CN101877965B - 针对流感病毒的多种亚型的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个方面涉及能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗，包含DNA质粒和药学上可接受的赋形剂。所述DNA质粒能够在所述哺乳动物的细胞中以有效引发所述哺乳动物中免疫反应的量表达共有流感抗原，其中所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它们的组合。所述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子。另外，本发明的一个方面包括使用提供的DNA质粒疫苗在哺乳动物中引发针对多种流感病毒亚型的免疫反应的方法。

Description

针对流感病毒的多种亚型的疫苗
相关申请的交叉引用 
本申请要求享有于1997年11月12日提交的美国临时申请号60/987,284的权益，其内容通过引用并入本文。 
发明领域
本发明涉及改进的流感疫苗、改进的用于诱导针对流感的免疫反应和用于预防性地和/或治疗性地针对流感免疫个体的方法。 
背景 
已研究接种针对动物和人类疾病的核酸序列的使用。研究已集中于有效力和有效率的递送手段以产生期望抗原的必要表达，产生免疫原性反应和最后这项技术的成功。一种用于递送核酸序列例如质粒DNA的方法是电穿孔（EP）技术。该技术已被用于人临床试验以递送抗癌药物例如博来霉素并用于对大量动物物种的许多临床前研究中。 
流感病毒基因组包含在编码十一种蛋白（HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2）的八个单（非成对的）RNA链上。基因组的分段性质允许不同病毒菌株的全部基因在细胞共居过程中交换。八个RNA区段是：HA，它编码血球凝集素（需要大约500个血球凝集素分子组成一个病毒粒子）；NA，它编码神经氨酸酶（需要大约100个神经氨酸酶分子组成一个病毒粒子）；NP，它编码核蛋白；M，它通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框来编码两种基质蛋白（M1和M2）（需要大约3000个基质蛋白分子组成一个病毒粒子）；NS，它通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框来编码两种不同的非结构蛋白（NS1和NEP）；PA， 它编码RNA聚合酶；PB1，它通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框来编码RNA聚合物和PB1-F2蛋白(诱导凋亡)；以及PB2，它编码RNA聚合酶。 
流感病毒血球凝集素(HA)在流感病毒粒子的表面表达并且负责该病毒与其宿主细胞之间的最初接触。HA是一种公知的免疫原。甲型流感菌株H5N1为一种禽流感菌株，因其HA蛋白(H5)而特别地威胁人类种群，如果通过自然突变稍微遗传重配，它相比于病毒的其他菌株具有大大提高的对人类细胞的传染性。婴儿和老人或无免疫应答的成人感染病毒H5N1菌株通常与差的临床结果相关联。因此，公众非常需要针对流感H5N1菌株的保护。 
有两类可利用的抗流感剂，甲型流感细胞进入/脱壳抑制剂(例如抗病毒药金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(例如抗病毒药奥塞米韦、扎那米韦)。这些抗病毒剂抑制甲型和乙型流感病毒的细胞释放。由于对这些药剂有抵抗力的病毒菌株的发现，已报道了对使用这些药剂的忧虑。 
流感疫苗是流行性季节性疫苗，许多人经历过此类接种。然而，接种的保护结果是有限的，因为疫苗对某些病毒亚型是特异性的。疾病控制与预防中心推进用“流感针(flu shot)”接种，所述流感针是包含三种流感病毒(灭活病毒)的疫苗：一种甲型(H3N2)病毒、一种甲型(H1N1)病毒和一种乙型病毒。每年他们还基于国际监督和科学家对于在给定年中病毒的哪种型和菌株将流行的估测来报道在该疫苗中的病毒改变。因此，很明显接种疫苗受限于亚型的预测和针对那种亚型的特定疫苗的可用性。 
对于经济的和在许多亚型都有效的有效流感疫苗仍存有需求。此外，为了在预防上或治疗上提供针对流感的免疫，对于向哺乳动物施用DNA疫苗的有效方法存有需求。 
发明概述 
本发明的一个方面涉及能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗，包含DNA质粒和药学上可接受的赋形剂。所述DNA质粒能够在哺乳动物的细胞中以有效引发哺乳动物中免疫反应 的量表达共有流感抗原，其中所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它们的组合。所述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子。优选地，所述DNA质粒疫苗是具有1mg/ml或更大的总DNA质粒浓度的疫苗。 
本发明的另一方面涉及能够在哺乳动物细胞中表达共有流感抗原的DNA质粒，所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它们的组合。所述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子。 
本发明的另一方面涉及在哺乳动物中引发针对多种流感病毒亚型的免疫反应的方法。所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗并且用有效允许DNA质粒进入细胞的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔，所述DNA质粒疫苗包括能够在哺乳动物的细胞中表达共有流感抗原以引发在哺乳动物中的免疫反应的DNA质粒，所述共有流感抗原包括共有的HA、NA、M2e-NP或它们的组合。 
附图简述 
通过参考附图本领域的技术人员可以更好地理解本发明的许多目的和优点，其中： 
图1展示了本文所述研究中使用的DNA质粒构建体的示意图(质粒图谱)。通过分析来自16种H5病毒和超过40种人类N1病毒(美国洛斯阿拉莫斯国家实验室流感病毒序列数据库)的主要病毒序列产生了共有HA、NA和M2e-NP的构建体，所述16种H5病毒最近几年中已被证明对人具有致死性。在产生共有序列之后，对所述构建体进行优化用于哺乳动物表达，包括加入Kozak序列、密码子优化和RNA优化。然后将这些构建体亚克隆到pVAX载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。示出了质粒 pGX2001(共有HA)、pGX2002(共有NA)、pGX2003(共有M2e-NP)。所展示的质粒pCMVSEAP编码报告蛋白分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。 
图2展示了在注射后第35天猪血清HI滴度的结果的条形图。在施用了2mg表达HA的质粒、以0.5A的电流设置的组中发现最高滴度(120±40；*P＝0.11相对于2mg/0.3A和*P＝0.02相对于2mg/0.1A)。施用递减剂量质粒并以0.5A电穿孔的三组也表现出递减的HI滴度。 
图3展示了IFN-γ的酶联免疫斑点计数的条形图。计数在施用2mg的HA和2mg的NA质粒疫苗(总计4mg质粒)并以0.3A的电流电穿孔的猪中(2000个斑点)以及在施用0.8mg的HA和0.8mg的NA质粒疫苗(总计1.6mg质粒)并以0.5A的电流电穿孔的组中(934个斑点)是最高的。出于比较的目的，描绘了未免疫的对照组的细胞免疫反应。 
图4A和4B展示了示出来自第14天和第35天处理的猪的肌肉活组织检查的结果的条形图：图4A展示了示出所有组的平均病理学得分的条形图。图4B展示了示出肌肉坏死和纤维化的得分的条形图。以6mg的总质粒注射并且在0.5A电穿孔的组显示出最高的平均病理学得分(相比于对照 *P＜0.0002)。除了0.3mg/0.3A组(P＝0.057)和2.4mg/0.1A组(P＝1.0)之外在所有组中第35天相比于第14天的病理学得分均显著降低(P＜0.05)。 
图5展示了在以H5N1病毒(甲型/越南/1203/2004(H5N1)/PR8-IBCDC-RG)攻击后雪貂体重的变化百分比。在攻击后9天的时间内，以HA、HA+M2e-NP或HA+M2e-NP+NA接种的雪貂损失的体重显著小于对照动物(相对于对照*P＜0.005)。HA疫苗组中一只动物实际上在攻击后增加了体重。 
图6展示了示出在攻击后9天期间的雪貂体温的图。对照动物显示比接种动物体温更高。没有描绘第5天的体温，因为它是在那天的不同时间测量的，并且不论哪组所有温度都更低。 
图7展示了来自雪貂接种后HI滴度结果的条形图；使用从疾病控制中心获得的重配病毒进行测定：甲型/越南/1203/04或印度尼西亚/05/2005流感菌株。 
图8展示了来自第二次免疫后三周测量的HI滴度的结果的条形图。皮内(ID)免疫仅接着电穿孔(EP)的猕猴示出比所有其他组显著更高的HI滴度(P＜0.03)。无处理的对照没有显示出任何HI滴度。 
优选实施方案的详细描述 
给出下述简略或简短的定义以帮助理解本发明的优选实施方案。这里所给出的简略的定义绝不是穷举性的，它们与本领域理解的定义或字典含义也绝不矛盾。在这里给出简略的定义是为了补充或更清晰地界定本领域中已知的定义。 
定义 
如本文使用的核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和Gapped BLAST(Altschul等人，Nuc.Acids Res.，1997，25，3389，其以全文通过引用并入本文)以及PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford，SinauerAssociates，Massachusetts)确定。简言之，BLAST算法代表基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)，它适合于确定序列相似性(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410，其以全文通过引用并入本文)。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公共可利用的。由BLAST算法提供的一个相似性量度是最小和概率(P(N))法，它提供了在两条核苷酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如，如果在测验核酸与另一种核酸的比较中最小和概率小于大约1、优选地小于大约0.1、更优选地小于大约0.01、以及最优选地小于大约0.001，那么认为该核酸与所述另一种核酸是相似的。可使用PAUP*4.0b10软件(D.L.Swofford，Sinauer Associates，Massachusetts)计算“相似性的百分比”。计算出与系统进化树中的所有序列相比共有序列的平均相似性。 
如本文使用的术语“基因构建体”或“核酸构建体”可被互换使用并且都是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列或“编码核酸序列”包括可操作地与调控元件连接的起始信号和终止信号，所述调控 元件包括能够在施用了所述核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。 
如本文使用的术语“可表达的形式”是指包含必要调控元件的核酸构建体，所述调控元件与编码蛋白的编码序列可操作的连接以使得当所述编码序列存在于个体的细胞中时将被表达。 
本文使用术语“恒定电流”来定义由组织或界定所述组织的细胞在递送到相同组织的电脉冲的持续期间所接受或经历的电流。所述电脉冲是从本文所述的电穿孔装置中递送的。这种电流在电脉冲的存在期在所述组织中保持恒定安培数，因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。所述反馈元件能够测量整个脉冲持续期间组织(或细胞)的阻抗并引起电穿孔装置改变其电能输出(例如增加电压)，所以相同组织中的电流在整个电脉冲(微妙数量级)以及从脉冲到脉冲中保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。 
术语“反馈”或“电流反馈”可被互换使用并且表示所提供的电穿孔装置的主动反应，所述反应包括测量在电极之间的组织中的电流并且因此改变由EP装置递送的能量输出以保持电流在恒定水平。这个恒定水平是由使用者在脉冲序列或电处理开始之前预先设定。优选地，反馈是由电穿孔装置的电穿孔部件例如控制器完成的，因为其中的电路能够连续地监测在电极之间的组织中的电流并将被监测的电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较，并且能够连续地进行能量输出调整以保持监测的电流在预设水平。在一些实施方案中，所述反馈环路是瞬时的，因为它是类似物闭合环路反馈。 
如本文可互换使用的术语“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)是指使用跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观途径(孔)；这些微观途径的存在允许生物分子例如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过到另一侧。 
本文使用术语“分散电流”来定义从本文所述的电穿孔装置的各个针电极阵列中递送的电流模式，其中所述模式使得在被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关的热应激的发生减到最小或者优选地将其消除。 
如本文使用的术语“反馈机制”是指通过软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收期望组织的阻抗(在递送能量脉冲之前、期间中和/或之后)并将其与现值(优选地是当前值)进行比较，并且调整递送的能量脉冲以达到预设值。当讨论反馈机制时术语“阻抗”被本文使用并且能够根据欧姆定律被转换为电流值，由此能够与预设电流比较。在一个优选的实施方案中，“反馈机制”是通过类似物闭合环路执行的。 
本文使用术语“免疫反应”来表示宿主的免疫系统例如哺乳动物的免疫系统的激活，作为对通过所提供的DNA质粒疫苗引入流感共有抗原的反应。免疫反应可以是细胞反应或体液反应的形式或二者兼有。 
本文使用术语“共有”或“共有序列”来表示基于特定流感抗原的多个亚型的比对的分析而构建的合成的核酸序列或对应的多肽序列，其可被用来诱导针对特定流感抗原的多个亚型或血清型的广泛的免疫性。共有流感抗原包括HA(包括共有的H1、H2、H3或H5)、NA、NP、基质蛋白和非结构蛋白。同样，可将合成的抗原例如融合蛋白(例如M2e-NP)操作为共有序列(或共有抗原)。 
本文使用术语“佐剂”来表示加到本文所述的DNA质粒疫苗中以增强由所述DNA质粒和下文所述的编码核酸序列所编码的流感抗原的抗原性的任何分子。 
术语“亚型”或“血清型”可被本文互换使用并且是关于流感病毒，表示流感病毒抗原的遗传变体以致于一个亚型被免疫系统识别以区别于一个不同的亚型(或者换句话说，每个亚型与不同亚型在抗原特征上是不同的)。 
在一些实施方案中，具有能够在哺乳动物细胞中表达共有流感抗原的DNA质粒，所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它们的组合。DNA质粒包含与编码共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子。 
在一些实施方案中，本发明提供了能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗，所述DNA质粒疫苗包含DNA 质粒和药学上可接受的赋形剂。所述DNA质粒能够以有效引发该哺乳动物中免疫反应的量在哺乳动物细胞中表达共有流感抗原，其中所述共有流感抗原包括共有的血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)或它们的组合。优选地，所述共有流感抗原包括HA、NA、M2e-NP或它们的组合。所述DNA质粒包含与编码所述共有流感抗原的编码序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述DNA质粒疫苗是具有1mg/ml或更大的总DNA质粒浓度的疫苗。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或二者兼有；优选地，所述免疫反应是细胞和体液二者兼有。 
在一些实施方案中，DNA质粒能够还包括与编码序列的N端末端相连并与启动子可操作地连接的IgG前导序列。此外，在一些实施方案中，DNA质粒能够还包括与编码序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，DNA质粒是密码子优化的。 
在本发明的一些实施方案中，DNA质粒疫苗能够还包括佐剂。在一些实施方案中，佐剂选自以下组成的组：α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括具有被删除信号序列的IL-15并任选地包括来自IgE的信号肽。可能是有用的佐剂的其他基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-1α、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、 TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及它们的功能片段。在一些优选的实施方案中，佐剂选自IL-12、IL-15、CTACK、TECK或MEC。 
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是转染促进剂，它可包括以下转染促进剂：表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物；小囊泡(vesicle)例如角鲨烯和菠菜烯(squalene and squalene)；透明质酸；脂质；脂质体；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子；或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子、包括聚L谷氨酸(LGS)或脂质。优选地，转染促进剂是聚L谷氨酸，并且更优选地，聚L谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于DNA质粒疫苗中。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗中聚L谷氨酸的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。 
在一些实施方案中，DNA质粒疫苗可包括多种不同的DNA质粒。在一些实施例中，不同的DNA质粒包括含有编码共有HA的核酸序列的DNA质粒、含有编码共有NA的序列的DNA质粒和含有编码共有M2e-NP的序列的DNA质粒。在一些实施方案中，共有HA是共有H1、共有H2、共有H3或共有H5。优选地，共有HA是核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：1(H5N1HA共有DNA)、SEQ ID NO：9(共有H1的DNA)、SEQID NO：11(共有H3的DNA)或SEQ ID NO：13(共有H5)。共有HA还可以是对序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的多肽进行编码的核苷酸序列。在一些实施方案中，共有NA是为SEQ IDNO：3的核苷酸序列或对序列SEQ ID NO：4的多肽进行编码的核苷酸序列。在一些实施方案中，共有M2e-NP是为SEQ ID NO：7的核苷酸序列或对序列SEQ ID NO：8的多肽进行编码的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，DNA质粒疫苗包括包含编码共有H1的序列的DNA质粒、包含编码共有H2的序列的DNA质粒、包含编码共有H3的序列的DNA质粒、 包含编码共有H5的序列的DNA质粒、包含编码共有NA的序列的DNA质粒和包含编码共有M2e-NP的序列的DNA质粒。 
在一些实施方案中，DNA质粒疫苗可包括多种不同的DNA质粒，所述DNA质粒包括能够表达共有流感抗原的至少一种DNA质粒和能够表达一种流感亚型抗原的至少一种DNA质粒。在一些实施例中，表达共有抗原的不同的DNA质粒包括含有编码共有HA的核酸序列的DNA质粒、含有编码共有NA的序列的DNA质粒和含有编码共有M2e-NP的序列的DNA质粒。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗包括能够表达共有HA抗原例如共有的H1、H3或H5的DNA质粒和能够表达以下甲型流感抗原中的任何一种的DNA质粒：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、NS1或NEP，或其组合。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗包括能够表达共有NA抗原的DNA质粒和能够表达以下甲型流感抗原的任一种的DNA质粒：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、NS1或NEP，或其组合。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗包括能够表达共有M2e-NP的DNA质粒和能够表达以下甲型流感抗原中的任何一种的DNA质粒：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、NP、M1、M2、NS1或NEP，或其组合。 
在一些实施方案中，可以将DNA质粒疫苗递送给哺乳动物以引发免疫反应；优选地，哺乳动物是灵长类动物，包括人类和非人类的灵长类动物、牛、猪、鸡、狗或雪貂。更优选地，哺乳动物是人类灵长类动物。 
本发明的一个方面涉及在哺乳动物中引发针对多种流感病毒亚型的免疫反应的方法。所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗并且用有效允许DNA质粒进入细胞的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔，所述DNA质粒疫苗包括能够在哺乳动物的细胞中表达共有流感抗原以引发在哺乳动物中的免疫反应的DNA质粒，所述共有流感 抗原包括共有的HA、NA、M2e-NP或它们的组合。 
在一些实施方案中，本发明的方法包括递送步骤，所述递送步骤包括将DNA质粒疫苗注射到皮内、皮下或肌肉组织中。优选地，这些方法包括使用体内电穿孔装置来预先设定期望被递送到组织的电流；并且以等于预设电流的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔。在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括：测量电穿孔的细胞中的阻抗；相对于测量的阻抗调整能量脉冲的能量水平以保持电穿孔细胞中的恒定电流；其中测量和调整步骤发生在能量脉冲的存在期内。 
在一些实施方案中，电穿孔步骤包括根据以分散模式递送能量脉冲的脉冲序列模式将能量脉冲递送至多个电极。 
在一些实施方案中，本发明的DNA质粒流感疫苗包括编码共有HA或共有HA的核苷酸序列和编码选自以下组成的组的流感蛋白的核酸序列：SEQ ID NO：4、6和8。SEQ ID NO：1和13分别包括编码流感病毒的共有H5N1 HA和H5的核酸序列。SEQ ID NO：2和14分别包括流感病毒的共有H5N1 HA和H5的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。SEQ ID NO：3包含编码流感H1N1和H5N1(H1N1/H5N1)的NA共有序列的核酸序列。SEQ ID NO：4包含流感H1N1/H5N1的NA共有序列的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。SEQ ID NO：5包含编码流感H1N1/H5N1的M1共有序列的核酸序列。SEQ ID NO：6包含流感H1N1/H5N1的M1共有序列的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。SEQ ID NO：7包含编码流感H5N1的M2E-NP共有序列的核酸序列。SEQ ID NO：8包含流感H5N1的M2E-NP共有序列的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。SEQ ID NO：9包含编码流感H1N1的HA共有序列的核酸序列。SEQ ID NO：4包含流感H1N1的NA共有序列的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。SEQ ID NO：11包含编码流感H3N1的HA共有序列的核酸序列。SEQ ID NO：12包含流感H3N1的HA 共有序列的氨基酸序列。流感病毒菌株H5N1的HA共有序列包括SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：13中列出的免疫优势表位。由SEQ ID NO：1编码的流感病毒H5N1的HA氨基酸序列是SEQ ID NO：2并且由SEQ ID NO：13编码的流感病毒H5N1的HA氨基酸序列是SEQ ID NO：14。流感病毒H1N1/H5N1的NA共有序列包括SEQ ID NO：3中列出的免疫优势表位。由SEQ ID NO：3编码的流感病毒菌株H1N1/H5N1的NA氨基酸序列是SEQ ID NO：4。流感病毒菌株H1N1/H5N1的M1共有序列包括SEQ IDNO：5中列出的免疫优势表位。由SEQ ID NO：5编码的流感病毒H1N1/H5N1的M1氨基酸序列是SEQ ID NO：6。流感病毒H5N1的M2E-NP共有序列包括SEQ ID NO：7中列出的免疫优势表位。由SEQ ID NO：7编码的流感病毒H5N1的M2E-NP氨基酸序列是SEQ ID NO：8。本发明的疫苗可包括由以上定义核酸分子所编码的蛋白质产物或任何的蛋白质片段。 
本发明还包括编码能够在哺乳动物中引发免疫反应的多肽的DNA片段，所述免疫反应基本上类似于至少一种流感亚型的非片段的免疫反应。当所述DNA片段应用于本文提供的特定编码核酸序列时，它是选自于本发明的各种编码核苷酸序列的至少一种的片段，包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11和13，并且可以是以下所述DNA片段中的任一种。在一些实施方案中，DNA片段可包含30个或更多、45个或更多、60个或更多、75个或更多、90个或更多、120个或更多、150个或更多、180个或更多、210个或更多、240个或更多、270个或更多、300个或更多、360个或更多、420个或更多、480个或更多、540个或更多、600个或更多、660个或更多、720个或更多、780个或更多、840个或更多、900个或更多、960个或更多、1020个或更多、1080个或更多、1140个或更多、1200个或更多、1260个或更多、1320个或更多、1380个或更多、1440个或更多、1500个或更多、1560个或更多、1620个或更多、1680个或更多或者1740个或更多的核苷酸。在一些实施方案中，DNA片段可包括免疫球蛋白E(IgE)前导序列的编码序列。在一些实施方案中，DNA片段可包括少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少于540、少于600、少于660、少于720、少于780、少于840、少于900、少于960、少于1020、 少于1080、少于1140、少于1200、少于1260、少于1320、少于1380、少于1440、少于1500、少于1560、少于1620、少于1680或者少于1740个核苷酸。优选地，DNA片段是SEQ ID NO：1、3、7、9、11或13的片段，并且更优选地是SEQ ID NO：1、5、9、11或13的片段，并且甚至更优选地是SEQ ID NOS：1、9或13的片段。 
本发明还包括能够在哺乳动物中引发免疫反应的多肽片段，所述免疫反应基本上类似于至少一种流感亚型的非片段的免疫反应。当所述多肽片段应用于本文提供的特定多肽序列时，它们选自于本发明的各种多肽序列的至少一种，包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12和14，并且可以是以下所述多肽片段中的任一种。在一些实施方案中，多肽片段可包括15个或更多、30个或更多、45个或更多、60个或更多、75个或更多、90个或更多、105个或更多、120个或更多、150个或更多、180个或更多、210个或更多、240个或更多、270个或更多、300个或更多、360个或更多、420个或更多、480个或更多、540个或更多或者565个或更多的氨基酸。在一些实施方案中，多肽片段可包括少于30、少于45、少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少于540或者少于565个氨基酸。优选地，多肽片段是SEQ ID NO：2、4、8、10、12或14的片段，并且更优选地是SEQ ID NO：2、6、10、12或14的片段，并且甚至更优选地是SEQ ID NOS：2、10或14的片段。 
在哺乳动物中引发基本上类似于至少一种流感亚型的非片段的免疫反应的免疫反应的片段的确定，可容易地由本领域普通技术人员确定。如由公共可利用的数据库例如美国洛斯阿拉莫斯国家实验室流感病毒序列数据库所提供的，可分析所述片段以包含至少一个、优选地更多个抗原表位。此外，可使用小鼠和HI滴度以及酶联免疫斑点分析常规地评估免疫反应研究，例如在下文实施例中所示。 
根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫反应的方法包括向所述哺乳动物施用：a)流感菌株H5N1共有HA蛋白、其功能片段或其可表达的编码序列；和b)一种或多种本文所提 供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子编码的蛋白或其片段。 
根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫反应的方法包括向所述哺乳动物施用：a)流感菌株H1N1和流感菌株H5N1共有NA蛋白、其功能片段或其可表达的编码序列；和b)一种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子编码的蛋白或其片段。 
根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫反应的方法包括向所述哺乳动物施用：a)流感菌株H1N1和流感菌株H5N1共有M1蛋白、其功能片段或其可表达的编码序列；和b)一种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子编码的蛋白或其片段。 
根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫反应的方法包括向所述哺乳动物施用：a)流感菌株H5N1的M2E-NP共有蛋白、其功能片段或其可表达的编码序列；和b)一种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子编码的蛋白或其片段。 
根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫反应的方法包括向所述哺乳动物施用：a)流感菌株H1N1的HA共有蛋白、其功能片段或其可表达的编码序列；和b)一种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子编码的蛋白或其片段。 
根据本发明的一些实施方案，在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫反应的方法包括向所述哺乳动物施用：a)流感菌株H3N1的HA共有蛋白、其功能片段或其可表达的编码序列；和b)一种或多种本文所提供的分离的编码核酸分子、由此类核酸分子编码的蛋白或其片段。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗包括以下序列的至少两种：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或者上述名单中的两种或多种序列的任何组合。 
疫苗 
在一些实施方案中，本发明通过提供蛋白和编码具有如下表位的蛋白的基因构建体而提供了改进的疫苗：所述表位使得蛋白作为免疫原是特别有效的，针对所述免疫原免疫反应可被诱导。因此，可提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫反应。 
根据本发明的一些实施方案，将根据本发明的疫苗递送给个体来调节个体免疫系统的活性并由此增强免疫反应。当编码所述蛋白的核酸分子被所述个体的细胞摄取时，所述核苷酸序列在细胞中被表达并且所述蛋白由此被递送给个体。本发明的各方面提供了在核酸分子例如质粒上递送蛋白的编码序列的方法。 
根据本发明的某些方面，提供了预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。 
当被细胞摄取时，DNA质粒能够作为分离的遗传物质留在细胞中。可替代地，RNA可被施用至细胞。还可虑提供作为线性微小染色体的基因构建体，包括着丝粒、端粒和复制起点。基因构建体包括核酸分子的基因表达必需的调控元件。所述元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，增强子通常为编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达所需。有必要将这些元件与编码期望蛋白的序列可操作地连接并且调节元件可操作地处于它们被施用的个体中。 
一般认为起始密码子和终止密码子是编码期望蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，有必要的是这些元件在施用核酸构建体的哺乳动物中是有功能的。起始密码子和终止密码子必须与编码序列处于框内。 
所使用的启动子和聚腺苷酸化信号必须是在个体细胞中有功能的。 
实施本发明尤其是在人基因疫苗的生产中有用的启动子的实例包括但不限于：来自猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)的启动子、莫洛尼(Moloney)病毒、禽白血病病毒(ALV)、巨细胞病毒 (CMV)例如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及来自人类基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白(metalothionein)的启动子；在其他实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然的或合成的。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开号US20040175727中，其以全文由此并入本文。 
实施本发明尤其是在人基因疫苗的生产中有用的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于：SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。具体而言，可使用pCEP4质粒(Invitrogen，SanDiego，CA)中的SV40聚腺苷酸化信号，称为SV40聚腺苷酸化信号。 
除了DNA表达所需的调控元件之外，其他元件也可以被包括在DNA分子中。此类另外的元件包括增强子。增强子可选自于包括但不限于以下的组：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子例如来自CMV、RSV和EBV的增强子。 
基因构建体可以被提供哺乳动物复制起点以便使构建体保持在染色体外并且在细胞中产生构建体的多个拷贝。来自Invitrogen(San Diego，CA)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4包含EB病毒的复制起点和产生高拷贝的未整合附加型复制的核抗原EBNA-1编码区。 
为了使蛋白的产生达到最大，可选择如下调控序列：很好地适合于在构建体被施入的细胞中的基因表达。此外，可选择如下编码所述蛋白的密码子：在所述宿主细胞中被最有效率地转录。本领域普通技术人员可生产在细胞中有功能的DNA构建体。 
在一些实施方案中，可提供如下核酸构建体：其中本文所述蛋白的编码序列与IgE信号肽相连。在一些实施方案中，本文所述的蛋白与IgE信号肽相连。 
在使用蛋白的一些实施方案中，例如，本领域普通技术人员可使用公知技术生产并使用公知技术分离本发明的蛋白。在使用蛋白的一些实施方案中，例如，本领域普通技术人员可使用公知技术将编码本发明的蛋白的 DNA分子插入到在公知表达系统中使用的可商购获得的表达载体中。例如，可商购获得的质粒pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)可被用于在大肠杆菌(E.coli)中生产蛋白。例如，可商购获得的质粒pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)可被用于在酵母的酿酒酵母菌株中的生产。例如，可商购获得的MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)可用于在昆虫细胞中的生产。例如，可商购获得的质粒pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，Calif.)可用于在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的生产。本领域普通技术人员可使用这些商品化表达载体和系统或以其他方式通过常规技术和可容易获得的起始材料生产蛋白(参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版.Cold Spring Harbor Press(1989))。因此，可以在原核和真核系统中制备期望蛋白，产生蛋白的各种加工形式。 
本领域普通技术人员可使用其他可商购获得的表达载体和系统或者使用公知方法和容易获得的起始材料来生产载体。包含必要的调控序列例如启动子和聚腺苷酸化信号以及优选地增强子的表达系统可容易地获得并且在本领域中对于各种宿主是已知的。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版.ColdSpring Harbor Press(1989)。基因构建体包括与启动子可操作地连接的蛋白编码序列，所述启动子在构建体被转染的细胞系或靶组织的细胞中是有功能的。组成型启动子的实例包括来自巨细胞病毒(CMV)或SV40的启动子。诱导型启动子的实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白的启动子。本领域普通技术人员可从容易获得的起始材料中容易地生产对于用编码本发明的蛋白的DNA转染细胞有用的基因构建体。将包括编码蛋白的DNA的表达载体用来转化相容的宿主，然后将所述宿主培养并保持在其中发生外源DNA的表达的条件下。 
按照对本领域技术人员来说适当且已知的，通过溶解细胞或者从培养基中将产生的蛋白从培养物中回收。本领域普通技术人员可使用公知技术来分离使用此类表达系统生产的蛋白。使用与以上所述的特定蛋白特异性结合的抗体从自然来源中纯化蛋白的方法可同样地应用于通过重组DNA 方法产生的纯化蛋白。 
除了通过重组技术生产蛋白之外，还可以采用自动化肽合成器来生产分离的、基本上纯的蛋白。此类技术对于本领域普通技术人员是公知的，并且如果具有取代的衍生物没有为DNA编码的蛋白的生产中提供的话，此类技术是有用的。 
可使用几种公知技术中的任一种递送核酸分子，所述技术包括：有和没有体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)，脂质体介导，纳米颗粒推进，重组载体例如重组腺病毒、病毒相关的重组腺病毒和重组牛痘苗。优选地，本文所述的核酸分子例如DNA质粒是通过DNA注射以及与体内电穿孔共同递送的。 
施用途径包括但不限于：肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部地、经皮、通过吸入或栓剂或者至粘膜组织，例如通过灌洗至阴道、直肠、尿道、口腔或舌下的组织。优选的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建体可以通过如下手段施用，包括但不限于：传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪(microprojectile bombardment gone gun)”或其他物理方法例如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声。 
用于促进本发明的DNA疫苗的递送的优选的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963、Smith等人递交美国专利公布2005/0052630中描述的那些，两篇文献的内容均以全文通过引用并入本文。用于促进下述文献中提供的DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法也是优选的：2007年10月17号提交的共同待审和共有拥有的美国专利申请系列号11/874072，它要求享有美国法典第35条119款之下对2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月提交的60/978,982的权益，所有这些文献均以全文并入本文。优选的，电穿孔装置是CELLECTRATM装置(VGX Pharmaceuticals，Blue Bell，PA)，包括肌内(IM)和皮内(ID)模型。 
Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述了模块化电极系统和它们用于促进将生物分子引入到身体或植物内的选定组织的细胞中的用途。 模块化电极系统包括多个针状电极；皮下的针；提供从程序化恒定电流脉冲控制器到所述多个针状电极的导电连接的电连接器；以及电源。操作者可以抓住装在支撑结构上的多个针状电极并将它们牢固地插入到身体或植物内的选定组织中。然后将生物分子通过皮下的针递送到选定组织中。程序化恒定电流脉冲控制器被激活并且恒定电流的电脉冲被应用到多个针状电极。应用的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容通过引用并入本文。 
Smith等人递交的美国专利公布2005/0052630描述了可被用来有效促进将生物分子引入到身体或植物内的选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括由软件或固件限定操作的电动力学装置(“EKD装置”)。EKD装置基于使用者的控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列可程序化的恒定电流脉冲模式并且允许电流波形数据的存储和获取。电穿孔装置还包括具有针状电极阵列的可替代的电极盘、用于注射针的中心注射通道以及可移去的引导盘。美国专利公布2005/0052630的全部内容通过引用并入本文。 
在美国专利号7,245,963和美国专利公布2005/0052630中描述的电极阵列和方法被修改以用于深深穿入不仅例如肌肉的组织而且还有其他组织或器官。因为电极阵列的配置，注射针(递送选择的生物分子)也被完全插入到靶器官中，并且注射被垂直施用至由电极预先划定的区域中的靶组织，在美国专利号7,245,963和美国专利公布2005/005263中描述的电极优选地是20mm长以及21规格(gauge)。 
以下是本发明的方法的一个实例，并且在以上讨论的专利参考文献中更详细地被讨论：可以配置电穿孔装置来将产生恒定电流的能量脉冲递送至哺乳动物的期望组织，所述恒定电流类似于使用者输入的预设电流。电穿孔装置包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可包括并结合电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测验器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆部件、电源和电源开关。电穿孔部件能够作为电穿孔装置的一个元件发挥作用，并且其他元件是与电穿孔部件保持联系的分开的元件(或部件)。 在一些实施方案中，电穿孔部件不只能够作为电穿孔装置的一个元件发挥作用，它还能够与电穿孔装置的其他元件保持联系，所述其他元件与电穿孔部件是分开的。本发明不受作为一个机电或机械装置的零件而存在的电穿孔装置的元件限制，因为所述元件能够作为一个装置或者作为彼此保持联系的分开的元件起作用。电穿孔部件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲并且包括反馈机制。电极组件包括在空间布置中具有多个电极的电极阵列，其中所述电极组件接收来自电穿孔部件的能量脉冲并且将此能量脉冲通过电极递送到期望组织。多个电极中的至少一个在递送能量脉冲的过程中是中性的，并且测量期望的组织中的阻抗，并且将该阻抗传递到电穿孔部件。反馈机制能够接收测量的阻抗并且能调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒定电流。 
在一些实施方案中，所述多个电极能够以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方案中，所述多个电极能够通过控制电极于程序化顺序以分散模式递送能量脉冲，并且所述程序化顺序是由使用者向电穿孔部件输入。在一些实施方案中，程序化顺序包括按顺序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲是通过具有测量阻抗的一个中性电极的至少两个活性电极递送，并且其中多个脉冲中的随后的脉冲是通过具有测量阻抗的一个中性电极的至少两个活性电极中的不同的一个递送。 
在一些实施方案中，反馈机制是通过硬件或软件执行的。优选地，反馈机制是通过类似物闭合环路执行的。优选地，这种反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生，但优选地是实时反馈或是瞬时的(即如通过用于确定反应时间的可获得的技术所确定的基本上瞬时)。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的阻抗并且将该阻抗传递至反馈机制，该反馈机制对该阻抗作出反应并调整能量脉冲以将恒定电流保持在与预设电流类似的值。在一些实施方案中，反馈机制在递送能量脉冲的过程中连续地并瞬时地保持恒定电流。 
药学上可接受的赋形剂可包括例如运载体(vehicle)、佐剂、载体(carrier)或稀释剂这类公共已知并且可容易获得的功能分子。优选地，药学上可接受的赋形剂是佐剂或转染促进剂。在一些实施方案中，将核酸 分子或DNA质粒与施用多核苷酸功能增强剂或基因疫苗促进剂(或转染促进剂)联合递送至细胞。多核苷酸功能增强剂描述于美国系列号5,593,972、5,962,428和1994年1月26日提交的国际申请系列号PCT/US94/00899中，这些文献各自通过引用并入本文。基因疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国系列号021,579中，其通过引用并入本文。转染促进剂能够作为与核酸分子的混合物与核酸分子联合施用或者在核酸分子施用同时、之前或之后分开施用。转染促进剂的实例包括表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A；胞壁酰肽；醌类似物以及小囊泡例如角鲨烯和菠菜烯；并且也可以使用透明质酸与基因构建体联合施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂例如脂质；脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，为DNA脂质体混合物(参见例如WO9324640)；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒；或者其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子、包括聚L谷氨酸(LGS)或脂质。 
在一些优选的实施方案中，将DNA质粒与佐剂一起递送，所述佐剂是进一步增强针对此类靶蛋白的免疫反应的蛋白的基因。此类基因的实例是那些编码其他细胞因子和淋巴因子的基因，所述细胞因子和淋巴因子例如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15，包括具有被删除信号序列的IL-15并任选地包括来自IgE的信号肽。可能有用的其他基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-1α、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、 IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及它们的功能片段。 
根据本发明的药物组合物包含的DNA量为从约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；或者优选地约0.1微克到约10毫克；或者更优选地约1毫克到约2毫克。在一些优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克到约1000微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约10纳克到约800微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约0.1到约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约1到约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约25到约250微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约100到约200微克DNA。 
根据本发明的药物组合物是根据待使用的施用方式而配制。在药物组合物是可注射的药物组合物的情况中，它们是灭菌的、无热原的和无颗粒的。优选地使用等渗制剂。一般来说，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况中，等渗溶液例如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂加到制剂中。在一些实施方案中，使得制剂在室温或环境温度稳定延长时段的稳定剂例如LGS或其他聚阳离子或聚阴离子被加到制剂中。 
在一些实施方案中，在哺乳动物中引发针对共有流感抗原的免疫反应的方法包括诱导粘膜免疫反应的方法。此类方法包括向所述哺乳动物施用CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它们的功能片段或它们的可表达的编码序列中的一种或多种，结合包括以上所述的共有流感抗原的DNA质粒。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它们的功能片段中的一种或多种可以在本文提供的DNA质粒流感疫苗的施用之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，向哺乳动物施用分离的核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白：CTACK、TECK、MEC和它们的功能片段。 
实施例 
在以下实施例中进一步举例说明了本发明。应当理解这些实施例当指出本发明的优选实施方案时仅通过举例说明方式被给出。从以上讨论和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的必要特征，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下能够对本发明作出各种变动和修改以使其适合于各种运用和条件。因此，从上述描述，本发明的各种修改除了本文示出并描述的那些之外对本领域技术人员将是明显的。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围之内。 
优选地，供本文所述的肌肉或皮肤EP装置使用的DNA制剂具有高DNA浓度，优选包括毫克到数十毫克量并且优选数十毫克量的DNA的浓度，以对于递送到皮肤最适的小体积、优选小注射体积、理想的是25-200微升(μL)。在一些实施方案中，所述DNA制剂具有高DNA浓度，例如1mg/mL或更大(mg DNA/制剂的体积)。更优选地，DNA制剂具有的DNA浓度提供了200μL的配方中克量的DNA，并且更优选100μL的配方中克量的DNA。 
可使用已知装置与技术的组合配制或制造供本发明的EP装置使用的DNA质粒，但优选使用在以下文献中所述的优化的质粒制造技术来制造它们：共同拥有的、共同待审的美国临时申请美国系列号60/939,792，它于2007年5月23日提交。在一些实施例中，在这些研究中使用的DNA质粒能够在大于或等于10mg/mL的浓度配制。制造技术还包括或结合了本领域普通技术人员通常知道的各种装置和方案，除了在美国系列号60/939792中描述的那些之外还包括在下述文献中描述的装置和方案：2007年7月3日授予的共同拥有的专利美国专利号7,238,522。供本文描述的皮肤EP装置和递送技术使用的高浓度质粒允许质粒以合理低体积施用到ID/SC空间中并且帮助增强表达和免疫的效应。共同拥有的申请和专利美国系列号60/939,792和美国专利号7,238,522分别以全文并入本文。 
实施例1：质粒构建体 
普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子驱使pCMV-SEAP载体中人分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告转基因产物表达。使用可商购获得的试剂盒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)获得质粒。内毒素水平为小于0.01EU/μg，如通过Kinetic Chromagenic LAL(Endosafe，Charleston，SC)所测量的。通过分析来自16种H5病毒和超过40种人N1病毒的主要病毒序列产生了共有的HA和NA构建体，所述16种H5病毒已在近年中被证明对人具有致死性。这些序列从美国洛斯阿拉莫斯国家实验室流感病毒序列数据库下载。在产生共有序列之后，对所述构建体进行优化用于哺乳动物表达，包括加入Kozak序列、密码子优化和RNA优化。然后这些构建体亚克隆到pVAX载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。除非另外指明，将质粒制品在无菌水中稀释并且以聚L谷氨酸钠盐(LGS)(平均MW＝10.5kDa)(Sigma，St.Louis，MO)配制1％重量/重量，在VGX Pharmaceuticals免疫治疗剂分部(The Woodlands，TX)进一步HPLC纯化。 
实施例2猪的处理 
将猪分成10组每组4头，总计40头猪(表1)。使猪适应环境4天，称重并且在耳朵做标记。在研究的第0天，对猪称重、采血并使用猪的组合前驱麻醉剂-开他敏-(20mg/kg)、甲苯噻嗪-(2.2mg/kg)和阿托品(0.04mg/kg)麻醉，然后使用异氟烷(在5％诱导，保持在2-3％)麻醉。用0.6mL的CMV-HA(表达共有H5抗原的基于pVAX的构建体)、CMV-NA(表达共有N1抗原的基于pVAX的构建体)和CMV-SEAP(表达报告基因分泌型胚胎碱性磷酸酶SEAP的构建体)质粒(最后被添加以增加质粒浓度和溶液粘度用于“肌肉损伤”评定)+1.0％wt/wt LGS在改变的质粒浓度和电流强度对猪(n＝4/组)进行注射。根据实施例1中提供的材料和方法制备所述质粒。4s后，使用适合的恒定电流CELLECTRATM肌内(IM)系统(VGX Pharmaceuticals，Blue Bell，PA)将动物电穿孔，所述系统配有5个针状电极并以下述脉冲参数操作：52毫秒脉冲，脉冲间隔1秒、具有改变电流的3个脉冲(0.1、0.3和0.5A)。 
表1.猪疫苗实验的组 
对每个注射部位周围区域进行纹身用于在注射后第14天和35天快速鉴定活组织检查。 
使猪从麻醉中复苏并且紧密监测24小时以确保完全复苏。记录在处理后2到3小时内没有完全复苏的任何猪。在第10天、21天和35天将猪称重并采血。在第21天对猪施用第二次接种。将血收集在2个紫色盖子的管中，1.0mL用于CBC和分类(Antech Diagnostics，Irvine，CA)；10mL用于针对HA和NA抗原的干扰素-γ酶联免疫斑点法；并将血收集在分开的falcon管中，使其凝块，离心以分离血清，然后将其等分到冰上的管中。在第35天，在麻醉的外科平面之下给所有的猪放血，并获取注射部位的针孔活组织检查用于组织学。 
血球凝集素抑制(HI)测定
通过用三份酶稀释一份血清用受体破坏酶(RDE)处理猪血清，并在37℃水浴中孵育过夜。通过在56℃孵育30min接着加入六份PBS以最终稀释1/10使酶失活。在V形底的96孔微量滴定板中进行HI测定，如之前所述使用了病毒的四个HA单位和1％的马红细胞(Stephenson，I.，等人.，Virus Res.，103(1-2)：91-5(2004年7月))。 
在来自以0.5A的电流设置(120±40；P＝0.11相对于2mg/0.3A和P＝0.02相对于2mg/0.1A)施用2mg的表达HA的质粒的组的血清中发现通过HI测定表现出最高滴度(图2)；使用接收2mg每种质粒的组的电场 强度滴度降低；如果此后当前每种质粒的量降低，那么滴度更加易变并且在组间是不同的。 
在施用了2mg的表达HA的质粒并在0.5A电穿孔的组中HI滴度最高。此外，滴度随着以0.5A电穿孔的组中递减的质粒剂量并随着电场强度而降低。更低的质粒量或更低的电流强度看起来增加了组内可变性。 
HA和NA的干扰素-γ酶联免疫斑点
如之前所述使用干扰素-γ捕获抗体和检测抗体(MabTech，Sweden)进行酶联免疫斑点实验(Boyer JD，等人.，J Med Primatol，34(5-6)：262-70(2005年十月))。通过从含有肽的孔中减去阴性对照孔中的斑点数目确定抗原特异性反应。结果被显示为三重孔获得的平均值(斑点/百万脾细胞)。 
在0.3A的电流设置施用了2mg每种质粒(总计4mg)的组达到最高的细胞免疫反应，如通过每百万细胞537±322SFU的干扰素-γ酶联免疫斑点所测量的。所有其他组的平均反应是在该测定的背景水平之内。图3中凸显了达到最高细胞免疫反应的两只动物的单独的酶联免疫斑点反应。 
CBC结果
不考虑电流设置，淋巴细胞在施用最高疫苗剂量的组中在研究的第21天达到最高水平，尽管具有最高剂量(4mg的总质粒，各2mg)和最高电流设置(0.5A)的组表现出最高的淋巴细胞反应，比对照高40％(分别为12670±1412对7607±1603淋巴细胞计数/100血液；P＜0.002)。 
肌肉组织病理学
在给猪放血处理后第14天和第35天识别注射部位并且获取打孔活组织检查。将组织固定在缓冲的福尔马林中24小时，然后在PBS中洗涤3次并储存在70％乙醇中。将活组织检查样品交付给Antech Diagnostics，在那里样品被加工并且切片用苏木精和曙红(H&E)染色。一位委员会认证 的病理学家评价了所有的玻片，根据各个组织层(表3)中的病理学标准(表2)为它们评分为0至5。在每个时间点计算出每组的平均得分。 
表2.活组织检查病理学评分参数 
表3.活组织检查组织层和病理学参数 
从质粒注射后第14天和35天的肌肉活组织检查(图4A)和基于0到5等级标准(表2)的EP对组织病理学评分。在电穿孔后总的病理学得分在第14天到第35天的组织层(表3)中下降。在0.3A的设置接受6mg 的总质粒的组在第14天展示出最高的总病理学得分(18.3±6.4，相比于对照P＜0.0002)，与最高的平均淋巴细胞反应相关。在第35天的所有病理学得分接近非处理的对照水平的水平(6.67到4.25的范围)。尽管如此，当肌肉坏死和纤维化(通常与EP程序有关)(Gronevik E，等人.，J Gene Med，7(2)：218-27(2005年2月))被分开分析时(图4B)，得分范围在1和2之间，组间或处理组与对照之间没有差异，而由于免疫反应更高的得分与淋巴的、浆细胞的或嗜酸性炎症有关。显著地，这些得分也从处理后第14天到第35天下降。 
数据分析
使用微软Excel统计软件包分析数据。图中示出的值是平均值±SEM。使用单因素ANOVA和随后的t检验通过比较获得了具体的值。将p＜0.05的值设定为统计显著性的水平。 
实施例3：雪貂的处理 
将4-6月龄或至少1kg体重的二十只雄性雪貂(Triple F Farms，Sayre，PA)用于本研究中并且饲养在BIOQUAL公司(Rockville，MD)。在表4中是雪貂的研究设计。使动物在研究之前适应环境两周。在第0、4和9周免疫动物(在麻醉之下)。每2周抽一次血。在第三次免疫后，将动物移至BSL-3设施中并且在第13周用非常有力的禽流感菌株(H5N1)攻击，然后攻击后又过两周。在攻击后的两周，每天监测动物，并且记录体重、温度和临床得分。监测并记录活性水平；记载死亡。 
这项研究在雪貂的流感攻击模型中测验了肌内接着是电穿孔递送的HA、NA和M2e-NP的DNA疫苗的效力，所述电穿孔使用了CELLECTRATM适合的恒定电流电穿孔肌内(IM)系统(VGXPharmaceuticals，Blue Bell，PA)。根据实施例1中提供的材料和方法制备了DNA质粒。如在表4中概述，在组2、3和4中的动物接受了0.2mg的各自的流感质粒疫苗。为了校正剂量，接受1种质粒疫苗的组(组2和组3)或未接受疫苗的组(对照组1)，通过pVAX空载体弥补差额以使得每组中 的所有动物都接受0.6mg总剂量的质粒。使用5个针状电极阵列的电穿孔的条件是：0.5安培、52毫秒脉冲宽度、脉冲间隔1秒、注射与电穿孔之间4秒延迟。 
表4.雪貂中流感攻击实验的组 
血球凝集素抑制(HI)分析
通过用三份酶稀释一份血清用受体破坏酶(RDE)处理血清，并在37℃水浴中孵育过夜。通过在56℃孵育30min接着加入六份PBS以最终稀释1/10使酶失活。在V形底的96孔微量滴定板中进行HI测定，如之前所述使用了病毒的四个HA单位和1％的马红细胞(Stephenson，I.，等人.，VirusRes.，103(1-2)：91-5(July 2004))。HI测定使用的病毒是我们从疾病控制中心获得的重配菌株：甲型/越南/1203/2004(H5N1)/PR8-IBCDC-RG(进化枝1的病毒)和甲型/印度尼西亚/05/2005(H5N1)/PR8-IBCDC-RG2(进化枝2的病毒)。流感感染的雪貂模型被认为更多的反映了人类疾病并且是更为严格的攻击模型。雪貂展示出与感染流感的人相似的症状和关于人和禽流感病毒的相似组织嗜性。使用整个研究中在不同时间点收集的血清来检测针对H5N1病毒的HI活性。如图7中示出的，含有共有H5的特定HA构建体的两组在两次免疫后均达到了抗体的保护水平(＞1∶40)并且还能抑 制进化枝2的H5N1病毒。换言之，该HI测定针对两种毒株是阳性的，尽管共有HA菌株是以进化枝1的病毒为基础。 
数据分析
使用微软Excel统计软件包分析数据。图中示出的值是平均值±SEM。使用单因素ANOVA和随后的t检验通过比较获得了具体的值。将p＜0.05的值设定为统计显著性的水平。 
雪貂流感攻击
流感攻击的结果描绘于图5和图6中。对照动物在攻击后平均损失25％的体重(图5)，而接种HA(组1)或HA+M2e-NP+NA(组4)的动物损失了9％至10％(相比于对照*P＜0.004)。体温在对照动物中升高直到发现所有对照动物死亡或到第8天被实施安乐死(图6)。所有接种动物，不论哪种疫苗方案，都在攻击下存活并且显示出与对照动物相比更少的感染体征，如通过其临床得分证明的(表5)。对照动物临床得分恶化(鼻排出物、咳嗽、昏睡)，并且在攻击后第5天和第7天之间死亡。如表5中所示，接种动物中临床得分的严重度与抗体滴度呈反向相关(抗体滴度越高，临床得分越低，临床结果越好)。 
表5受攻击的雪貂的结果 
  888 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1   160
  889 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1   320
  881 0_1 0_1 1_0 0_1 0_1 1_1 0_1 0_1   ＜20
M2-NP 880 0_1 0_1 0_0 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1   ＜20
  883 0_1 1_1 1_1 0_1 0_1 1_1 0_1 0_1   ＜20
  882 0_1 0_1 1_1 0_1 0_1 1_2 0_2 0_1   ＜20
  885 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1   1280
H5+M2-NP+NA 884 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0_1 0 1 0_1   320
  886 1_1 1_1 0_1 0_1 0_1 1_1 0_1 1_1   160
  887 0_1 1_1 0_0 0_1 0_1 1_1 0_1 0_1   640
表5注释：描绘了对于攻击后观察期的临床得分。“*”指示出动物被实施安乐死；FD＝发现死亡。每一栏中第一个临床得分是鼻的症状：0＝无；1＝鼻排出物；2＝由嘴呼吸。第二个得分是活动：0＝睡觉；1＝聪明且警觉；2＝警觉但无反应；3＝昏睡。出于比较的目的，描绘了攻击前3周测量的每只动物的HI滴度。 
实施例4在灵长类动物中皮内递送与肌内递送的比较 
在这些研究中免疫了猕猴。使动物在实验开始之前适应环境2个月。该研究如下进行：第0周-进行第一次免疫(质粒剂量施用)和基线采血；第2周进行采血；第3周进行第二次免疫(质粒剂量施用)；第5周进行采血；第6周进行第三次免疫(质粒剂量施用)和采血；第8周进行采血。 
表6 
研究组 DNA构建体 数目 施用途径 剂量 总DNA(mg)
A DNA6+9 5 IMCELLECTRATM 1mg/不变 2
       EP    
 B   DNA6+9  5  ID CELLECTRATM EP   1mg/不变  2
 C   DNA 1+6+9+10  5  IM注射器   1mg/不变  4
 D   阴性对照  5  N/A    0
DNA构建体#   编码抗原 
1            无流感抗原的对照质粒 
6            流感H5共有 
9            无流感抗原的对照质粒 
10           无流感抗原的对照质粒 
将所有质粒在注射用水+1％LGS中配制成10mg/mL，如以上在之前的实施例中描述的，并且将其混合成每个研究组(在上个表6中的组C、D、G和H)的单一溶液。计算出指定IM CELLECTRATM EP(VGXPharmaceuticals)、ID CELLECTRATM EP(VGX Pharmaceuticals)和IM注射器的各组的校正注射体积。对于皮内施用，如果每个位点所需注射体积超过100μL，那么将制剂分成多个注射位点(为2、3或6，取决于施用多少总mg的疫苗)。对接受IM注射的动物在一单个位点给出全部制剂。 
在猪实验、雪貂实验和非人类实验中使用的CELLECTRATM合适的恒定电流装置描述于实施例中。电穿孔条件如下：对于IM注射和电穿孔的组，条件是：0.5安培，52毫秒/脉冲，三个脉冲，质粒注射与电穿孔之间4秒延迟。对于ID注射和电穿孔的组，条件是：0.2安培，52毫秒/脉冲，三个脉冲，质粒注射与电穿孔之间4秒延迟。 
血细胞凝集抑制(HI)测定-通过用三份酶稀释一份血清用受体破坏酶(RDE)处理猴血清，并在37℃水浴中孵育过夜。通过在56℃孵育30min接着加入六份PBS以最终稀释1/10使酶失活。在V形底的96孔微量滴定 板中进行HI测定，使用了病毒的四个HA单位和1％的马红细胞。本文呈现的数据是第二次免疫后的结果(第三次免疫前采的血)。 
在第二次免疫后三周测量了HI滴度。可以看到结果展示在图8的图中。通过ID注射紧接着电穿孔接受HA质粒疫苗的猴表现出多于两倍的IM+EP组的平均滴度和几乎三倍的单独的IM组的平均滴度(*P＜0.03)。无处理的对照没有显示出任何HI滴度。 
实施例5灵长类动物中的交叉保护 
使用递送方法-ID注射紧接着电穿孔(EP) 
对于流感疫苗(包括H5、NA和M2e-NP共有抗原，见以上)在非人类灵长类动物中的研究指明，ID注射紧接着电穿孔引发了比IM注射更高的对疫苗抗原的抗体反应。在我们的一项非人类灵长类动物研究(NHP)中，根据表7接种动物。 
  组   n/组   抗原   递送   浓度  (mg/质粒)   EP条件
  1   5   pVax(假)   IM   1mg/构建  体   0.5安培，3个脉冲，52毫秒，脉  冲间隔1秒
  2   5   H5，NA，  M2e-NP   IM   1mg/构建  体   0.5安培，3个脉冲，52毫秒，脉  冲间隔1秒
  3   5   M2e-NP   IM   1mg/构建  体   0.5安培，3个脉冲，52毫秒，脉  冲间隔1秒
  4   5   H5，NA，  M2e-NP   ID   1mg/构建  体   0.2安培，2X2个脉冲，52毫秒，  脉冲间隔1秒
表7.研究设计和条件。在第0、4和8周免疫猕猴。 
每只动物接受三次接种，并且对相同进化枝和交叉进化枝执行了HAI滴度和微量中和。如所示，共有疫苗不仅在相同进化枝内而且在交叉进化枝内提供了广泛的保护。结果被包含在表8中。 
表8.血细胞凝集(HAI)和微量中和测定法的结果。所呈现的值指明了平均滴度、范围(括号中)和小于5/5(上标)的反应者数目。注释：一般认为在NHP模型中HAI滴度＞1∶20有血清保护性。 
皮内电穿孔装置中的针要短得多(约5mm)、具有较低的规格(gauge)并且在迄今为止测验的动物中没有引发肌肉收缩或可见的疼痛反应。此外，有效的ID EP所需的电场比最适肌内递送所需更低。ID注射已显示出更好的对流感疫苗抗原的免疫反应(Holland D，等人.(2008).J Inf Dis.198：650-58.)。通常，与肌内递送相比皮内递送的疫苗中需要更低的剂量来达到相似的体液反应。 
序列表
<110>R.德拉奇亚-阿科利；A.可汗；D.韦纳；严健；D.雷蒂
<120>针对流感病毒的多种亚型的新颖疫苗
<130>133172.01802
<150>60/987,284
<151>2007-11-12
<160>17
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1707
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>流感H5N1HA共有序列
<400>1
atggaaaaga tcgtgctgct gttcgccatc gtgagcctgg tgaagagcga ccagatctgc     60
atcggctacc acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccatcatgga aaaaaacgtg    120
accgtgaccc acgcccagga catcctggaa aagacccaca acggcaagct gtgcgacctg    180
gacggcgtga agcccctgat cctgcgggac tgcagcgtgg ccggctggct gctgggcaac    240
cccatgtgcg acgagttcat caacgtgccc gagtggagct acatcgtgga gaaggccaac    300
cccgtgaacg acctgtgcta ccccggcgac ttcaacgact acgaggaact gaagcacctg    360
ctgtcccgga tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ccaagagcag ctggtccagc    420
cacgaggcca gcctgggcgt gagcagcgcc tgcccatacc agggcaagtc cagcttcttc    480
cggaacgtgg tgtggctgat caagaagaac agcacctacc ccaccatcaa gcggagctac    540
aacaacacca accaggaaga tctgctggtc ctgtggggca tccaccaccc caacgacgcc    600
gccgagcaga ccaagctgta ccagaacccc accacctaca tcagcgtggg caccagcacc    660
ctgaaccagc ggctggtgcc ccggatcgcc acccggtcca aggtgaacgg ccagagcggc    720
cggatggaat tcttctggac catcctgaag cccaacgatg ccatcaactt cgagagcaac    780
ggcaacttca tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc    840
atgaagagcg agctggaata cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc catgggcgcc    900
atcaacagca gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag    960
tacgtgaaga gcaacaggct ggtgctggcc accggcctgc ggaacagccc ccagcgggag   1020
cggcgggccg ccgcccgggg cctgttcggc gccatcgccg gcttcatcga gggcggctgg   1080
cagggcatgg tggacgggtg gtacggctac caccacagca atgagcaggg cagcggctac   1140
gccgccgaca aagagagcac ccagaaggcc atcgacggcg tcaccaacaa ggtgaacagc   1200
atcatcgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtgggcc gggagttcaa caacctggaa   1260
cggcggatcg agaacctgaa caagaaaatg gaagatggct tcctggacgt gtggacctac   1320
aacgccgagc tgctggtgct gatggaaaac gagcggaccc tggacttcca cgacagcaac   1380
gtgaagaacc tgtacgacaa agtgcggctg cagctgcggg acaacgccaa agagctgggc   1440
aacggctgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggaaag cgtgcggaac   1500
ggcacctacg actaccccca gtacagcgag gaagcccggc tgaagcggga ggaaatcagc   1560
ggcgtgaaac tggaaagcat cggcatctac cagatcctga gcatctacag caccgtggcc   1620
agcagcctgg ccctggccat catggtggcc ggcctgagcc tgtggatgtg cagcaacggc   1680
agcctgcagt gccggatctg catctag                                       1707
<210>2
<211>568
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感H5N1 HA共有序列
<400>2
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Ala Ala Ala Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
            340                 345                 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
        355                 360                 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
    370                 375                 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385                 390                 395                 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
                405                 410                 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
            420                 425                 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
        435                 440                 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
    450                 455                 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465                 470                 475                 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
                485                 490                 495
Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
            500                 505                 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly
        515                 520                 525
Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
    530                 535                 540
Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545                 550                 555                 560
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
                565
<210>3
<211>1466
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>流感H1N1和H5N1 NA共有序列
<400>3
ggtaccgaat tcgccaccat ggactggacc tggatcctgt tcctggtggc cgctgccacc     60
cgggtgcaca gcatgaaccc caaccagaag atcatcacca tcggcagcat ctgcatggtg    120
atcggcatcg tgagcctgat gctgcagatc ggcaacatga tcagcatctg ggtgtcccac    180
agcatccaga ccggcaacca gcaccaggcc gagcccatca gcaacaccaa ctttctgacc    240
gagaaggccg tggccagcgt gaccctggcc ggcaacagca gcctgtgccc catcagcggc    300
tgggccgtgt acagcaagga caacagcatc cggatcggca gcaagggcga cgtgttcgtg    360
atccgggagc ccttcatcag ctgcagccac ctggaatgcc ggaccttctt cctgacccag    420
ggggccctgc tgaacgacaa gcacagcaac ggcaccgtga aggacagaag cccctaccgg    480
accctgatga gctgccccgt gggcgaggcc cccagcccct acaacagccg gttcgagagc    540
gtggcctggt ccgccagcgc ctgccacgac ggcaccagct ggctgaccat cggcatcagc    600
ggccctgaca acggcgccgt ggccgtgctg aagtacaacg gcatcatcac cgacaccatc    660
aagagctggc ggaacaacat cctgcggacc caggaaagcg agtgcgcctg cgtgaacggc    720
agctgcttca ccgtgatgac cgacggcccc agcaacggcc aggccagcta caagatcttc    780
aagatggaaa agggcaaggt ggtgaagagc gtggagctgg acgcccccaa ctaccactac    840
gaggaatgca gctgctaccc cgacgccggc gagatcacct gcgtgtgccg ggacaactgg    900
cacggcagca accggccctg ggtgtccttc aaccagaacc tggaatacca gatcggctac    960
atctgcagcg gcgtgttcgg cgacaacccc aggcccaacg atggcaccgg cagctgcggc   1020
cctgtgagcg ccaacggcgc ctacggcgtg aagggcttca gcttcaagta cggcaacggc   1080
gtgtggatcg gccggaccaa gagcaccaac agcagatccg gcttcgagat gatctgggac   1140
cccaacggct ggaccgagac cgacagcagc ttcagcgtga agcaggacat cgtggccatc   1200
accgactggt ccggctacag cggcagcttc gtgcagcacc ccgagctgac cggcctggac   1260
tgcatccggc cctgcttttg ggtggagctg atcagaggca ggcccaaaga gagcaccatc   1320
tggaccagcg gcagcagcat cagcttttgc ggcgtgaaca gcgacaccgt gagctggtcc   1380
tggcccgacg gcgccgagct gcccttcacc atcgacaagt acccctacga cgtgcccgac   1440
tacgcctgat gagcggccgc gagctc                                        1466
<210>4
<211>476
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感H1N1和H5N1 NA共有序列
<400>4
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1               5                   10                  15
His Ser Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys
            20                  25                  30
Met Val Ile Gly Ile Val Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile
        35                  40                  45
Ser Ile Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln His Gln Ala
    50                  55                  60
Glu Pro Ile Ser Asn Thr Asn Phe Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser
65                  70                  75                  80
Val Thr Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Ser Gly Trp Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val
            100                 105                 110
Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg
        115                 120                 125
Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn
    130                 135                 140
Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro
145                 150                 155                 160
Val Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala
                165                 170                 175
Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly
            180                 185                 190
Ile Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly
        195                 200                 205
Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr
    210                 215                 220
Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met
225                 230                 235                 240
Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Lys Met
                245                 250                 255
Glu Lys Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr
            260                 265                 270
His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ala Gly Glu Ile Thr Cys
        275                 280                 285
Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe
    290                 295                 300
Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe
305                 310                 315                 320
Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val
                325                 330                 335
Ser Ala Asn Gly Ala Tyr Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly
            340                 345                 350
Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly
        355                 360                 365
Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp Ser Ser
    370                 375                 380
Phe Ser Val Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr
385                 390                 395                 400
Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile
                405                 410                 415
Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser
            420                 425                 430
Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser
        435                 440                 445
Asp Thr Val Ser Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr
    450                 455                 460
Ile Asp Lys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
465                 470                 475
<210>5
<211>875
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>流感H1N1和H5N1 M1共有序列
<400>5
ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtggc cgctgccacc     60
cgggtgcaca gcatgagcct gctgaccgag gtggagacct acgtgctgtc catcatcccc    120
agcggccctc tgaaggccga gatcgcccag cggctggaag atgtgttcgc cggcaagaac    180
accgacctgg aagccctgat ggaatggctg aaaacccggc ccatcctgag ccccctgacc    240
aagggcatcc tgggcttcgt gttcaccctg accgtgccca gcgagcgggg cctgcagcgg    300
cggagattcg tgcagaacgc cctgaacggc aacggcgacc ccaacaacat ggaccgggcc    360
gtgaagctgt acaagaagct gaagcgggag atcaccttcc acggcgccaa agaggtggcc    420
ctgagctaca gcacaggcgc cctggccagc tgcatgggcc tgatctacaa ccggatgggc    480
accgtgacca ccgaggtggc cttcggcctg gtgtgcgcca cctgcgagca gatcgccgac    540
agccagcaca gatcccaccg gcagatggcc accaccacca accccctgat ccggcacgag    600
aaccggatgg tcctggcctc caccaccgcc aaggccatgg aacagatggc cggcagcagc    660
gagcaggccg ccgaagccat ggaagtggcc agccaggcca ggcagatggt gcaggccatg    720
cggaccatcg gcacccaccc cagcagcagc gccggactgc gggacgacct gctggaaaac    780
ctgcaggcct accagaaacg gatgggcgtg cagatgcagc ggttcaagta cccctacgac    840
gtgcccgact acgcctgatg agcggccgcg agctc                               875
<210>6
<211>279
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感H1N1和H5N1M1共有序列
<400>6
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1               5                   10                  15
His Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile
            20                  25                  30
Ile Pro Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp
        35                  40                  45
Val Phe Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu
    50                  55                  60
Lys Thr Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe
65                  70                  75                  80
Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg
                85                  90                  95
Phe Val Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp
            100                 105                 110
Arg Ala Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His
        115                 120                 125
Gly Ala Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser
    130                 135                 140
Cys Met Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val
145                 150                 155                 160
Ala Phe Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln
                165                 170                 175
His Arg Ser His Arg Gln Met Ala Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg
            180                 185                 190
His Glu Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu
        195                 200                 205
Gln Met Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala
    210                 215                 220
Ser Gln Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His
225                 230                 235                 240
Pro Ser Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln
                245                 250                 255
Ala Tyr Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys Tyr Pro
            260                 265                 270
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
        275
<210>7
<211>1700
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>流感H5N1 M2E-NP共有序列
<400>7
ggtaccgaat tcgccaccat ggactggacc tggatcctgt tcctggtcgc tgccgccacc    60
agggtgcaca gcagcctgct gaccgaggtg gagaccccca cccggaacga gtggggctgc    120
cggtgcagcg acagcagcga ccggggcagg aagcggagaa gcgccagcca gggcaccaag    180
cggagctacg agcagatgga aacaggcggc gagcggcaga acgccaccga gatccgggcc    240
agcgtgggca gaatggtcgg cggcatcggc cggttctaca tccagatgtg caccgagctg    300
aagctgtccg actacgaggg ccggctgatc cagaacagca tcaccatcga gcggatggtg    360
ctgtccgcct tcgacgagcg gcggaacaga tacctggaag agcaccccag cgccggcaag    420
gaccccaaga aaaccggcgg acccatctac cggcggaggg acggcaagtg ggtgcgggag    480
ctgatcctgt acgacaaaga ggaaatccgg cggatctggc ggcaggccaa caacggcgag    540
gacgccacag ccggcctgac ccacctgatg atctggcaca gcaacctgaa cgacgccacc    600
taccagcgga caagggctct ggtccggacc ggcatggacc cccggatgtg cagcctgatg    660
cagggcagca cactgcccag aagaagcgga gccgctggcg cagccgtgaa gggcgtgggc    720
accatggtga tggaactgat ccggatgatc aagcggggca tcaacgaccg gaatttttgg    780
aggggcgaga acggcaggcg gacccggatc gcctacgagc ggatgtgcaa catcctgaag    840
ggcaagttcc agacagccgc ccagcgggcc atgatggacc aggtccggga gagccggaac    900
cccggcaacg ccgagatcga ggacctgatc ttcctggcca gaagcgccct gatcctgcgg    960
ggcagcgtgg cccacaagag ctgcctgccc gcctgcgtgt acggactggc cgtggccagc   1020
ggctacgact tcgagcggga gggctacagc ctggtcggca tcgacccctt ccggctgctg   1080
cagaactccc aggtgttcag cctgatccgg cccaacgaga accccgccca caagtcccag   1140
ctggtctgga tggcctgcca cagcgccgcc ttcgaggatc tgagagtgag cagcttcatc   1200
cggggcacca gagtggtgcc caggggccag ctgtccacca ggggcgtgca gatcgccagc   1260
aacgagaaca tggaagccat ggacagcaac accctggaac tgcggagccg gtactgggcc   1320
atccggacca gaagcggcgg caacaccaac cagcagcggg ccagcgccgg acagatcagc   1380
gtgcagccca ccttctccgt gcagcggaac ctgcccttcg agagggccac catcatggcc   1440
gccttcaccg gcaacaccga gggccggacc agcgacatgc ggaccgagat catcaggatg   1500
atggaaagcg ccaggcccga ggacgtgagc ttccagggca ggggcgtgtt cgagctgtcc   1560
gatgagaagg ccaccaaccc catcgtgccc agcttcgaca tgaacaacga gggcagctac   1620
ttcttcggcg acaacgccga ggaatacgac aactacccct acgacgtgcc cgactacgcc   1680
tgatgagcgg ccgcgagctc                                               1700
<210>8
<211>554
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感H5N1 M2E-NP共有序列
<400>8
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1               5                   10                  15
His Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp
            20                  25                  30
Gly Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
        35                  40                  45
Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly Gly
    50                  55                  60
Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met Val
65                  70                  75                  80
Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys Leu
                85                  90                  95
Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg
            100                 105                 110
Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu Glu
        115                 120                 125
His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr
    130                 135                 140
Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys
145                 150                 155                 160
Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala
                165                 170                 175
Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn Asp
            180                 185                 190
Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro
        195                 200                 205
Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser Gly
    210                 215                 220
Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu
225                 230                 235                 240
Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg Gly
                245                 250                 255
Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile
            260                 265                 270
Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp Gln
        275                 280                 285
Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu Ile
    290                 295                 300
Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys
305                 310                 315                 320
Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly Tyr
                325                 330                 335
Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Arg
            340                 345                 350
Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu Asn
        355                 360                 365
Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala
    370                 375                 380
Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Arg Val Val
385                 390                 395                 400
Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn Glu
                405                 410                 415
Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg Tyr
            420                 425                 430
Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg Ala
        435                 440                 445
Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg Asn
    450                 455                 460
Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn Thr
465                 470                 475                 480
Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met Glu
                485                 490                 495
Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe Glu
            500                 505                 510
Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp Met
        515                 520                 525
Asn Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr Asp
    530                 535                 540
Asn Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
545                 550
<210>9
<211>1728
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>流感H1共有序列
<400>9
ggtaccaagc ttgccaccat gaaggtgaaa ctgctggtgc tgctgtgcac cttcaccgcc     60
acctacgccg acaccatctg catcggctac cacgccaaca acagcaccga caccgtggat    120
accgtgctgg aaaagaacgt gaccgtgacc cacagcgtga acctgctgga agatagccac    180
aacggcaagc tgtgcctgct gaaaggcatc gcccccctgc agctgggcaa ctgcagcgtg    240
gccggctgga tcctgggcaa ccccgagtgc gagctgctga tttccaaaga aagctggtcc    300
tacatcgtgg agacccccaa ccccgagaac ggcacctgct accccggcta cttcgccgac    360
tacgaggaac tgcgggagca gctgtccagc gtgagcagct tcgagcggtt cgagatcttc    420
cccaaagaga gcagctggcc caaccacacc gtgaccggcg tgagcgccag ctgctcccac    480
aatggcaaga gcagcttcta ccggaacctg ctgtggctga ccggcaagaa cggcctgtac    540
cccaacctga gcaagagcta cgccaataac aaagaaaagg aagtgctggt gctgtggggc    600
gtgcaccacc cccccaacat cggcgaccag cgggccctgt accacaccga gaacgcctac    660
gtgagcgtgg tgtccagcca ctacagccgg cggttcaccc ccgagatcgc caagcggccc    720
aaagtgcggg accaggaagg ccggatcaac tactactgga ccctgctgga acccggcgac    780
accatcatct tcgaggccaa cggcaacctg atcgccccca gatacgcctt cgccctgagc    840
cggggcttcg gcagcggcat catcaccagc aacgccccca tggacgagtg cgacgccaag    900
tgccagaccc ctcagggagc tattaacagc agcctgccct tccagaacgt gcaccccgtg    960
accatcggcg agtgccccaa gtacgtgcgg agcgccaagc tgcggatggt gaccggcctg   1020
cggaacatcc ccagcatcca gagcaggggc ctgttcggcg ccatcgccgg cttcatcgag   1080
ggcggctgga ccggcatggt ggacgggtgg tacggctacc accaccagaa cgagcagggc   1140
agcggctacg ccgccgacca gaagagcacc cagaacgcca tcaacggcat caccaacaag   1200
gtgaacagcg tgatcgagaa gatgaacacc cagttcaccg ccgtgggcaa agagttcaac   1260
aagctggaac ggcggatgga aaacctgaac aagaaggtgg acgacggctt cctggacatc   1320
tggacctaca acgccgagct gctggtgctg ctggaaaacg agcggaccct ggacttccac   1380
gacagcaacg tgaagaacct gtacgagaag gtgaaaagcc agctgaagaa caacgccaaa   1440
gagatcggca acggctgctt cgagttctac cacaagtgca acgacgagtg catggaaagc   1500
gtgaagaatg gcacctacga ctaccccaag tacagcgagg aaagcaagct gaaccgggag   1560
aagatcgacg gcgtgaagct ggaaagcatg ggcgtgtacc agatcctggc catctacagc   1620
accgtcgctt ccagcctcgt cctgctcgtg tccctgggcg ccatctcctt ttggatgtgc   1680
agcaacggca gcctgcagtg ccggatctgc atctgatgac tcgagctc                1728
<210>10
<211>565
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感H1共有序列
<400>10
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1               5                   10                  15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
            20                  25                  30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
        35                  40                  45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile
    50                  55                  60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65                  70                  75                  80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile
                85                  90                  95
Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe
            100                 105                 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
        115                 120                 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
    130                 135                 140
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
                165                 170                 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
            180                 185                 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Leu Tyr
        195                 200                 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
    210                 215                 220
Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu
225                 230                 235                 240
Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile
                245                 250                 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala
            260                 265                 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met
        275                 280                 285
Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser
    290                 295                 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro
305                 310                 315                 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
                325                 330                 335
Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
            340                 345                 350
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
        355                 360                 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
    370                 375                 380
Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu
385                 390                 395                 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
                405                 410                 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu
            420                 425                 430
Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
        435                 440                 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
    450                 455                 460
ValLys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys
465                 470                 475                 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
                485                 490                 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
            500                 505                 510
Arg Glu Lys Ile Asp Gly ValLys Leu Glu Ser Met Gly ValTyr Gln
        515                 520                 525
Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
    530                 535                 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545                 550                 555                 560
Cys Arg Ile Cys Ile
                565
<210>11
<211>1731
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>流感H3共有序列
<400>11
ggtaccaagc ttgccaccat gaaaaccatc atcgccctga gctacatcct gtgcctggtg     60
ttcgcccaga agctgcccgg caacgacaac agcaccgcca ccctgtgtct gggccaccac    120
gccgtgccca acggcaccat cgtgaaaaca atcaccaacg accagatcga ggtgaccaac    180
gccaccgagc tggtgcagag cagcagcacc ggcggcatct gcgacagccc ccaccagatc    240
ctggacggcg agaactgcac cctgatcgac gccctgctgg gcgaccctca gtgcgacggc    300
ttccagaaca aaaagtggga cctgttcgtg gagcggagca aggcctacag caactgctac    360
ccctacgacg tgcccgacta cgccagcctg cggagcctgg tggccagcag cggcaccctg    420
gaattcaaca acgagagctt caactggacc ggcgtgaccc agaacggcac cagcagcgcc    480
tgcaagcggc ggagcaacaa cagcttcttt tccagactga actggctgac ccacctgaag    540
ttcaagtacc ccgccctgaa cgtgaccatg cccaacaatg agaagttcga caagctgtac    600
atctggggcg tgcaccaccc cggcaccgac aatgaccaga tcagcctgta cgcccaggcc    660
agcggccgga tcaccgtgag caccaagcgg agccagcaga ccgtgatccc caacatcggc    720
agccggccca gagtgagaga catccccagc cggatcagca tctactggac aatcgtgaag    780
cccggcgaca tcctgctgat caactccacc ggcaacctga tcgcccccag gggctacttc    840
aagatcagaa gcggcaagag cagcatcatg cggagcgacg cccccatcgg caagtgcaac    900
agcgagtgca tcacccccaa tggcagcatc cccaacgaca agcccttcca gaacgtgaac    960
cggatcacct acggcgcctg ccccagatac gtgaagcaga acaccctgaa gctggccacc   1020
ggcatgcgga acgtgcccga gaagcagacc cggggcatct tcggcgccat cgccggcttc   1080
atcgagaacg gctgggaggg catggtggac gggtggtacg gcttccggca ccagaactcc   1140
gagggcatcg gccaggccgc cgacctgaag agcacccagg ccgccatcaa ccagatcaac   1200
ggcaagctga accggctgat cggcaagacc aacgagaagt tccaccagat cgaaaaagaa   1260
ttcagcgagg tggagggccg gatccaggac ctggaaaagt acgtggagga caccaagatc   1320
gacctgtgga gctacaacgc cgagctgctg gtcgccctgg aaaaccagca caccatcgac   1380
ctgaccgaca gcgagatgaa caagctgttc gagcggacca agaagcagct gcgggagaac   1440
gccgaggaca tgggcaacgg ctgctttaag atctaccaca agtgcgacaa cgcctgcatc   1500
ggcagcatcc ggaacggcac ctacgaccac gacgtgtacc gggacgaggc cctgaacaac   1560
cggttccaga tcaagggcgt ggagctgaag agcggctaca aggactggat cctgtggatc   1620
agcttcgcca tcagctgctt tctgctgtgc gtggccctgc tgggattcat catgtgggcc   1680
tgccagaagg gcaacatccg ctgcaacatc tgcatctgat gactcgagct c            1731
<210>12
<211>566
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感H3共有序列
<400>12
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1               5                   10                  15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
            20                  25                  30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
        35                  40                  45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr
    50                  55                  60
Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
65                  70                  75                  80
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
                85                  90                  95
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
            100                 105                 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
        115                 120                 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
    130                 135                 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn
145                 150                 155                 160
Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys
                165                 170                 175
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Asn Asp Gln Ile
        195                 200                 205
Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
    210                 215                 220
Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Val Arg
225                 230                 235                 240
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
                245                 250                 255
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
            260                 265                 270
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
        275                 280                 285
Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
    290                 295                 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
305                 310                 315                 320
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
                325                 330                 335
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
            340                 345                 350
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
        355                 360                 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Ile Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
    370                 375                 380
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
385                 390                 395                 400
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
                405                 410                 415
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
            420                 425                 430
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
        435                 440                 445
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
    450                 455                 460
Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465                 470                 475                 480
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
                485                 490                 495
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
            500                 505                 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly ValGlu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
        515                 520                 525
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
    530                 535                 540
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
545                 550                 555                 560
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
                565
<210>13
<211>1791
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>流感H5共有序列
<400>13
atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cccgggtgca cagcatggaa     60
aagatcgtgc tgctgttcgc catcgtgagc ctggtgaaga gcgaccagat ctgcatcggc    120
taccacgcca acaacagcac cgagcaggtg gacaccatca tggaaaaaaa cgtgaccgtg    180
acccacgccc aggacatcct ggaaaagacc cacaacggca agctgtgcga cctggacggc    240
gtgaagcccc tgatcctgcg ggactgcagc gtggccggct ggctgctggg caaccccatg    300
tgcgacgagt tcatcaacgt gcccgagtgg agctacatcg tggagaaggc caaccccgtg    360
aacgacctgt gctaccccgg cgacttcaac gactacgagg aactgaagca cctgctgtcc    420
cggatcaacc acttcgagaa gatccagatc atccccaaga gcagctggtc cagccacgag    480
gccagcctgg gcgtgagcag cgcctgccca taccagggca agtccagctt cttccggaac    540
gtggtgtggc tgatcaagaa gaacagcacc taccccacca tcaagcggag ctacaacaac    600
accaaccagg aagatctgct ggtcctgtgg ggcatccacc accccaacga cgccgccgag    660
cagaccaagc tgtaccagaa ccccaccacc tacatcagcg tgggcaccag caccctgaac    720
cagcggctgg tgccccggat cgccacccgg tccaaggtga acggccagag cggccggatg    780
gaattcttct ggaccatcct gaagcccaac gatgccatca acttcgagag caacggcaac    840
ttcatcgccc ccgagtacgc ctacaagatc gtgaagaagg gcgacagcac catcatgaag    900
agcgagctgg aatacggcaa ctgcaacacc aagtgccaga cccccatggg cgccatcaac    960
agcagcatgc ccttccacaa catccacccc ctgaccatcg gcgagtgccc caagtacgtg   1020
aagagcaaca ggctggtgct ggccaccggc ctgcggaaca gcccccagcg ggagcggcgg   1080
aggaagaagc ggggcctgtt cggcgccatc gccggcttca tcgagggcgg ctggcagggc   1140
atggtggacg ggtggtacgg ctaccaccac agcaatgagc agggcagcgg ctacgccgcc   1200
gacaaagaga gcacccagaa ggccatcgac ggcgtcacca acaaggtgaa cagcatcatc   1260
gacaagatga acacccagtt cgaggccgtg ggccgggagt tcaacaacct ggaacggcgg   1320
atcgagaacc tgaacaagaa aatggaagat ggcttcctgg acgtgtggac ctacaacgcc   1380
gagctgctgg tgctgatgga aaacgagcgg accctggact tccacgacag caacgtgaag   1440
aacctgtacg acaaagtgcg gctgcagctg cgggacaacg ccaaagagct gggcaacggc   1500
tgcttcgagt tctaccacaa gtgcgacaac gagtgcatgg aaagcgtgcg gaacggcacc   1560
tacgactacc cccagtacag cgaggaagcc cggctgaagc gggaggaaat cagcggcgtg   1620
aaactggaaa gcatcggcat ctaccagatc ctgagcatct acagcaccgt ggccagcagc   1680
ctggccctgg ccatcatggt ggccggcctg agcctgtgga tgtgcagcaa cggcagcctg   1740
cagtgccgga tctgcatcta cccctacgac gtgcccgact acgcctgatg a            1791
<210>14
<211>579
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>流感HA共有序列
<400>14
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile
                165                 170                 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
            340                 345                 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr
        355                 360                 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
    370                 375                 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser
385                 390                 395                 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe
                405                 410                 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
            420                 425                 430
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met
        435                 440                 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
    450                 455                 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465                 470                 475                 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
                485                 490                 495
Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala
            500                 505                 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly
        515                 520                 525
Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
    530                 535                 540
Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545                 550                 555                 560
Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
                565                 570                 575
Ala Leu Glu
<210>15
<211>4733
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含流感共有H5N1HA编码序列的DNA质粒
<400>15
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta     60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata    120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat    180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga    240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc    300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt    360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat    420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag    480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc    540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga    600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga    660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt    720
accgccacca tggactggac ctggatcctg ttcctggtgg ccgctgccac ccgggtgcac    780
agcatggaaa agatcgtgct gctgttcgcc atcgtgagcc tggtgaagag cgaccagatc    840
tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gagcaggtgg acaccatcat ggaaaaaaac    900
gtgaccgtga cccacgccca ggacatcctg gaaaagaccc acaacggcaa gctgtgcgac    960
ctggacggcg tgaagcccct gatcctgcgg gactgcagcg tggccggctg gctgctgggc   1020
aaccccatgt gcgacgagtt catcaacgtg cccgagtgga gctacatcgt ggagaaggcc   1080
aaccccgtga acgacctgtg ctaccccggc gacttcaacg actacgagga actgaagcac   1140
ctgctgtccc ggatcaacca cttcgagaag atccagatca tccccaagag cagctggtcc   1200
agccacgagg ccagcctggg cgtgagcagc gcctgcccat accagggcaa gtccagcttc   1260
ttccggaacg tggtgtggct gatcaagaag aacagcacct accccaccat caagcggagc   1320
tacaacaaca ccaaccagga agatctgctg gtcctgtggg gcatccacca ccccaacgac   1380
gccgccgagc agaccaagct gtaccagaac cccaccacct acatcagcgt gggcaccagc   1440
accctgaacc agcggctggt gccccggatc gccacccggt ccaaggtgaa cggccagagc   1500
ggccggatgg aattcttctg gaccatcctg aagcccaacg atgccatcaa cttcgagagc   1560
aacggcaact tcatcgcccc cgagtacgcc tacaagatcg tgaagaaggg cgacagcacc   1620
atcatgaaga gcgagctgga atacggcaac tgcaacacca agtgccagac ccccatgggc   1680
gccatcaaca gcagcatgcc cttccacaac atccaccccc tgaccatcgg cgagtgcccc   1740
aagtacgtga agagcaacag gctggtgctg gccaccggcc tgcggaacag cccccagcgg   1800
gagcggcgga ggaagaagcg gggcctgttc ggcgccatcg ccggcttcat cgagggcggc   1860
tggcagggca tggtggacgg gtggtacggc taccaccaca gcaatgagca gggcagcggc   1920
tacgccgccg acaaagagag cacccagaag gccatcgacg gcgtcaccaa caaggtgaac   1980
agcatcatcg acaagatgaa cacccagttc gaggccgtgg gccgggagtt caacaacctg   2040
gaacggcgga tcgagaacct gaacaagaaa atggaagatg gcttcctgga cgtgtggacc   2100
tacaacgccg agctgctggt gctgatggaa aacgagcgga ccctggactt ccacgacagc   2160
aacgtgaaga acctgtacga caaagtgcgg ctgcagctgc gggacaacgc caaagagctg   2220
ggcaacggct gcttcgagtt ctaccacaag tgcgacaacg agtgcatgga aagcgtgcgg   2280
aacggcacct acgactaccc ccagtacagc gaggaagccc ggctgaagcg ggaggaaatc   2340
agcggcgtga aactggaaag catcggcatc taccagatcc tgagcatcta cagcaccgtg   2400
gccagcagcc tggccctggc catcatggtg gccggcctga gcctgtggat gtgcagcaac   2460
ggcagcctgc agtgccggat ctgcatctac ccctacgacg tgcccgacta cgcctgatga   2520
ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc   2580
cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc   2640
actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct   2700
attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg   2760
catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctactgggc ggttttatgg acagcaagcg   2820
aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact   2880
ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga   2940
caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg   3000
cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg   3060
ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt   3120
ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg   3180
gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat   3240
tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat   3300
ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg   3360
accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg   3420
atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc   3480
tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc   3540
cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg   3600
tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg   3660
gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca   3720
tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaattat taacgcttac aatttcctga   3780
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatcagg tggcactttt   3840
cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat   3900
ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat   3960
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct   4020
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct   4080
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca   4140
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc   4200
agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc   4260
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct   4320
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag   4380
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc   4440
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg   4500
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag   4560
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt   4620
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac   4680
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctt          4733
<210>16
<211>4418
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含流感共有NA编码序列的DNA质粒
<400>16
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta     60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata    120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat    180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga    240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc    300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt    360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat    420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag    480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc    540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga    600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga    660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt    720
accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattcgc caccatggac tggacctgga    780
tcctgttcct ggtggccgct gccacccggg tgcacagcat gaaccccaac cagaagatca    840
tcaccatcgg cagcatctgc atggtgatcg gcatcgtgag cctgatgctg cagatcggca    900
acatgatcag catctgggtg tcccacagca tccagaccgg caaccagcac caggccgagc    960
ccatcagcaa caccaacttt ctgaccgaga aggccgtggc cagcgtgacc ctggccggca   1020
acagcagcct gtgccccatc agcggctggg ccgtgtacag caaggacaac agcatccgga   1080
tcggcagcaa gggcgacgtg ttcgtgatcc gggagccctt catcagctgc agccacctgg   1140
aatgccggac cttcttcctg acccaggggg ccctgctgaa cgacaagcac agcaacggca   1200
ccgtgaagga cagaagcccc taccggaccc tgatgagctg ccccgtgggc gaggccccca   1260
gcccctacaa cagccggttc gagagcgtgg cctggtccgc cagcgcctgc cacgacggca   1320
ccagctggct gaccatcggc atcagcggcc ctgacaacgg cgccgtggcc gtgctgaagt   1380
acaacggcat catcaccgac accatcaaga gctggcggaa caacatcctg cggacccagg   1440
aaagcgagtg cgcctgcgtg aacggcagct gcttcaccgt gatgaccgac ggccccagca   1500
acggccaggc cagctacaag atcttcaaga tggaaaaggg caaggtggtg aagagcgtgg   1560
agctggacgc ccccaactac cactacgagg aatgcagctg ctaccccgac gccggcgaga   1620
tcacctgcgt gtgccgggac aactggcacg gcagcaaccg gccctgggtg tccttcaacc   1680
agaacctgga ataccagatc ggctacatct gcagcggcgt gttcggcgac aaccccaggc   1740
ccaacgatgg caccggcagc tgcggccctg tgagcgccaa cggcgcctac ggcgtgaagg   1800
gcttcagctt caagtacggc aacggcgtgt ggatcggccg gaccaagagc accaacagca   1860
gatccggctt cgagatgatc tgggacccca acggctggac cgagaccgac agcagcttca   1920
gcgtgaagca ggacatcgtg gccatcaccg actggtccgg ctacagcggc agcttcgtgc   1980
agcaccccga gctgaccggc ctggactgca tccggccctg cttttgggtg gagctgatca   2040
gaggcaggcc caaagagagc accatctgga ccagcggcag cagcatcagc ttttgcggcg   2100
tgaacagcga caccgtgagc tggtcctggc ccgacggcgc cgagctgccc ttcaccatcg   2160
acaagtaccc ctacgacgtg cccgactacg cctgatgagc ggccgctcga gtctagaggg   2220
cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt   2280
tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa   2340
taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg   2400
gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg   2460
gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag   2520
ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc   2580
cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca agagacagga tgaggatcgt   2640
ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc   2700
tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc   2760
tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg   2820
aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag   2880
ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg   2940
ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg   3000
caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac   3060
atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg   3120
acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc   3180
ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg   3240
aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc   3300
aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc   3360
gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc   3420
ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc   3480
ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc   3540
ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa   3600
taaccctgat aaatgcttca ataatagcac gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg   3660
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg   3720
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt   3780
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg   3840
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata   3900
ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca   3960
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag   4020
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc   4080
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga   4140
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg   4200
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac   4260
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg   4320
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg   4380
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctt                           4418
<210>17
<211>4652
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含流感共有M2e-NP编码序列的DNA质粒
<400>17
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta     60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata    120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat    180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga    240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc    300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt    360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat    420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag    480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc    540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga    600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga    660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt    720
accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattcgc caccatggac tggacctgga    780
tcctgttcct ggtcgctgcc gccaccaggg tgcacagcag cctgctgacc gaggtggaga    840
cccccacccg gaacgagtgg ggctgccggt gcagcgacag cagcgaccgg ggcaggaagc    900
ggagaagcgc cagccagggc accaagcgga gctacgagca gatggaaaca ggcggcgagc    960
ggcagaacgc caccgagatc cgggccagcg tgggcagaat ggtcggcggc atcggccggt   1020
tctacatcca gatgtgcacc gagctgaagc tgtccgacta cgagggccgg ctgatccaga   1080
acagcatcac catcgagcgg atggtgctgt ccgccttcga cgagcggcgg aacagatacc   1140
tggaagagca ccccagcgcc ggcaaggacc ccaagaaaac cggcggaccc atctaccggc   1200
ggagggacgg caagtgggtg cgggagctga tcctgtacga caaagaggaa atccggcgga   1260
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ggcacagcaa cctgaacgac gccacctacc agcggacaag ggctctggtc cggaccggca   1380
tggacccccg gatgtgcagc ctgatgcagg gcagcacact gcccagaaga agcggagccg   1440
ctggcgcagc cgtgaagggc gtgggcacca tggtgatgga actgatccgg atgatcaagc   1500
ggggcatcaa cgaccggaat ttttggaggg gcgagaacgg caggcggacc cggatcgcct   1560
acgagcggat gtgcaacatc ctgaagggca agttccagac agccgcccag cgggccatga   1620
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tggccagaag cgccctgatc ctgcggggca gcgtggccca caagagctgc ctgcccgcct   1740
gcgtgtacgg actggccgtg gccagcggct acgacttcga gcgggagggc tacagcctgg   1800
tcggcatcga ccccttccgg ctgctgcaga actcccaggt gttcagcctg atccggccca   1860
acgagaaccc cgcccacaag tcccagctgg tctggatggc ctgccacagc gccgccttcg   1920
aggatctgag agtgagcagc ttcatccggg gcaccagagt ggtgcccagg ggccagctgt   1980
ccaccagggg cgtgcagatc gccagcaacg agaacatgga agccatggac agcaacaccc   2040
tggaactgcg gagccggtac tgggccatcc ggaccagaag cggcggcaac accaaccagc   2100
agcgggccag cgccggacag atcagcgtgc agcccacctt ctccgtgcag cggaacctgc   2160
ccttcgagag ggccaccatc atggccgcct tcaccggcaa caccgagggc cggaccagcg   2220
acatgcggac cgagatcatc aggatgatgg aaagcgccag gcccgaggac gtgagcttcc   2280
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acccctacga cgtgcccgac tacgcctgat gagcggccgc tcgagtctag agggcccgtt   2460
taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc   2520
tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat   2580
gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg   2640
caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc   2700
tctatggctt ctactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg   2760
cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa   2820
ggatctgatg gcgcagggga tcaagctctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca   2880
tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg   2940
gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag   3000
cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc   3060
aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc   3120
tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg   3180
atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc   3240
ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca   3300
tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag   3360
agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg   3420
gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg   3480
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tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc   3600
tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg   3660
acgagttctt ctgaattatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc   3720
atctgtgcgg tatttcacac cgcatcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc   3780
cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc   3840
tgataaatgc ttcaataata gcacgtgcta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag   3900
gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac   3960
tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc   4020
gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat   4080
caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat   4140
actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct   4200
acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt   4260
cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg   4320
gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta   4380
cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg   4440
gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg   4500
tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc   4560
tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg   4620
gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tt                                 4652

Claims (13)

1.DNA质粒在制备DNA质粒疫苗中的用途，所述DNA质粒能够在所述哺乳动物的细胞中表达共有流感抗原以在所述哺乳动物中引发免疫反应，所述共有流感抗原包含共有的HA、NA、M1、M2e-NP或它们的组合，其中如下引发针对多种流感病毒亚型的免疫反应：
向所述哺乳动物的组织递送所述DNA质粒疫苗，并且
用有效允许所述DNA质粒进入细胞的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔，
其中
由编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的核酸序列来编码所述的共有HA，
由编码SEQ ID NO:4的核酸序列来编码所述的共有NA，
由编码SEQ ID NO:6的核酸序列来编码所述的共有M1，以及
由编码SEQ ID NO:8的核酸序列来编码所述的共有M2e-NP。
2.如权利要求1所述的用途，其中：
由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13所示核酸序列来编码所述的共有HA，
由SEQ ID NO:3所示核酸序列来编码所述的共有NA，
由SEQ ID NO:5所示核酸序列来编码所述的共有M1，以及
由SEQ ID NO:7所示核酸序列来编码所述的共有M2胞外结构域核蛋白(M2e-NP)。
3.如权利要求1-2中任一项所述的用途，其中递送步骤包括：
将所述DNA质粒疫苗注射到皮内、皮下或肌肉的组织中。
4.如权利要求1-2中任一项所述的用途，包括：
预先设定期望被递送到所述组织的电流；并且
用等于预设电流的恒定电流的能量脉冲将所述组织的细胞电穿孔。
5.如权利要求1-2中任一项所述的用途，其中电穿孔步骤还包括：
测量被电穿孔的细胞中的阻抗；
相对于被测量的阻抗调整所述能量脉冲的能量水平以在所述被电穿孔的细胞中保持恒定电流；
其中测量和调整步骤发生在所述能量脉冲的存在期内。
6.如权利要求1-2中任一项所述的用途，其中电穿孔步骤包括：
根据以分散模式递送所述能量脉冲的脉冲序列模式将所述能量脉冲递送至多个电极。
7.一种能够在哺乳动物的细胞中表达共有流感抗原的DNA质粒，包含：
编码共有的血球凝集素（HA）、神经氨酸酶（NA）、M1、M2胞外结构域核蛋白（M2e-NP）或它们的组合组成的核酸编码序列；
与所述编码序列可操作地连接的、调控所述共有流感抗原的表达的启动子；其中
所述编码共有的血球凝集素（HA）的核酸序列编码SEQ ID NO:2、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14，
所述编码共有的神经氨酸酶（NA）的核酸序列编码SEQ ID NO:4，
所述编码共有的M1的核酸序列编码SEQ ID NO:6，以及
所述编码共有的M2胞外结构域核蛋白（M2e-NP）的核酸序列编码SEQ ID NO:8。
8.如权利要求7所述的DNA质粒，其中
所述编码共有的血球凝集素（HA）的核酸序列是SEQ ID NO:1、SEQID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13，
所述编码共有的神经氨酸酶（NA）的核酸序列是SEQ ID NO:3，
所述编码共有的M1的核酸序列是SEQ ID NO:5，以及
所述编码共有的M2胞外结构域核蛋白（M2e-NP）的核酸序列是SEQID NO:7。
9.如权利要求7-8中任一项所述的DNA质粒，其中所述DNA质粒还包含与所述编码序列的N端末端相连并且与所述启动子可操作地连接的IgG前导序列。
10.如权利要求7-8中任一项所述的DNA质粒，其中所述DNA质粒还包含与所述编码序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。
11.如权利要求7-8中任一项所述的DNA质粒，其中所述DNA质粒是密码子优化的。
12.一种DNA质粒疫苗，包含多种不同的根据权利要求7所述的DNA质粒；
其中所述多种DNA质粒之一包含编码共有HA的序列，
所述多种DNA质粒之一包含编码共有NA的序列，
所述多种DNA质粒之一包含编码共有M1的序列，并且
所述多种DNA质粒之一包含编码共有M2e-NP的序列。
13.一种DNA质粒疫苗，包含多种不同的根据权利要求8所述的DNA质粒；
其中所述多种DNA质粒之一包含编码共有的血球凝集素（HA）的核酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13，
所述多种DNA质粒之一包含编码共有的神经氨酸酶（NA）的核酸序列SEQ ID NO:3，
所述多种DNA质粒之一包含编码共有的M1的核酸序列SEQ IDNO:5，以及
所述多种DNA质粒之一包含编码共有的M2胞外结构域核蛋白（M2e-NP）的核酸序列SEQ ID NO:7。
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