CN108778326A - 用于流感疫苗接种的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
描述了用于构建和产生含有多种流感抗原基因的基于重组腺病毒的载体疫苗的方法，该疫苗用于产生针对甲型和乙型流感病毒的广泛免疫应答，并且允许在对腺病毒具有预先存在的免疫力的个体中进行多次疫苗接种。特别地，该基于重组腺病毒的载体是在早期2b(E2b)基因中包含缺失的复制缺陷型腺病毒载体。
Description
交叉引用
本申请要求于2016年1月15日提交的美国临时专利申请号62/279,267和于2016年2月12日提交的美国临时专利申请号62/294,840的权益，所述临时专利申请的全部内容通过引用而并入。
政府利益声明
本发明在国立卫生研究院(NIH)的国家变态反应和传染病研究所(NIAID)授予的研究基金RO1AI111364下由政府支持完成。政府可对本发明享有一定的权利。
背景技术
疫苗通过训练免疫系统识别并破坏有害物质和病变细胞来帮助身体抵抗疾病。疫苗可大致分为预防疫苗和治疗疫苗两种类型。将预防疫苗给予健康的人，以防止特定疾病的发生，而将治疗疫苗(也称为免疫治疗)给予被诊断出患有疾病的人，以帮助阻止该疾病的发展和扩散或作为预防性的。
目前正在开发病毒疫苗来帮助抵抗感染性疾病和癌症。这些病毒疫苗通过诱导与宿主细胞内的疾病相关联的基因的一小部分的表达而起作用，这继而强化宿主的免疫系统以鉴定并破坏病变细胞。因此，病毒疫苗的临床反应可取决于疫苗获得高水平免疫原性和具有持续长期的表达的能力。
仍然存在开发用于增强对诸如感染性疾病等复杂疾病的治疗反应的方法和组合物的需求。
发明内容
在各个方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含：在E2b基因区中包含缺失的复制缺陷型腺病毒载体；以及编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸序列。
在一些方面，所述甲型流感靶抗原是甲型流感病毒的靶抗原。在进一步的方面，所述甲型流感靶抗原和所述乙型流感靶抗原是甲型流感病毒和乙型流感病毒共同的靶抗原。
在一些方面，所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E1区中包含缺失。在进一步的方面，所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E3区中包含缺失。在更进一步的方面，所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E4区中包含缺失。在一些方面，所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E3和E4区中包含缺失。
在一些方面，所述甲型流感靶抗原包括选自H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7及其组合的病毒的抗原。在其他方面，所述乙型流感靶抗原包括选自乙型流感/山形株(Yamagata)病毒和乙型流感/维多利亚株(Victoria)病毒的病毒的抗原。
在其他方面，所述甲型流感靶抗原是来自蛋白质的抗原，所述蛋白质选自基质蛋白M2、基质蛋白M2的M2e部分、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白M1及其组合。在一些方面，所述乙型流感靶抗原是来自选自蛋白质的抗原，所述蛋白质BM2蛋白、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白及其组合。
在一些方面，所述缺失包含碱基对。在进一步的方面，所述缺失包含至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个或至少150个碱基对。
在更进一步的方面，所述缺失包含多于150个、多于160个、多于170个、多于180个、多于190个、多于200个、多于250个或多于300个碱基对。
在一些方面，所述腺病毒载体包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种甲型流感靶抗原的核酸。在一些方面，所述腺病毒载体包含编码多种甲型流感靶抗原的核酸。在其他方面，所述腺病毒载体包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种乙型流感靶抗原的核酸。在一些方面，所述腺病毒载体包含编码多种乙型流感靶抗原的核酸。
在进一步的方面，所述腺病毒载体进一步包含增加所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者的表达的元件。在一些方面，所述元件包括至少1种元件、至少2种元件、至少3种元件、至少4种元件或至少5种元件。在一些方面，所述元件包括内部核糖体结合位点。在一些方面，所述元件包括组成型启动子。在其他方面，所述元件包括诱导型启动子。
在其他方面，所述元件包括转录增强子。在一些方面，所述转录增强子是劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子。在一些方面，所述元件不含回文序列。
在一些方面，所述腺病毒载体进一步包含编码增加所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者的免疫原性的蛋白质的核酸序列。在一些方面，所述腺病毒载体不是无内容载体。在一些方面，所述组合物或所述复制缺陷型腺病毒载体进一步包含编码共刺激分子的核酸序列。在进一步的方面，所述共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。在更进一步的方面，所述共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。在一些方面，所述腺病毒载体包含所述编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过5x1010个VP。在其他实施方案中，所述组合物包含至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过1x1012个VP。
在各个方面，本公开内容提供了在有需要的个体中产生针对甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的免疫应答的方法，包括向所述个体施用根据上述组合物中的任一种的组合物。
在各个方面，本公开内容提供了在个体中产生针对甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的免疫应答的方法，包括向所述个体施用第一腺病毒载体，所述第一腺病毒载体包含：复制缺陷型腺病毒载体和编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失；向所述个体施用第二腺病毒载体，所述第二腺病毒载体包含：(a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和(b)编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸；从而产生针对一种或多种甲型和乙型流感靶抗原的免疫应答。
在各个方面，本公开内容提供了在个体中产生针对甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的免疫应答的方法，包括：(a)向所述个体施用第一载体，所述第一载体包含：(i)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和(ii)编码第一甲型流感靶抗原和第一乙型流感靶抗原的核酸；以及(b)随后向所述个体施用第二载体，所述第二载体包含：(i)步骤(a)的所述复制缺陷型腺病毒载体，和(ii)编码第二甲型流感靶抗原和第二乙型流感靶抗原的核酸，其中所述第二载体的所述第二甲型流感靶抗原与所述第一载体的所述第一甲型流感靶抗原相同或不同，并且其中所述第二载体的所述第二乙型流感靶抗原与所述第一载体的所述第一乙型流感靶抗原相同或不同；从而产生针对所述第一靶抗原和所述第二靶抗原的免疫应答。
在各个方面，本公开内容提供了在个体中产生针对甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的免疫应答的方法，包括：向所述个体施用包含复制缺陷型腺病毒载体和编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失；以及向所述个体重新施用所述腺病毒载体至少一次；从而产生针对所述甲型和乙型流感靶抗原的免疫应答。
在各个方面，本公开内容提供了构建通用流感疫苗载体的方法，包括将编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸插入复制缺陷型腺病毒载体中，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失。
在一些方面，所述甲型流感靶抗原包括选自H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7及其组合的病毒的抗原。在一些方面，所述乙型流感靶抗原包括选自乙型流感/山形株病毒和乙型流感/维多利亚株病毒的病毒的抗原。
在其他方面，所述甲型流感靶抗原是来自蛋白质的抗原，所述蛋白质选自基质蛋白M2、基质蛋白M2的M2e部分、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白M1及其组合。在其他方面，所述乙型流感靶抗原是来自蛋白质的抗原，所述蛋白质选自BM2蛋白、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白及其组合。
在一些方面，所述个体对腺病毒具有预先存在的免疫力。在一些方面，所述腺病毒载体不是无内容载体。
在其他方面，第一载体不是无内容载体。在进一步的方面，第二载体不是无内容载体。在更进一步的方面，所述第一和第二腺病毒载体不是无内容载体。在一些方面，所述个体对5型腺病毒具有预先存在的免疫力。
在一些方面，所述第一和第二载体的所述第一和第二靶抗原衍生自相同的感染性生物体。在其他方面，所述第一和第二载体的所述第一和第二靶抗原衍生自不同的感染性生物体。在一些方面，所述甲型流感靶抗原和所述乙型流感靶抗原是不同的靶抗原。
在一些方面，所述甲型流感靶抗原是甲型流感病毒的靶抗原。在一些方面，所述甲型流感靶抗原和所述乙型流感靶抗原是甲型流感病毒和乙型流感病毒共同的靶抗原。
在一些方面，所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E1区中包含缺失。在进一步的方面，所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E3区中包含缺失。在更进一步的方面，所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E4区中包含缺失。在更进一步的方面，所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E3和E4区中包含缺失。
在一些方面，所述缺失包含碱基对。在进一步的方面，所述缺失包含至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个或至少150个碱基对。
在更进一步的方面，所述缺失包含多于150个、多于160个、多于170个、多于180个、多于190个、多于200个、多于250个或多于300个碱基对。
在一些方面，所述腺病毒载体包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种甲型和乙型流感靶抗原的核酸序列。
在一些方面，所述腺病毒载体进一步包含增加所述甲型流感和乙型流感靶抗原的表达的元件。在一些方面，所述元件包括至少1种元件、至少2种元件、至少3种元件、至少4种元件或至少5种元件。在一些方面，所述元件包括内部核糖体结合位点。在其他方面，所述元件包括组成型启动子。在一些方面，所述元件包括诱导型启动子。在其他方面，所述元件包括转录增强子。在进一步的方面，所述转录增强子是劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子。在一些方面，所述元件不含回文序列。
在一些方面，所述腺病毒载体进一步包含编码增加所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者的免疫原性的多肽的核酸序列。在一些方面，所述甲型流感靶抗原包括M，且所述乙型流感靶抗原包括BM2。
在其他方面，所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者包括血凝素。在一些方面，所述血凝素包含HA1结构域。在一些方面，本文的所述血凝素包含HA2结构域。在其他方面，本文的所述血凝素包含柄结构域。在一些方面，所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者包括神经氨酸酶。
在其他方面，所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者包括核蛋白(NP)。在其他方面，所述甲型流感靶抗原包括基质蛋白M1。在一些方面，所述甲型流感靶抗原包括基质蛋白M2。在其他方面，所述甲型流感靶抗原包括基质蛋白M2e。在一些方面，所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者由与编码BM2蛋白、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白M1、基质蛋白M2或其任意组合的序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或100％的序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，所述方法包括施用至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过5x1010个VP。在其他实施方案中，所述方法包括施用至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过1x1012个VP。
在本文描述的方法和/或组合物的上下文中所讨论的实施方案可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物使用。因此，关于一种方法或组合物的实施方案也可应用于其他方法和组合物。
根据以下详细描述，其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解，该详细描述和具体实施例虽然表明了特定的实施方案，但它们仅以说明的方式给出，因为根据此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
图1图示了本公开内容的多种基因构建体的示意图。
图1A图示了待用于插入至Ad5[E1-,E2b-]中的三基因插入物，其含有甲型流感的基质1(M1)蛋白、核蛋白(NP)蛋白、血凝素(HA)，和每个蛋白质基因之间的Gly-Ser-Gly连接体。
图1B图示了含有两个抗原基因序列的Ad5[E1-,E2b-]，所述两个抗原基因序列被分别来自衍生自猪捷申病毒(Porcine teschovirus)-1和明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus)的单个“自切割”2A肽分隔开。
图2图示了在单个基于Ad5[E1-,E2b-]的平台中的流感M1、NP和HA抗原的Western印迹表示。
图3图示了图表，表明在用升高剂量的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA疫苗免疫后产生对HA抗原的抗体应答，但对于Ad5[E1-,E2b-]空壳空对照载体未产生抗体应答。值为平均值+/-SEM。
图4图示了图表，表明如通过针对分泌IFN的脾细胞的ELISpot测定确定的，在用升高剂量的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA疫苗免疫后产生对M1、NP和HA抗原的细胞介导免疫(CMI)应答，但对于Ad5[E1-,E2b-]空壳空对照载体未产生该应答。与不相关的SIV-Nef和SIV-Vif肽库缺乏脾细胞反应性显示出ELISpot应答的特异性。值为平均值+/-SEM。
图5为图表，表明如通过针对分泌粒酶B的脾细胞的ELISpot测定确定的，在用升高剂量的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA疫苗免疫后产生对M1、NP和HA抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，但对于Ad5[E1-,E2b-]空壳空对照载体未产生该应答。与不相关的SIV-Nef和SIV-Vif肽库缺乏脾细胞反应性显示出ELISpot应答的特异性。值为平均值+/-SEM。
图6图示了图表，表明如通过针对分泌IFN-γ的脾细胞的ELISpot测定确定的，在用Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA疫苗免疫一次(红线；第1组)、两次，间隔2周(蓝线；第2组)、两次，间隔1个月(绿线；第3组)，或两次，间隔2个月(橙线；第4组)后，在时间进程(纵向)研究中对NP和HA抗原产生CMI应答。值为平均值+/-SEM。箭头表示免疫次数。
图7图示了图表，表明在用Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA疫苗免疫一次(红线；第1组)、两次，间隔2周(蓝线；第2组)、两次，间隔1个月(绿线；第3组)，或两次，间隔2个月(橙线；第4组)后，在时间进程(纵向)研究中对HA抗原产生抗体(Ab)应答。值为平均值+/-SEM。箭头表示免疫次数。
图8图示了如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定的，在用Ad5[E1-,E2b-]流感疫苗在小鼠中进行免疫后，血清中甲型流感或乙型流感HA抗体应答的定量。
图8A图示了甲型流感HA抗体应答的定量。
图8B图示了乙型流感HA抗体应答的定量。
图9图示了如通过来自已经用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e疫苗和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA疫苗联合免疫的小鼠的经再刺激脾细胞中表达IFN-γ的效应T淋巴细胞的定量所测量的细胞介导免疫应答。
图9A图示了表达IFN-γ的CD8+脾细胞的百分比。
图9B图示了表达IFN-γ的CD4+脾细胞的百分比。
图10图示了如通过来自已经用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e疫苗和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA疫苗联合免疫的小鼠的分泌细胞因子的经再刺激脾细胞的定量所测量的细胞介导免疫应答。
图10A图示了分泌IFN-γ的脾细胞的定量。
图10B图示了分泌IL-2的脾细胞的定量。
图11图示了在60天的时间段内，与对照(空壳)疫苗相比，用Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/InfA-HA疫苗免疫的小鼠中攻击研究的存活率曲线。
具体实施方式
以下段落更详细地描述了本发明的不同方面。除非有明确相反的指示，否则本发明的各个方面可与本发明的任何其他一个或多个方面相组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可与被指示为优选或有利的特征中的任何其他特征相组合。
如本文所用，除非另有说明，否则冠词“一个”意指一个或多个，除非另有明确规定。
如本文所用，除非另有说明，否则诸如“含有”、“含”、“包含”、“包括”等术语意指“包含”。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“或”可以是连接的或转折的。
如本文所用，除非另有说明，否则任何实施方案都可与任何其他实施方案相组合。
如本文所用，除非另有说明，否则本文的一些发明实施方案考虑数值范围。本发明的多个方面可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应被视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值，如同它们被明确写出。例如，范围的描述如1至6应被视为具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度如何这均适用。当范围存在时，该范围包括范围端点。
术语“腺病毒”或“Ad”是指一组来自腺病毒科的无包膜DNA病毒。除了人类宿主之外，这些病毒可在不限于禽类、牛、猪和犬的物种中找到。可考虑使用来自腺病毒科的四个属(例如，禽腺病毒属(Aviadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、腺嘌呤-胸腺嘧啶富集性腺病毒属(Atadenovirus)和唾液酸酶同源性腺病毒属(Siadenovirus))中的任何属的任何Ad作为E2b缺失的病毒载体或含有本文所述其他缺失的载体的基础。此外，在各个物种中均发现了数种血清型。Ad还涉及这些病毒血清型中任一种的遗传衍生物，包括但不限于同源或异源DNA序列的遗传突变、缺失或转座。
“辅助腺病毒”或“辅助病毒”是指可提供特定宿主细胞不能提供(该宿主可提供Ad基因产物如E1蛋白)的病毒功能的Ad。该病毒用于以反式方式提供第二种病毒或辅助依赖性病毒(例如，无内容(gutted)或无内容物(gutless)病毒，或特定区域如E2b或如本文所述的其他区域缺失的病毒)所缺乏的功能(例如，蛋白质)；第一个复制缺陷型病毒被认为“帮助”第二个辅助依赖性病毒，从而允许细胞中第二个病毒基因组的产生。
如本文所用，术语“5型腺病毒空壳(adenovirus 5 null)(Ad5-空壳(Ad5-null))”是指不包含用于表达的任何异源核酸序列的非复制型Ad。
如本文所用，术语“第一代腺病毒”是指具有早期区域1(E1)缺失的Ad。在另外的情况下，非必要的早期区域3(E3)也可能缺失。
如本文所用，术语“无内容(Gutted)”或“无内容物(gutless)”是指所有的病毒编码区均缺失的腺病毒载体。
如本文所用，术语“转染”是指将外来核酸引入真核细胞中。可通过本领域已知的各种手段完成转染，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物射弹术(biolistics)。
术语“稳定的转染”或“稳定转染的”是指将外来核酸、DNA或RNA引入并整合到被转染细胞的基因组中。术语“稳定的转染子”是指已将外来DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
术语“报告基因”表示编码报告分子(包括酶)的核苷酸序列。“报告分子”可在多种检测系统中的任一种中检测，该检测系统包括但不限于基于酶的检测分析(例如，ELISA以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。
在一个实施方案中，可使用大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶基因(可从PharmaciaBiotech,Pistacataway,N.J.获得)、绿色荧光蛋白(GFP)(可从Clontech,Palo Alto,Calif.商购获得)、人胎盘碱性磷酸酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因或本领域已知的其他报告基因。
如本文所用，术语“编码……的核酸分子”、“编码……的DNA序列”和“编码……的DNA”是指脱氧核糖核苷酸沿着脱氧核糖核酸链的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了氨基酸沿着多肽(蛋白质)链的顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。
如本文所用，术语“异源核酸序列”是指与核酸序列连接或被操作以变得与该核酸序列连接的核苷酸序列，该核苷酸序列本质上不与该核酸序列连接或本质上在不同位置处与该核酸序列连接。异源核酸可包括在其被引入到的细胞中天然存在的核苷酸序列，或者异源核酸可含有相对于天然存在的序列的一些修饰。
术语“转基因”是指被引入到测试受试者的细胞或基因组中的任何基因编码区(天然或异源的核酸序列或者融合的同源或异源核酸序列)。在本发明中，转基因被携带在用于将转基因引入受试者的细胞中的任何病毒载体上。
如本文所用，术语“第二代腺病毒”是指具有E1、E2、E3的全部或部分的Ad，并且在某些实施方案中，从该病毒中删除(去除)E4DNA基因序列。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，例如，哺乳动物或有袋类动物。受试者包括但不限于人类、非人灵长类动物(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
在某些方面，可提供使用腺病毒载体来生产产生针对各种流感病毒的免疫应答的疫苗的方法，所述腺病毒载体允许多次疫苗接种以产生针对流感病毒的广泛反应性免疫应答。
一个方面提供了在个体中产生针对几种流感靶抗原的免疫应答的方法，包括向个体施用腺病毒载体，所述腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和b)编码多种流感靶抗原的核酸；以及向个体重新施用腺病毒载体至少一次；从而产生针对流感靶抗原的免疫应答。
另一个方面提供了用于在个体中产生针对几种流感靶抗原的免疫应答的方法，其中所述个体对腺病毒具有预先存在的免疫力，所述方法包括：向个体施用腺病毒载体，所述腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和b)编码多种流感靶抗原的核酸；以及向个体重新施用腺病毒载体至少一次；从而产生针对流感靶抗原的免疫应答。
在进一步的方面，靶抗原由衍生自甲型和乙型流感病毒蛋白的抗原组成。就此而言，流感蛋白可以衍生自任何甲型和乙型流感病毒，包括但不限于H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、乙型流感/山形株和乙型流感/维多利亚株。在某些实施方案中，流感病毒蛋白可以是任何流感蛋白，包括但不限于BM2蛋白、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白M1和基质蛋白M2。
开发通用流感疫苗的需要和免疫应答的重要性。
大流行性流感爆发是全球公共健康的重要威胁。这种爆发可能造成人类具有很少免疫力或没有免疫力的病毒株的突然出现和爆发性传播。许多这些病毒株会导致需要住院治疗的严重或危及生命的疾病。预防严重流感最有效的方法是对易感人群进行疫苗接种。常规流感疫苗通过诱导针对高度可变的表面糖蛋白血凝素(HA)的抗体(Ab)而起作用，并且主要通过降低感染个体中的病毒感染性和传播来起作用。一旦鉴定出潜在的大流行性株，这种类型的疫苗目前需要至少6-12个月来制备和发放，时间过长。2009年H1N1大流行突显了这一点，当时在2010年4月鉴定了新出现的病毒，但直到10月份也没能获得足够用于大规模免疫的疫苗。与此同时，病毒传播和对疫苗的需求是显而易见的。这证明了对可以快速生产的流感疫苗的需求，特别是用于需要诱导针对流感的细胞和体液免疫应答的保护作用的疫苗的高风险群体。
流感抗原
在某些实施方案中，流感抗原如血凝素、核蛋白和基质组分可用于例如疫苗组合物或包含腺病毒载体的组合物中。
例如，可使用血凝素抗原。针对天然流感感染的保护的主要关联是血清和粘膜中对HA特异的Ab的水平。基于如通过血细胞凝集抑制(HAI)测定所测量的对HA的体液应答的诱导来批准季节性流感疫苗。HA抗原似乎在茎区域含有与流感亚型交叉反应的保守抗原表位(Nabel GJ Trans Am Clin Climatol Assoc.2012；123:9-15)。
在某些方面，还可使用M2蛋白和核蛋白(NP)。研究表明，流感M2蛋白和核蛋白(NP)也含有保守区，该保守区在用于包括采用Ad5载体的疫苗在内的实验疫苗时提供广泛的不依赖流感亚型的保护(Epstein SL等人,Vaccine.2005 23:5404-10；Tompkins SM等人,Emerg Infect Dis.2007 13:426-35；Price GE等人,PLoS One.2010 5(10):e13162；Osterhaus A Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2011 366(1579):2766-73)。
疫苗接种策略已经使用NP作为抗原来诱导免疫应答，因为它在流感病毒亚型中是非常保守的(Altstein AD等人,Arch Virol.2006151:921-31；Saha S等人,Virology.2006354:48-57；Goodman AG等人,PloS One.2011 6(10):e25938)。
此外，M2蛋白(M2e)内高度保守的膜外结构域已经被研究作为甲型流感疫苗开发的有吸引力的靶标(Tompkins SM等人,Emerg Infect Dis.2007 13:426-35；Neirynck S等人,Nat Med.1999 5:1157-63；Roose K等人,Drug News Perspect.2009 22:80-92；TurleyCB等人,Vaccine.201129:5145-52)。对M2e的体液应答可通过潜在涉及Ab依赖性细胞介导的细胞毒性和/或触发补体级联而导致细胞溶解的机制来抑制流感感染(El Bakkouri K等人,J Immunol.2011 186:1022-31)。一个研究组(Zhou D等人,Mol Ther.2010 18:2182-9)从黑猩猩血清型C68(AdC68)或C6(AdC6)产生了E1缺失的腺病毒(Ad)载体，其串联表达来自与H1N1NP融合的不同甲型流感病毒株(H1N1、H5N1和H7N2)的三个M2e序列。表达M2e和NP的Ad疫苗在小鼠中对三种M2e序列引发强劲的NP特异性CD8+T细胞应答和中度的抗体应答。有趣的是，在用高剂量的不同流感病毒攻击后，接种疫苗的幼年小鼠被保护免于死亡。乙型流感病毒突变缓慢，并且其BM2蛋白含有在广谱疫苗的理想候选物——乙型流感株中高度保守的区域(Hiebert SW.,Williams MA,Lamb RA Virology.1986 155:747-51)。诱导针对保守的流感组分如BM2、M2、NP的体液和CMI应答的能力，以及导致对抗异源流感病毒的保护的共有HA在开发广泛反应性流感疫苗中具有巨大潜力。
在开发新的通用流感疫苗时，利用了所有这些上述的方面以采用甲型和乙型流感的高度保守且交叉反应性的抗原来开发多毒株交叉反应性流感疫苗。
腺病毒载体
在某些方面，可在用于递送流感抗原的组合物和方法中使用腺病毒载体。
重组Ad5[E1-,E2b-]载体疫苗平台是在早期基因2b(E2b)区中具有额外缺失的新平台，其去除了病毒DNA聚合酶(pol)基因和/或前末端蛋白(pTP)基因，并在E.C7人细胞系中繁殖(Amalfitano A,Begy CR,Chamberlain JS Proc Natl Acad Sci U S A.1996 93:3352-6；Amalfitano A,Chamberlain JS Gene Ther.1997 4:258-63；Amalfitano A等人,JVirol.1998 72:926-33；Seregin SS和Amalfitano A Expert Opin Biol Ther.2009 9:1521-31)。与当前Ad5[E1-]载体的7kb的基因携带/克隆能力相比，该载体具有高达12kb的扩展的基因携带/克隆能力，这足以允许包含多个基因(Amalfitano A等人,J Virol.199872:926-33；Seregin SS和Amalfitano A Expert Opin Biol Ther.2009 9:1521-31)。E2b区的额外缺失赋予有利的免疫特性，诸如引发对特定抗原的有效免疫应答，同时使对Ad5病毒蛋白的免疫应答最小化。
重要的是，癌症和感染性疾病的临床前和临床研究证明，基于Ad5[E1-,E2b-]的载体诱导针对所运载的抗原的有效CMI和Ab应答，即使存在Ad5免疫力也是如此(Osada T等人,Cancer Gene Ther.200916:673-82；Gabitzsch ES等人,Vaccine.2009 27:6394-8；Gabitzsch ES等人,Immunol Lett.2009 122:44-51；Gabitzsch ES等人,Cancer ImmunolImmunother.2010 59:1131-5；Gabitzsch ES等人,Cancer Gene Ther.2011 18:326-35；Gabitzsch ES等人,Vaccine 2011 29:8101-7；Jones FR等人,Vaccine 2011 29:7020-6；Gabitzsch ES,Jones FR J Clin Cell Immunol.2011 S4:001.doi:10.4172/2155-9899.S4-001；Gabitzsch ES等人,Vaccine 2012 30:7265-70；Wieking BG等人,CancerGene Ther.2012 19:667-74；Morse MA等人,Cancer Immunol Immunother.2013 62:1293-1301；Balint等人Cancer Immunol Immunother.2015 64:977-87；Rice AE等人,CancerGene Ther.2015 22:454-62；Gabitzsch ES等人,Oncotarget,在印刷前于2015年9月7日电子出版)。
先进的重组腺病毒血清型5(Ad5)载体平台给予了开发用于流感的新型广泛交叉反应性疫苗的机会。该载体可通过皮下注射直接递送，以将确定的流感抗原暴露于诱导有效免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。重要的是，Ad5重组载体以游离方式复制并且不将基因组插入宿主细胞基因组中，从而确保没有基因整合和重要细胞基因功能的破坏(Imler JLVaccine.1995 13:1143-51；Ertl HC,Xiang Z J Immunol.1996 156:3579-82；Amalfitano,A Curr Opin Mol Ther.2003 5:362-6)。
不幸的是，当前基于Ad5的载体面临的主要挑战是存在对Ad5的预先存在的免疫力。大多数人都展现出针对用于人类疫苗最广泛使用的亚型Ad5的中和Ab，其中三分之二被研究的人具有针对Ad5的淋巴增殖反应(Chirmule N等人,Gene Ther.1999 6:1574-83)。这种免疫力阻碍了当前的早期基因1(E1)区缺失的Ad5载体(Ad5[E1-])作为流感疫苗平台的使用。Ad5免疫力抑制免疫，并且特别抑制用重组Ad5载体进行的再次免疫，并且还阻碍针对第二疾病抗原的疫苗的免疫。克服预先存在的Ad5载体免疫力的问题一直是热切研究的主题。然而，使用其他Ad血清型或甚至非人类形式的Ad可能直接导致重要趋化因子和细胞因子的产生发生改变、基因调节异常，并且具有显著不同的生物分布和组织毒性(AppledornDM等人,Gene Ther.2008 15:885-901；Hartman ZC等人Virus Res.2008 132:1-14)。即使这些方法在初始免疫中取得成功，但随后的疫苗接种还是会由于对Ad亚型的诱导免疫应答而存在问题。为了帮助避免Ad免疫障碍并规避当前Ad5[E1-]载体的不利条件，构建了如上所述的改进的Ad5载体平台。
此外，与当前的Ad5[E1-]载体相比，Ad5[E1-,E2b-]载体在注射后的前24至72小时期间显示出减少的炎症(Nazir SA，Metcalf JP J Investig Med.2005 53：292-304；Schaack J Proc Natl Acad Sci US A.2004101：3124-9；Schaack J Viral Immunol.200518：79-88)。缺乏Ad5[E1-,E2b-]晚期基因表达使受感染的细胞不易受抗Ad5活性的影响，并允许它们在延长的时间段内产生和表达转基因(Gabitzsch ES,Jones FR J Clin CellImmunol.2011S4:001.doi:10.4172/2155-9899.S4-001；Hodges BL J Gene Med.2000 2:250-9)。针对Ad5[E1-,E2b-]病毒蛋白的减少的炎症反应和所产生的对预先存在的Ad5免疫力的逃避可增加Ad5[E1-,E2b-]感染APC细胞的能力，从而使接种者具有更强的免疫。此外，其他细胞类型的感染增加可提供有效CD4+和CD8+ T细胞应答所需的高水平的抗原呈递，从而导致记忆T细胞发育。因此，E2b区的缺失似乎赋予有利的免疫特性，诸如引发对特定抗原的有效免疫应答，同时使对Ad5蛋白的免疫应答最小化，即使存在预先存在的Ad5免疫力。
在癌症(结肠直肠癌、乳腺癌和HPV)(Osada T等人,Cancer Gene Ther.2009 16:673-82；Gabitzsch ES等人,Cancer Immunol Immunother.2010 59:1131-5；Gabitzsch ES等人,Cancer Gene Ther.2011 18:326-35；Wieking BG等人,Cancer Gene Ther.2012 19:667-74；Rice AE等人,Cancer Gene Ther.2015 22:454-62；Gabitzsch ES等人,Oncotarget,在印刷前于2015年9月7日电子出版)和感染性疾病(HIV、SIV和H1N1流感)(Gabitzsch ES等人,Vaccine.2009 27:6394-8；Gabitzsch ES等人,Vaccine 2011 29:8101-7；Jones FR等人,Vaccine 2011 29:7020-6；Gabitzsch ES等人,Vaccine 2012 30:7265-70)的动物模型中报道了即使存在Ad5超免疫，仍然诱导了针对表达的抗原基因的有效免疫应答。特别相关的是在晚期结肠直肠癌专利中使用新的Ad5[E1-,E2b-]-CEA(癌胚抗原)平台疫苗进行免疫治疗的研究。尽管预先存在Ad5免疫力，但仍诱导了CEA指导的CMI应答；治疗耐受良好，施用安全，并且未观察到严重的副作用(Morse MA等人,Cancer ImmunolImmunother.201362:1293-1301；Balint等人Cancer Immunol Immunother.2015 64:977-87)。
结果表明了基于重组Ad5[E1-,E2b-]平台的疫苗克服预先存在的免疫力和/或Ad5载体诱导的免疫力并且诱导显著的保护性免疫应答的能力。这些研究确定，新的基于Ad5[E1-,E2b-]载体的疫苗1)与当前的Ad5[E1-]载体相比，可诱导显著更高的CMI应答，2)可用于被设计用于诱导有效CMI应答的多种免疫方案，3)可在具有预先存在的Ad5免疫力的动物中诱导显著的抗原特异性CMI应答，并且4)可在具有高水平的预先存在的Ad5免疫力的动物中诱导显著的抗肿瘤反应或保护免于感染性疾病。
在某些实施方案中，新Ad5[E1-,E2b-]重组平台的创新属性可用于开发广泛交叉反应性的流感疫苗。这可通过在重组Ad5[E1-,E2b-]平台中并入多种转基因来完成，该转基因表达来自甲型和乙型流感病毒株的HA、BM2、M2和NP蛋白的保守和交叉反应性的抗原，并用作新的通用流感疫苗。
某些方面涉及用于产生针对流感靶抗原的免疫应答的方法和腺病毒载体。特别地，某些方面可提供改进的基于Ad的疫苗，使得可以实现针对超过一种抗原靶标实体的多次疫苗接种。重要的是，疫苗接种可在对Ad存在预先存在的免疫力的情况下进行和/或施用于先前用如本文所述的腺病毒载体或其他腺病毒载体进行过多次免疫的受试者。该腺病毒载体可多次施用于受试者以诱导针对各种甲型和乙型流感抗原的免疫应答，包括但不限于产生广谱抗体以及针对甲型和乙型流感病毒的细胞介导免疫应答。
某些方面提供了E2b缺失的腺病毒载体，诸如美国专利号6,063,622；6,451,596；6,057,158；和6,083,750中描述的那些腺病毒载体(全部通过引用整体并入本文)的使用。如'622专利中所述，为了进一步削弱病毒蛋白质表达以及降低产生有复制能力的Ad(RCA)的频率，可在某些方面提供在E2b区中含有缺失的腺病毒载体。这些E2b缺失的腺病毒载体的繁殖需要表达缺失的E2b基因产物的细胞系。
在进一步的方面，可提供包装细胞系；例如，衍生自HEK-203细胞系的E.C7(正式称为C-7)(Amalfitano A等人,Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:3352-56；Amalfitano A等人Gene Ther 1997 4:258-63)。
此外，E2b基因产物、DNA聚合酶和前末端蛋白可在E.C7或类似的细胞中与E1基因产物一起组成型表达。将基因区段从Ad基因组转移至生产细胞系具有直接的益处：(1)重组DNA聚合酶和前末端蛋白缺失的腺病毒载体的携带能力增加，因为理论上可能删除的DNA聚合酶和前末端蛋白的组合编码序列接近4.6kb；以及(2)RCA产生的可能性降低，因为将会需要两个或更多个独立的重组事件来产生RCA。
因此，表达E1、Ad DNA聚合酶和前末端蛋白的细胞系可在不需要污染性辅助病毒的情况下使得承载容量接近13kb的腺病毒载体能够繁殖(Mitani等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 92:3854；Hodges等人,J Gene Med 2000 2:250-259；Amalfitano和Parks Curr Gene Ther 2002 2:111-133)。
此外，当缺失对病毒生命周期关键的基因(例如，E2b基因)时，出现Ad复制或表达其他病毒基因蛋白的进一步削弱。这将会减少病毒感染细胞的免疫识别，并使外来转基因表达的持续时间延长。
然而，E1、DNA聚合酶和前末端蛋白缺失的载体的重要属性包括它们不能从E1和E2b区表达相应的蛋白质，以及预测缺乏大多数病毒结构蛋白质的表达。例如，Ad的主要晚期启动子(MLP)负责晚期结构蛋白L1至L5的转录(Doerfler,In Adenovirus DNA,TheViral Genome and Its Expression(Martinus Nijhoff Publishing Boston,1986)。然而，MLP在Ad基因组复制之前活性最低，只有在病毒基因组复制发生后，高毒性Ad晚期基因才能从MLP首先得到转录并翻译(Thomas和Mathews,Cell 1980 22:523)。晚期基因转录的这一顺式依赖性活化通常是DNA病毒(如多瘤病毒和SV-40的生长中)的特征。DNA聚合酶和前末端蛋白对于Ad复制是绝对需要的(不同于E4蛋白或IX蛋白)，因此它们的缺失极其不利于腺病毒载体晚期基因表达，以及该表达在细胞如APC中的毒性作用。
在某些实施方案中，考虑使用的腺病毒载体包括在Ad基因组的E2b区以及E1区中具有缺失但没有缺失Ad基因组的其他任何区域的E2b缺失的腺病毒载体。在另一个实施方案中，考虑使用的腺病毒载体可包括在Ad基因组的E2b区中具有缺失并且在E1和E3区中具有缺失但没有缺失其他区域的E2b缺失的腺病毒载体。在进一步的实施方案中，考虑使用的腺病毒载体可包括在Ad基因组的E2b区中具有缺失并在E1、E3中具有缺失并且部分或完全去除E4区但没有其他缺失的腺病毒载体。
在另一个实施方案中，考虑使用的腺病毒载体包括在Ad基因组的E2b区中具有缺失并且在E1和E4区中具有缺失但没有其他缺失的腺病毒载体。在另外的实施方案中，考虑使用的腺病毒载体可包括在Ad基因组的E2a、E2b和E4区中具有缺失但没有其他缺失的腺病毒载体。
在一个实施方案中，用于本文的腺病毒载体包括E2b区的DNA聚合酶功能和E1缺失但没有其他缺失的载体。在进一步的实施方案中，用于本文的腺病毒载体的E2b区的前末端蛋白功能和E1缺失但没有其他缺失。
在另一个实施方案中，用于本文的腺病毒载体的E1、DNA聚合酶功能和/或前末端蛋白功能缺失，但没有其他缺失。在一个特定的实施方案中，考虑用于本文的腺病毒载体缺失E2b区和E1区的至少一部分，但不是“无内容”腺病毒载体。就这点而言，载体的E2b区的DNA聚合酶功能和前末端蛋白功能均可能缺失。
如本文所用，术语“E2b缺失”是指以阻止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能的方式突变的特定DNA序列。因此，在某些实施方案中，“E2b缺失”是指从Ad基因组删除(去除)的特定DNA序列。E2b缺失或“在E2b区内含有缺失”是指Ad基因组的E2b区内的至少一个碱基对的缺失。因此，在某些实施方案中，多于一个碱基对缺失，而在另外的实施方案中，至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对缺失。在进一步的实施方案中，缺失是Ad基因组的E2b区内的多于150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对的缺失。E2b缺失可以是阻止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能的缺失，因此包括编码部分E2b特异性蛋白质的外显子内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在某些实施方案中，E2b缺失是阻止E2b区的DNA聚合酶和前末端蛋白中的一种或两种的表达和/或功能的缺失。在进一步的实施方案中，“E2b缺失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一种或多种编码的蛋白质是非功能性的。这样的突变包括被不同残基取代从而导致氨基酸序列的变化进而产生非功能性蛋白质的残基。
如本领域技术人员在阅读本公开内容时将会理解的，Ad基因组的其他区域可以缺失。因此，如本文所用，在Ad基因组的特定区域中“缺失”是指以阻止由该区域编码的至少一种基因产物的表达和/或功能的方式突变的特定DNA序列。在某些实施方案中，在特定区域中“缺失”是指以阻止由该区域编码的表达和/或功能(例如，DNA聚合酶的E2b功能或前末端蛋白功能)的方式从Ad基因组删除(去除)的特定DNA序列。“缺失”或在特定区域内“含有缺失”是指Ad基因组的该区域内的至少一个碱基对的缺失。因此，在某些实施方案中，多于一个碱基对缺失，而在进一步的实施方案中，至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对从特定区域缺失。在另一个实施方案中，缺失是在Ad基因组的特定区域内的超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。
这些缺失使得可以阻止由该区域编码的基因产物的表达和/或功能。因此，缺失包括编码部分蛋白质的外显子内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在进一步的实施方案中，Ad基因组的特定区域中的“缺失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一种或多种编码的蛋白质是无功能的。这样的突变包括被不同残基取代从而导致氨基酸序列的变化进而产生非功能性蛋白质的残基。
可使用本领域已知的重组技术产生包含一个或多个缺失的腺病毒载体(参见例如，Amalfitano等人,J.Virol.1998 72:926-33；Hodges,等人,J Gene Med 2000 2:250-59)。熟练技术人员将会认识到，可使用组成型表达E2b基因产物和可能已缺失的任何必需基因的产物的合适包装细胞系，使供使用的腺病毒载体成功地生长至高滴度。在某些实施方案中，可使用不仅组成型表达E1和DNA聚合酶蛋白而且还表达Ad前末端蛋白的HEK-293衍生的细胞。在一个实施方案中，使用E.C7细胞成功地生长腺病毒载体的高滴度原种(参见例如，Amalfitano等人,J.Virol.199872:926-33；Hodges等人,J Gene Med 2000 2:250-59)。
为了从自我繁殖的腺病毒载体删除关键基因，必须首先使由靶基因编码的蛋白质在HEK-293细胞或类似细胞中与E1蛋白一起共表达。因此，仅可采用在组成型共表达时无毒的那些蛋白质(或诱导表达的毒性蛋白质)。已经证明了E1和E4基因在HEK-293细胞中的共表达(利用诱导型非组成型启动子)(Yeh等人,J.Virol.1996 70:559；Wang等人,GeneTherapy 1995 2:775；以及Gorziglia等人,J.Virol.1996 70:4173)。E1和蛋白质IX基因(一种病毒体结构蛋白)已被共表达(Caravokyri和Leppard J.Virol.1995 69:6627)，并且E1、E4和蛋白IX基因的共表达也已经被描述(Krougliak和Graham Hum.Gene Ther.1995 6:1575)。E1和100k基因已经在反式互补细胞系中成功表达，E1和蛋白酶基因同样已经成功表达(Oualikene等人,Hum Gene Ther 2000 11:1341-53；Hodges等人,J.Virol 2001 75:5913-20)。
用于生长高滴度的E2b缺失的Ad颗粒的共表达E1和E2b基因产物的细胞系描述于美国专利号6,063,622中。E2b区编码对于Ad基因组复制绝对需要的病毒复制蛋白(Doerfler，同上，以及Pronk等人,Chromosoma 1992 102:S39-S45)。有用的细胞系组成型表达大约140kDa的Ad-DNA聚合酶和/或大约90kDa的前末端蛋白。特别地，没有毒性、具有E1、DNA聚合酶和前末端蛋白的高水平组成型共表达的细胞系(例如，E.C7)是用于繁殖Ad以供多次疫苗接种使用所期望的。这些细胞系允许缺失E1、DNA聚合酶和前末端蛋白的腺病毒载体的繁殖。
可使用本领域已知的技术繁殖重组Ad。例如，在某些实施方案中，用适当MOI(例如5)的腺病毒载体病毒原种感染含有E.C7细胞的组织培养板，并在37.0℃下温育40-96h。收获感染的细胞，将其重悬于10mMTris-CI(pH 8.0)中，并进行声处理，并通过两轮氯化铯密度离心来纯化病毒。在某些技术中，含有病毒的条带在Sephadex CL-6B柱(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)上脱盐，添加蔗糖或甘油，并将等分储存在-80℃下。在一些实施方案中，病毒将会被放置在设计用于提高其稳定性的溶液如A195中(Evans等人,J PharmSci 2004 93:2458-75)。测量原种的滴度(例如，通过测量SDS裂解后病毒等分在260nm处的光密度)。在另一个实施方案中，可将包含整个重组的E2b缺失的腺病毒载体的线性或圆形质粒DNA转染到E.C7或类似细胞中，并在37℃下温育，直到存在病毒产生的证据(例如，细胞病变效应)。然后可以使用来自这些细胞的条件培养基来感染更多的E.C7或类似细胞，以在纯化前扩增产生的病毒量。
可通过两轮氯化铯密度离心或选择性过滤来完成纯化。在某些实施方案中，可使用可商购获得的产品(例如，来自Puresyn,Inc.,Malvem,PA的Adenopure)或定制的色谱柱通过柱色谱法来纯化病毒。
在某些实施方案中，重组Ad可包含足够的病毒以确保待感染的细胞面对一定数目的病毒。因此，可提供重组Ad的原种，特别是不含RCA的重组Ad原种。Ad原种的制备和分析是本领域公知的。病毒原种的滴度差异较大，这很大程度上取决于病毒基因型以及用来制备它们的方案和细胞系。病毒原种可具有至少约106、107或108pfu/ml的滴度，并且许多这样的原种可具有更高的滴度，诸如至少约109、1010、1011或1012pfu/ml。
异源核酸
腺病毒载体进一步包含编码几种感兴趣的靶抗原、其片段或融合物(期望针对它们产生免疫应答)的异源核酸序列。在一些实施方案中，腺病毒载体包含编码可调节免疫应答的几种蛋白质、其融合物或其片段的异源核酸序列。因此，某些方面提供了包含异源核酸序列的第二代E2b缺失的腺病毒载体。
如此，某些方面提供编码几种感兴趣的流感靶抗原的核酸序列，该核酸序列在本文也称为多核苷酸。如此，某些方面提供了编码来自如本文进一步描述的任何来源的靶抗原的多核苷酸、包含这样的多核苷酸的载体，和用这样的表达载体转化或转染的宿主细胞。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中基本上可互换使用。如熟练技术人员还将认识到的，多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链的，并且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子可包括含有内含子并且以一对一的方式对应于DNA分子的HnRNA分子，以及不含内含子的mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但并不是必须存在于多核苷酸内，并且多核苷酸可以但并不是必须与其他分子和/或支持材料连接。如本文所用的分离的多核苷酸意指基本上远离其他编码序列的多核苷酸。例如，如本文所用的分离的DNA分子不含不相关的编码DNA的大部分，如大染色体片段或其他功能基因或多肽编码区。当然，这是指如原始分离的DNA分子，并且不排除在实验室中后续重组添加到区段的基因或编码区。
如本领域技术人员将会理解的，多核苷酸可包括基因组序列、外基因组序列和质粒编码的序列以及表达或可适于表达如本文所述的靶抗原、抗原片段、肽等的较小的工程化基因区段。这样的区段可自然地进行分离或人为地进行合成修饰。
多核苷酸可包括天然序列(即，编码靶抗原多肽/蛋白质/表位或其部分的内源序列)，或者可包括编码这样的序列的变体或衍生物的序列。在某些实施方案中，本文陈述的多核苷酸序列编码如本文所述的靶抗原蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸代表被优化以供在特定细胞类型(即，人细胞系)中表达的新基因序列，该新基因序列可大体上与天然核苷酸序列或变体不同，但编码相似的蛋白质抗原。
在其他相关的实施方案中，可提供与编码如本文所述的蛋白质(例如，感兴趣的靶抗原)的天然序列具有显著同一性的多核苷酸变体，例如，使用本文所述的方法(例如，使用标准参数的BLAST分析，如下所述)，与编码多肽的天然多核苷酸序列相比，包含至少70％的序列同一性，特别是至少75％直至99％或更高的序列同一性的多核苷酸变体。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
在某些方面，多核苷酸变体将包含一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，特别地，使得由变体多核苷酸编码的多肽的表位的免疫原性基本不降低或使得异源靶蛋白的免疫原性相对于由天然多核苷酸序列编码的多肽基本不降低。如本文其他各处所述，多核苷酸变体可编码靶抗原的变体或其片段(例如，表位)，其中变体多肽或其片段(例如，表位)与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向相对于天然多肽基本不降低。术语“变体”还应当理解为包括异种起源的同源基因。
某些方面可提供多核苷酸，该多核苷酸包含编码多肽(包括如本文所述的靶蛋白抗原)的至少约5个直至1000个或更多个以及其间的所有中间长度的连续核苷酸或由该连续核苷酸组成。将会容易理解，在这种上下文中，“中间长度”是指引用值之间的任何长度，诸如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500；500-1,000等中的所有整数。如本文所述的多核苷酸序列可在一端或两端通过未在编码如本文所述的多肽(如表位或异源靶蛋白)的天然序列中发现的额外核苷酸进行延伸。该额外序列在所公开序列的任一端或在所公开序列的两端可由1至20个核苷酸或更多个核苷酸组成。
在某些实施方案中，无论编码序列本身的长度如何，多核苷酸或其片段均可与其他DNA序列如启动子、表达控制序列、多聚腺苷化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等组合，使得它们的总长度可以差异很大。因此，考虑可使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度可受到在预期重组DNA方案中的制备和使用的容易程度的限制。例如，总长度为约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有中间长度)的说明性多核苷酸区段考虑在许多实施方式中有用。
当比较多核苷酸序列时，如果两个序列中的核苷酸序列在进行如下所述的最大对应关系比对时是相同的，则称这两个序列是“相同的”。可通过比较对比窗口上的序列以鉴定并比较具有序列相似性的局部区域来进行两个序列之间的比较。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个连续位置，通常为30至约75、40至约50个连续位置的区段，其中可在两个序列经过最佳比对后将一个序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
使用采用默认参数的生物信息学软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)的Lasergene套件中的Megalign程序来进行用于比较的序列的最佳比对。该程序包含以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff MO(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff MO(ed.)Atlas ofProtein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J,Unified Approach to Alignmentand Phylogenes,pp.626-645(1990)；Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins DG和Sharp PM,CABIOS 1989 5:151-53；Myers EW和MullerW,CABIOS 1988 4:11-17；Robinson ED,Comb.Theor 1971 11A 05；Saitou N,Nei M,Mol.Biol.Evol.1987 4:406-25；Sneath PHA和Sokal RR,Numerical Taxonomy-thePrinciples and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA(1973)；Wilbur WJ和Lipman DJ,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 1983 80:726-30。
或者，可通过Smith和Waterman,Add.APL.Math 1981 2:482的本地同一性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.1970 48:443的同一性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988 85:2444的相似性方法检索，通过这些算法(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)的计算机化实现，或通过检查来进行用于比较的序列的最佳比对。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人,Nucl.Acids Res.1977 25:3389-3402和Altschul等人,J.MoI.Biol.1990 215:403-10中。例如，可利用本文所述参数，使用BLAST和BLAST 2.0来确定多核苷酸的百分比序列同一性。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。在一个说明性实例中，对于核苷酸序列，可使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分，总是<0)来计算累积分数。当出现以下情况时，每个方向上的单词点击(word hits)的延伸停止：累积比对得分从其最大获得值下降了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，使得累积得分变为零或以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下默认设置：字长(W)为11，以及期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989 89:10915)对齐，(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。
在某些方面，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定“序列同一性百分比”，其中与用于两个序列最佳比对的参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包括20％或更少，通常5％至15％或10％至12％的添加或缺失(即空位)。通过以下方法来计算百分比：确定在两个序列中均出现的相同核酸碱基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以参考序列中的位置总数目(即窗口大小)，并将所得结果乘以100以得到序列同一性百分比。
本领域普通技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的感兴趣的特定抗原或其片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，在某些方面特别考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。此外，还考虑包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于一个或多个突变，如核苷酸的缺失、添加和/或置换而被改变的内源基因。所得到的mRNA和蛋白质可以但不必具有改变的结构或功能。可使用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定等位基因。
因此，在另一个实施方案中，使用诱变方法如位点特异性诱变来制备如本文所述的靶抗原序列或其片段的变体和/或衍生物。通过这种方法，可通过对编码多肽序列的潜在多核苷酸进行诱变来进行多肽序列中的特异性修饰。这些技术通过将一个或多个核苷酸序列变化引入多核苷酸中而提供制备和测试序列变体的例如包含一个或多个前述考虑因素的直接方法。
位点特异性诱变允许通过使用编码具有所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数目的相邻核苷酸来提供具有足够大小和序列复杂性的引物序列从而在穿过的缺失连接处的两侧形成稳定的双链体，来产生突变体。可在选择的多核苷酸序列中进行突变以改善、改变、减少、修饰或以其他方式改变多核苷酸本身的性质，并且/或者改变所编码的多肽的性质、活性、组成、稳定性或一级序列。
如通常使用自动化寡核苷酸合成仪实践的，编码多肽的多核苷酸区段或片段可通过例如由化学手段直接合成片段而容易地制备。此外，通过应用核酸复制技术，诸如美国专利4,683,202的PCRTM技术，通过将选择的序列引入重组载体用于重组生产，以及通过分子生物学领域技术人员通常已知的其他重组DNA技术，可获得片段(参见例如，CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,NY,NY)。
为了表达期望的靶抗原多肽或其片段，或包含如本文所述的上述任一种的融合蛋白，使用本领域已知的重组技术将编码该多肽的核苷酸序列或功能等同物插入到如本文其他各处所述的合适的Ad中。合适的腺病毒载体含有对于所插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件以及任何期望的连接体。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有编码感兴趣的多肽的序列和适当的转录和翻译控制元件的这些腺病毒载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。这样的技术描述于例如，Amalfitano等人,J.Virol.199872:926-33；Hodges等人,J Gene Med 2000 2:250-259；Sambrook J等人,(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.，以及Ausubel FM等人,(1989)Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中。
多种载体/宿主系统可用于包含并产生多核苷酸序列。这些载体/宿主系统包括但不限于微生物，如用重组细菌噬菌体、质粒或粘粒DNA载体转化的细菌；用酵母载体转化的酵母；感染有病毒载体(例如，杆状病毒(baculovirus))的昆虫细胞系统；用病毒载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)；烟草花叶病毒(tobacco mosaicvirus，TMV))或细菌载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
存在于腺病毒载体中的“控制元件”或“调控序列”包括载体的那些非翻译区(增强子、启动子、5’和3’非翻译区)，它们与宿主细胞蛋白相互作用以执行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可以不同。根据所使用的载体系统和宿主，可使用任何数目的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，可将编码感兴趣的多肽的序列连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的Ad转录/翻译复合体中。病毒基因组的非必需E1或E3区中的插入可用于获得能够在感染的宿主细胞中表达多肽的活的病毒(Logan J和Shenk T(1984)Proc.Natl.Acad.Sci 1984 87:3655-59)。此外，转录增强子，如劳斯肉瘤病毒增强子可用于增强哺乳动物宿主细胞中的表达。
特异性起始信号也可用于实现编码感兴趣多肽的序列的更有效的翻译。这样的信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列被插入适当的表达载体的情况下，可能不需要额外的转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其部分的情况下，应当提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应当在正确的阅读框内，以确保整个插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是各种来源(天然的和合成的)。可通过包含适用于所使用的特定细胞系统的增强子来增强表达的效率，该增强子诸如文献中所述的那些(Scharf D.等人,Results Probl.CellDiffer.1994 20:125-62)。还可并入用于转录或翻译的特异性终止序列，以便实现编码所选多肽的序列的有效翻译。
使用对产物特异的多克隆或单克隆抗体检测和测量多核苷酸编码的产物(例如，感兴趣的靶抗原)的表达的多种方案是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。利用对给定多肽上两个非干扰表位具反应性的单克隆抗体的基于双位点单克隆的免疫测定可用于一些应用，但也可采用竞争性结合测定。这些和其他测定描述于Hampton R等人(1990；Serological Methods,aLaboratory Manual,APS Press,St Paul.Minn.)和Maddox DE等人(J.Exp.Med.1983 758:1211-16)中及其他各处。腺病毒载体可包含编码几种感兴趣的流感抗原的核酸序列。
在某些实施方案中，将增强所需靶抗原的表达的元件并入到本文所述的腺病毒载体的核酸序列中。这样的元件包括内部核糖体结合位点(IRES；Wang和SiddiquiCurr.Top.Microbiol.Immunol 1995 203:99；Ehrenfeld和SemlerCurr.Top.Microbiol.Immunol.1995 203:65；Rees等人,Biotechniques 1996 20:102；Sugimoto等人,Biotechnology 1994 2:694)。IRES提高翻译效率。同样，其他序列可增强表达。对于一些基因，尤其是在5’端的序列抑制转录和/或翻译。这些序列通常是可形成发夹结构的回文序列。可删除或不删除将要递送的核酸中的这类序列。
可测定转录物或翻译产物的表达水平以确认或确定哪些序列影响表达。可通过任何已知的方法，包括RNA印迹杂交、RNA酶探针保护等，来测定转录水平。可通过任何已知的方法，包括ELISA来测定蛋白质水平。熟练技术人员将会认识到，可使用本领域已知的重组技术产生包含异源核酸序列的腺病毒载体，诸如描述于Maione等人,Proc Natl Acad SciUSA 2001 98:5986-91；Maione等人,Hum Gene Ther 2000 1:859-68；Sandig等人,ProcNatl Acad Sci USA,2000 97:1002-07；Harui等人,Gene Therapy 2004 11:1617-26；Parks等人,Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:13565-570；DelloRusso等人,Proc NatlAcad Sci USA 2002 99:12979-984；Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley and Sons,NY,NY中的那些技术。
如上所述，腺病毒载体包含编码感兴趣的几种流感靶蛋白或抗原的核酸序列。就这点而言，载体可含有编码1至4种或更多种不同的感兴趣靶抗原的核酸。靶抗原可以是全长蛋白质，或者可以是其片段(例如，表位)。腺病毒载体可含有编码来自一种感兴趣的靶蛋白的多个片段或表位的核酸序列，或者可含有来自许多不同的感兴趣的靶流感抗原蛋白的一个或多个片段或表位。
在某些实施方案中，免疫原性片段与MHC I类或Il类分子结合。如本文所用，免疫原性片段被认为“结合”MHC I类或Il类分子，条件是使用本领域已知的任何测定可检测到这样的结合。例如，可通过监测促进125I标记的β-2-微球蛋白(β2m)向MHC l类/β2m/肽异三聚体复合物中并入的能力来间接评估多肽与MHC I类结合的能力(参见Parker等人,J.Immunol.752:163,1994)。或者，可采用本领域已知的功能性肽竞争测定。通常可使用熟知的技术来鉴定多肽的免疫原性片段，诸如总结于Paul,Fundamental Immunology,第三版,243-247(Raven Press，1993)和其中引用的参考文献中的那些技术。用于鉴定免疫原性片段的代表性技术包括筛选多肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。特定靶多肽的免疫原性片段是以基本上不低于全长靶多肽的反应性的水平与这样的抗血清和/或T细胞反应的片段(例如，在ELISA和/或T细胞反应性测定中)。换句话说，免疫原性片段可以以类似于或高于全长多肽的反应性的水平在这样的测定内进行反应。通常可使用本领域普通技术人员公知的方法进行这样的筛选，诸如描述于Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988中的那些方法。
靶抗原包括但不限于衍生自任何甲型和乙型流感病毒的抗原。靶抗原可包括由本文所述的任何感染性流感病毒产生的蛋白质，诸如但不限于病毒抗原蛋白，即流感BM2蛋白、血凝素、基质蛋白M1、基质蛋白M2、核蛋白和神经氨酸酶。如本文所用，“感染原”是能够感染宿主的任何活生物体。感染原包括例如任何种类的甲型和乙型流感病毒。
腺病毒载体还可包括编码增强靶抗原的免疫原性的蛋白质的核酸序列。在这方面，用含有这样的蛋白质的腺病毒载体免疫后产生的蛋白质可以是融合蛋白，该融合蛋白包含与增强感兴趣靶抗原的免疫原性的蛋白质融合的感兴趣靶抗原。
使用方法
腺病毒载体可用于许多疫苗环境，以产生针对如本文所述的一种或多种靶抗原的免疫应答。腺病毒载体由于以下意想不到的发现而特别重要：它们可用于在对Ad具有预先存在的免疫力的受试者中产生免疫应答，并且可用于包括使用腺病毒载体进行多轮免疫的疫苗接种方案，该方案无法使用上一代腺病毒载体实现。
通常，产生免疫应答包括诱导体液应答和/或细胞介导的应答。在某些实施方案中，期望增加针对感兴趣的靶抗原的免疫应答。因此，“产生免疫应答”或“诱导免疫应答”包括任何统计学上显著的变化，例如，一种或多种免疫细胞的数目(T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞等)增加或这些免疫细胞中的一种或多种的活性(CTL活性、HTL活性、细胞因子分泌、细胞因子分泌概况的变化等)增加。
熟练技术人员将会容易理解，有许多用于确定免疫应答是否发生改变的许多方法可用。多种用于检测免疫应答(例如，细胞数目、细胞因子表达、细胞活性)的改变的方法是本领域已知的，并且在本发明的情境下有用。说明性方法描述于Current Protocols inImmunology，编辑：John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,EthanM.Shevach,Warren Strober(2001John Wiley&Sons,NY,NY)；Ausubel等人(2001 CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)；Sambrook等人(1989Molecular Cloning,Second Ed.,Cold Spring HarborLaboratory,Plainview,NY)；Maniatis等人(1982Molecular Cloning,Cold SpringHarbor Laboratory,Plainview,NY)及其他各处。在该上下文中有用的说明性方法包括细胞内细胞因子染色(ICS)、ELISpot、增殖测定、细胞毒性T细胞测定(包括铬释放或等同测定)以及使用任何数目的聚合酶链反应(PCR)的基因表达分析或基于RT-PCR的测定。
在某些实施方案中，产生免疫应答包括与对照相比，被施用腺病毒载体的受试者的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5至20或更多倍、至少、约或至多1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19倍或由它们衍生的任何范围或数值的倍数。在另一个实施方案中，产生免疫应答包括与对照相比，被施用腺病毒载体的受试者的靶标特异性CTL活性增加约1.5至20倍或更多倍。在进一步的实施方案中，产生免疫应答包括如通过测量细胞因子分泌如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、颗粒酶或其他细胞因子的ELISpot测定测量的，与对照相比，靶抗原特异性细胞介导免疫活性增加约1.5至20倍或更多倍。
在进一步的实施方案中，产生免疫应答包括与适当的对照相比，被施用腺病毒载体的受试者的靶标特异性抗体产生增加约1.5至5倍。在另一个实施方案中，产生免疫应答包括与对照相比，被施用腺病毒载体的受试者的靶标特异性抗体产生增加约1.5至20倍或更多倍。
因此，某些方面可提供用于产生针对感兴趣的流感病毒靶抗原的免疫应答的方法，包括向个体施用腺病毒载体，所述腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和b)编码靶抗原的核酸；以及向个体重新施用腺病毒载体至少一次；从而产生针对靶抗原的免疫应答。在某些实施方案中，可提供其中所施用的载体不是无内容载体的方法。
在进一步的实施方案中，可提供用于通过向个体施用腺病毒载体而在个体中产生针对流感病毒靶抗原的免疫应答的方法，其中所述个体对Ad具有预先存在的免疫力，所述腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和b)编码靶抗原的核酸；以及向个体重新施用腺病毒载体至少一次；从而产生针对流感病毒靶抗原的免疫应答。
关于对Ad的预先存在的免疫力，这可使用本领域已知的方法，诸如用来测试Ad抗体的存在的基于抗体的测定来确定。此外，在某些实施方案中，所述方法可包括首先确定个体对Ad具有预先存在的免疫力，然后施用如本文所述的E2b缺失的腺病毒载体。
在某些方面，可提供产生针对流感靶抗原(诸如本文其他各处所述的那些)的免疫应答的方法。
在特定方面，可提供产生针对甲型和乙型流感病毒(诸如本文其他各处所述的那些)的免疫应答的方法。
如本文其他各处所述，腺病毒载体包含编码来自任一种或多种感染原的一种或多种感兴趣的靶抗原的核酸序列，对所述感染原产生免疫应答。例如，靶抗原可包括但不限于病毒抗原蛋白，即流感BM2蛋白、血凝素、基质蛋白M1、基质蛋白M2、核蛋白和神经氨酸酶。
为了施用，可将腺病毒载体原种与合适的缓冲液、生理学上可接受的载体、赋形剂等组合。在某些实施方案中，在合适的缓冲液，如无菌PBS中施用合适数目的腺病毒载体颗粒。
在某些情形下，可能期望肠胃外、静脉内、肌肉内甚至腹膜内递送本文公开的腺病毒载体组合物。在某些实施方案中，活性化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可在合适地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散体。在其他实施方案中，E2b缺失的腺病毒载体可以以丸剂形式递送，通过吞咽或通过栓剂递送。
适合于可注射使用的说明性药物形式包括无菌水溶液或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(参见例如，美国专利5,466,468)。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是流动的，其流动程度使得制剂容易被吸起并推动通过注射器。该形式必须在制造和储存条件下稳定，并且必须被保存以防止微生物如细菌、霉菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小和/或通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来促进对微生物作用的预防。在许多情况下，可包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
在一个实施方案中，为了在水溶液中进行肠胃外施用，如果需要，应当对该溶液进行适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释液等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并添加到1000ml皮下灌注(hypodermoclysis)液体中或在推荐的输注部位进行注射(参见例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据接受治疗的受试者的病况，剂量必然会发生一些变化。此外，对于人类施用，制剂可能需要满足FDA生物学标准办公室要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。
载体可进一步包括任何及所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣材料、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮剂、胶体等。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分都不相容，否则考虑将其用于治疗性组合物中。补充的活性成分也可并入到组合物中。词语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生变应性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
本文所述的治疗性组合物的施用途径和频率以及剂量将会因个体与个体以及疾病与疾病的不同而不同，并且可使用标准技术容易地建立。通常，可通过注射(例如，皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如，通过吸入)、以药丸形式(例如，吞咽、用于阴道或直肠递送的栓剂)施用药物组合物和疫苗。在某些实施方案中，可在6周的时间段内施用1至3个剂量，并且可在此后定期进行进一步的加强疫苗接种。
合适的剂量是在如上所述施用时能够促进如本文别处所述的靶抗原免疫应答的腺病毒载体的量。在某些实施方案中，免疫应答比基线(即，未处理的)水平高至少10-50％。可通过测量患者的靶抗原抗体或通过能够在体外杀死感染流感的细胞的溶细胞性效应细胞的疫苗依赖性生成或本领域已知的用于监测免疫应答的其他方法来监测这样的应答。
通常，适当的剂量和治疗方案提供足以提供预防益处的量的腺病毒载体。通常可使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评估保护性免疫应答，并且可使用在免疫(疫苗接种)之前和之后从患者获得的样品来进行这些测定。
虽然一个优点是能够用相同的腺病毒载体，尤其是在对Ad具有预先存在的免疫力的个体中施用多次疫苗接种，但腺病毒疫苗还可作为初次和加强方案的一部分进行施用。混合方式的初次和加强接种方案可导致增强的免疫应答。
因此，一个方面是采用质粒疫苗，如包含感兴趣的靶抗原的质粒载体通过以下步骤引发受试者的方法：施用质粒疫苗至少一次，允许预定的时间长度过去，然后通过施用腺病毒载体进行加强。可采用多次引发，例如，1-3次，但也可使用更多次。引发与加强之间的时间长度可在约六个月至一年之间变化，但也可使用其他时间范围。
在某些实施方案中，组合物或复制缺陷型病毒载体进一步包含编码共刺激分子的核酸序列。在某些实施方案中，共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。在特定实施方案中，共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。在某些方面，组合物进一步包含位于相同复制缺陷型病毒载体中的编码多个共刺激分子的多个核酸序列。在某些方面，组合物进一步包含位于不同的复制缺陷型病毒载体中的编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
在特定方面，组合物包含复制缺陷型病毒载体，该载体包含编码如本文所述的流感病毒靶抗原的核酸序列，并且进一步包含编码B7、ICAM-1、LFA-3或其组合的一种或多种核酸序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了含有包含靶抗原的复制缺陷型腺病毒载体的组合物，所述载体的剂量为至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过1x1010个VP。在其他实施方案中，本公开内容提供了含有包含靶抗原的复制缺陷型腺病毒载体的组合物，所述载体的剂量为至少1x108个VP但不超过5x1011个VP。在一些实施方案中，本公开内容提供了含有包含靶抗原的复制缺陷型腺病毒载体的组合物，所述载体的剂量为至少1x108个VP但不超过1x1012个VP。在特定实施方案中，本公开内容提供了用于以至少1x108个VP但不超过1x1010个VP的剂量施用复制缺陷型腺病毒载体的方法。在其他实施方案中，本公开内容提供了用于以至少1x108个VP但不超过5x1011个VP的剂量施用复制缺陷型腺病毒载体的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于以至少1x108个VP但不超过1x1012个VP的剂量施用复制缺陷型腺病毒载体的方法。
在进一步的实施方案中，本文所述的疫苗或药物组合物可包含至少、约或至多103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020个病毒颗粒或可从其中衍生的任何数目或范围的病毒颗粒。在特定实施方案中，本文所述的疫苗或药物组合物可包含至少、约或至多109、1010、1011个病毒颗粒或可从其中衍生的任何数目或范围的病毒颗粒。
在某些实施方案中，本文所述的疫苗或药物组合物可以以预定间隔施用，诸如每小时、每天、每周、每两周、每三周、每个月、每两个月、每三个月、每季度、每两个季度、每三个季度、每年或每十年至少、约或至多1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、30次、40次、50次、100次、120次、130次、140次、150次或可从其中衍生的任何间隔或范围。
可以组合上述各个实施方案以提供进一步的实施方案。本说明书中提及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用而整体并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
如果需要使用各个专利、申请和出版物的概念以提供另外的实施方案，则可对实施方案的各个方面进行修改。
可以根据以上的详述描述对实施方案进行这些及其他改变。总之，在以下权利要求中，所使用的术语不应被理解为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，而应被理解为包括所有可能的实施方案连同这样的权利要求所具有的等同项的全部范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。
实施例
通过参考以下实验实施例，进一步详细描述了本发明。除非另有说明，这些实施例仅提供用于说明的目的，而不是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应该被解释为包括因本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实施例1
用于插入至Ad5[E1-,E2b-]载体中的多种流感抗原基因的构建
本实施例描述了用于插入至Ad5[E1-,E2b-]载体中的多种流感抗原基因的构建。为了产生含有多种流感抗原的Ad5[E1-,E2b-]，各个流感抗原基因序列将会被分别衍生自猪捷申病毒-1和明脉扁刺蛾β四体病毒的“自切割”2A肽分隔开(参见图1A)(de Felipe P和Ryan M,Traffic 2004 5(8),616–26；Holst J等人,Nature Immunol.2008 9:658–66；KimJH等人,PloS One,2011 6(4),e18556.doi:10.1371/journal.pone.0018556)。当2A肽在核糖体上翻译时，2A肽的最后两个残基之间的肽键从不形成，从而在一次核糖体通过(pass)时产生区别表达的蛋白质。使用分隔开这三个基因的两个2A肽序列将会导致三种蛋白质的接近化学计量的表达。类似地，可构建含有由单个“自切割”2A肽分隔开的两个抗原基因序列的Ad5[E1-,E2b-]，该2A肽分别衍生自猪捷申病毒-1和明脉扁刺蛾β四体病毒(图1B)。
实施例2
用Ad5[E1-,E2b]-M1/NP/HA细胞感染后流感蛋白的表达
本实施例描述了用Ad5[E1-,E2b]-M1/NP/HA细胞感染后流感蛋白的表达。用含有基质1(M1)蛋白、核蛋白(NP)和血凝素(HA)的Ad5[E1-,E2b]载体感染A549细胞。通过Western印迹确认M1、NP和HA的表达。如图2中所示，含有来自甲型流感的基因插入物的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和基质1(M1)蛋白全部三种的基于Ad5[E1-,E2b-]的平台(Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA)已经被构建并产生。如实施例3和实施例4中所示，该疫苗在诱导HA、NP和M1定向免疫应答的小鼠中具有免疫原性。
实施例3
对Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫的抗体应答
本实施例描述了在用含有M1蛋白、NP蛋白和HA蛋白的Ad5[E1-,E2b-]载体多次免疫后针对流感血凝素(HA)抗原的抗体应答。对每组5只小鼠以每周的间隔进行两次皮下免疫，剂量为1X108、1X109或1X1010个病毒颗粒(VP)的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA。对照小鼠被注射相同剂量的Ad5空壳(空载体)。在最后一次免疫(疫苗接种)后两周从个体小鼠获得血清，并使用定量酶联免疫吸附测定(ELISA)评估抗HA抗体的存在(Gabitzsch ES等人,Cancer Gene Ther.2011 18:326-35)。如图3中所示，抗HA抗体应答在Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫的小鼠中以剂量依赖性方式产生，但未在注射Ad5空壳(空载体)的对照小鼠中产生。
实施例4
对Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫的细胞介导免疫(CMI)应答
本实施例描述了用含有M1蛋白、NP蛋白和HA蛋白的Ad5[E1-,E2b-]载体多次免疫后针对流感抗原的细胞介导免疫(CMI)应答。对每组5只小鼠以每周的间隔进行两次皮下免疫，剂量为1X108、1X109或1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA。对照小鼠被注射相同剂量的Ad5空壳(空载体)。在最后一次免疫(疫苗接种)后两周从个体小鼠获得脾脏，并使用ELISpot测定评估分泌IFN-γ的脾细胞的CMI(Gabitzsch ES等人,Cancer ImmunolImmunother.2010 59:1131-35；Gabitzsch ES等人,Cancer Gene Ther.2011 18:326-35；Jones FR等人,Vaccine 2011 29:7020-26)。如图4中所示，CMI应答在Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫小鼠中产生，但未在注射Ad5空壳(空载体)的对照小鼠中未产生。
实施例5
对Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答
本实施例描述了用含有M1蛋白、NP蛋白和HA蛋白的Ad5[E1-,E2b-]载体多次免疫后针对流感抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。通过用ELISpot测定测量粒酶B分泌来定量CTL应答。
对每组5只小鼠以每周的间隔进行两次皮下免疫，剂量为1X108、1X109或1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA。对照小鼠被注射相同剂量的Ad5空壳(空载体)。在最后一次免疫(疫苗接种)后两周从个体小鼠获得脾脏，并使用ELISpot测定评估分泌粒酶B的脾细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。如图5中所示，CTL应答在Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫小鼠中产生，但未在注射Ad5空壳(空载体)的对照小鼠中未产生。
实施例6
对Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫的CMI应答的时间进程评估
本实施例描述了在用含有M1蛋白、NP蛋白和HA蛋白的Ad5[E1-,E2b-]载体多次免疫后的各个时间点针对流感抗原的细胞介导免疫(CMI)应答。以如下方式用1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫每组小鼠：一次(第1组)、两次，间隔两周(第2组)、两次，间隔一个月(第3组)，和两次，间隔两个月(第4组)。在免疫(疫苗接种)后的各个时间点从个体小鼠获得脾脏，并通过使用ELISpot测定来评估分泌IFN-γ的脾细胞针对NP和HA的CMI应答。如图6中所示，CMI应答总体上在最后一次免疫后的一周时最高，之后下降。
实施例7
含有m1蛋白、NP蛋白和血凝素的Ad5[E1-,E2b-]载体的施用
本实施例描述了在各个时间点注射含有m1蛋白、np蛋白和血凝素的Ad5[E1-,E2b-]载体以产生针对流感血凝素抗原的抗体应答。以如下方式用1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/HA免疫每组小鼠：一次(第1组)、两次，间隔2周(第2组)、两次，间隔1个月(第3组)和两次，间隔2个月(第4组)。在免疫(疫苗接种)后的各个时间点从个体小鼠获得血清，并通过定量ELISA技术评估抗HA抗体的存在。如图7中所示，观察到抗HA抗体应答在免疫后的58至85天达到峰值，之后抗体应答略微降低。
实施例8
对Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA联合免疫的抗体应答
本实施例描述了用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e疫苗和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA疫苗联合免疫后针对甲型流感(InfA)和乙型流感(InfB)抗原的抗体应答。以1x1010个病毒颗粒(VP)的剂量施用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e，并以1x1010个VP的剂量施用Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA。
用下列各项以2周的间隔对5只小鼠的组进行两次免疫：1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]空壳(空载体)，作为阴性对照、1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-甲型流感(InfA)-血凝素(HA)/基质2e(M2e)、1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA，或含有1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e和1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-乙型流感(InfB)-HA的疫苗混合物。在第二次免疫后两周，使用如前所述的定量ELISA来分析来自个体小鼠的血清中针对甲型流感-HA或乙型流感-HA的抗体的存在(Gabitzsch ES等人,Cancer Gene Ther.201118:326-35)。
图8图示了在用Ad5[E1-,E2b-]流感疫苗在小鼠中进行免疫后通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定的血清中的甲型流感HA抗体应答或乙型流感HA抗体应答的定量。图8A图示了甲型流感HA抗体应答的定量。图8B图示了乙型流感HA抗体应答的定量。
针对甲型流感和乙型流感的抗体在用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA的混合物进行疫苗接种的小鼠中检测到，但未在注射Ad5[E1-,E2b-]空壳的对照小鼠中未检测到。这些应答是特异性的，因为单独用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e免疫的小鼠未产生针对乙型流感-HA的抗体，而单独用Ad5[E1-,E2b-]-InfB免疫的小鼠未产生针对甲型流感-HA的抗体。
实施例9
再刺激的脾细胞中细胞介导免疫(CMI)应答的流式细胞术分析
本实施例描述了在来自用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e疫苗和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA疫苗联合免疫的小鼠的脾细胞用流感HA、流感M2、乙型流感HA肽离体再刺激后，细胞介导免疫应答的流式细胞术分析。
用下列各项以2周的间隔对5只小鼠的组进行两次免疫：1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]空壳(空载体)、1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-甲型流感(InfA)-血凝素(HA)/基质2e(M2e)、1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA，或含有1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e和1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-乙型流感(InfB)-HA的疫苗混合物。在第二次免疫后两周，通过流式细胞术分析来自个体小鼠的脾脏的CMI活性，如通过在暴露于特定肽库后表达干扰素γ(IFN-γ)的CD8+T细胞(A)和/或CD4+T细胞(B)所证明的。
图9图示了通过对来自已经用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e疫苗和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA疫苗联合免疫的小鼠的经再刺激的脾细胞中表达IFN-γ的效应T淋巴细胞进行定量所测量的细胞介导免疫应答。图9A图示了表达IFN-γ的CD8+脾细胞的百分比。图9B图示了表达IFN-γ的CD4+脾细胞的百分比。
在疫苗接种Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA的混合物的小鼠中检测到对甲型和乙型流感的CMI应答，但在注射Ad5[E1-,E2b-]空壳的对照小鼠中未检测到CMI应答。尽管观察到针对流感HA抗原的背景应答，但在免疫的小鼠中观察到显著(P<0.05，Mann-Whitney检验)更高的CMI应答。这些应答是特异性的，因为来自疫苗免疫小鼠的T细胞在暴露于培养基或无关抗原(SIV-nef)肽库后未产生CMI应答。
实施例10
再刺激的脾细胞中细胞介导免疫(CMI)应答的ELISpot分析
本实施例描述了在来自用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e疫苗和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA疫苗联合免疫的小鼠的脾细胞用流感HA、流感M2、乙型流感HA肽离体再刺激后，细胞介导免疫应答的ELISpot分析。
用下列各项以2周的间隔对5只小鼠的组进行两次免疫：1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]空壳(空载体)、1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-甲型流感(InfA)-血凝素(HA)/基质2e(M2e)、1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA，或含有1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e和1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]-乙型流感(InfB)-HA的疫苗混合物。在第二次免疫后两周，使用针对暴露于特定肽库后的分泌干扰素γ(IFN-γ)(A)或IL-2(B)的斑点形成细胞(SFC)的ELISpot测定，分析了来自个体小鼠的脾脏的CMI活性。
图10图示了通过对来自已经用Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e疫苗和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA疫苗进行联合免疫的小鼠的分泌细胞因子的经再刺激脾细胞进行定量所测量的细胞介导免疫应答。图10A图示了分泌IFN-γ的脾细胞的定量。图10B图示了分泌IL-2的脾细胞的定量。
在疫苗接种Ad5[E1-,E2b-]-InfA-HA/M2e和Ad5[E1-,E2b-]-InfB-HA的混合物的小鼠中检测到对甲型和乙型流感的CMI应答，但在注射Ad5[E1-,E2b-]空壳的对照小鼠中未检测到CMI应答。这些应答是特异性的，因为来自疫苗免疫的小鼠的脾细胞在暴露于无关抗原(SIV-Nef)肽库后未产生CMI应答。
实施例11
基于Ad5[E1-,E2b-]的流感疫苗的攻击研究
本实施例描述了用基于Ad5[E1-,E2b-]的流感疫苗进行的攻击研究。用1X1010个VP的Ad5[E1-,E2b-]空壳(空载体)或用含有1X1010个VP的如本申请图1B中构建的Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/InfA-HA的疫苗以2周的间隔对10只小鼠的组进行两次免疫。在第二次免疫后三十天，用H1N1流感病毒株(甲型流感株/California/07/2009)攻击小鼠并评估攻击后的存活率。
图11图示了在60天的时间段内，与对照(空壳)疫苗相比，用Ad5[E1-,E2b-]-M1/NP/InfA-HA疫苗免疫的小鼠中的攻击研究的存活率曲线。
与经历仅20％存活率的注射Ad5[E1-,E2b-]空壳的对照小鼠相比，接种疫苗的小鼠被提供了免受病毒攻击的完全保护，并且该差异是显著的(Log Rank Mantel-Cox检验，P＝0.0003)。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言将显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。意在用以下权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
Claims (84)
1.一种组合物，其包含：
在E2b基因区中包含缺失的复制缺陷型腺病毒载体；以及
编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸序列。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述甲型流感靶抗原是甲型流感病毒的靶抗原。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述甲型流感靶抗原和所述乙型流感靶抗原是甲型流感病毒和乙型流感病毒共同的靶抗原。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E1区中包含缺失。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E3区中包含缺失。
6.如权利要求4所述的组合物，其中所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E4区中包含缺失。
7.如权利要求4所述的组合物，其中所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E3和E4区中包含缺失。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述甲型流感靶抗原包括选自H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7及其组合的病毒的抗原。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述乙型流感靶抗原包括选自乙型流感/山形株病毒和乙型流感/维多利亚株病毒的病毒的抗原。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述甲型流感靶抗原是来自蛋白质的抗原，所述蛋白质选自基质蛋白M2、基质蛋白M2的M2e部分、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白M1及其组合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述乙型流感靶抗原是来自蛋白质的抗原，所述蛋白质选自BM2蛋白、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白及其组合。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述缺失包含碱基对。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述缺失包含至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个或至少150个碱基对。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述缺失包含多于150个、多于160个、多于170个、多于180个、多于190个、多于200个、多于250个或多于300个碱基对。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种甲型流感靶抗原的核酸。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体包含编码多种甲型流感靶抗原的核酸。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种乙型流感靶抗原的核酸。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体包含编码多种乙型流感靶抗原的核酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体进一步包含增加所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者的表达的元件。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述元件包括至少1种元件、至少2种元件、至少3种元件、至少4种元件或至少5种元件。
21.如权利要求19或20所述的组合物，其中所述元件包括内部核糖体结合位点。
22.如权利要求19或20所述的组合物，其中所述元件包括组成型启动子。
23.如权利要求19或20所述的组合物，其中所述元件包括诱导型启动子。
24.如权利要求19或20所述的组合物，其中所述元件包括转录增强子。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述转录增强子是劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子。
26.如权利要求19-25中任一项所述的组合物，其中所述元件不含回文序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体进一步包含编码增加所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者的免疫原性的蛋白质的核酸序列。
28.如权利要求1-27中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体不是无内容载体。
29.如权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中所述组合物或所述复制缺陷型腺病毒载体进一步包含编码共刺激分子的核酸序列。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。
31.如权利要求30或31所述的组合物，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。
32.如权利要求1-31中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体包含所述编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过5x1011个VP。
34.如权利要求1-32中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过1x1012个病毒颗粒VP。
35.一种在有需要的个体中产生针对甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的免疫应答的方法，包括向所述个体施用根据权利要求1-34中任一项所述的组合物。
36.一种在个体中产生针对甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的免疫应答的方法，包括向所述个体施用第一腺病毒载体，所述第一腺病毒载体包含：
复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和
编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸；向所述个体施用第二腺病毒载体，所述第二腺病毒载体包含：
(a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和
(b)编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸；从而产生针对一种或多种甲型和乙型流感靶抗原的免疫应答。
37.一种在个体中产生针对甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的免疫应答的方法，其包括：
(a)向所述个体施用第一载体，所述第一载体包含：
(i)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和
(ii)编码第一甲型流感靶抗原和第一乙型流感靶抗原的核酸；以及
(b)随后向所述个体施用第二载体，所述第二载体包含：
(i)步骤(a)的所述复制缺陷型腺病毒载体，和
(ii)编码第二甲型流感靶抗原和第二乙型流感靶抗原的核酸，其中所述第二载体的所述第二甲型流感靶抗原与所述第一载体的所述第一甲型流感靶抗原相同或不同，并且其中所述第二载体的所述第二乙型流感靶抗原与所述第一载体的所述第一乙型流感靶抗原相同或不同；从而产生针对所述第一靶抗原和所述第二靶抗原的免疫应答。
38.一种在个体中产生针对甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的免疫应答的方法，包括：向所述个体施用包含复制缺陷型腺病毒载体和编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸的腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失；以及向所述个体重新施用所述腺病毒载体至少一次；从而产生针对所述甲型和乙型流感靶抗原的免疫应答。
39.一种构建通用流感疫苗载体的方法，包括将编码甲型流感靶抗原和乙型流感靶抗原的核酸插入复制缺陷型腺病毒载体中，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原包括选自H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7及其组合的病毒的抗原。
41.如权利要求36-40中任一项所述的方法，其中所述乙型流感靶抗原包括选自乙型流感/山形株病毒和乙型流感/维多利亚株病毒的病毒的抗原。
42.如权利要求36-41中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原是来自蛋白质的抗原，所述蛋白质选自基质蛋白M2、基质蛋白M2的M2e部分、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白M1及其组合。
43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述乙型流感靶抗原是来自蛋白质的抗原，所述蛋白质选自BM2蛋白、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白及其组合。
44.如权利要求36-43中任一项所述的方法，其中所述个体对腺病毒具有预先存在的免疫力。
45.如权利要求36-44中任一项所述的方法，其中所述腺病毒载体不是无内容载体。
46.如权利要求36-45中任一项所述的方法，其中第一载体不是无内容载体。
47.如权利要求36-46中任一项所述的方法，其中第二载体不是无内容载体。
48.如权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述第一和第二腺病毒载体不是无内容载体。
49.如权利要求36-48中任一项所述的方法，其中所述个体对5型腺病毒具有预先存在的免疫力。
50.如权利要求36-49中任一项所述的方法，其中所述第一和第二载体的所述第一和第二靶抗原衍生自相同的感染性生物体。
51.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中所述第一和第二载体的所述第一和第二靶抗原衍生自不同的感染性生物体。
52.如权利要求36-51中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原和所述乙型流感靶抗原是不同的靶抗原。
53.如权利要求36-52中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原是甲型流感病毒的靶抗原。
54.如权利要求36-53中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原和所述乙型流感靶抗原是甲型流感病毒和乙型流感病毒共同的靶抗原。
55.如权利要求36-54中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E1区中包含缺失。
56.如权利要求36-55中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E3区中包含缺失。
57.如权利要求36-56中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E4区中包含缺失。
58.如权利要求36-57中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型腺病毒载体进一步在E3和E4区中包含缺失。
59.如权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所述缺失包含碱基对。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述缺失包含至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个或至少150个碱基对。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述缺失包含多于150个、多于160个、多于170个、多于180个、多于190个、多于200个、多于250个或多于300个碱基对。
62.如权利要求36-61中任一项所述的方法，其中所述腺病毒载体包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种甲型和乙型流感靶抗原的核酸序列。
63.如权利要求36-62中任一项所述的方法，其中所述腺病毒载体进一步包含增加所述甲型流感和乙型流感靶抗原的表达的元件。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述元件包括至少1种元件、至少2种元件、至少3种元件、至少4种元件或至少5种元件。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述元件包括内部核糖体结合位点。
66.如权利要求63所述的方法，其中所述元件包括组成型启动子。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述元件包括诱导型启动子。
68.如权利要求63所述的方法，其中所述元件包括转录增强子。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述转录增强子是劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子。
70.如权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述元件不含回文序列。
71.如权利要求36-70中任一项所述的方法，其中所述腺病毒载体进一步包含编码增加所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者的免疫原性的多肽的核酸序列。
72.如权利要求36-71中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原包括M，且所述乙型流感靶抗原包括BM2。
73.如权利要求36-72中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者包括血凝素。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述血凝素包含HA1结构域。
75.如权利要求73所述的方法，其中此处的所述血凝素包含HA2结构域。
76.如权利要求73所述的方法，其中此处的所述血凝素包含柄结构域。
77.如权利要求36-76中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者包括神经氨酸酶。
78.如权利要求36-77中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者包括核蛋白(NP)。
79.如权利要求36-78中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原包括基质蛋白M1。
80.如权利要求36-79中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原包括基质蛋白M2。
81.如权利要求36-80中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原包括基质蛋白M2e。
82.如权利要求36-81中任一项所述的方法，其中所述甲型流感靶抗原、所述乙型流感靶抗原或两者由与编码BM2蛋白、血凝素、血凝素柄、神经氨酸酶、核蛋白、基质蛋白M1、基质蛋白M2或其任意组合的序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.5％或100％的序列同一性的核酸序列编码。
83.如权利要求36-82中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过5x1011个VP。
84.如权利要求36-82中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用至少1x108个病毒颗粒(VP)但不超过1x1012个病毒颗粒VP。
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