ID NO:1; * uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:3; um fragmento de SEQ ID NO:3; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:6; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:6; um fragmento de SEQ ID NO:6; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:9,uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:9; um fragmento de SEQ ID NO:9; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:9; SEQ ID NO: 11, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO: 11; um fragmento de SEQ ID NO: 11; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:13; um fragmento de SEQ 1D NO:13; uma — sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:13;.e SEQ ID NO:15; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:15; um fragmento de SEQ ID NO:15; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:15. Ainda são fornecidas composições compreendendo: a) uma primeira sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em uma ou mais de: SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:1; um fragmento de SEQ ID NO: |; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID
NO:3; um fragmento de SEQ ID NO:3; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:6; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:6; um fragmento de SEQ ID NO:6; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:9; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:9; um fragmento de SEQ ID NO:9; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:9; SEQ ID NO: 11; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:11; um fragmento de SEQ ID NO:11; and uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; uma sequência de cido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO: 13; um fragmento de SEQ ID NO:13; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:15; uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:15; um fragmento de SEQ ID NO:15; e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO: 15; e b) uma segunda sequência de ácido —nucleico que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em uma ou mais de: influenza A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, Ni, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, influenza B hemaglutinina, neuraminidase e fragmentos dos mesmos.
Alguns aspectos da invenção fornecem métodos de induzir uma resposta imune que compreende a etapa de: administrar a um indivíduo ditas moléculas de ácido nucleico e/ou composições.
Aspectos adicionais da invenção fornecem métodos de proteção de um indivíduo contra infecção. Os métodos compreendem a etapa de: administrar a dito indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico compreendendo dita — sequência de ácido nucleico ou composições, em que a sequência de ácido nucleico é expressa em células de dito indivíduo e uma resposta imune protetora é induzida contra uma proteína codificada por dita sequência de ácido nucleico. Em alguma modalidade, a resposta imune é uma resposta imune protetora contra influenza humana de origem suína.
Em alguns aspectos da invenção, os métodos são fornecidos para tratar um indivíduo que foi infectado por Influenza. Os métodos compreendem a etapa de: administrar a dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de ditas moléculas de ácido nucleico e/ou composição. Em alguma modalidade, a resposta imune é uma resposta imune protetora contra influenza humana de origem suína.
Ti43
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um mapa do plasmídeo pVAX1 de vetor de estrutura de 2999 pares bases (Invitrogen, Carlsbad CA). O promotor CMV está localizado nas bases 137-724, O sítio promotor/iniciador T7 está nas bases 664-683. Vários sítios de clonagem estão nas —bases696-811.O sinal de poliadenilação GH bovino está nas bases 829-1053. O gene de resistência a canamicina está nas bases 1226-2020. A origem pUC está nas bases 2320-
2993. Baseado na sequência de pVvAX1 disponível de Invitrogen, as seguintes mutações foram encontradas na sequência de pVAX1 que foram usadas como a estrutura para pGX2009: C>G 241 nopromotor CMV C>T 1942 estrutura, a jusante do sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (DGHpolyA) ' A>- 2876 estrutura, a jusante do gene de canamicina CT 3277 naorigem pUC de replicação (Ori) mutação de alto número de cópia (vide Nucleic Acid Research 1985) G>C 3753 em cada extremidade de pUC Ori a montante de sítio RNASeH Pares bases 2, 3 e 4 são alterados de ACT para CTG em estrutura, a montante do promotor CMV.
A Figura 2 mostra dois mapas de plasmídeo pGX2009, que é ainda referenciado como pH1HAOS9. A sequência de ácido nucleico do plasmídeo pGX2009 (SEQ ID NO:5) inclui a sequência de codificação para o constructo de proteína consenso H1 (aminoácido SEQ ID NO:4 codificado por SEQ ID NO:3) que inclui o líder IE (aminoácido SEQ ID NO:17) ligado ao N terminal de sequência consenso de aminoácido H1 (aminoácido SEQ —IDNO:2 codificado por SEQ ID NO:1) que é ligada a seu C terminal ao Tag HA (SEQ ID NO:18). A proteína de consenso H1l (aminoácido SEQ ID NO:4 codificado por SEQ ID NO:3) é marcada SwiHum Con HA e H1IHAO9.
Figura 3 mostra um mapa de plasmídeo pGX2006. A sequência de ácido nucleico do plasmídeo pGX2006 (SEQ ID NO:8) inclui a sequência de codificação para a proteína — de consenso H2 (aminoácido SEQ ID NO:7 codificado por SEQ ID NO:6) que é marcada H2HA.
Figura 4 mostra dados de ensaios de inibição de hemaglutinação realizados com soro a partir de furões imunizados.
Figura 5 mostra resultados de um desafio de furões imunizados e não imunizados com uma nova cepa HIN1.
DESCRIÇÃO DETALHADA Sequências consensos de aminoácidos de cada influenza A H1 e H2 (referenciado aqui como “consenso HI” (SEQ ID NO:2) e “consenso H2”(SEQ ID NO:7), respectivamente), bem como novos híbridos sintéticos de consenso H1 influenza À hemaglutinina sequência de aminoácido (referenciado aqui como “consenso U2”(SEQ ID NO:10)) e um consenso sequência de aminoácido de influenza B hemaglutinina (referenciado aqui como “consenso BHA”(SEQ ID NO:13)) são fornecidos, que pode fornecer proteção de mamíferos contra influenza. Além disso, as proteínas são fornecidas ' que compreendem a sequência de aminoácido H1 consenso, a sequência de aminoácido H2 consenso, a sequência de aminoácido U2 consenso e/ou a sequência de aminoácido BHA consenso. Em alguns aspectos, sequências de ácido nucleicos são fornecidas que codificam proteínas compreendendo a sequência de aminoácido consenso H1 (por exemplo (SEQ ID NO:1) ou (SEQ ID NO:3)), a sequência de aminoácido consenso H2 (por exemplo (SEQ ID NO:6)), a sequência de aminoácido consenso U2 (por exemplo (SEQ ID NO:9) ou (SEQ ID NO:11)), &/ou a sequência de aminoácido BHA consenso (por exemplo (SEQ ID NO:13) ou (SEQ ID NO:15)). Enquanto não se ligando por teoria científica, uma vacina que pode ser usada para induzir uma resposta imune (humoral, celular, ou ambos) amplamente contra vários subtipos de influenza pode compreender uma ou mais do seguinte: 1) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido H1 consenso; 2) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido H1 consenso; 3) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso H2; 4) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso H2; 5) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso U2; 6) uma proteina compreendendo a sequência de aminoácido consenso U2; 7) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso BHA; e 8) uma — proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso BHA. Os métodos de imunização podem ser realizados e vacinas podem ser preparados cujo uso use e/ou combinam os dois ou mais dos seguintes componentes: 1) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido
H1 consenso; 2) uma proteina compreendendo a sequência de aminoácido H1 consenso; 3) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso H2, 4) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso H2; 5) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína — compreendendo a sequência de aminoácido consenso U2, 6) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso U2, 7) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso BHA, e 8) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso BHA. Para tratamentos mais amplos contra influenza, os métodos de imunização podem ser realizados e vacinas podem ser preparadas cujo uso e/ou combinação de uma ou mais outras proteinas influenza como influenza A HI1-H16, influenza À NI-N9, influenza B hemaglutinina, influenza B neuraminidase e/ou genes que codificam estas proteínas junto com uma ou mais dos séguintes componentes: 1) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteina compreendendo a sequência de aminoácido Hi consenso; 2) uma proteína compreendendo —asequência de aminoácido H1 consenso; 3) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso H2, 4) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso H2; 5) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteina compreendendo a sequência de aminoácido consenso U2, 6) uma proteina compreendendo a sequência de aminoácido consenso U2, 7) uma — sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido consenso BHA, e 8) uma proteina compreendendo a sequência de aminoácido consenso BHA.
1. Definições, A terminologia usada aqui é para fins de descrever modalidades particulares —somentee não pretendem ser limitantes. Conforme usado na especificação e reivindicações anexadas, as formas singulares “um,” “uma” e “o/a” incluem os referentes plurais salvo se o contexto claramente indicar o contrário. Para indicação de faixas numéricas aqui, cada número interveniente com o mesmo grau de precisão é explicitamente contemplado. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os —números7 e38 são contemplados além de 6 e 9, e para a faixa 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são explicitamente contemplados. a. Adjuvante “Adjuvante” conforme usado aqui significa qualquer molécula adicionada às vacinas de plasmídeo de DNA descritas aqui para aumentar a imunogenicidade dos antígenos codificados por plasmídeos de DNA e as sequências de codificação de ácido nucleicos descritas a seguir. b.
Anticorpo "Anticorpo" conforme usado aqui significa um anticorpo de classes IgG, IZM, IgA, 1gD ou IgE, ou fragmentos, fragmentos ou derivados dos mesmos, incluindo Fab, F(ab'2, Fd, e anticorpos de cadeia simples, diacorpos, anticorpos biespecíficos, anticorpos binfuncionais e derivados dos mesmos.
O anticorpo pode ser um anticorpo isolado da amostra de soro do mamífero, um anticorpo policlonal, anticorpo de afinidade purificado, oumisturas dos mesinos que apresentam especificidade de ligação a um epítopo desejado ou uma sequência derivada do mesmo. c.
Sequência de Codificação “Sequência de codificação” ou “que codifica ácido nucleico” conforme usado aqui significa os ácidos nucleicos (molécula de RNA ou DNA) que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteina.
A sequência de codificação pode ainda incluir sinais de iniciação e terminação operacionalmente ligados a elementos regulatórios incluindo um sinal promotor e poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células de um indivíduo ou mamífero aos quais o ácido nucleico é administrado. d.
Complemento “Complemento” ou “complementar” conforme usado aqui significa um ácido nucleico pode significar um pareamento de base Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C- G) ou Hoogsteen entre nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos de moléculas de ácido nucleico. e.
Consenso ou Sequência de Consenso “Consenso” ou “sequência de consenso” conforme usado aqui significa uma sequência de polipeptídeo bascada em análise de um alinhamento de vários subtipos de um antígeno de influenza particular.
Sequências de ácido nucleicos que codificam uma sequência consenso de polipeptídeo podem ser preparadas.
Vacinas compreendendo proteínas que compreendem sequências de consensos e/ou moléculas de ácido nucleico que —codificam ditas proteínas podem ser usadas para induzir ampla imunidade contra vários subtipos ou sorotipos de um antígeno de influenza particular.
Antígenos consenso de influenza podem incluir sequência de aminoácidos de hemaglutinina consenso de influenza A, incluindo por exemplo consenso H1, consenso H2, ou sequência de aminoácidos de hemaglutinina consenso influenza B. f.
Corrente Constante “Corrente constante” conforme usado aqui significa uma corrente que é recebida ou experimentada por um tecido, ou células que definem dito tecido, durante a duração de um pulso elétrico liberado ao mesmo tecido.
O pulso elétrico é liberado a partir de dispositivos de eletroporação descrito aqui.
Esta corrente permanece em uma amperagem constante em dito tecido durante a vida de um pulso elétrico porque o dispositivo de eletroporação fornecido aqui tem um elemento de retroalimentação, preferencialmente contendo retroalimentação instantânea.
O elemento de retroalimentação pode medir a resistência do tecido (ou células) através da duração do pulso e faz com que o dispositivo de eletroporação altere sua saída de energia elétrica (por exemplo, aumento de voltagem) de modo que a corrente no mesmo tecido permanece em todo o pulso elétrico (na ordem de microssegundos), e de pulso a pulso.
Em algumas modalidades, o elemento de retroalimentação compreende um controlador. g.
Retroalimentação Corrente ou Retroalimentação “Retroalimentação corrente” ou “retroalimentação” pode ser usado de modo intercambiável e significa a resposta ativa dos dispositivos de eletroporação fornecidos, que compreendem medir a corrente no tecido entre eletrodos e alterando a saída de energia liberada por dispositivo EP de modo a manter a corrente em um nível constante.
Este nível constante é predefinido por um usuário antes da iniciação de uma sequência de pulso de tratamento clétrica, A retroalimentação pode ser conseguida por um componente de eletroporação, por exemplo, controlador, do dispositivo de eletroporação, como o circuito elétrico neste é capaz de continuamente monitorar a corrente no tecido entre eletrodos e comparar aquela corrente monitorada (ou corrente dentro do tecido) a uma corrente —predeterminada e continuamente produzir ajustes de saída de energia para manter a corrente monitorada em níveis predeterminados.
A alça de retroalimentação pode ser instantânea uma vez que este é uma retroalimentação análoga de alça fechada. h.
Corrente Descentralizada “Corrente descentralizada” conforme usado aqui significa o padrão de correntes elétricas liberada a partir de vários arranjos de eletrodos agulhas dos dispositivos de eletroporação descritos aqui, em que os padrões minimizam, ou preferencialmente eliminam, a ocorrência de eletroporação relacionada a estresse de calor em qualquer área de tecido sendo eletroporado.
i.
Eletroporação “Eletroporação,” “eletro-permeabilização,” ou “melhoria eletro-cinética” (“EP”) conforme usado de modo intercambiável aqui significa o uso de um pulso de campo elétrico transmembrana para induzir vias microscópicas (poros) em uma biomembrana; suas presenças permitem que biomoléculas como plasmídeos, oligonucleotídeos, siRNA, drogas, íons, e água passem de um lado da membrana celular para outro. j.
Mecanismo de Retroalimentação “Mecanismo de retroalimentação” conforme usado aqui significa um processo realizado por software ou hardware (ou firmware), cujo processo recebe e compara a impedância do tecido desejado (antes, durante, e/ou após liberação do pulso da energia) ' com um valor presente, preferencialmente corrente, e ajusta o pulso da energia liberada para obter o valor predeterminado.
Um mecanismo de retroalimentação pode ser realizado por um circuito de alça fechada análogo. k.
Fragmento “Fragmento” conforme usado aqui com relação às sequências de ácido nucleicos significa uma sequência de ácido nucleico ou uma parte do mesmo, que codifica um polipeptídeo capaz de induzir uma resposta imune em um mamífero que tem reação cruzada com um antígeno de influcnza cepa tipo selvagem de comprimento total, incluindo, por exemplo, uma influenza A hemaglutinina H1l, uma influenza À —hemaglutinina H2 ou uma influenza B hemaglutinina.
Os fragmentos podem ser fragmentos de DNA selecionados de pelo menos uma das várias sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos consenso e constructos compreendendo ditas sequências, incluindo SEQ ID NOS: 1, 3, 6, 9, 11 13 e 15. Fragmentos de DNA podem compreender sequências de codificação para a líder —imunoglobulina como sequências IgE ou IgG.
Os fragmentos de DNA podem ser 30 ou mais nucleotídeos em comprimento, 45 ou mais, 60 ou mais, 75 ou mais, 90 ou mais, 120 ou mais, 150 ou mais, 180 ou mais, 210 ou mais, 240 ou mais, 270 ou mais, 300 ou mais, 360 ou mais, 420 ou mais, 480 ou mais, 540 ou mais, 600 ou mais, 660 ou mais, 720 ou mais, 780 ou mais, 840 ou mais, 900 ou mais, 960 ou mais, 1020 ou mais, 1080 ou mais, 1140 ou mais, 1200 ou mais, 1260 ou mais, 1320 ou mais, 1380 ou mais, 1440 ou mais, 1500 ou mais, 1560 ou mais, 1620 ou mais, 1680 ou mais, 1740 ou mais, 1800 ou mais, 1860 ou mais, 1820 ou mais, 1880 ou mais, 1940 ou mais, 2000 ou mais, 2600 ou mais, 2700 ou mais, 2800 ou mais, 2900 ou mais, 2910 ou mais, 2920 ou mais, 2930 ou mais,
2931 ou mais, 2932 ou mais, 2933 ou mais, 2934 ou mais, 2935 ou mais, 2936 ou mais, 2937 ou mais, ou 2938 ou mais em comprimento. Fragmentos de DNA podem ser menores do que 10 nucleotídeos, menores do que 20, menores do que 30, menores do que 40, menores do que 50, menores do que 60, menores do que 75, menores do que 90, menores doque 120, menores do que 150, menores do que 180, menores do que 210, menores do que 240, menores do que 270, menores do que 300, menores do que 360, menores do que 420, menores do que 480, menores do que 540, menores do que 600, menores do que 660, menores do que 720, menores do que 780, menores do que 840, menores do que 900, menores do que 960, menores do que 1020, menores do que 1080, menores do que 1140, menores do que 1200, menores do que 1260, menores do que 1320, menores do que 1380, menores do que 1440, menores do que 1500, menores do que 1560, menores do que 1620, menores do que 1680, ou menores do que 1740 nucleotídeos, menores do que 1800, menores do que 1860, menores do que 1820, menores do que 1880, menores do que 1940, menores do que 2000, menores do que 2600, menores do que 2700, menores do que 2800, menores do que 2900, menores do que 2910, menores do que 2920, menores do que 2930, menores do que 2931, menores do que 2932, menores do que 2933, menores do que 2934, menores do que 2935, menores do que 2936, menores do que 2937, ou menores do que
2938. “Fragmento” com relação às sequências de polipeptídeo significa um polipeptídeo capaz de induzir uma resposta imune em um mamífero que tem reação cruzada com um antígeno de influenza de cepa tipo selvagem de comprimento completo, incluindo, por | exemplo, uma influenza A hemaglutinina H1, uma influenza A hemaglutinina H2 ou uma influenza B hemaglutinina. O fragmento pode ser fragmento de polipeptídeo selecionado de pelo menos uma das várias sequências de polipeptídeo da presente invenção, incluindo —SEQIDNOS:2,4,7,10,12, 14 e 16. Fragmentos de polipeptídeo podem ser analisados para contatar pelo menos um epítopo conforme fornecido por uma base de dados publicamente disponível como Los Alamos National Laboratory's HA Sequence Database. Os fragmentos HA de polipeptídeos podem ainda compreender sequências de aminoácidos para a sequência líder de imunoglobulina como IgE ou IgG. Os fragmentos de polipeptídeo podem ser 30 ou mais aminoácidos em comprimento, 45 ou mais, 60 ou mais, 75 ou mais, 90 ou mais, 120 ou mais, 150 ou mais, 180 ou mais, 210 ou mais, 240 ou mais, 270 ou mais, 300 ou mais, 360 ou mais, 420 ou mais, 480 ou mais, 540 ou mais, 600 ou mais, 660 ou mais, ou 710 aminoácidos ou mais em comprimento. Fragmentos de polipeptídeo podem ser menores do que 10 aminoácidos, menores do que 20, menores do que 30, menores do que 40, menores do que 50, menores do que 60, menores do que 75, menores do que 90, menores do que 120, menores do que 150, menores do que 180, menores do que 210, menores do que 240, menores do que 270, menores do que 300, menores do que 360, menores do que 420, menores do que 480, menores do que 540, menores do que 600, menores do que 660, menores do que 700, menores do que 701, menores do que 702, menores do que 703, menores do que 704, menores do que 705, menores do que 706, menores do que 707, menores do que 708, menores do que 709, ou menores do que 710 aminoácidos em comprimento. l.
Constructo genético Conforme usado aqui, o termo “constructo genético" refere-se à moléculas de DNA ou RNA que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína.
À sequência de codificação inclui sinais de iniciação e terminação operacionalmente ligadas aos elementos regulatórios incluindo um sinal promotor e poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células do indivíduo aos quais a molécula de ácido nucleico é administrado.
Conforme usado aqui, o termo "forma expressável" refere-se aos constructos de gene que contêm os elementos regulatórios necessários operacionalmente ligados à sequência de codificação que codifica uma proteína de modo que quando presente na célula do indivíduo, a sequência de codificação será expressa. m.
Idêntica "Idêntica" ou "identidade" conforme usado aqui no contexto de dois ou mais sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, significa que as sequências têm um percentual especificado de resíduo que são o mesmo sobre uma região especificada.
O percentual pode ser calculado por otimamente alinhar as duas sequências, comparando as — duas sequências sobre a região especificada, determinando o número de posições em que o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na região especificada, e multiplicando o resultado por 100 para gerar o percentual de identidade de sequência.
Em casos onde as duas sequências são de comprimentos diferentes ou o alinhamento produz uma ou mais extremidades escalonadas c a região especificada de comparação incluí somente uma única sequência, os resíduos de sequência única são incluídos no denominador, mas não no numerador do cálculo.
Quando comparando DNA e RNA, timina (T) e uracila (U) podem ser consideradas equivalentes.
À identidade pode ser realizada manualmente ou usando um algoritmo de sequência de computador como BLAST ou BLAST 2.0. n. Impedância “Impedância” pode ser usada quando discutindo o mecanismo de retroalimentação e pode ser convertido a um valor corrente de acordo com a lei de Ohm, assim permitindo comparações com a corrente atual.
o. Resposta Imune “Resposta imune” conforme usado aqui significa a ativação de um sistema imune do hospedeiro, por exemplo, aquele de um mamífero, em resposta à introdução de antígeno ' 10 como antígeno consenso de hemaglutinina de influenza. A resposta imune pode estar na forma de uma resposta celular ou humoral, ou ambas.
p. Ácido nucleico “Ácido Nucleico” ou “oligonucleotídeo” ou “polinucleotídeo” conforme usado aqui significa pelo menos dois nucleotídeos covalentemente unidos. A descrição de uma fita simples ainda define a sequência de fita complementar. Assim, um ácido nucleico ainda inclui a fita complementar de uma fita simples descrita. Muitas variantes de um ácido nucleico podem ser usadas para a mesma finalidade como certo ácido nucleico. Ássim, um ácido nucleico ainda inclui substancialmente ácidos nucleicos idênticos e complementos do mesmo. Uma fita simples fornecer uma sonda que pode hibridizar a uma sequência alvo sob condições rígidas de hibridização. Assim, um ácido nucleico ainda inclui uma sonda que hibridiza sob condições rígidas de hibridização.
Ácidos nucleicos podem ser de fita simples ou fita dupla, ou podem conter porções de ambas as sequências de fita dupla e fita simples. O ácido nucleico pode ser DNA, ambos genômico e cDNA, RNA, ou um híbrido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de deoxiribo- e ribo-nucleotídeos, e combinações de bases incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Ácidos nucleicos podem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos recombinantes.
q. Ligados operacionalmente “Ligado operacionalmente” conforme usado aqui significa que a expressão de um gene está sob o controle de um promotor com o qual está espacialmente conectado. Um promotor pode estar posicionado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. À distância entre o promotor e um gene pode ser aproximadamente o mesmo que a distância entre aquele promotor e o gene que controla no gene do qual o promotor é derivado.
Como é conhecido na técnica, a variação nesta distância pode ser acomodada sem perda de função promotora. r.
Promotor “Promotor” conforme usado aqui significa uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativar ou melhorar a expressão de um ácido nucleico em uma célula.
Um promotor pode compreender uma ou mais sequências regulatórias de transcrição específicas para ainda melhorar a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal do mesmo.
Um promotor pode ainda compreender elementos de “melhora distais ou repressores, que podem estar localizados como vários milhares de pares ': de base a partir do sítio inicial de transcrição.
Um promotor pode ser derivado de fontes incluindo virais, bacterianas, fúngicas, plantas, insetos, e animais.
Um promotor pode regular a expressão de um componente gene constitutivamente, ou diferentemente com relação à célula, tecido ou órgão em que a expressão ocorre, com relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta ao estímulo externo como estresse fisiológico, patógenos, íons de metal, ou agentes de indução.
Exemplos representativos de promotores incluem o promotor T7 bacteriófago, promotor T3 bacteriófago, promotor SP6, promotor lac operator, promotor tac, promotor SV40 tardio, promotor S V40 precoce, promotor RSV-LTR, promotor CMV IE, promotor SV40 precoce —oupromotor SV40 tardio e o promotor CMV IE. s.
Condições Rígidas de Hibridização “Condições rígidas de hibridização” conforme usado aqui significa as condições em que uma primeira sequência de ácido nucleico (por exemplo, sonda) irão hibridizar a uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, alvo), como em uma mistura complexa —deácidosnucleicos.
Condições rígidas são dependentes de sequência e irão ser diferentes em diferentes circunstâncias.
Condições rígidas podem ser selecionadas a cerca de 5-10ºC inferior do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica em uma força iônica pH definida.
O Tr, pode ser a temperatura (sob força iônica definida, pH, e concentração nucleica) em que 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à — sequência alvo em equilíbrio (conforme as sequências alvo estão presentes em excesso, em Tm: 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). As condições rígidas podem ser aquelas em que a concentração de sal é menos do que cerca de 1,0 M em íon de sódio, como cerca de 0,01-1,0 M concentração de fon de sódio (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30ºC para sondas pequenas (por exemplo, cerca de 10-50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60ºC para sondas grandes (por exemplo, maior do que cerca de 50 nucleotídeos). As condições rígidas podem ainda ser conseguidas com a adição de agentes de desestabilização como formamida.
Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser pelo menos 2 a 10 vezes a hibridização de fundo.
As condições de hibridização rígidas exemplares incluem as seguintes: 50% formamida, 5x SSC, e 1% SDS, incubando a 42ºC, ou, 5x SSC, 1% SDS, incubando a 65ºC, com lavagem em 0,2x SSC, e 0,1% SDS a 65ºC. . t.
Substancialmente Complementar “Substancialmente complementar” conforme usado aqui significa que uma primeira sequência é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de uma segunda sequência sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440,1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou que as duas sequências hibridizam sob condições rígidas de hibridização. u.
Substancialmente idênticos “Substancialmente idênticos” conforme usado aqui significam que uma primeira e segunda sequências são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,23,24,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou com relação aos ácidos nucleicos, se a primeira sequência é substancialmente complementar so complemento da segunda sequência. v.
Subtipo ou Sorotipo “Subtipo” ou “sorotipo”: conforme usado aqui, de modo intercambiável, e em relação ao vírus influenza, significa variantes genéticas de um vírus influenza como aquele subtipo é reconhecido por um sistema imune afastado de um diferente subtipo. w.
Variante “Variante” usado aqui com relação a um ácido nucleico significa (1) uma parte ou fragmento de uma sequência de nucleotídeo referenciada; (1i) o complemento de uma sequência de nucleotídeo referenciada ou parte da mesma; (iii) um ácido nucleico que é substancialmente idêntica a um ácido nucleico referenciado ou o complemento do mesmo; ou (iv) um ácido nucleico que hibridiza sob condições rígidas ao ácido nucleico referenciado, complemento ao mesmo, ou uma sequência substancialmente idêntica a esta. “Variante” com relação a um peptídeo ou polipeptídeo que diferem em sequência de aminoácido por inserção, deleção, ou substituição conservada de aminoácidos, mas retêm pelo menos uma atividade biológica.
Variante pode ainda significar uma proteína com uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácido que retém pelo menos uma atividade biológica.
Uma substituição conservadora de um aminoácido, ou seja, substituindo um aminoácido com um aminoácido diferente de propriedades semelhantes (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecido na técnica como tipicamente envolvendo uma alteração menor.
Estas alterações menores podem ser identificadas, em parte, considerando o índice hidropático de aminoácidos, conforme entendido na técnica.
Kyte et al., J.
Mol.
Biol. 157:105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga.
É conhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropáticos semelhantes podem ser substituídos e ainda retêm função de proteína.
Em um aspecto, aminoácidos contendo índices hidropáticos de +2 são substituídos.
A hidrofilicidade de aminoácidos pode ainda ser usado para revelar substituições que poderiam resultar em proteínas retendo função biológica Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior média de hidrofilicidade daquele peptídeo, uma medida útil que foi reportada por correlacionar bem com antigenicidade e imunogenicidade.
Patente US 4.554.101 incorporada aqui por referência.
A substituição de amincácidos contendo valores semelhantes de hidrofilicidade pode resultar em peptídeos retendo atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, conforme é entendido na técnica.
As substituições podem ser realizadas com aminoácidos contendo valores de hidrofilicidade dentro de +2 de cada outra.
Ambos o índice de hidrofobicidade e o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados por outra cadeia de lado particular daquele aminoácido.
Consistente com aquela observação, as substituições de aminoácido que são compatíveis com função biológica são entendidos por depender na similaridade relativa dos aminoácidos, e particularmente as cadeias laterais daqueles aminoácidos, conforme revelado por hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e outras propriedades.
x. Vetor "Vetor" conforme usado aqui significa uma sequência de ácido nucleico contendo uma origem de replicação. Um vetor pode ser um vetor, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Um vetor pode ser um vetor extracromossômico de auto-replicação, e preferencialmente, é um plasmídeo de DNA.
2. Antígeno de Influenza São fornecidos aqui antígenos capazes de induzir uma resposta imune em um mamífero contra ou mais sorotipos de influenza. O antígeno pode ser capaz de induzir uma resposta imune em um mamífero contra um ou mais sorotipos de influenza, incluindo contra uma ou mais cepas pandêmicas, como 2009 influenza HIN1 de origem suína. O antígeno pode ser capaz de induzir uma resposta imune em um mamífero contra um ou mais sorotipo de influenza, incluindo contra uma ou mais cepas de influenza humana de origem suína. O antígeno pode compreender epítopos que podem tornar os mesmos particularmente eficazes como imunógenos com respostas imune anti-influenza podem ser induzidas. O antígeno pode compreender o produto de tradução de comprimento completo HAO, subunidade HAI, subunidade HA2, uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação do mesmo. O antígeno de hemaglutinina de influenza pode ser uma sequência de consenso derivada de várias cepas de sorotipo H1 influenza A, a sequência de consenso derivada de várias cepas de sorotipo H2 influenza À, uma sequência híbrida contendo partes de duas diferentes sequências de consensos derivadas de vários conjuntos de várias cepas de sorotipo H1 influenza À ou uma sequência de consenso derivada de várias cepas de influenza B. o antígeno de hemaglutinina de influenza pode ser de influenza B. O antígeno pode conter pelo menos um epítopo antigênico que pode ser efetivo contra imunógenos particulares de influenza contra o qual uma resposta imune pode ser induzida. O antígeno pode fornecer um repertório inteiro de sítios imunogênicos e epítopos presentes em um vírus intacto de influenza. O antígeno pode ser uma sequência de antígeno de hemaglutinina de consenso que pode ser derivado de sequências de — antígeno de hemaglutinina a partir de uma pluralidade de cepas de vírus influenza A de um sorotipo como uma pluralidade de cepas de vírus influenza À de sorotipo H1 ou de sorotipo H2. O antígeno pode ser uma sequência de antígeno hemaglutinina de consenso híbrido que pode ser derivado da combinação de duas sequências de antígeno de hemaglutinina de consenso ou porções dos mesmos.
Cada uma das duas diferentes consensus sequências de antigeno de hemaglutinina de consenso podem ser derivados de um conjunto diferente de uma pluralidade de cepas de vírus influenza À de um sorotipo como uma pluralidade de cepas de vírus influenza A de sorotipo HI.
O antígeno pode ser uma sequência de consenso de antígeno hemaglutinina que pode ser derivado de sequências de antígeno de hemaglutinina a partir de uma pluralidade de cepas de vírus influenza B.
O antígeno de hemaglutinina consenso pode ser uma proteína compreendendo SEQ ID NO: 2 (a sequência de aminoácido H1 consenso) em que os aminoácidos 1-343 correspondem a subunidade HA1 do precursor HAO consenso H1 sequência de aminoácido ' e aminoácidos 344-566 correspondem a subunidade HA2 de sequência HAO de aminoácido H1 consenso.
O antígeno de hemaglutinina consenso pode ser uma proteina compreendendo SEQ ID NO: 7 (a sequência de aminoácido consenso H2). O antígeno consenso de hemaglutinina pode ser um híbrido sintético de sequências H1 consenso compreendendo partes de duas diferentes sequências H1 consenso que são derivados de um conjunto diferente de sequências dos outros.
Um exemplo de um antígeno HA consenso que é um híbrido sintético consenso de proteína HI1 é uma proteína compreendendo SEQ ID NO: 10 (a sequência U2 de aminoácido). O antígeno hemaglutinina de consenso pode ser uma proteína de consenso hemaglutinina derivada de sequências de hemaglutinina de cepas deinfluenza B, como uma proteína compreendendo SEQ ID NO: 14 (a sequência de aminoácido consenso BHA). O antígeno de consenso hemaglutinina pode ainda compreender uma ou mais sequências adicionais de clementos aminoácido.
O antígeno consenso hemaglutinina pode ainda compreender em seu N-terminal uma sequência líder IgE ou IgG de aminoácido.
À — sequência líder IgE de aminoácido pode ser SEQ ID NO: 17. O antígeno consenso hemaglutinina pode ainda compreender um tag imunogênico que é um epítopo é um único epítopo que pode ser detectado por anticorpos prontamente disponíveis.
Um exemplo de dito tag imunogênico é o 9 aminoácido influenza HA Tag que pode ser ligado no consenso hemaglutinina C terminal.
À sequência de aminoácido HA Tag pode ser SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, antígeno de consenso hemaglutinina pode ainda compreender em seu N-terminal uma sequência líder IZE ou IgG de aminoácido em seu C terminal um tag HA, O antígeno consenso hemaglutinina pode ser uma proteína consenso hemaglutinina que consiste em influenza sequência de aminoácidos consenso ou fragmentos e variantes dos mesmos. O antígeno consenso hemaglutinina pode ser uma proteína consenso hemaglutinina que compreende sequências de proteína não influenza e sequências de proteína influenza ou fragmentos e variantes do mesmo.
Exemplos de uma proteina consenso H1 inclui aqueles que pode consistir da sequência de aminoácido H1 consenso (SEQ ID NO:2) ou aqueles que ainda compreendem elementos adicionais como uma sequência líder IgE, ou um Tag HA ou ambos uma sequência lider I8E e um Tag HA. Um exemplo de proteína H1 de consenso que inclui ambas sequência líder IgE e um Tag HA é SEQ ID NO: 4, que compreende a sequência de codificação Hl de aminoácido de consenso (SEQ ID NO:2) ligado à sequência líder de aminoácido de IgE (SEQ ID NO: 17) em seu N terminal e ligado ao Tag HA (SEQ ID NO:18) em seu C terminal.
* Exemplos de proteínas H2 de consenso incluem aqueles que podem consistir de uma sequência de aminoácido de consenso H2 (SEQ ID NO:7) ou aqueles que ainda 15º compreendem uma sequência líder IgE, ou uma Tag HA, ou ambas sequência líder IgE e um Tag HA.
Exemplos de proteínas H1 de consenso híbridas que pode consistir da sequência de aminoácido U2 consenso (SEQ ID NO:10) ou aqueles que ainda compreendem uma sequência líder IgE, ou uma Tag HA, ou ambas sequência líder IZE e um Tag HA. Um exemplo da proteína consenso U2 é SEQ ID NO:12, que compreende a sequência de aminoácido U2 consenso (SEQ ID NO:10) ligada à sequência líder IZE de aminoácido (SEQ ID NO: 17) em seu N terminal e ligado ao Tag HA (SEQ ID NO:18) em seu C terminal.
Exemplos de proteínas consenso hemaglutinina de influenza B incluem aquelas que — podem consistir da sequência de aminoácido consenso BHA (SEQ ID NO:14) ou pode compreender uma sequência líder IgE, ou um Tag HA, ou ambas sequência líder IZE e um Tag HA. Um exemplo da proteína consenso BHA é SEQ ID NO:16 que compreende a sequência de aminoácido consenso BHA (SEQ ID NO: 14) ligada à sequência líder IgE de aminoácido (SEQ TD NO: 17) em seu N terminal e ligado ao Tag HA (SEQ ID NO:18) em seuCterminal.
A proteína consenso hemaglutinina pode ser codificada por um ácido nucleico consenso hemaglutinina, uma variante do mesmo ou um fragmento do mesmo. Diferente da proteína consenso hemaglutinina que pode ser uma sequência de consenso derivada de uma pluralidade de diferentes sequências de hemaglutinina a partir de diferentes cepas e variantes, o ácido nucleico hemaglutínina refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de proteína consenso e a sequência de codificação usada pode diferir daquelas usadas para codificar a sequência particular de aminoácidos na pluralidade de diferentes sequências de hemaglutinina a partir da qual a sequência de proteína consenso de hemaglutinina é derivada.
A sequência de ácido nucleico consenso pode ser códon otimizado e/ou RNA otimizado.
À sequência de ácido nucleico de hemaglutinina pode compreender uma sequência de Kozak na região 5º não traduzida.
À sequência consenso de hemaglutinina de ácido nucleico pode compreender sequências de ácido i 10 —nucleico que codificam uma sequência líder.
A sequência de codificação de um N terminal de sequência líder é 5º da sequência de codificação de hemaglutinina.
O líder N-terminal pode facilitar a secreção.
O líder N-terminal pode ser um líder IgE ou um líder IgG.
À sequência de ácido nucleico de consenso de hemaglutinina pode compreender sequências de ácido nucleico que codificam um tag imunogênico.
O tag imunogênico pode ser no C terminal da proteína e a sequência de codificação é 3º da sequência de codificação de HA.
O tag imunogênico fornece um único epítopo para o qual há anticorpos prontamente disponíveis de modo que ditos anticorpos podem ser usados em ensaios para detectar e confirmar a expressão da proteína.
O tag imunogênico pode ser um tag H no C-terminal da proteína.
Ácido nucleico hemaglutinina de consenso pode ter uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:14. Um consenso hemaglutinina ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:14 pode ser SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:13, respectivamente.
O ácido nucleico consenso hemaglutinina pode ainda compreender uma sequência de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido líder IgE, ou a sequência de polinucleotídeo que codifica um Tag HA sequência de aminoácido, ou ambos.
SEQ ID NO: 17 é um sequência líder IgE polipeptídeo.
SEQ ID NO: 18 é uma sequência polipeptídeo de Tag HA.
Exemplos de ácidos nucleicos consenso —hemaglutinina que ainda compreenderm sequências de polinucleotídeo que codificam uma sequência líder IBGE e um Tag HA inclui moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12 ou SEQ ID NO:16. Um consenso hemaglutinina ácido nucleico que codifica SEQ ID
NO:4, SEQ ID NO:12 ou SEQ ID NO:16 pode ser SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:15, respectivamente,
3. Constructos genéticos e plasmídeos São fornecidos aqui constructos genéticos que podem compreender uma sequência —deácidonucleico que codifica o antígeno hemaglutinina. O constructo genético pode estar presente na célula como uma molécula de funcionamento extracromossomial compreendendo o ácido nucleico que codifica o antígeno hemaglutinina. O constructo genético compreendendo o ácido nucleico que codifica o antígeno hemaglutinina pode ser um minicromossomo linear incluindo centrômero, telômeros ou plasmídeos ou cosmídeos. ' 10 O constructo genético pode ainda ser parte de um genoma de um vetor viral recombinante, incluindo adenovírus recombinantes, adenovírus recombinantes associados a virus e vacina recombinante, O constructo genético pode ser parte do material genético em micro-organismos vivos atenuados ou vetores microbianos recombinantes que vivem nas células.
Os constructos genéticos podem compreender elementos regulatórios para expressão genica do ácido nucleico hemaglutinina. Os elementos regulatórios podem ser um promotor, um melhoradora, um códon de iniciação, um códon de parada ou um sinal de poliadenilação.
As composições podem compreender uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica o antígeno consenso hemaglutinina selecionado do grupo que consiste em uma ou mais de: antígeno consenso hemaglutinina H1 influenza A, antígeno consenso hemaglutinina H2 influenza À, antígeno consenso hemaglutinina U2 influenza A, e hemaglutinina proteína BHA consenso influenza B, e podem ainda compreender uma ou mais sequências adicionais de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteína selecionadas do grupo que consiste em: proteínas hemaglutinina de influenza A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, neuraminidase de influenza À N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, hemaglutinina (BHA) de influenza B e neuraminidase de influenza B (BNA). A primeira e as adicionais sequências de ácido nucleico podem estar presentes na mesma molécula de ácido nucleico ou diferentes “moléculas de ácido nucleico. À primeira e as adicionais sequências de ácido nucleico podem estar sob o controle de elementos regulatórios que funcionam em uma célula humana. Às sequências de codificação adicionais podem codificar uma ou mais H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, NI, N2, N3, N4, N5,
N6, N7, N8, N9, BHA e BNA a partir de uma ou mais cepas de influenza, ou ser um consenso derivado de uma pluralidade de cepas contendo o sorotipo, ou ser um híbrido que inclui sequências a partir de duas ou mais sequência de consensos.
A sequência de ácidos nucleicos pode gerar um constructo genético que pode ser um vetor.
O vetor pode ser capaz de expressar um antígeno de consenso hemaglutinina na célula de um mamífero em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune no mamífero.
O vetor pode ser recombinante.
O vetor pode compreender ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno consenso hemaglutininan O vetor pode ser um plasmídeo.
O vetor pode ainda ser útil para transfectar células com ácido nucleico que codifica um antígeno consenso hemaglutinina, que a célula hospedeira transformada é ' cultivada e mantida em condições em que a expressão do antígeno consenso hemaglutinina ocorre.
O vetor pode compreender ácido micleico heterólogo que codifica um antígeno de consenso hemaglutinina e pode ainda compreender um códon de iniciação, que pode ser a montante da sequência de codificação consenso hemaglutinina, e um códon de parada, que pode ser a jusante da sequência de codificação consenso hemaglutinina.
O códon de iniciação e terminação pode estar em uma região com a sequência de codificação de consenso hemaglutinina.
O vetor pode ainda compreender um promotor que é ligado operacionalmente à sequência de codificação de consenso hemaglutinina.
O promotor ligado operacionalmente à sequência de codificação de consenso hemaglutinina pode ser um promotor de vírus de símio 40 (SV40), um promotor de vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), um promotor de vírus da imunodeficiência humana (HIV) como o vírus da imunodeficiência bovina (BIV) de repetição de terminal longo (LTR), um promotor de viírs Moloney, um promotor de vírus aviário de leucose (ALV), um promotor —decitomegalovirus (CMV) como o promotor precoce intermediário CMV, um promotor de vírus Epstein Barr (EBV), ou um promotor de vírus Rous sarcoma (RSV). O promotor pode ser um promotor a partir de um gene humano como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano, ou metalotioneina humana.
O promotor pode ainda ser um promotor específico de tecido, como um promotor específico de músculo ou pele, natural ou sintético.
Exemplos de ditos promotores são descritos no pedido de publicação de patente US 20040175727, os conteúdos dos quais estão incorporados aqui em sua totalidade.
O vetor pode ainda compreender um sinal de poliadenitação, que pode estar a jusante da sequência HA de codificação. O sinal de poliadenilação pode ser um sinal de poliadenilação SV40, sinal de poliadenilação LTR, sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (bGH), sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (DG), ou sinal de poliadenilação de B-globina humana. O sinal de poliadenilação SV40 —podeserum sinal de poliadenilação de um vetor pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
O vetor pode ainda compreender um melhorador a montante da codificação consenso hemaglutinina. O melhorador pode ser necessário para expressão de DNA. O melhorador pode ser uma actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humana ou um melhoradora viral como um de CMV, HA, RSV ou EBV. As melhoras da função de polinucleotídeo são descritas na Patente U.S. Nos. 5.593.972,
5.962.428, e WOS4/016737, os conteúdos de cada são completamente incorporados por referência.
O vetor pode ainda compreender uma origem mamífera de replicação para manter o vetor extracromossomicamente e produzir várias cópias do vetor em uma célula. O vetor pode ser pVAXI! (Figura 1), pCEP4 ou pREP4 da Invitrogen (San Diego, CA), que pode compreender o vírus Epstein Barr origem de replicação e antígeno nuclear EBNA-1 região de codificação, que pode produzir replicação epissomal em altas cópias sem integração. O vetor pode ser pvAX1 com alterações como aquelas descritas no parágrafo referente à Figura 1 na seção acima de Breve Descrição das Figuras. A estrutura do vetor pode ser —pAVO242.O vetor pode ser um vetor defectivo de replicação do adenovírus tipo 5 (Ad5S).
O vetor pode ainda compreender uma sequência regulatória, que pode ser bem apropriada para expressão de gene em uma célula de mamífero ou humana em que o vetor é administrado. A sequência de codificação de consenso hemaglutinina pode compreender um códon, que pode permitir mais transcrição eficiente da sequência de codificação na célula hospedeira.
O vetor pode ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que pode ser usado para produção de proteina em Escherichia coli (E.coli). O vetor pode ainda ser pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que pode ser usado para a produção de proteína em cepas de Saccharomyces cerevisiae de levedura. O vetor ainda pode ser do sistema de expressão — de baculovírus completo MAXBAC'MY (Invitrogen, San Diego, Calif.), que pode ser usado para a produção de proteína em células de inseto. O vetor pode ainda ser peDNA 1 ou pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que pode ser usado para a produção de proteína em células de mamíferos como células de ovário de hamster chinês (CHO). O vetor pode ser vetores ou sistemas de expressão para produzir proteína por técnicas de rotina e prontamente materiais de partida disponíveis incluindo Sambrook et al., Molecular Cloning an Laboratory Manual, Second Ed., ColdSpringHarbor (1989), que é totalmente incorporado por referência.
O vetor pode ser pGX2009 ou pGX2006, que pode ser usado para expressar o antígeno consenso hemaglutinina. O vetor pGX2009 (4739 bp, Figura 2; SEQ ID NO: 5) é um plasmídeo modificado pVvAX1 com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína consenso H1l (aminoácido SEQ ID NO:4 codificado por SEQ ID NO:3) que compreende uma sequência líder IgE (aminoácido SEQ ID NO:12 codificado por SEQ ID NO:11) ligado a um consenso H] sequência de aminoácido (aminoácido SEQ ID NO:2 codificado por SEQ ID NO:1). O vetor pPGX2006 (4628 bp; Figura 3, SEQ ID NO:8) é um plasmídeo pVAX1 com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína consenso H2 (aminoácido SEQ ID NO:7 codificado por SEQ ID NO:6).
Os constructos genéticos e componentes revelados aqui que incluem sequência de codificação de consenso hemaglutininas podem ser usados para expressar outras proteínas de influenza como influenza A HI, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, Nó, N6, N7, N8, N9, influenza B hemaglutinina ou proteína neuraminidase por meio da qual sequência de codificação para influenza À proteinas H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, NJ, N2,N3,N4,N5, N6, N7, N8, N9, influenza B hemaglutinina ou proteina neuraminidase são incluídas no lugar de sequência de codificação de consenso hemaglutininas.
4. Composições farmacêuticas São fornecidas aqui composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção que compreendem cerca de 1 nanograma a cerca de 10 mg de DNA. Em algumas modalidades, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem de entre: 1) pelo menos 10, 15, 20,25, 30,35, 40,45, 50,55, 60,65, 70,75, 80,85, 90,95 ou 100 nanogramas, ou pelo menos 1, 5, 10, 15, 20,25, 30,35, 40,45, 50,55, 60,65, 70,75, 80,85, 90,95,100, 105, 110, 115, 120,125, 130,135, 140,145, 150,155, 160,165, 170,175, 180,185, 190,195, 200, 205, 210, 215, 220,225, 230,235, 240,245, 250,255, 260,265, 270,275, 280,285, 290,295, 300, 305, 310, 315, 320,325, 330,335, 340,345, 350,355, 360,365, 370,375, 380,385, 390,395, 400, 405, 410, 415, 420,425, 430,435, 440,445, 450,455, 460,465, 470,475, 480,485, 490,495, 500, 605, 610, 615, 620,625, 630,635, 640,645, 650,655, 660,665, 670,675, 680,685, 690,695, 700, 705, 710,
715, 720,725, 730,735, 740,745, 750,755, 760,765, 770,775, 780,785, 790,795, 800, 805, 810, 815, 820,825, 830,835, 840,845, 850,855, 860,865, 870,875, 880,885, 890,895. 900, 905, 910, 915, 920,925, 930,935, 940,945, 950,955, 960,965, 970,975, 980,985, 990,995 ou 1000 microgramas, ou pelo menos 1,5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9,950ul0mgoumais;e2) até e incluindo 15, 20,25, 30,35, 40,45, 50,55, 60,65, 70,75, 80,85, 90,95 ou 100 nanogramas, ou até e incluindo 1, 5, 10, 15, 20,25, 30,35, 40,45, 50,55, 60,65, 70,75, 80,85, 90,95,100, 105, 110, 115, 120,125, 130,135, 140,145, 150,155, 160,165, 170,175, 180,185, 190,195, 200, 205, 210, 215, 220,225, 230,235, 240,245, 250,255, 260,265, 270,275, 280,285, 290,295, 300, 305, 310, 315, 320,325, 330,335, ' 10 340,345, 350,355, 360,365, 370,375, 380,385, 390,395, 400, 405, 410, 415, 420,425, 430,435, 440,445, 450,455, 460,465, 470,475, 480,485, 490,495, 500, 605, 610, 615, 620,625, 630,635, 640,645, 650,655, 660,665, 670,675, 680,685, 690,695, 700, 705, 710, 715, 720,725, 730,735, 740,745, 750,755, 760,765, 770,775, 780,785, 790,795, 800, 805, 810, 815, 820,825, 830,835, 840,845, 850,855, 860,865, 870,875, 880,885, 890,895. 900, —905,910,915,920,925, 930,935, 940,945, 950,955, 960,965, 970,975, 980,985, 990,995, ou 1000 microgramas, ou até e incluíndo 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mg.
Em algumas modalidades, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem cerca de 5 nanograma a cerca de 10 mg de DNA.
Em algumas modalidades, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem cerca de 25 nanograma a cerca de 5 mg de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 50 nanogramas a cerca de 1 mg de DNA, Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de | a cerca de 350 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as — composições farmacêuticas contêm cerca de 5 a cerca de 250 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 10 a cerca de 200 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 15 a cerca de 150 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 20 a cerca de 100 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 25 a cerca de 75 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 30 a cerca de 50 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 35 a cerca de 40 microgramas de DNA.
Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 a cerca de 200 micrograma DNA. Em algumas modalidades, as composições farmacênticas compreendem cerca de 10 micrograma a cerca de 100 microgramas de DNA. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 20 microgramas a cerca de 80 —microgramas de DNA. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 25 microgramas a cerca de 60 microgramas de DNA. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 30 nanogramas a cerca de 50 microgramas de DNA. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 35 nanogramas a cerca de 45 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, as composições farmacêuticas contêm cerca de 0,1 a cerca de ' 500 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, as composições farmacêuticas contêm cerca de | a cerca de 350 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, as composições farmacêuticas contêm cerca de 25 a cerca de 250 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 a cerca de 200 microgramas DNA.
As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são formuladas de acordo com o modo de administração a ser usado. Nos casos onde as composições farmacêuticas são composições farmacêuticas injetáveis, são estéreis, livres de pirogênio e livres de partículas. Uma formulação isotônica é preferencialmente usada. Geralmente, aditivos para isotonicidade pode incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. Em alguns casos, soluções isotônicas como salina tampão fosfato são preferenciais. Estabilizadores incluem gelatina e albumina. Em algumas modalidades, um agente de vasoconstrição é adicionado à formulação.
Preferencialmente, a composição farmacêutica é uma vacina ec mais —preferencialmente uma vacina de DNA.
São fornecidas aqui vacinas capazes de gerar uma resposta imune em um mamífero contra ou mais sorotipos de influenza. À vacina pode compreender o constructo genético conforme discutido acima. À vacina pode compreender uma pluralidade de vetores cada um direcionado a uma ou mais Influenza À sorotipos como HI-H16 Influenza B —hemaglutinina ou combinações dos mesmos. À vacina pode compreender uma ou mais sequências de ácido nucleico que codifica um ou mais antígenos consenso hemaglutinina. Quando a vacina compreende mais do que uma sequência consenso de hemaglutinina ácido nucleico, todas ditas sequências podem estar presentes em uma molécula de ácido nucleico simples ou cada dita sequência pode estar presente em uma molécula diferente de ácido nucleico. Alternativamente, vacinas que compreendem mais do que uma sequência consenso de hemaglutinina ácidos nmucleicos pode compreender moléculas de ácido nucleico com uma sequência única de consenso hemaglutinina de ácidos nucleicos e —moléculas de ácido nucleico com mais do que uma sequência consenso hemaglutinina ácido nucleico. Além disso, as vacinas compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico consenso hemaglutinina podem ainda compreender sequência de codificação para uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, Nº e influenza B neuramiínise. ' Em algumas modalidades, às vacinas podem compreender proteínas. Algumas vacinas podem compreender um ou mais antígenos mais consenso hemaglutinina como Hl, H2, U2 e BHA. Às vacinas podem compreender uma ou mais outras proteínas selecionadas do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, Hl2, 13, Hl4, H15, H16, Nl, N2, N3, N4, Nó, N6, N7, N8, NO e influenza B neuraminidase. As vacinas podem compreender um ou mais antígeno ou mais consenso hemaglutinina em combinação com uma ou mais outras proteínas selecionadas do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, HIS, H16, NI, N2, N3, N4, Nó, Nó, N7, N8, N9, influenza B hemaglutinina e neuraminidase.
A vacina pode ser uma vacina de DNA. À vacina de DNA pode compreender uma pluralidade dos mesmos ou de diferentes plasmídeos compreendendo uma ou mais sequências de consenso hemaglutinina ácido nucleico. À vacina de DNA pode compreender uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um ou mais antígenos consenso hemaglutinina. Quando a vacina de DNA compreende mais do que uma sequência consenso hemaglutinina ácido nucleico, todas ditas sequências podem estar presentes em um único plasmídeo, ou dita cada sequência pode estar presente em plasmídeos diferentes, ou alguns plasmídeos podem compreender uma única sequência de consenso hemaglutinina de ácidos nucleicos enquanto outros plasmídeos têm mais do que uma sequência consenso hemaglutinina ácido nucleico. Além disso, vacinas de DNA pode ainda compreender uma ou mais sequências de codificação consenso para uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em influenza À H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, NI, N2, N3, N4, Nó, N6, N7, N8, N9, influenza B hemaglutinina e neuramidase. Dita sequência de codificação adicional pode estar no mesmo ou em diferente plasmídeo a partir de cada outro e a partir de plasmídeos compreendendo uma ou mais sequências consenso hemaglutinina ácido nucleico. Em algumas modalidades, as vacinas podem compreender sequências de ácido nucieico que codificam antígenos de influenza em combinação com antígenos de influenza.
Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica um ou mais antígenos consenso hemaglutinina como H1, H2, U2 e BHA. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica uma ou mais outras proteínas selecionadas do grupo que consiste em influenza A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H1l4, H15, Hl6, NI, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, influenza B hemaglutinina e —neuramidase. Em algumas modalidades, as vacinas compreendem um ou mais antígenos consenso de hemaglutinina como H1l, H2, U2 e BHA. Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma ou mais outras proteínas selecionadas do grupo que consiste em influenza A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, HIS, H16, NI, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, influenza B hemaglutinina e neuramidase.
Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma combinação de três ou mais sequências consenso de ácidos nucleicos de hemaglutinina incluindo aqueles que codificam uma ou mais de H1, H2, U2 e BHA. Em algumas modalidades, vacinas compreendem uma combinação de três ou mais sequências de ácido nucleico de hemaglutinina incluindo aquelas que codificam consenso U2, consenso BHA e uma H3 —hemaglutinina. Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma combinação de três ou mais sequências de ácido nucleico de hemaglutinina incluindo aquelas que codificam consenso BHA, Hi hemaglutinina e H3 hemaglutinin Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um ou mais antígenos de influenza revelados em US 12/375.518, que é incorporado aqui por referência e/ou US 12/269.824, que é incorporado aqui por referência. Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma sequência de ácido nucleico SEQ ID NO:19 que codifica SEQ ID NO:20 (que é uma hemaglutinina H1 revelada em US 12/375.518 como SEQ ID NO:36 e SEQ ID NO:37 respectivamente nesta) e/ou sequência de ácido nucleico SEQ ID NO:21 que codifica SEQ ID NO:22 (que é uma —hemaglutinina H1 revelada em US 12/269.824 como SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10 respectivamente nesta). Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma sequência de ácido nucleico SEQ ID NO:23 que codifica SEQ ID NO:24 (que é uma hemaglutinina H3 revelada em US 12/269,824 como SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO: 12 respectivamente nesta.
Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma combinação de três ou mais proteínas consenso de hemaglutinina incluindo uma ou mais de H1, H2, U2 e BHA. Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma combinação de três ou mais — proteínas hemaglutinina incluindo consenso U2, consenso BHA e H3 hemagiutinina. Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma combinação de três ou mais proteínas hemaglutinina incluindo consenso BHA, hemaglutinina Ht e hemaglutinina H3. Em algumas modalidades, as vacinas compreendem um ou mais antígenos de US 12/375.518 e/ou US 12/269,824, Em algumas modalidades, as vacinas compreendem SEQ ID NO:20 NT e/ou SEQ ID NO:22 e/ou SEQ ID NO:24.
Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma combinação de 1) proteina consenso hemaglutinina U2 e/ou um sequência de ácido nucleico que codifica a proteína consenso de hemaglutinina U2, 2) a proteína consenso de hemaglutinina BHA e/oú uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteina de consenso hemaglutinina BHA, e 3) uma proteína hemaglutinina H3 revelada em SEQ ID NO:24.
Em algumas modalidades, as vacinas compreendem uma combinação de 1) proteína consenso de hemaglutinina BHA e/ou uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína consenso de hemaglutinina BHA, 2) uma proteína hemaglutinina Ht contendo SEQ ID NO:20 e/ou SEQ ID NO:22 e/ou uma proteína homaglutinina H1 que codifica sequência de ácido nucleico SEQ ID NOI9 e/ou SEQ ID NO:21, e 3) uma proteína hemaglutinina H3 contendo SEQ ID NO:24 e/ou uma proteína hemaglutinina H3 que codifica sequência de ácido nucleico SEQ ID NO:23 nesta).
Vacinas de DNA são reveladas nas Patentes US 5.593.972, 5.739.118, 5.817.637,
5.830.876, 5.962.428, 5.981.505, 5.580.859, 5.703.055, e 5.676.594, que são incorporadas —aquicompletamente por referência. A vacina de DNA. pode ainda compreender elementos ou reagentes que inibem esta da integração no cromossomo. À vacina pode ser um RNA do antígeno de hemaglutinina. À vacina de RNA pode ser introduzida na célula.
À vacina pode ser uma vacina recombinante compreendendo o constructo genético ou antígeno descrito acima. A vacina poda ainda compreender um ou mais antígeno de — consenso hemaglutinina na forma de uma ou mais subunidades de proteína, uma ou mais partículas mortas de influenza compreendendo um ou mais antígenos consenso de hemaglutinina, ou uma ou mais partículas atenuadas de influenza compreendendo um ou mais antígenos consenso de hemaglutinina. À vacina atenuada pode ser vacina viva atenuada, vacina morta e vacina que usa vetores recombinantes para liberar genes estranhos que codificam um ou mais antígenos consenso de hemaglutinina, e bem como subunidade e vacinas de glicoproteína. Exemplos de vacinas vivas atenuadas, aquelas usando vetores recombinantes para liberar antígenos estranhos, vacinas de subunidades e —vacinasde glicoproteínas são descritas nas patentes US: 4.510.245; 4.797.368; 4.722.848;
4.790.987; 4.920.209; 5.017.487; 5.077.044; 5.110.587; 5.112.749; 5.174.993; 5,223,424;
5.225.336; 5,240.703; 5.242.829; 5.294.441; 5.294.548; 5.310.668; 5.387.744; 5.389.368;
5.424.065; 5.451.499; 5.453.3 64; 5.462.734; 5.470.734; 5.474.935; 5.482.713; 5.591.439;
5.643.579; 5.650.309; 5.698.202; 5.955.088; 6.034.298; 6.042.836; 6.156.319 e 6.589.529, —quesão cada uma incorporada aqui por referência. ' A vacina pode compreender vetores e/ou proteínas direcionada para sorotipos de Influenza À a partir de regiões particulares no mundo, por exemplo, Ásia. A vacina pode ainda ser direcionada contra sorotipos de Influenza À de origem suína que agora infectam humanos. À vacina pode compreender vetores e/ou proteínas direcionadas a Influenza B a partir de regiões particulares no mundo. À vacina poda ainda ser direcionada contra Influenza B que infecta humanos. À vacina pode compreender um ou mais vetores e/ou uma ou mais proteínas direcionadas a uma ou mais cepas de Influenza A e/ou B. À vacina fomecida pode ser usada para induzir respostas imunes incluindo respostas imunes terapêuticas ou profiláticas. Anticorpos e/ou células T killer podem ser geradas que são direcionadas ao antígeno consenso de hemaglutinina, e ainda amplamente através de vários subtipos de vírus de influenza. Ditos anticorpos e células podem ainda ser isolados. A vacina pode ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser moléculas funcionais como veículos, —adjuvantes, carreadores, ou diluentes. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente que facilita a transfecção, que pode incluir agentes ativos de superfície, como complexos imuno estimuladores (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freunds, análogo de LPS incluindo lipídeo monofosforil A, peptídeos muramil, análogos de quinona, vesículas como esqualeno e esqualeno, ácido hialurônico, lipídeos, lipossomas, íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes que facilitam transfecção conhecidas. O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L- glutamato (LGS), ou lipídeo. O agente que facilita a transfecção é poli-L-glutamato, e mais preferencialmente, poli-L-glutamato está presente na vacina em uma concentração de menos do que 6 mg/ml. O agente que facilita a transfecção pode ainda incluir agentes ativos da superfície como complexos imuno estimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freunds, análogo de LPS incluindo lipídeo monofosforil A, peptídeos S —muramil, análogos de quinona e vesículas como esqualeno e esqualeno, e ácido hialurônico podem ainda ser usados administrados em conjunto com o constructo genético. Em algumas modalidades, vacinas com vetor de DNA podem ainda incluir um agente que facilita a transfecção como lipídeos, lipossomas, incluíndo lipossomas de lecitina ou outros lipossomas conhecidos na técnica, como uma mistura de DNA-lipossoma (vide, por exemplo, W09324640), íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes que facilitam a transfecção. Preferencialmente, o agente que facilita a transfecção é um poliânion, policátion, incluíndo poli-L-glutamato (LGS), ou lipídeo. As concentrações do agente de transfecção na vacina é menos do que 4 mg/ml, menos do que 2 mg/ml, menos do que 1 mg/ml, menos do que 0,750 mg/ml, menos do que 0,500 mg/ml, menos do que 0,250 mg/ml, menos do que 0,100 mg/ml, menos do que 0,050 mg/ml, ou menos do que 0,010 mg/ml.
O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um adjuvante. O adjuvante pode ser outros genes que são expressos em plasmídeo alternativo ou são liberados em combinação com o plasmídeo acima na vacina. O adjuvante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: a-interferon(IFN- o), B-interferon (LFN-B), y-interferon, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), TNFa, TNFB, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), quimiocina que atrai célula T cutânea (CTACK), quimiocina expressão em timos epitelial (TECK), quimiocina epitelial associada em mucosa (MEC), IL-12, IL- 15, MHC, CD80,CD86 incluindo IL-15 contendo a sequência sinal apagada c — opcionalmente incluindo o peptpídeo sinal a partir de IZE. O adjuvante pode ser IL-12, IL- 15, IL-28, CTACK, TECK, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), TNFa, TNFB, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 10, IL-12, 11-18, ou uma combinação dos mesmos.
Outros genes que podem ser adjuvantes úteis incluem aqueles que codificam: MCP- 1,MIP-la, MIP-Ip, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GIyCAM- 1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL, formas mutantes de IL.-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento de fibroblasto, IL-7, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL- 1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DRA, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, e-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, póSRel, MyD88, TIRAK, TRAFG, TKkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, INK, genes de resposta de interferon, NFKB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP? e fragmentos funcionais dos mesmos.
A vacina pode ainda compreender um agente facilitador de vacina genética conforme descrito em US 021.579 depositado em 01 de abril de 1994, que é completamente incorporado por referência.
5. Métodos de Liberação É fornecido aqui um método para liberação de formulações farmacêuticas, preferencialmente vacinas, para fornecer constructos genéticos e proteínas do antígeno hemaglutinina que compreendem epítopos que tornam os mesmos imunógenos efetivos particulares contra os quais uma resposta imune às infecções virais pode ser induzida, O método de liberação da vacina, ou vacinação, pode ser fornecido para induzir uma resposta imune terapêutica e/ou profilática. O processo de vacinação pode gerar no mamífero uma resposta imune contra uma pluralidade de subtipos de influenza, incluindo um sorotipo HINI, o suíno 2009 originado HINI], ou outras variedades sazonais e/ou pandêmicas. À vacina pode ser liberada a um indivíduo para modular a atividade de sistema imune de mamífero e melhora da resposta imune. A liberação da vacina pode ser a transfecção do antígeno HA como uma molécula de ácido nucleico que é expressa na célula e liberada à superfície da célula em que o sistema imune reconhecido e induz uma resposta celular, humoral, ou celular e humoral. A liberação da vacina pode ser usada para induzir ou —elicitar uma resposta imune em mamíferos contra uma pluralidade de vírus influenza administrando aos mamíferos a vacina conforme discutido aqui.
Na liberação da vacina ao mamífero, e então o vetor nas células do mamífero, as células transfectadas irão expressar e secretar a proteína correspondente da influenza, incluindo pelo menos um dos antígenos consenso, e preferencialmente H1, H2, U2, e BHA Estas proteínas secretadas, ou antígenos sintéticos, serão reconhecidas como estrangeiras pelo sistema imune, que irá montar uma resposta imune que inclui: anticorpos feitos contra os antígenos, e resposta a célula T especialmente contra o antígeno. Em alguns exemplos, um mamífero vacinado com as vacinas discutidas aqui irá ter um sistema imune iniciado e quando desafiado com uma cepa viral de influenza, o sistema imune iniciador irá permitir rápido clareamento de vírus influenza subsequentes, através de resposta humoral, celular, ou ambos. A vacina pode ser administrada a um indivíduo para modular a atividade do sistema imune individual assim aumentando a resposta imune.
A vacina pode ser liberada na forma de uma vacina de DNA e métodos de liberação de vacinas de DNA são descritos nas patentes US 4.945.050 e 5,036.006, que são ambas incorporadas totalmente por referência.
À vacina pode ser administrada a um mamífero para induzir uma resposta imune em um mamífero. O mamífero pode ser humano, primata não humano, vaca, porco, ovelha, cabra, antílope, bisão, búfalo, bovinos, veado, ouriços, elefantes, lhama, alpaca, camundongos, ratos, ou galinhas, e preferencialmente humanos, vacas, porcos, ou galinha. a. Tratamentos de combinação As composições farmacêuticas, preferencialmente vacinas, podem ser administradas em combinação com uma ou mais outras proteínas influenza ou genes que codificam influenza À H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H1l5, Hl6, NI, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, influenza B hemaglutinina e neuramidase. À vacina pode ser administrada em combinação com proteínas ou genes que codificam adjuvantes, que podem incluir: a-interferon(IFN- a), B-interferon (IFN-B), y- interferon, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), TNFa, TNFB, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GI,YCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-I, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento de fibroblasto, IL-7, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, TNF receptor, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DRA, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, pósRel, MyD88, IRAK, TRAFS, IkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, Benes de resposta de interferon, NFKB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILTecDRCS, TRAIL- R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, ou TAP2, ou fragmentos funcionais dos mesmos.
b. Vias de administração : À vacina pode ser administrada por diferentes vias incluindo administração oral, parenteral, sublingual, transdermal, retal, transmucosa, tópica, via inalação, via bucal, intrapleural, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal —intratecal, e intraarticular ou combinações dos mesmos. Para uso veterinário, a composição pode ser administrada como uma formulação aceitável de acordo com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente determinar o regime de dose e via de administração que é mais apropriada para um animal particular. À vacina pode ser administrada por seringas tradicionais, dispositivos de injeção sem agulha, "pistolas de bombardeio de microprojétil", ou outros métodos físicos como eletroporação (“EP”), “método hidrodinâmico”, ou ultrassom.
O vetor da vacina pode ser liberado ao mamífero por várias tecnologias conhecidas incluindo injeção de DNA (ainda referenciado como vacinação de DNA) com e sem eletroporação in vivo, mediado por lipossoma, facilitado por nanopartícula, vetores —recombinantes como adenovírus recombinante, adenovírus recombinante associado com vírus e vaccínia recombinante. O antígeno HA pode ser liberado através de injeção de DNA e junto com eletroporação in vivo.
c. Eletroporação A administração da vacina via eletroporação dos plasmídeos da vacina pode ser conseguida usando dispositivo de eletroporação que pode ser configurado para liberar a um tecido desejado de um mamífero um pulso de energia eficaz para causar poros reversíveis em membranas de células, e preferencialmente o pulso de energia é uma corrente constante semelhante a uma entrada de corrente predefinida por um usuário. O dispositivo de eletroporação pode compreender um componente eletroporação e uma montagem de — eletrodo ou montagem de alça. O componente eletroporação pode incluir e incorporar um ou mais dos vários elementos de dispositivos eletroporação, incluindo: controlador, gerador de onda de corrente, testador de impedância, registrador de forma de onda, elemento de entrada, elemento reportando o status, porta de comunicação, componente de memória, fonte de energia, e interruptor de energia. A eletroporação pode ser conseguida usando um dispositivo de eletroporação in vivo, por exemplo, sistema CELLECTRAG& EP (VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) ou eletroporador Elgen (Genetronics, San Diego, CA) para facilitar a transfecção de células pelo plasmídeo.
O componente eletroporação pode funcionar como um elemento dos dispositivos de eletroporação, e os outros elementos são elementos separados (ou componentes) em comunicação com o dispositivo de eletroporação. O componente de eletroporação pode funcionar como mais do que um elemento dos dispositivos de eletroporação, que pode estar em comunicação com ainda outros elementos dos dispositivos de eletroporação separados do componente de cletroporação. Os elementos dos dispositivos de eletroporação que existem como partes de um dispositivo eletroquímico ou mecânico podem não ser limitados como os elementos podem funcionar como um dispositivo ou como elementos separdos em comunicação com outro. O componente de eletroporação pode ser capaz de liberar o pulso de energia que produz a corrente constante no tecido desejado, e inclui um mecanismo de retroalimentação. À montagem do eletrodo pode incluir um arranjo de eletrodo contendo uma pluralidade de eletrodos em um arranjo espacial, em que a montagem de eletrodo recebe o pulso de energia a partir do componente eletroporação e libera o mesmo ao tecido desejado através dos eletrodos. Pelo menos um de uma pluralidade de eletrodos é neutro durante a liberação de pulso de energia e medidas deimpedância no tecido desejado e comunica a impedância ao componente eletroporação. Um mecanismo de retroalimentação pode receber a impedância medida e pode ajustar o pulso de energia liberado por componente eletroporação para manter a corrente constante.
Uma pluralidade de eletrodos pode liberar o, pulso de energia em um padrão descentralizado. A pluralidade de eletrodos pode liberar o pulso de energia no padrão descentralizado através do controle de eletrodos sob uma sequência programada, e a sequência programada é entrada por um usuário ao componente eletroporação. À sequência programada pode compreender uma pluralidade de pulsos liberados em sequência, em que cada pulso de pluralidade de pulsos é liberado por pelo menos dois eletrodos ativos com um eletro neutro que mede a impedância, e em que um pulso subsequente da pluralidade de — pulsos é liberado por um diferente de pelo menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede à impedância.
O mecanismo de retroalimentação pode ser realizado por hardware ou software. O mecanismo de retroalimentação pode ser realizado por um circuito de alça fechada análogo. À retroalimentação ocorre a cada 50 us, 20 us, 10 us ou 1 us, mas é —preferencialmente uma retroalimentação em tempo real ou instantânea (ou seja, substancialmente instantâneo como determinado por técnicas disponíveis para determinar o tempo de resposta). O eletrodo neutro pode medir a impedância no tecido desejado e comunica a impedância ao mecanismo de retroalimentação e o mecanismo de retroalimentação responde à impedância e ajusta o pulso de energia para manter a corrente constante em um valor semelhante à corrente atual. O mecanismo de retroalimentação pode manter a corrente constante continuamente e instantaneamente durante a liberação do pulso de energia.
Exemplos de dispositivos e métodos de celetroporação que podem facilitar a liberação de vacinas de DNA da presente invenção, incluem aqueles descritos na patente US 7.245.963 por Draghia-Akli, et al., Publicação US 2005/0052630 submetida por Smith, et al., cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em suas totalidades. Outros dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem ser usados para as — vacinas de DNA incluem aquelas fornecidas nos pedidos de patentes co-pendentes e de co- propriedade US 11/874072, depositado em 17 de outubro de 2007, que reivindica o benefício de 35 USC 119(e) do pedido provisório US 60/852.149, depositado em 17 de outubro de 2006, e 60/978.982, depositado em 10 de outubro de 2007, todos dos quais são incorporados em suas totalidades.
Patente US 7.245.963 por Draghia-Akli, et al. descrever sistemas de cletrodo modulares e seus usos para facilitar a introdução de uma biomolécula nas células de um tecido selecionado em um corpo ou planta. Os sistemas de eletrodo modular podem compreender uma pluralidade de eletrodos sem agulha; uma agulha hipodérmica; um conector elétrico que fornece uma ligação condutora a partir de um controlador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletrodos em agulha; e uma fonte de energia. Um operador pode alcançar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inserir os mesmos no tecido selecionado em um corpo ou planta. As biomoléculas são então liberadas através da agulha hipodérmica no tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico corrente constante é aplicado à pluralidade de eletrodos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da biomolécula na célula entre a pluralidade dos eletrodos. O conteúdo inteiro de patente US 7.245.963 é aqui incorporado por referência.
A Publicação de Patente US 2005/0052630 submetida por Smith, et al. descrever um dispositivo de eletroporação que pode ser usado para efetivamente facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou planta. O dispositivo de eletroporação compreende um dispositivo eletro cinético ("dispositivo EKD") cuja operação é especificada por software ou firmware. O dispositivo
EKD produz uma série de padrões de pulso corrente constante programável entre eletrodos em um arranjo baseado em controle do usuário e entrada de parâmetros de pulso, e permite o armazenamento e aquisição de dados de forma de onda de corrente. O dispositivo de eletroporação ainda compreende um disco de eletrodo substituível contendo um arranjo de — eletrodos de agulhas, um canal de injeção central para uma agulha de injeção, e um disco guia removível. O conteúdo completo da Publicação de Patente US 2005/0052630 está aqui incorporado por referência.
Os arranjos de eletrodo e métodos descritos na patente US 7.245.963 e Publicação US 2005/0052630 pode ser adaptado para penetração profunda não somente em tecidos ' como músculo, mas ainda outros tecidos ou órgãos. Devido à configuração do arranjo de eletrodo, a agulha de injeção (para liberar a biomolécula de escolha) é ainda inserida completamente no órgão alvo, e a injeção é administrada perpendicular ao tecido alvo, na área que é pré-delineado por eletrodos. Os eletrodos descritos na patente US 7.245.963 e Publicação de Patente US 2005/005263 são preferencialmente 20 mm de comprimento e 21 calibre.
Adicionalmente, são contemplados em algumas modalidades que incorporam dispositivos de eletroporação e usos dos mesmos, os dispositivos de eletroporação que são aqueles descritos nas seguintes patentes: Patente US 5.273.525 publicada em 28 de dezembro de 1993, patente US 6.110.161 publicada em 29 de agosto de 2000, 6.261.281 —publicadaem 17 de julho de 2001, e 6,958.060 publicada em 25 de outubro de 2005, e patente US 6.939.862 publicada em 6 de setembro de 2005. Além disso, as patentes que cobrem o assunto objeto fornecido na patente US 6.697.669 publicada em 24 de fevereiro de 2004, que refere-se à liberação de DNA usando qualquer uma de uma variedade de dispositivos, e patente US 7.328.064 publicada em 5 de fevereiro de 2008, extraído ao método de injeção de DNA são contemplados aqui. As patentes acima citadas são incorporadas por referência em suas totalidades.
d. Método de preparação de vacina São fornecidos aqui métodos para preparar os plasmídeos de DNA que compreendem as vacinas de DNA discutidos aqui. Os plasmídeos de DNA, após a etapa de —subclonagem final no plasmídeo de expressão mamífera, podem ser usados para inocular uma cultura de célula em tanque de fermentação de grande escala, usando métodos conhecidos na técnica.
Os plasmídeos de DNA para uso com os dispositivos EP da presente invenção podem ser formulados ou produzidos usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidas, mas preferencialmente são produzidos usando técnicas otimizadas de produção de plasmídeos que são descritas em um pedido provisório US copendente licenciado US 60/939.792, que foi depositado em 23 de maio de 2007. Em alguns exemplos, os —plasmídeos de DNA usados nestes estudos podem ser formulados em concentrações maiores do que ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação ainda incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos aos especialistas na técnica, além daqueles descritos em US 60/939792, incluindo aqueles descritos em uma patente licenciada, Patente US 7.238.522, publicada em 3 de julho de
2007. Os pedidos e patentes acima referenciadas US 60/939.792 e Patente US 7.238.522, respectivamente, estão aqui incorporados em suas totalidades.
EXEMPLOS A presente invenção é ainda ilustrada nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que estes Exemplos, enquanto indicando modalidades preferenciais da invenção, são conferidos por meio de ilustração somente. A partir da discussão acima e estes Exemplos, um especialista na técnica pode verificar as características essenciais desta invenção, e sem se afastar do espírito e escopo do mesmo, pode gerar várias alterações e modificações da invenção para adaptar esta a vários usos e condições. Assim, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui serão aparentes aos especialistas na técnica a partir da descrição anterior. Ditas modificações são ainda estão dentro do escopo das reivindicações anexadas.
Exemplo 1 PGX2009 (pHIHAO9) — Plasmídeo que codifica antígeno de hemaglutinina 2009 Influenza HINÍ (Gripe suína) À estrutura de pGX2009 (H1IHAO09) é o vetor de expressão modificado pVAX1 (Invitrogen, Carlsbady CA) sob o controle de promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV). O original pVAXI1 foi adquirido de Invitrogen (número de catálogo V260-20) e mantido a -20ºC. Conforme observado acima, a análise de sequência revelou diferenças entre a sequência de pVvAX] usado como a estrutura de pGX2009 e a — sequência pVAX! disponível de Invitrogen. As diferenças são estabelecidas acima.
O plasmídeo pGX2009, ainda referenciado como pHIHA09, compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma molécula de hemaglutinina consenso 2009 HINI influenza (gripe suína). As 79 sequências primárias usadas para gerar a sequência de consenso foram selecionadas de Base de dados de Sequência de Influenza.
Os números de acessão para sequências de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido para as várias proteínas de influenza À hemaglutinina Hl bem como a sequência de aminoácidos codificado para as sequências de nucleotídeo estão na base de — dados GenBank correspondendo aos seguintes números de acessão.
Os números de acessão não em parênteses revelam as sequências de nucleotídeo e lista adicional de sequência de aminoácidos codificado por estes.
Os números de acessão em parênteses são para entradas da correspondente sequência de aminoácido em base de dados de proteína GenBank.
Os números de acessão são os seguintes: GQ323579,1 (ACS72657,1), GQ323564,1 (ACST2654.1), GQ323551.1 (ACST2652.1), GQ323530.1 (ACST26511), GQ323520.1 (ACST72650.1), GQ323495.1 (ACS72648.1), GQ323489.1 (ACST72647.1), GQ323486.1 (ACS7T2646.1), GQ323483.1 (ACS72645.1), GQ323455.1 (ACS72641.1), GQ323451.1 (ACS72640.1), GQ323443.1 (ACS72638.1), GQ293077.1 (ACS68822.1), GQ288372.1 (ACSS4301.1), GQ287625.1 (ACSS4262.1), GQ287627.1 (ACSS4263.1), GQ287623.1 15º (ACSS4261.1), GQ287621.1 (ACSS4260.1), GQ286175.1 (ACSS4258.1), GQ283488.1 (ACSS0088.1), GQ280797.1 (ACS45035.1), GQ280624.1 (ACS45017.1), GQ280121.1 (ACS45189.1), GQ261277.1 (ACS34968.1), GQ253498.1 (ACS27787.1), GQ323470.1 (ACS72643.1), GQ253492.1 (ACS27780.1), FI9SI613.1 (ACQSS359.1), FI971076.1 (ACP52565.1), FJI969540.4 (ACP44189.1), FI969511.1i (ACP44150.1), FJ969509.1 (ACP44147.1), GQ255900.1 (ACS27774.1),GQ255901.1 (ACS27775.1), FI966974.1 (ACP41953.1), GQ261275.1 (ACS34967.1), FJI966960.1 (ACP41935,1),FJ966952.1 (ACP41926.1), FJI966082.1 (ACP41105.1),GQ255897.1 (ACS27770.1), CXY041645.1 (ACS27249.1), CY041637.1 (ACS27239.1),CY041629 (ACS27229.1), GQ323446.1 (ACS72639,1),CY041597.1º (ACS27189.1), CYO41581.1 (ACS14726.1),CY040653.1 (ACSI4666.1), CYO041573.1 (ACSI14716.1),CY041565.1 (ACS14706.1), CY041541.1 i (ACS14676.1),GQ258462.1 (ACS34667.1), CY041557.1 (ACS14696.1), CY041549.1 (ACS14686.1), GQ283484.1 (ACSSO084.1), GQ283493.1 (ACSS0095.1), GQ303340.1 (ACSTI656.1), GQ287619.1 (ACSS4259.1), GQ267839.1 (ACS36632.1), GQ268003.1 (ACS36645.1), CYO041621.1 (ACS27219.1), CY041613.1 (ACS27209.1), CYO041605.1. (ACS27199.1), FI966959.1 (ACP41934.1), FI966982.1 (ACP41963.1), CY039527.2 (ACQ45338.1), FI981612.1 (ACQSS358.1), FI9SIGIS.1 (ACQSS361.1), FI982430.1 (ACQS9195.1), FJ998208.1 (ACQ73386.1), GQ259909.1 (ACS34705.1), GQ261272.1 (ACS34966.1), GQ287621.1 (ACSS4260.1), GQ290059.1 (ACS66821.1), GQ323464.1
(ACS72642,1), GQ323473.1 (ACS72644.1), GQ323509.1 (ACS72649.1), GQ323560.1 (ACS72653.1), GQO323574.1 (ACS7T2655.1), e GQ323576.1 (ACS72656.1). As sequências de aminoácidos foram baixadas da base de dados de sequências da NCBI, e um alinhamento e sequência de consenso gerou usando Clustal X.
Uma sequência líder de alta 3 eficiência, o líder IgE, foi fundido na região a montante do códon de início para facilitar a expressão.
Para ter um nível maior de expressão, o uso de códon deste gene de fusão foi adaptado ao códon bias de genes Homo Sapiens.
Além disso, otimização de RNA foi ainda realizada: regiões de muito alto (80%) ou muito baixo (<30%) teor de GC e os motivos de sequência atuando em cis como caixas internas TATA, sítios chi e sítios de entrada —ribossomais foram evitados.
À sequência de entrada foi sinteticamente produzida em Geneart (Regensburg, Alemanha). O gene sintético engenheirado H1HAO09 foi 1818 bp em comprimento (SEQ ID NO:1) e foi clonado em pVAX1 em sítios BamHI e Xhol por Geneart (Figura 2). Exemplo 2 Desafio de Furões imunizadas por Influenza pGX2009 com A/Mexico/INDRE4487/2009 Os experimentos do desafio foram conduzidos usando furões, um modelo preferencial para influenza.
Os furões foram imunizados usando plasmídeo pGX2009, Animais: 4 grupos x 5 animais/grupo, mais um grupo controle com 4 animais = 24 —furõestotais (machos) Duração: 18 semanas (incluindo o desafio) Dose: 0,2mg plasmídeo Sumário do protocolo: Furões foram alocados aleatoriamente em grupos de vacina de DNA.
Os animais foram imunizados no Dia do Estudo 0, Dia 28, e Dia 56. Animais foram anestesiados com coquetel cetamina/midazolam, isoflurano ou equivalente de acordo com os protocolos aprovados de anestesia e vacinados IM com combinações de vacina de DNA de DNA.
Grupos 1 e 2 foram imediatamente eletroporados usando dispositivo de eletroporação de corrente constante adaptativa CELLECTRAG (EP) a 0,5 Amp, 52 pulsos de milissegundos, 0,2 segundos entre pulsos, 4 segundos de atraso de disparo, 3 pulsos totais.
Animais de controle foram controles naive (sem plasmídeo, sem EP). Furões foram deixados recuperar da anestesia em suas gaiolas e foram monitorados de perto por 24 horas para garantir recuperação total.
Alimento e água estavam disponíveis ad libitum para a duração do estudo.
No Dia
84, animais foram desafiados por infecção intranasal com 1 ml de MX10 (A/Mexico/InDRE4487/2009; 5 x 105 PFU/ml). Animais foram monitorados diariamente para sinais clínicos (peso, temperatura, etc.), usando uma folha de classificação estabelecida e aprovada.
Em 1, 3, 6, 9 ce 15 dpi lavagens nasais e esfregaços retais foram coletados.
Os pulmões foram coletados no dia 15. As amostras foram armazenadas em RNAlater para carga de vírus por PCR em tempo real, meio para vírus de infecção (TCDI50) e formalina para histologia quando apropriado.
Figura 4 mostra um ensaio de Inibição de Hemaglutinação realizada com soro a partir de furões imunizados (3 imunizações). Um título de >1:40 é considerado "protetor". Uma linha pontilhada indica o marco 1:40. Todos os animais foram abaixo de marco 1:40 após 3 imunizações.
Figura 5 mostra resultados de um desafio de furões imunizados e não imunizados com uma nova cepa HIN! MX10 (A/Mexico/MDRE4487/2009). Todos os furões imunizados sobreviveram, enquanto que 75% dos furões naive morreram dentro do período de 15 dias.

Claims (1)

  1. : : va
    REIVINDICAÇÕES
    1. Molécula isolada de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: - a) uma selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:1; um fragmento de SEQ ID NO:1 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:1 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; - b) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQIDNO:3, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:3; um fragmento de SEQ ID NO:3 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:3 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; c) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: 15º SEQID NO:6, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:6; um fragmento de SEQ ID NO:6 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:6 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; d) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQIDNO:9, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:9; um fragmento de SEQ ID NO:9 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:9 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; e) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: —SEQIDNO:11, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO: 11; um fragmento de SEQ ID NO:11 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:11 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; f) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQIDNO:13, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:13; um fragmento de SEQ ID NO:13 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:13 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; e
    : 2/11 8) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:15, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:15; um fragmento de SEQ ID NO:15 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:15 — compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos.
    2. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQTID NO:13 e SEQ ID NO:15.
    3. Molécula de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:3, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:6, uma sequência de ácido 15º nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:9, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO: 11, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:13, e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:15.
    4, Molécula de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:3, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:6, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:9, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:11, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQIDNO:13,e uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO: 15.
    ,. Molécula de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:13, e SEQ ID NO:15 e uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência líder IgE.
    6. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico da reivindicação 1 ligado operacionalmente a elementos regulatórios.
    TF Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma
    . < 3/11 sequência de ácido nucleico da reivindicação 1 ligada operacionalmente a elementos regulatórios que são funcionais em uma célula humana.
    8. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de expressão é um plasmídeo.
    9. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de expressão é pGX2009.
    10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma pluralidade de uma ou mais moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: i) uma selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:1; um fragmento de SEQ ID NO:1 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:1 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; ii) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: 15º SEQIDNO:3, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:3; um fragmento de SEQ ID NO:3 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:3 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; iii) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQIDNO:6, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:6; um fragmento de SEQ ID NO:6 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:6 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; iv) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQIDNO:9, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ TD NO:9; um fragmento de SEQ ID NO:9 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:9 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; v) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQIDNO:11, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:11; um fragmento de SEQ ID NO:11 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:11 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos;
    . f 4/11 vi) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:13, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:13; um fragmento de SEQ ID NO:13 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:13 — compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; e vii) uma sequência de ácido nucleico que é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:15, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:15; um fragmento de SEQ ID NO:15 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos e uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO: 15 compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos; e b) uma ou mais sequências adicionais de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma ou mais de: influenza À hemaglutinina H1, uma influenza A hemaglutinina H2, uma influenza À hemaglutinina H3, influenza A H4 influenza À hemaglutinina H5, uma influenza À hemaglutinina H3, influenza A hemaglutinina H5, influenza A NI... influenza À hemaglutinina H6, uma influenza A hemaglutinina H7, uma influenza À hemaglutinina H5, influenza A hemaglutinina H6, uma influenza À hemaglutinina H7, uma influenza À hemaglutinina H8, uma influenza A hemaglutinina H9, uma influenza A hemaglutinina H10, uma influenza A hemaglutinina H11, uma influenza A hemaglutinina H12, influenza A H13 influenza A hemaglutinina HI4, uma influenza À hemaglutinina HIS, influenza À hemaglutinina H16, uma influenza À neuraminidase N1, uma influenza A neuraminidase N2, uma influenza À neuraminidase N3, uma influenza A neuraminidase N4, uma influenza A neuraminidase N5, uma influenza A neuraminidase N6, uma influenza À neuraminidase N7, uma influenza A neuraminidase N8, uma influenza A neuraminidase —N9,uma influenza B hemaglutinina e uma influenza B neuraminidase.
    11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a dita uma ou mais sequências adicionais de ácidos nucleicos são uma pluralidade de uma ou mais diferentes moléculas de ácido nucleico da pluralidade de moléculas de ácido nucleico estabelecidas na seção a).
    12. “Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de moléculas de ácido nucleico estabelecida na seção a) compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 e
    : 511 SEQ1ID NO:15.
    13. — Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de moléculas de ácido nucleico estabelecida na seção a) compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: uma — sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:3, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:6, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:9, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:11, uma sequência de ácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:13, e uma sequência deácido nucleico que é 95% homóloga à SEQ ID NO:15.
    1 Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de moléculas de ácido nucleico estabelecida na seção a) compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:3, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:6, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:9, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:11, uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:13, e uma sequência de ácido nucleico que é 98% homóloga à SEQ ID NO:15.
    15. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que as sequências de ácido nucleico estabelecidas em a) e b) são cada uma ligada operacionalmente a elementos regulatórios.
    16. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que as sequências de ácido nucleico estabelecida em a) e b) são cada uma ligada — operacionalmente a elementos regulatórios que são funcionais em uma célula humana.
    17. — Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que as sequências de ácido nucleico estabelecidas em a) e b) são parte de um ou mais vetores de expressão.
    18. — Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de —queumoumais vetores de expressão são plasmídeos.
    19. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende pGX2009 e/ou pGX2006.
    20. — Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais de: uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:1; uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:6; uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:9; Ss uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:13; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma influenza A hemaglutinina H1; e uma sequência de ácido nucleico que codifica uma influenza A hemaglutinina H3.
    21. — Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma influenza À hemaglutinina H1 compreende SEQ ID NO:21 ea sequência de ácido nucleico que codifica uma influenza À hemaglutinina H3 compreende SEQ 1D NO23.
    22. “Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que compreende: uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQID NO:S; uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 13; e uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:23.
    23. — Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:9 é um plasmídeo; a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:13 é um plasmídeo; e a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:23 é um plasmídeo.
    24. — Uso de uma molécula isolada de ácido nucleico, que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fabricação de um medicamento para induzir uma resposta imune.
    25. — Uso da composição da reivindicação 10 caracterizado pela fabricação de um medicamento para induzir uma resposta imune.
    26. — Uso da composição da reivindicação 23 caracterizado pela fabricação de um medicamento para induzir uma resposta imune.
    27. — Uso de uma molécula isolada de ácido nucleico, que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fabricação de um medicamento para proteção de um indivíduo contra infecção por uma cepa de influenza A humana de origem suína, a molécula de ácido nucleico compreendendo sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em:
    . 71 SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga à SEQ ID NO:1; um fragmento de SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:9, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga à SEQ ID NO:9; um fragmento de SEQ ID NO:9, e uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:9; em que a sequência de ácido nucleico é expressa em células do dito indivíduo e uma resposta imune contra a dita proteína é induzida que é uma resposta imune protetora contra influenza A humana de origem suína.
    28. — Uso da composição da reivindicação 10 caracterizado pela fabricação de um medicamento para proteção de um indivíduo contra infecção por uma cepa de influenza A humana de origem suína, caracterizado pelo fato de a composição compreender: a) uma primeira sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: SEQID NO:1, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga à SEQ ID NO:1; um fragmento de SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:1; SEQ1ID NO:9, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga à SEQ ID NO:9; um fragmento de SEQ ID NO:9, e uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:9; e b) uma ou mais sequências adicionais de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma ou mais de: uma influenza À hemaglutinina H1, uma influenza A hemaglutinina H2, uma influenza A hemaglutinina H3, influenza A H4 influenza A hemaglutinina H5, uma influenza A hemaglutinina H3, influenza A hemaglutinina H5, influenza A NI... influenza À hemaglutinina H6, uma influenza À hemaglutinina H7, influenza A hemaglutinina HS, influenza À hemaglutinina H6, uma influenza A hemaglutinina H7, uma influenza À hemaglutinina H8, uma influenza A hemaglutinina H9, uma influenza A hemaglutinina H10, uma influenza À hemaglutinina H11, uma influenza A hemaglutinina H12, influenza A H13 influenza À
    É 8/11 hemaglutinina H14, uma influenza À hemaglutinina H15, influenza À hemaglutinina H16, uma influenza À neuraminidase N1, uma influenza A neuraminidase N2, uma influenza À neuraminidase N3, uma influenza À neuraminidase N4, uma influenza À neuraminidase N5, uma influenza A neuraminidase N6, uma influenza A neuraminidase N7, uma influenza A neuraminidase N8, uma influenza À neuraminidase N9, uma influenza B hemaglutinina e uma influenza B neuraminidase; em que a primeira sequência de ácido nucleico é expressa em células do dito indivíduo e uma resposta imune contra a dita primeira proteína é induzida que é uma resposta imune protetora contra influenza A humana de origem suína, as uma ou mais sequências adicionais de ácido nucleico são expressas em células do dito indivíduo e resposta imune contra as ditas uma ou mais segundas proteínas é induzida.
    29. — Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a composição compreende uma ou mais de: uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:1; uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:9; uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:13; uma sequência de ácido nucleico que codifica influenza A hemaglutinina H1; e uma sequência de ácido nucleico que codifica influenza A hemaglutinina H3.
    30. — Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a — sequência de ácido nucleico que codifica uma influenza A hemaglutinina H1 compreende SEQ ID NO:21 e a sequência de ácido nucleico que codifica uma influenza À hemaglutinina H3 compreende SEQ ID N0:23.
    31. — Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a composição compreende uma ou mais de: uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:9; uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:13; e uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO 23.
    32. — Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:9 é um plasmídeo; a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:13 é um plasmídeo; e a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:23 é um plasmídeo.
    33. — Uso de uma molécula isolada de ácido nucleico, que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela
    $/11 fabricação de um medicamento para tratamento de um indivíduo que foi infectado por uma cepa de influenza A humana de origem suína, a molécula de ácido nucleico compreendendo sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga à SEQ ID NO:1; um fragmento de SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:9, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga à SEQ ID NO:9; um fragmento de SEQ ID NO:9, e uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:9; em que a sequência de ácido nucleico é expressa nas células do dito indivíduo e uma resposta imune contra a dita proteína é induzida que é uma resposta imune protetora contra influenza À humana de origem suína.
    34. — Uso de uma molécula isolada de ácido nucleico, que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela fabricação de um medicamento para tratamento de um indivíduo que foi infectado por uma cepa de influenza A humana de origem suína, caracterizado pelo fato de a composição que compreender: a) uma primeira sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga à SEQ ID NO:1; um fragmento de SEQ ID NO:1, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga a um fragmento de SEQTD NO:1; SEQ ID NO:9, uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga à SEQ ID NO:9; um fragmento de SEQ ID NO:9, e uma sequência de ácido nucleico 95% homóloga a um fragmento de SEQ ID NO:9; e b) uma ou mais sequências adicionais de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma ou mais de: uma influenza À hemaglutinina H1, uma influenza A hemaglutinina H2, uma influenza A hemaglutinina H3, influenza A H4 influenza A hemaglutinina H5, uma influenza A hemaglutinina H3,
    : 10/11 influenza A hemaglutinina H5, influenza A NI... influenza À hemaglutinina H6, uma influenza A hemaglutinina H7, influenza A hemaglutinina H5, influenza A hemaglutinina H6, uma influenza A hemaglutinina H7, uma influenza A hemaglutinina H8, uma influenza A hemaglutinina H9, uma influenza A hemaglutinina H10, uma influenza À —hemaglutinina HI1, uma influenza A hemaglutinina H12, influenza A H13 influenza A hemaglutinina H14, uma influenza A hemaglutinina H15, influenza A hemaglutinina H16, uma influenza A neuraminidase N1, uma influenza A neuraminidase N2, uma influenza À neuraminidase N3, uma influenza A neuraminidase N4, uma influenza A neuraminidase N5, uma influenza A neuraminidase N6, uma influenza A neuraminidase N7, uma influenza A neuraminidase N8, uma influenza À neuraminidase N9, uma influenza B hemaglutinina e uma influenza B neuraminidase; em que a primeira sequência de ácido nucleico é expressa em células do dito indivíduo e uma resposta imune contra a dita primeira proteína é induzida que é uma resposta imune protetora contra influenza A humana de origem suína, as uma ou mais sequências adicionais de ácido nucleico são expressas nas células do dito indivíduo e respostas imunes contra as ditas uma ou mais segundas proteínas são induzidas.
    35. Uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a composição compreende uma ou mais de: uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 1; uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:9; uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:13; uma sequência de ácido nucleico que codifica influenza A hemaglutinina H1; e uma sequência de ácido nucleico que codifica influenza A hemaglutinina H3.
    36. — Uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que — sequência de ácido nucleico que codifica uma influenza A hemaglutinina H1 compreende SEQ ID NO:21 e a sequência de ácido nucleico que codifica influenza A hemaglutinina H3 compreende SEQ ID NO:23.
    37. — Uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a composição compreende uma ou mais de: uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:9; uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:13; e uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:23.
    38. Uso, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que
    . 11/11 a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:9 é um plasmídeo; a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:13 é um plasmídeo; e a molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:23 é um plasmídeo.
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3009145A1 (en) 2009-03-30 2016-04-20 Mount Sinai School of Medicine of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
MX342716B (es) * 2010-02-18 2016-10-11 Sinai School Medicine Vacunas para su uso en la profilaxis y tratamiento de la enfermedad del virus de influenza.
EP3900740A1 (en) 2010-03-30 2021-10-27 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US8883171B2 (en) 2010-09-14 2014-11-11 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for influenza
US9238679B2 (en) 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
EA037377B1 (ru) 2011-02-11 2021-03-22 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Вакцина для индукции иммунного ответа на hbv
CA2839995A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza
US20140236070A1 (en) * 2011-07-29 2014-08-21 Kate Broderick Linear expression cassettes and uses thereof
CN116162175A (zh) 2011-09-20 2023-05-26 西奈山伊坎医学院 流感病毒疫苗及其应用
JP6336915B2 (ja) * 2012-02-07 2018-06-06 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 計算で最適化した広い反応性を示すｈ３ｎ２、ｈ２ｎ２、およびｂ型インフルエンザウイルスの抗原
MX359071B (es) 2012-02-13 2018-09-13 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Antígenos ampliamente reactivos computacionalmente optimizados para influenza h5n1 humana y aviar.
JP2015513902A (ja) 2012-03-30 2015-05-18 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 計算で最適化した広い反応性を示す、ｈ５ｎ１およびｈ１ｎ１インフルエンザウイルスの抗原
CA2870182A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human respiratory syncytial virus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same
CN104797594A (zh) 2012-11-27 2015-07-22 高等教育联邦系统-匹兹堡大学 计算优化的广泛反应性h1n1流感抗原
EA201591131A1 (ru) 2012-12-13 2015-12-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Днк-конструкции антитела и способ их применения
EP2931304B1 (en) * 2012-12-13 2021-04-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Wt1 vaccine
KR20150104117A (ko) 2012-12-18 2015-09-14 이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이 인플루엔자 바이러스 백신 및 그의 용도
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
CA2898303A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mono or multivalent botulinum neurotoxin based vaccine using the heavy chain from serotypes of clostridium botulinum
PL2969005T3 (pl) 2013-03-15 2020-04-30 The Research Foundation For The State University Of New York Atenuowane wirusy grypy i szczepionki
US10022434B2 (en) 2013-03-15 2018-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
WO2015023461A2 (en) * 2013-08-06 2015-02-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
US10130705B2 (en) 2013-10-07 2018-11-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines with interleukin-33 as an adjuvant
AU2015323944B2 (en) 2014-10-01 2018-11-29 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Vaccines having an antigen and interleukin-21 as an adjuvant
BR112017011556A2 (pt) 2014-12-01 2018-03-06 Inovio Pharmaceuticals Inc métodos para gerar um anticorpo sintético, prevenir ou tratar uma doença, tratar um sujeito de infecção por um patógeno e um sujeito com câncer, produto, molécula de ácido nucleico, e, composição.
AU2016209032A1 (en) 2015-01-23 2017-08-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
EP3270976A4 (en) 2015-03-20 2019-02-27 The Trustees of the University of Pennsylvania VACCINES WITH CD40 LIGAND AS ADJUVANS
CN108778326A (zh) * 2016-01-15 2018-11-09 埃图比克斯公司 用于流感疫苗接种的方法和组合物
EP3452068A4 (en) * 2016-05-05 2020-01-22 The Trustees of The University of Pennsylvania FILOVIRUS-CONSENSUS-ANTIGENE, NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND VACCINES PRODUCED THEREOF, AND METHODS FOR USE THEREOF
CN105999257A (zh) * 2016-05-11 2016-10-12 长春海基亚生物技术股份有限公司 无针注射流感疫苗系统与应用
JP7237344B2 (ja) 2016-06-15 2023-03-13 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質及びその使用
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
US12064478B2 (en) * 2018-09-21 2024-08-20 Nutech Ventures Methods of making and using universal centralized influenza vaccine genes
CN111514287A (zh) * 2020-04-29 2020-08-11 河南大学 甲型流感通用型dna疫苗及其制备方法和应用
CN114854777B (zh) * 2022-04-15 2024-06-25 中山大学 一种基于优化na序列的广谱流感疫苗及其应用

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US21579A (en) 1858-09-21 Rotary valve fob steam-engines
US5077044A (en) 1980-05-19 1991-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting shigella live vaccines
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US5643579A (en) 1984-11-01 1997-07-01 American Home Products Corporation Oral vaccines
ZA858044B (en) 1984-11-01 1987-05-27 American Home Prod Oral vaccines
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US5223424A (en) 1985-09-06 1993-06-29 Prutech Research And Development Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence
US4790987A (en) 1985-11-15 1988-12-13 Research Corporation Viral glycoprotein subunit vaccine
US5310668A (en) 1986-06-20 1994-05-10 Merck & Co., Inc. Varicella-zoster virus as a live recombinant vaccine
US5242829A (en) 1986-09-23 1993-09-07 Therion Biologics Corporation Recombinant pseudorabies virus
US5294441A (en) 1987-06-04 1994-03-15 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi
IL86583A0 (en) 1987-06-04 1988-11-15 Molecular Eng Ass Vaccine containing a derivative of a microbe and method for the production thereof
US5387744A (en) 1987-06-04 1995-02-07 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi
US5112749A (en) 1987-10-02 1992-05-12 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for the malaria circumsporozoite protein
AU625584B2 (en) 1989-03-08 1992-07-16 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host selection system
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
AU645489B2 (en) 1989-03-31 1994-01-20 Washington University Vaccines containing avirulent phoP-type microorganisms
ES2070997T3 (es) 1989-12-04 1995-06-16 Akzo Nobel Nv Virus de herpes recombinante de pavos y vacunas vector vivas derivadas de los mismos.
US5294548A (en) 1990-04-02 1994-03-15 American Biogenetic Sciences, Inc Recombianant Hepatitis a virus
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5462734A (en) 1990-11-02 1995-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Bovine herpesvirus vaccine and method of using same
US5240703A (en) 1991-03-01 1993-08-31 Syntro Corporation Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof
US6034298A (en) 1991-08-26 2000-03-07 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
US5955088A (en) 1992-02-03 1999-09-21 Cedars-Sinai Medical Center Pharmaceutical compsition of herpes simplex virus type-1 (HSV-1), glycoproteins
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
US5981505A (en) 1993-01-26 1999-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for delivery of genetic material
WO1994016737A1 (en) 1993-01-26 1994-08-04 Weiner David B Compositions and methods for delivery of genetic material
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
WO1994028929A1 (en) 1993-06-07 1994-12-22 Genentech, Inc. Hiv envelope polypeptides
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US6156319A (en) 1994-07-25 2000-12-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Soluble herpesvirus glycoprotein complex vaccine
NL9401820A (nl) 1994-11-02 1996-06-03 Meyn Maschf Inrichting voor het bewerken van aan zijn poten opgehangen gevogelte.
US5962428A (en) 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5650309A (en) 1995-05-16 1997-07-22 The Regents Of The University Of California Viral vectors
US5698202A (en) 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
KR100427786B1 (ko) 1997-04-03 2004-04-30 일렉트로우펙트 에이에스 약물과 핵산의 골격 근육 내 주입 장치 및 방법
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
HUP0004589A3 (en) 1997-06-30 2003-08-28 Centre Nat Rech Scient Improved method for transferring nucleic acid into the striped muscle and combination therefor
WO2000002621A1 (en) 1998-07-13 2000-01-20 Genetronics, Inc. Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field
US6589529B1 (en) 1998-10-30 2003-07-08 Children's Hospital Medical Center Rotavirus subunit vaccine
AU2002211490A1 (en) 2000-10-04 2002-04-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of using capsid protein from flaviviruses and pestiviruses
JP3543326B2 (ja) 2001-08-30 2004-07-14 ソニー株式会社 情報処理装置および方法、情報処理システム、情報配信装置、記録媒体、並びにプログラム
US7245963B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Advisys, Inc. Electrode assembly for constant-current electroporation and use
US8209006B2 (en) 2002-03-07 2012-06-26 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Constant current electroporation device and methods of use
US7328064B2 (en) 2002-07-04 2008-02-05 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
WO2004041177A2 (en) 2002-11-04 2004-05-21 Advisys, Inc. Synthetic muscle promoters with activities exceeding naturally occurring regulatory sequences in cardiac cells
US8080642B2 (en) * 2003-05-16 2011-12-20 Vical Incorporated Severe acute respiratory syndrome DNA compositions and methods of use
CA2567324C (en) 2003-05-30 2012-01-03 Advisys, Inc. Devices and methods for biomaterial production
CA2529647C (en) 2003-06-16 2013-08-13 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CA2822895A1 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CN101107428B (zh) 2005-01-18 2010-09-15 博格华纳公司 通过快速作用凸轮轴相位器操作的气门事件减小
CA2598884A1 (en) * 2005-02-24 2006-10-05 University Of Massachusetts Influenza nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
WO2007100584A2 (en) * 2006-02-16 2007-09-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antiviral agents and vaccines against influenza
US20070286873A1 (en) 2006-05-23 2007-12-13 Williams John V Recombinant Influenza H5 Hemagluttinin Protein And Nucleic Acid Coding Therefor
DK3037429T3 (en) 2006-07-28 2019-01-21 Univ Pennsylvania IMPROVED HIV VACCINES
ES2703744T3 (es) 2006-10-17 2019-03-12 Inovio Pharmaceuticals Inc Dispositivos de electroporación para la electroporación de células en mamíferos
BRPI0806336A2 (pt) 2006-12-29 2011-09-06 Inst Pasteur Of Shanghai lentivìrus pseudotipado com hemaglutinina da gripe e métodos de uso
WO2008124331A1 (en) 2007-04-03 2008-10-16 Cytogenix, Inc. Novel sequences and dna vaccines against avian flu
US20080299151A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Statens Serum Institut Influenza vaccines
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
WO2009026397A2 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Fraunhofer Usa, Inc. Prophylactic and therapeutic influenza vaccines, antigens, compositions, and methods
CN101877965B (zh) * 2007-11-12 2014-08-20 宾夕法尼亚大学托管会 针对流感病毒的多种亚型的疫苗
EP2358386B1 (en) * 2008-11-28 2016-11-02 Statens Serum Institut Optimized influenza vaccines
CA2653478A1 (en) 2009-01-23 2010-07-23 Gregg Martin Automated wash system for industrial vehicles
AU2011213559B2 (en) 2010-02-08 2015-05-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecules encoding RANTES, and compositions comprising and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
KR101912330B1 (ko) 2018-10-26
US8298820B2 (en) 2012-10-30
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EP2528626B1 (en) 2016-09-28
HK1249139A1 (zh) 2018-10-26

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