CN103333900A - 一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，含有选自以下的核苷酸序列：1）SEQIDNo.3中所示的第724-第1470位核苷酸序列；和/或SEQIDNo.1中所示的第724-第2472位核苷酸序列；2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。本发明的pVAX-CDPK1可有效地预防和控制弓形虫动物模型（昆明鼠）的感染，同时，pVAX-IL21-IL15不仅单独使用可有效地预防和控制弓形虫的感染，而且作为细胞因子佐剂可有效地提升疫苗pVAX-CDPK1的免疫效果。

Description

一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学领域,，尤其是涉及一种用于弓形虫感染预防的重组质粒。

背景技术

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T. gondii）是一种专性细胞内寄生的机会致病性原虫，属于孢子虫纲（Sporozoasida）真球虫目（Eucoccidiida）肉孢子虫科（Sarcocystidae）。所致的弓形虫病呈世界性范围分布，全球约1/3的人受感染，严重危害人类和动物的健康。弓形虫作为一种机会感染因子，可在免疫抑制或免疫缺陷患者中（如艾滋病患者、器官移植及恶性肿瘤患者等）引起严重的器官损害。妇女孕期首次感染弓形虫可引起流产、死胎以及胎婴先天性缺陷或畸形等。作为人兽共患病，弓形虫病对动物的影响也受到广泛关注。感染弓形虫可引起家畜发热、腹泻、呼吸困难及中枢神经系统疾病，可导致怀孕家畜流产、产弱胎或死胎，给畜牧业带来巨大的经济损失。弓形虫也可经肉、乳、蛋类大量流入食品市场，成为人类的传染源。猫是弓形虫的终末宿主，犬是中间宿主，作为伴侣动物，它们在弓形虫病的传播中也具有不可忽视的作用。因此，动物弓形虫病的流行和爆发也必将导致人类弓形虫病的流行和高发。弓形虫感染带来的危害如此严重，防治此病已刻不容缓。然而，由于弓形虫生活史复杂，目前还没有明确的、彻底的药物来预防弓形虫感染。虽然临床常以磺胺嘧啶和乙胺嘧啶联合用药为来治疗弓形虫病，但存在疗程长、不良反应多，疗效上不很理想，不能杀灭包囊等缺陷。因此目前，免疫预防尤其是DNA疫苗被认为是控制弓形虫病流行的重要措施。

目前，DNA疫苗已在抗寄生虫如：血吸虫，蛔虫，尤其是在原虫，包括疟原虫、利什曼原虫，锥虫等寄生虫的防治中得到广泛的应用，而且在抗弓形虫感染的疫苗研究也迈入了一个新的阶段，然而研究抗弓形虫的核酸疫苗却未取得较为理想的效果。究其原因，弓形虫生活史复杂，形态多样，宿主范围广泛，不同性质的抗原其免疫原也不同，而其包囊和速殖子的致病机制也存在差异，虽然能找到各种不同的单一抗原成分为基础的疫苗候选抗原，但是由于其含有的淋巴细胞结合位点少、受机体主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex, MHC)限制性大，而难以形成有效的抵抗力对抗弓形虫不同形态的攻击感染，因此仅靠少数的候选抗原基因也很难达到理想的效果，而找到更多的，更好的来源于不同弓形虫阶段的DNA疫苗候选抗原，尤其是与弓形虫毒力相关的抗原基因是研究抗弓形虫疫苗的一个重要途径。

同时，科研学者们提出核酸疫苗研究是否成功的关键，与多种因素相关，如佐剂、辅料、疫苗载体、给药途径等，因此这些理论证明在抗弓形虫的DNA疫苗中加入佐剂将极大的提高其免疫效果。大量的研究表明细胞因子具有明显的免疫佐剂效应，其可以纯化的蛋白质形式共同或提前免疫动物，也可将其编码的某些基因片段与疫苗DNA重组共同释放表达，从而调节免疫应答，增强和保护机体免受病毒、细菌和寄生虫的侵袭。截止到目前已有不少的细胞因子佐剂应用于抗弓形虫的疫苗研究中，如IL-2，IL-12，IL-7以及最近于我们实验室研究的IL-18（已发表的文章）等，这些细胞因子佐剂均能显著的增强疫苗的免疫保护效率。因此，细胞因子佐剂已逐渐成为弓形虫疫苗研究的又一趋势。

发明内容

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的基因，能有效的对抗弓形虫不同形态的攻击感染，可以应用其来制备感染预防弓形虫的疫苗。

弓形虫钙离子依赖蛋白酶1（CDPK1）是钙离子依赖性的胞吐作用所必要的调控酶，其能调控钙离子依赖的微线体（MICs）的分泌。当条件性敲除该蛋白时，弓形虫的一些重要表型就会被抑制如：虫体活力，入侵和逸出宿主细胞。这种重要功能的与弓形虫入侵有关的蛋白提示其能成为抗弓形虫的疫苗候选抗原。

IL-15是维持内环境“稳态”的细胞因子之一，能够显著的增强抗弓形虫的CD8+ T淋巴细胞介导的免疫应答，并延长免疫记忆T淋巴细胞的存活。同时，还发现IL-21对于抗慢性病毒感染是十分必要的，将IL-21和IL-15联合免疫能显著的提高抗原特异性的CD8+T细胞的效应功能。而且研究还表明IL-15和IL-21的联合能增强DNA疫苗抗HIV病毒感染的免疫保护性效果。因此IL-15和IL-21的联合具有成为抗弓形虫细胞因子佐剂的前景。

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：

1）SEQ ID No.3中所示的第724-第1470位核苷酸序列；和/或

SEQ ID No.1中所示的第724-第2472位核苷酸序列；

2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，例如所述载体为pVAX1载体。

本发明的第三个目的是提供一种重组质粒，其为SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；和/或SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列。

本发明的第四个目的是提供一种蛋白，其氨基酸序列由权利要求3所述的重组质粒编码。

本发明的第五个目的是提供一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。

本发明的第六个目的是提供权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的载体、权利要求3所述的重组质粒、权利要求4所述的蛋白、权利要求5所述的疫苗在弓形虫感染预防中的应用。

本发明的第七个目的是提供大量制备pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1重组质粒的方法，步骤如下：

（1）、将含有pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1质粒的菌液在Kan⁺ LB固体选择培养基上过夜培养，接种到Kan⁺ LB液体选择培养基中进行扩大培养；

（2）、将步骤（1）得到的细菌培养物离心取沉淀，重悬菌体；

（3）、将步骤（2）得到的菌液先后用Solution II和Solution III混匀，离心取上清；

（4）、将步骤（3）得到的上清用0.6倍体积±1ml的异丙醇混匀，离心取沉淀，将沉淀先用ddH₂O溶解，再加入LiCl溶液混匀，离心取上清，加入异丙醇混匀后离心弃上清，控干，得白色沉淀物；

（5）、将步骤（4）制备的白色沉淀物除RNA，加入无水乙醇和NaAc溶液混匀后离心取沉淀，洗脱沉淀。

进一步地，步骤（2）后不包含加入溶菌酶溶液振荡混匀的步骤。

进一步地，步骤（3）中Solution II和Solution III加入的时间间隔控制在5min以内。

进一步地，步骤（5）中离心取沉淀的方法为将上清吸出，再倒置于滤纸上控干。

本发明的pVAX-CDPK1可有效地预防和控制弓形虫动物模型（昆明鼠）的感染，同时，pVAX-IL21-IL15不仅单独使用可有效地预防和控制弓形虫的感染，而且作为细胞因子佐剂可有效地提升疫苗pVAX-CDPK1的免疫效果。由此认为pVAX-CDPK1可作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫感染，而且重组的pVAX-IL21-IL15可以作为免疫治疗剂或细胞因子佐剂用于抗弓形虫的感染。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是pVAX-CDPK1构建路线；

图2是pVAX-IL21-IL15构建路线；

图3是弓形虫RH株死亡曲线图；

图4是pMD18-T 质粒；

图5是pVAX1质粒。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

雌性KM鼠，6w龄左右，体重20±2g，购自兰州大学医学实验中心。

宿主菌，弓形虫RH、PRU株，pVAX1真核表达载体等材料，均为中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫功能基因组学研究室保存并提供。

PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2（货号：RR055B）、10×PCR Buffer（Mg²⁺ free）、MgCl₂（25mmol/L）、dNTP Mixture（2.5mmol/L each）、Ex-Taq（5U/μL）（货号：DDR100D）、pMD18-T Vector（货号：D103A）、BamH I（货号：D1010A）、XhoI（货号：D1094A）、KpnI（货号：D1068A）、PstI（货号：D1073A）、XbaI（货号：D1093A）、10×M Buffer、10×K Buffer、10×和6×Loading Buffer：购自TaKaRa公司；

Wizard^® SV Genomic DNA Purification System（货号：A2360）、Tris-Cl、EDTA、IPTG、X-gal、T4 DNA连接酶：购自Promega公司；

RNAprep Pure Tissue Kit（货号：DP431）、TIANprep Mini Plasmid Kit（货号：DP103-02）、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（货号：货号：DP209-02）、普通DNA产物纯化试剂盒（货号：DP204-02）：购自天根生化科技（北京）有限公司；

氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、琼脂糖：购自Sigma公司；

其他化学试剂如NaCl、、无水乙醇等均为国产分析纯级产品。

一、 pVAX-CDPK1 重组质粒的制备步骤如下：

1 ．弓形虫 RH 株总 RNA 的提取：将弓形虫RH株腹腔接种KM鼠，96 h后，经颈椎脱臼致死，无菌收集小鼠腹水1.0mL，在10000转/分钟转速下离心3～5min，弃上清，备用。用天根生化科技（北京）有限公司试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit提取弓形虫RH株总RNA，提取的具体方法和步骤参见说明书。

扩增：以所提取的弓形虫RH株总RNA为模板，用大连宝生物工程公司PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒进行CDPK1基因的RT-PCR扩增，使用方法参见说明书。其中，

上游引物：FCDPK1：5′- CGGGGTACCATGGGGCAGCAGGAAAGCAC-3′；

下游引物：RCDPK1：5′-GCTCTAGATTAGTTTCCGCAGAGCTTCAAGA-3′；

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58.8℃复性1min，72℃延伸 2min，35个循环，最后，72℃延伸10min。

扩增产物的连接与转化：将步骤2中的扩增产物与pMD连接，连接反应使用TaKaRa公司的pMD^TM18-T Vector，使用方法参见说明书，连接条件为16℃反应2～4h或4℃连接过夜，连接产物标记为pMD18- CDPK1。

的序列测定：将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。测序结果见SEQ ID No.1中所示的第724-第2472位核苷酸序列。其编码的蛋白序列见SEQ ID No.2。

质粒的小量提取：用天根生化科技（北京）有限公司的TIANprep Mini Plasmid Kit进行质粒提取，使用方法参照说明书。

载体（图 5 所示）及 CDPK1 目的片段的回收：用Kpn I和Xba I分别双酶切pVAX1质粒及pMD18-CDPK1重组质粒，并用天根生化科技（北京）有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体及目的片段，使用方法参照说明书。

载体及 CDPK1 目的片段的连接：将经切胶回收纯化得到的CDPK1基因片段定向亚克隆至pVAX1载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-CDPK1。其核苷酸序列见SEQ ID No.1，其中，第724-第2472位核苷酸序列为CDPK1的核苷酸序列（已用下划线标出）。

连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化至大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。产物标记为pVAX-CDPK1。pVAX-CDPK1构建路线参照图1。

二、 KM 鼠 pVAX-IL21-IL15 重组质粒的构建

1. KM 鼠脾脏总 RNA 的提取：弓形虫RH株腹腔接种KM鼠72 h后，将其经颈椎脱臼致死，并将其置75%乙醇溶液中浸泡2～3min，无菌取出脾脏。将脾脏装入一个RNase-Free离心管，用天根生化科技（北京）有限公司试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit提取KM鼠脾脏总RNA，提取的具体方法和步骤参见说明书；

2. RT-PCR 扩增目的片段：以KM鼠脾脏总RNA为模板，用大连宝生物工程公司PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒进行IL21和IL15基因序列的RT-PCR扩增，使用方法参见说明书。其中：

IL15基因引物序列：

上游引物：F_15B：5′-AACTGCAGATGAACTGGATAGATGTAAGATATG-3′；

下游引物：R_15B：5′-TGCTCTAGATCAGGACGTGTTGATGAAC-3′；

IL21基因引物序列：

上游引物：F₂₁：5′-CGGGGTACCATGCATAAATCAAGCCCCCAAG-3′ ；

下游引物：R₂₁：5′-AACTGCAGCTAGGAGAGATGCTGATGAATC-3′；

3. RT-PCR 扩增产物的连接：将步骤2中的扩增产物分别与pMD连接，连接反应使用TaKaRa公司的pMD^TM18-T Vector，使用方法参见说明书；连接条件为16℃反应2～4h或4℃连接过夜，产物依次标记为pMD18-IL21和pMD18-IL15。

和 pMD18-IL15 重组质粒的小量提取：用天根生化科技（北京）有限公司的TIANprep Mini Plasmid Kit进行质粒提取，使用方法参见说明书。

和 IL15 的序列测定：将经菌液PCR和双酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。

及目的片段 IL15 的回收与连接：用Pst I和Xba I双酶切pVAX1质粒和pMD18-IL15重组质粒，用天根生化科技（北京）有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体及目的片段，使用方法参见说明书。然后将经切胶回收纯化得到的IL15基因片段定向亚克隆到相应pVAX1载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-IL15。

连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化至大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。

和 pMD18-IL21 重组质粒的小量提取：用天根生化科技（北京）有限公司的TIANprep Mini Plasmid Kit进行质粒提取，使用方法参见说明书。

及目的片段 IL21 的回收与连接：用Kpn I和Pst I双酶切pVAX-IL15和pMD18-IL21重组质粒。用天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收线性载体pVAX-IL15及目的片段IL21，使用方法参见说明书，将经切胶回收纯化得到的IL21基因片段定向亚克隆到pVAX-IL15载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-IL21-IL15。pVAX-IL21-IL15构建路线参照图2。

连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化至大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。

的序列测定与保存：将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，于-20℃进行保存，送到上海生工生物工程有限公司测序。pVAX-IL21-IL15的序列见SEQ ID No.3。其中，第724-1116位核苷酸序列为IL21基因序列，第1123-1470为核苷酸序列为IL15基因序列（已分别用下划线标出）。IL21基因编码的蛋白序列见SEQ ID No.4，IL15基因编码的蛋白序列见SEQ ID No.5。

三、培养基和溶液的配制：

a、溶液的配制：

（1）LB液体培养基

称取LB粉末5.0g，加适量的去离子水溶解，并定容至200mL，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

（2）LB固体培养基

于LB液体培养基中加入2.0%（m/V）琼脂粉，121℃高压灭菌20min，待其冷却到55℃～65℃时倾注平板，待凝固后4℃保存备用。

（3）Kan⁺ LB选择液体培养基

待（1）中制备的LB液体培养基高压灭菌后冷却至50℃～55℃时，加入Kan（卡那霉素）（终浓度为1000IU/mL），摇晃混匀后4℃保存。

（4）Kan⁺ LB固体选择培养基

待（2）中制备的LB固体培养基灭菌后冷却至50℃～55℃时，加入Kan（终浓度为1000IU/mL）并轻轻摇动，混匀后迅速倾注平板，室温凝固并于4℃保存备用。

b、质粒大量提取时溶液的配制：

（1）0.25mol/L Tris-Cl溶液（pH8.0）

称取Tris-Cl粉末6.055g，并将其溶解到100mL ddH₂O中，调节pH值为8.0，定容到200mL，高压灭菌后4℃保存备用。

（2）0.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0）

称取Na₂EDTA 37.22g，溶于200mL ddH₂O中，振荡混匀，调节pH值为8.0，高压灭菌后4℃保存备用。

（3）TE溶液（pH8.0）

先将（1）中制备的0.25mol/L Tris-Cl溶液和（2）中制备的0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）稀释，并分别吸取10mmol/L Tris-Cl l.0mL与1mmol/L EDTA 0.2mL，加入无菌ddH₂O后定容到100mL，4℃保存备用。

（4）10% SDS溶液（pH7.2）

称取SDS（十二烷基磺酸钠）粉末10g，加入去离子水90mL后60℃水浴溶解，用浓HCl将其pH值调为7.2，并定容到100mL，现配现用，不宜长期保存。

（5）2mol/L NaOH溶液

先于烧杯中加入去离子水160mL，称取NaOH粉末16.0g并缓缓加入到去离子水中，边加边混匀，定容到200mL后于塑料瓶中4℃保存。

（6）Solution I

取（1）中制备的0.25mol/L Tris-C1 10mL，（2）中制备的0.5mol/LEDTA 2mL，加去离子水定容到100mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

（7）Solution II

取2mol/L NaOH 10mL，10% SDS 10mL，加去离子水定容到100mL，现配现用，常温保存，不宜长时间存放。

（8）Solution III

称取KAc粉末58.884g，与冰乙酸23mL混合，加入适量去离子水溶解后定容到200mL，4℃保存。

（9）3mol/L NaAc溶液（pH5.2）

称取无水NaAc 49.22g，加去离子水定容到200mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

（10）5mol/L LiCl溶液

称取无水LiCl 42.4g，加去离子水定容到200mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

（11）10mg/mL溶菌酶

使用前，称取10mg的溶菌酶，加10mmol/L的Tris-Cl（PH8.0）即刻溶解定容至1mL，-20℃保存。

四、大量制备质粒

1. 挑取步骤（一）和（二）中制备的已保存于-20℃的含有目的质粒（pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1）的阳性菌液于Kan⁺ LB固体选择培养基上划线，37℃培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于12mL Kan⁺ LB液体选择培养基中，摇床37℃，以180～220转/分钟的转速培养12～16h。将上述培养菌液以体积比1：100的比例接种到装有400mL Kan⁺ LB液体选择培养基的1000mL锥形瓶中，摇床37℃，在180～220转/分钟转速下培养过夜。

2. 将步骤1得到的细菌培养物置于冰中或4℃冰箱数分钟，4℃，以9000转/分钟转速离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清（利用移液器小心吸出上清），倒置离心管使上清尽量流出。用10mL 4℃预冷的Solution I重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在Solution I中完全分散。（由于旋涡振荡和Solution I的加入已足够是菌液裂解分散，为了简化操作，此处省去现有技术中进一步裂解分散的步骤：加入1mL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液（pH8.0），震荡混匀）。

3. 在步骤2得到的菌液中加入20mL新配制的Solution II，轻摇并上下颠倒混匀2～4次。再加入15mL 4℃预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或-20℃冰箱放置10min。加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，利用4层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中。

4. 将步骤3得到的上清与14-16mL异丙醇（现有技术中此处需加入0.6倍体积的异丙醇的方法，本申请人通过实验发现，异丙醇的加入量在0.6倍体积上下各1ml的范围内，是不影响产物的提取质量和产量的）混匀，室温放置10min。室温下，在11000转/分钟下离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上数分钟，除去残余。加入3mL ddH₂O充分溶解，再加入3mL预冷的5mol/L LiCl溶液（此时需先加ddH₂O，后加LiCl，才能使沉淀充分溶解，颠倒步骤易造成沉淀溶解不充分或不溶解），充分混匀，此处不可用吹打的方式混匀。吹打混匀易使提取的质粒发生断裂，两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积（12mL）预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，小心弃上清，倒置控干管内液体，一般倒置10～15min即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。

5. 在步骤4制备的白色沉淀物中加入3mL ddH₂O或TE溶液（pH8.0）溶解沉淀，并加入30μL 10mg/mL RNase A（Takara公司产品），37℃水浴1h除去RNA。加入2倍体积（8mL）无水乙醇和1/10体积（400μL）的3mol/L NaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min。4℃，在11000转/分钟下离心10min，小心将上清吸出（勿用倾倒的方式除去上清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出），并将离心管倒置于滤纸上控干（主要控干残余的试剂如：乙醇和NaAc，减少杂质，提高质粒的纯度）。加入100μL ddH₂O或TE溶液（pH8.0），充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，测出的浓度为10000mg/mL。因此，我们将以保存浓度为1000mg/mL（十倍稀释）的量分装于1.5mL离心管中，即每管保存有1000 mg质粒，体积为1mL，分装封口后于-20℃保存备用。

五、质粒DNA的纯度检测

以ddH₂O或TE（pH8.0）为空白对照，用分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度（OD）值。双链DNA纯品的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8，若样品OD₂₆₀/OD₂₈₀值低于1.8，说明样品可能被蛋白质污染，需进一步纯化。

六、重组质粒的免疫效果评价

1. KM 鼠免疫与分组：为了降低应激反应，KM鼠买回后需饲养1周，然后将其随机分为6个组，每组30只，每组进行的免疫实验情况见表1。

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以左后腿胫后肌注射途径进行免疫，首先将空载体pVAX1和提取纯化的重组质粒pVAX-IL21-IL15、pVAX-CDPK1用PBS（pH7.4）溶液稀释至100μg/100μL，分别给第3～5组中每只小鼠各注射100μL；再将纯化的重组质粒pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1用PBS（pH7.4）溶液稀释至200μg/100μL，然后将pVAX-IL21-IL15与pVAX-CDPK1等体积混合，混匀后于第6组中每只小鼠各注射100μL。初次免疫后，按照同样的剂量，于第2周和第4周对第Ⅱ组至第Ⅵ组加强免疫一次。

腹腔注射感染弓形虫 RH 株：弓形虫RH株的复苏需在攻虫前2周进行。从液氮罐中取出保存有弓形虫RH株虫体的冻存管，并立即将其放入37℃温水中进行解冻。将冻存管中的液体混匀，每只小鼠腹腔注射200μL，进行第一次传代。待感染小鼠发病（4～6d），颈椎脱臼处死后无菌采集小鼠腹水1～2mL。混匀后，吸取10μL腹水进行镜检。按照上述方式进行第二和第三次传代。将经第三次传代纯化后所得虫体按1×10³个速殖子/只的剂量，腹腔接种各组小鼠各15只，观察并记录其存活时间。见表2。

灌胃感染弓形虫 PRU 株：弓形虫PRU株的准备需在攻虫前30天进行。颈椎脱臼处死被弓形虫PRU株感染的小鼠，75%酒精浸泡2～3min。取出并于超净工作台中，无菌采集脑组织并将其置于研钵中，加入1mL生理盐水进行研磨。待研磨完全后，吸取10μL进行镜检，并观察计数。按10个包囊/只的剂量，以灌胃的方式感染各组小鼠各6只，攻虫后30天进行脑包囊计数。见表3。

本发明的有益效果将通过以下数据说明：

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如图2所示，与对照组（Control，PBS和pVAX1）相比，实验组小鼠存活时间均显著性增加，pVAX-IL21-IL15+pVAX-CDPK1，pVAX-IL21-IL15和 pVAX-CDPK1的存活时间分别为19.3±5.19^D，12.0±2.01^B，17.3±4.31^C；与pVAX-IL21-IL15或 pVAX-CDPK1相比，pVAX-IL21-IL15+pVAX-CDPK1更能显著性增加实验鼠感染T. gondii RH株后的存活天数；6d内对照组小鼠无存活。

从上述表格可以看出，无论是减少PRU脑包囊数目，还是延缓RH的死亡时间，都说明重组质粒pVAX-CDPK1可有效地起到良好的免疫效果，重组细胞因子质粒pVAX-IL21-IL15与pVAX-CDPK1的联合使用能进一步地有效地提升pVAX-CDPK1的免疫效果，可作为一种良好的免疫佐剂应用于实际的弓形虫感染预防中。

综上所述，本发明的pVAX-CDPK1可有效地预防和控制弓形虫动物模型（昆明鼠）的感染，同时，pVAX-IL21-IL15不仅单独使用可有效地预防和控制弓形虫的感染，而且作为细胞因子佐剂可有效地提升疫苗pVAX-CDPK1的免疫效果。由此可认为pVAX-CDPK1可作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫感染，而且重组的pVAX-IL21-IL15可以作为免疫治疗剂或细胞因子佐剂用于抗弓形虫的感染。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4679

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accatggggc agcaggaaag cactcttggg ggtgcggccg gggagcctcg ctcgcgcggt 780

catgcggcgg ggaccagcgg tggaccagga gaccatctcc acgcgacgcc cgggatgttc 840

gttcagcatt cgactgcgat cttctccgac cggtacaagg gacagcgggt gttggggaag 900

gggtcttttg gtgaggtgat tctgtgcaaa gacaagatca ccggtcagga gtgtgcggtg 960

aaggtcatta gcaagcgcca agtgaagcag aagacggaca aggagtctct gcttcgcgag 1020

gtgcagttgc tgaagcagct ggaccacccc aacatcatga agctgtatga attcttcgag 1080

gacaaaggct acttctacct cgtcggcgaa gtgtacacgg gaggcgagtt gttcgacgag 1140

atcatttccc gcaagcgctt cagcgaagtc gatgcggcgc ggatcatccg ccaagtcctc 1200

agcggcatca cgtacatgca caaaaataaa atcgtacatc gggacctcaa accggaaaac 1260

ctgctcctgg aaagcaaaag caaggacgcg aacatccgca tcatcgactt tggcctcagc 1320

actcacttcg aagcgagcaa gaagatgaag gacaaaatcg gaactgcata ctacatcgca 1380

cccgaggtcc tccacggcac ttacgacgag aaatgcgacg tatggtcgac cggtgttatt 1440

ctctacatcc ttctttccgg tgagtctgta ccgcgcagtg ctttcccggt ctctcctcgc 1500

tcttcaagtt ctttttgctc ttcaagttcg ttttgctctc caggtctccc ggtgtacctg 1560

cagaaaagag agataaaatc ttgtgttgct ttctatgtgg ggatgcagag ggatgcatgt 1620

gcactcatat atctgggaac gcaggatgcc agagcaggcg catttttccc cgacgagaag 1680

ccaagatgcc cacccttcaa tggagcaaac gagtacgaca tcctgaagaa ggttgagaaa 1740

ggcaagtaca cctttgaact gcctcagtgg aagaaagtgt cagagagcgc aaaagatttg 1800

attcgcaaaa tgctgaccta cgtccccagc atgagaatca gcgcgcgaga tgctctggac 1860

cacgagtgga tccagaccta cacgaaggag cagatcagcg tggacgttcc gtctctggac 1920

aacgccattc tcaacatccg acagttccaa ggcactcaga agctcgcgca agctgcgctg 1980

ctctacatgg gctcgaaact gacaagccaa gacgaaacga aggaactgac ggccatcttc 2040

cataagatgg acaagaatgg agacgggcaa ctggaccgtg cagagctcat cgaagggtac 2100

aaggagttga tgcggatgaa gggccaagat gcgagcatgc tcgacgcgag cgctgttgaa 2160

cacgaagttg accaggtctt ggacgcagtc gacttcgaca aaaacggcta catcgagtac 2220

tctgagttcg tcaccgtggc gatggacaga aagacgctgc tttcgcgaga acgcctggag 2280

cgcgccttcc ggatgtttga ctccgacaac tcaggaaaga tttcttccac tgagctggcc 2340

accatctttg gcgtctccga cgtggacagc gaaacatgga agagcgtgct gtctgaggtc 2400

gacaagaata acgacggcga agtcgacttt gacgagtttc aacagatgct cttgaagctc 2460

tgcggaaact aactagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 2520

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 2580

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 2640

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 2700

gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 2760

aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 2820

aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca 2880

agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 2940

ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 3000

tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 3060

cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 3120

gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 3180

gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 3240

agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 3300

attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 3360

tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 3420

caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 3480

cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 3540

gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 3600

tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 3660

gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt 3720

cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc 3780

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 3840

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa 3900

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3960

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 4020

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 4080

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 4140

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 4200

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 4260

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 4320

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 4380

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 4440

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 4500

agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 4560

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 4620

agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt 4679

<210> 2

<211> 582

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Gln Gln Glu Ser Thr Leu Gly Gly Ala Ala Gly Glu Pro Arg

1 5 10 15

Ser Arg Gly His Ala Ala Gly Thr Ser Gly Gly Pro Gly Asp His Leu

20 25 30

His Ala Thr Pro Gly Met Phe Val Gln His Ser Thr Ala Ile Phe Ser

35 40 45

Asp Arg Tyr Lys Gly Gln Arg Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Glu

50 55 60

Val Ile Leu Cys Lys Asp Lys Ile Thr Gly Gln Glu Cys Ala Val Lys

65 70 75 80

Val Ile Ser Lys Arg Gln Val Lys Gln Lys Thr Asp Lys Glu Ser Leu

85 90 95

Leu Arg Glu Val Gln Leu Leu Lys Gln Leu Asp His Pro Asn Ile Met

100 105 110

Lys Leu Tyr Glu Phe Phe Glu Asp Lys Gly Tyr Phe Tyr Leu Val Gly

115 120 125

Glu Val Tyr Thr Gly Gly Glu Leu Phe Asp Glu Ile Ile Ser Arg Lys

130 135 140

Arg Phe Ser Glu Val Asp Ala Ala Arg Ile Ile Arg Gln Val Leu Ser

145 150 155 160

Gly Ile Thr Tyr Met His Lys Asn Lys Ile Val His Arg Asp Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Asn Leu Leu Leu Glu Ser Lys Ser Lys Asp Ala Asn Ile Arg

180 185 190

Ile Ile Asp Phe Gly Leu Ser Thr His Phe Glu Ala Ser Lys Lys Met

195 200 205

Lys Asp Lys Ile Gly Thr Ala Tyr Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu His

210 215 220

Gly Thr Tyr Asp Glu Lys Cys Asp Val Trp Ser Thr Gly Val Ile Leu

225 230 235 240

Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Glu Ser Val Pro Arg Ser Ala Phe Pro Val

245 250 255

Ser Pro Arg Ser Ser Ser Ser Phe Cys Ser Ser Ser Ser Phe Cys Ser

260 265 270

Pro Gly Leu Pro Val Tyr Leu Gln Lys Arg Glu Ile Lys Ser Cys Val

275 280 285

Ala Phe Tyr Val Gly Met Gln Arg Asp Ala Cys Ala Leu Ile Tyr Leu

290 295 300

Gly Thr Gln Asp Ala Arg Ala Gly Ala Phe Phe Pro Asp Glu Lys Pro

305 310 315 320

Arg Cys Pro Pro Phe Asn Gly Ala Asn Glu Tyr Asp Ile Leu Lys Lys

325 330 335

Val Glu Lys Gly Lys Tyr Thr Phe Glu Leu Pro Gln Trp Lys Lys Val

340 345 350

Ser Glu Ser Ala Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met Leu Thr Tyr Val Pro

355 360 365

Ser Met Arg Ile Ser Ala Arg Asp Ala Leu Asp His Glu Trp Ile Gln

370 375 380

Thr Tyr Thr Lys Glu Gln Ile Ser Val Asp Val Pro Ser Leu Asp Asn

385 390 395 400

Ala Ile Leu Asn Ile Arg Gln Phe Gln Gly Thr Gln Lys Leu Ala Gln

405 410 415

Ala Ala Leu Leu Tyr Met Gly Ser Lys Leu Thr Ser Gln Asp Glu Thr

420 425 430

Lys Glu Leu Thr Ala Ile Phe His Lys Met Asp Lys Asn Gly Asp Gly

435 440 445

Gln Leu Asp Arg Ala Glu Leu Ile Glu Gly Tyr Lys Glu Leu Met Arg

450 455 460

Met Lys Gly Gln Asp Ala Ser Met Leu Asp Ala Ser Ala Val Glu His

465 470 475 480

Glu Val Asp Gln Val Leu Asp Ala Val Asp Phe Asp Lys Asn Gly Tyr

485 490 495

Ile Glu Tyr Ser Glu Phe Val Thr Val Ala Met Asp Arg Lys Thr Leu

500 505 510

Leu Ser Arg Glu Arg Leu Glu Arg Ala Phe Arg Met Phe Asp Ser Asp

515 520 525

Asn Ser Gly Lys Ile Ser Ser Thr Glu Leu Ala Thr Ile Phe Gly Val

530 535 540

Ser Asp Val Asp Ser Glu Thr Trp Lys Ser Val Leu Ser Glu Val Asp

545 550 555 560

Lys Asn Asn Asp Gly Glu Val Asp Phe Asp Glu Phe Gln Gln Met Leu

565 570 575

Leu Lys Leu Cys Gly Asn

580

<210> 3

<211> 3678

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accatgcata aatcaagccc ccaagggcca gatcgcctcc tgattagact tcgtcacctt 780

attgacattg ttgaacagct gaaaatctat gaaaatgact tggatcctga acttctatca 840

gctccacaag atgtaaaggg gcactgtgag catgcagctt ttgcctgttt tcagaaggcc 900

aaactcaagc catcaaaccc tggaaacaat aagacattca tcattgacct cgtggcccag 960

ctcaggagga ggctgcctgc caggagggga ggaaagaaac agaagcacat agctaaatgc 1020

ccttcctgtg attcgtatga gaaaaggaca cccaaagaat tcctagaaag actaaaatgg 1080

ctccttcaaa agatgattca tcagcatctc tcctagctgc agatgaactg gatagatgta 1140

agatatgacc tggagaaaat tgaaagcctt attcaatcta ttcatattga caccacttta 1200

tacactgaca gtgactttca tcccagttgc aaagttactg caatgaactg ctttctcctg 1260

gaattgcagg ttattttaca tgagtacagt aacatgactc ttaatgaaac agtaagaaac 1320

gtgctctacc ttgcagacag cactctgtct tctaacaaga atgtagcaga atctggctgc 1380

aaggaatgtg aggagctgga ggagaaaacc ttcacagagt ttttgcaaag ctttatacgc 1440

attgtccaaa tgttcatcaa cacgtcctga tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1500

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1560

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1620

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1680

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact 1740

gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg 1800

ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca 1860

ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 1920

gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 1980

aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 2040

ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 2100

ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 2160

aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 2220

accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 2280

ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 2340

ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 2400

cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 2460

tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 2520

tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 2580

gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 2640

tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa 2700

ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 2760

cacaccgcat acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 2820

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 2880

ataatagcac gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 2940

tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3000

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3060

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3120

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 3180

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3240

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3300

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3360

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3420

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3480

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3540

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3600

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctgggct tttgctggcc 3660

ttttgctcac atgttctt 3678

<210> 4

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu

1 5 10 15

Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp

20 25 30

Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys

35 40 45

Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser

50 55 60

Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile

85 90 95

Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu

100 105 110

Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His

115 120 125

Leu Ser

130

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe

20 25 30

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu

35 40 45

Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val

50 55 60

Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asp Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn

65 70 75 80

Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr

85 90 95

Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile

100 105 110

Asn Thr Ser

115

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4679

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accatggggc agcaggaaag cactcttggg ggtgcggccg gggagcctcg ctcgcgcggt 780

catgcggcgg ggaccagcgg tggaccagga gaccatctcc acgcgacgcc cgggatgttc 840

gttcagcatt cgactgcgat cttctccgac cggtacaagg gacagcgggt gttggggaag 900

gggtcttttg gtgaggtgat tctgtgcaaa gacaagatca ccggtcagga gtgtgcggtg 960

aaggtcatta gcaagcgcca agtgaagcag aagacggaca aggagtctct gcttcgcgag 1020

gtgcagttgc tgaagcagct ggaccacccc aacatcatga agctgtatga attcttcgag 1080

gacaaaggct acttctacct cgtcggcgaa gtgtacacgg gaggcgagtt gttcgacgag 1140

atcatttccc gcaagcgctt cagcgaagtc gatgcggcgc ggatcatccg ccaagtcctc 1200

agcggcatca cgtacatgca caaaaataaa atcgtacatc gggacctcaa accggaaaac 1260

ctgctcctgg aaagcaaaag caaggacgcg aacatccgca tcatcgactt tggcctcagc 1320

actcacttcg aagcgagcaa gaagatgaag gacaaaatcg gaactgcata ctacatcgca 1380

cccgaggtcc tccacggcac ttacgacgag aaatgcgacg tatggtcgac cggtgttatt 1440

ctctacatcc ttctttccgg tgagtctgta ccgcgcagtg ctttcccggt ctctcctcgc 1500

tcttcaagtt ctttttgctc ttcaagttcg ttttgctctc caggtctccc ggtgtacctg 1560

cagaaaagag agataaaatc ttgtgttgct ttctatgtgg ggatgcagag ggatgcatgt 1620

gcactcatat atctgggaac gcaggatgcc agagcaggcg catttttccc cgacgagaag 1680

ccaagatgcc cacccttcaa tggagcaaac gagtacgaca tcctgaagaa ggttgagaaa 1740

ggcaagtaca cctttgaact gcctcagtgg aagaaagtgt cagagagcgc aaaagatttg 1800

attcgcaaaa tgctgaccta cgtccccagc atgagaatca gcgcgcgaga tgctctggac 1860

cacgagtgga tccagaccta cacgaaggag cagatcagcg tggacgttcc gtctctggac 1920

aacgccattc tcaacatccg acagttccaa ggcactcaga agctcgcgca agctgcgctg 1980

ctctacatgg gctcgaaact gacaagccaa gacgaaacga aggaactgac ggccatcttc 2040

cataagatgg acaagaatgg agacgggcaa ctggaccgtg cagagctcat cgaagggtac 2100

aaggagttga tgcggatgaa gggccaagat gcgagcatgc tcgacgcgag cgctgttgaa 2160

cacgaagttg accaggtctt ggacgcagtc gacttcgaca aaaacggcta catcgagtac 2220

tctgagttcg tcaccgtggc gatggacaga aagacgctgc tttcgcgaga acgcctggag 2280

cgcgccttcc ggatgtttga ctccgacaac tcaggaaaga tttcttccac tgagctggcc 2340

accatctttg gcgtctccga cgtggacagc gaaacatgga agagcgtgct gtctgaggtc 2400

gacaagaata acgacggcga agtcgacttt gacgagtttc aacagatgct cttgaagctc 2460

tgcggaaact aactagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 2520

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 2580

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 2640

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 2700

gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 2760

aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 2820

aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca 2880

agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 2940

ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 3000

tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 3060

cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 3120

gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 3180

gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 3240

agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 3300

attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 3360

tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 3420

caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 3480

cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 3540

gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 3600

tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 3660

gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt 3720

cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc 3780

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 3840

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa 3900

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3960

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 4020

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 4080

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 4140

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 4200

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 4260

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 4320

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 4380

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 4440

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 4500

agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 4560

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 4620

agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt 4679

<210> 2

<211> 582

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Gln Gln Glu Ser Thr Leu Gly Gly Ala Ala Gly Glu Pro Arg

1 5 10 15

Ser Arg Gly His Ala Ala Gly Thr Ser Gly Gly Pro Gly Asp His Leu

20 25 30

His Ala Thr Pro Gly Met Phe Val Gln His Ser Thr Ala Ile Phe Ser

35 40 45

Asp Arg Tyr Lys Gly Gln Arg Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Glu

50 55 60

Val Ile Leu Cys Lys Asp Lys Ile Thr Gly Gln Glu Cys Ala Val Lys

65 70 75 80

Val Ile Ser Lys Arg Gln Val Lys Gln Lys Thr Asp Lys Glu Ser Leu

85 90 95

Leu Arg Glu Val Gln Leu Leu Lys Gln Leu Asp His Pro Asn Ile Met

100 105 110

Lys Leu Tyr Glu Phe Phe Glu Asp Lys Gly Tyr Phe Tyr Leu Val Gly

115 120 125

Glu Val Tyr Thr Gly Gly Glu Leu Phe Asp Glu Ile Ile Ser Arg Lys

130 135 140

Arg Phe Ser Glu Val Asp Ala Ala Arg Ile Ile Arg Gln Val Leu Ser

145 150 155 160

Gly Ile Thr Tyr Met His Lys Asn Lys Ile Val His Arg Asp Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Asn Leu Leu Leu Glu Ser Lys Ser Lys Asp Ala Asn Ile Arg

180 185 190

Ile Ile Asp Phe Gly Leu Ser Thr His Phe Glu Ala Ser Lys Lys Met

195 200 205

Lys Asp Lys Ile Gly Thr Ala Tyr Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu His

210 215 220

Gly Thr Tyr Asp Glu Lys Cys Asp Val Trp Ser Thr Gly Val Ile Leu

225 230 235 240

Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Glu Ser Val Pro Arg Ser Ala Phe Pro Val

245 250 255

Ser Pro Arg Ser Ser Ser Ser Phe Cys Ser Ser Ser Ser Phe Cys Ser

260 265 270

Pro Gly Leu Pro Val Tyr Leu Gln Lys Arg Glu Ile Lys Ser Cys Val

275 280 285

Ala Phe Tyr Val Gly Met Gln Arg Asp Ala Cys Ala Leu Ile Tyr Leu

290 295 300

Gly Thr Gln Asp Ala Arg Ala Gly Ala Phe Phe Pro Asp Glu Lys Pro

305 310 315 320

Arg Cys Pro Pro Phe Asn Gly Ala Asn Glu Tyr Asp Ile Leu Lys Lys

325 330 335

Val Glu Lys Gly Lys Tyr Thr Phe Glu Leu Pro Gln Trp Lys Lys Val

340 345 350

Ser Glu Ser Ala Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met Leu Thr Tyr Val Pro

355 360 365

Ser Met Arg Ile Ser Ala Arg Asp Ala Leu Asp His Glu Trp Ile Gln

370 375 380

Thr Tyr Thr Lys Glu Gln Ile Ser Val Asp Val Pro Ser Leu Asp Asn

385 390 395 400

Ala Ile Leu Asn Ile Arg Gln Phe Gln Gly Thr Gln Lys Leu Ala Gln

405 410 415

Ala Ala Leu Leu Tyr Met Gly Ser Lys Leu Thr Ser Gln Asp Glu Thr

420 425 430

Lys Glu Leu Thr Ala Ile Phe His Lys Met Asp Lys Asn Gly Asp Gly

435 440 445

Gln Leu Asp Arg Ala Glu Leu Ile Glu Gly Tyr Lys Glu Leu Met Arg

450 455 460

Met Lys Gly Gln Asp Ala Ser Met Leu Asp Ala Ser Ala Val Glu His

465 470 475 480

Glu Val Asp Gln Val Leu Asp Ala Val Asp Phe Asp Lys Asn Gly Tyr

485 490 495

Ile Glu Tyr Ser Glu Phe Val Thr Val Ala Met Asp Arg Lys Thr Leu

500 505 510

Leu Ser Arg Glu Arg Leu Glu Arg Ala Phe Arg Met Phe Asp Ser Asp

515 520 525

Asn Ser Gly Lys Ile Ser Ser Thr Glu Leu Ala Thr Ile Phe Gly Val

530 535 540

Ser Asp Val Asp Ser Glu Thr Trp Lys Ser Val Leu Ser Glu Val Asp

545 550 555 560

Lys Asn Asn Asp Gly Glu Val Asp Phe Asp Glu Phe Gln Gln Met Leu

565 570 575

Leu Lys Leu Cys Gly Asn

580

<210> 3

<211> 3678

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accatgcata aatcaagccc ccaagggcca gatcgcctcc tgattagact tcgtcacctt 780

attgacattg ttgaacagct gaaaatctat gaaaatgact tggatcctga acttctatca 840

gctccacaag atgtaaaggg gcactgtgag catgcagctt ttgcctgttt tcagaaggcc 900

aaactcaagc catcaaaccc tggaaacaat aagacattca tcattgacct cgtggcccag 960

ctcaggagga ggctgcctgc caggagggga ggaaagaaac agaagcacat agctaaatgc 1020

ccttcctgtg attcgtatga gaaaaggaca cccaaagaat tcctagaaag actaaaatgg 1080

ctccttcaaa agatgattca tcagcatctc tcctagctgc agatgaactg gatagatgta 1140

agatatgacc tggagaaaat tgaaagcctt attcaatcta ttcatattga caccacttta 1200

tacactgaca gtgactttca tcccagttgc aaagttactg caatgaactg ctttctcctg 1260

gaattgcagg ttattttaca tgagtacagt aacatgactc ttaatgaaac agtaagaaac 1320

gtgctctacc ttgcagacag cactctgtct tctaacaaga atgtagcaga atctggctgc 1380

aaggaatgtg aggagctgga ggagaaaacc ttcacagagt ttttgcaaag ctttatacgc 1440

attgtccaaa tgttcatcaa cacgtcctgatctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1500

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1560

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1620

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1680

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact 1740

gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg 1800

ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca 1860

ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 1920

gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 1980

aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 2040

ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 2100

ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 2160

aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 2220

accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 2280

ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 2340

ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 2400

cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 2460

tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 2520

tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 2580

gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 2640

tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa 2700

ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 2760

cacaccgcat acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 2820

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 2880

ataatagcac gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 2940

tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3000

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3060

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3120

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 3180

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3240

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3300

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3360

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3420

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3480

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3540

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3600

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctgggct tttgctggcc 3660

ttttgctcac atgttctt 3678

<210> 4

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu

1 5 10 15

Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp

20 25 30

Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys

35 40 45

Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser

50 55 60

Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile

85 90 95

Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu

100 105 110

Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His

115 120 125

Leu Ser

130

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ile Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe

20 25 30

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu

35 40 45

Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val

50 55 60

Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asp Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn

65 70 75 80

Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr

85 90 95

Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile

100 105 110

Asn Thr Ser

115

Claims (10)

1.一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：

1）SEQ ID No.3中所示的第724-第1470位核苷酸序列；和/或

SEQ ID No.1中所示的第724-第2472位核苷酸序列；

2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

2.一种载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，例如所述载体为pVAX1载体。

3.重组质粒，其为SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；和/或

SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列。

4.一种蛋白，其氨基酸序列由权利要求3所述的重组质粒编码。

5.一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的载体、权利要求3所述的重组质粒、权利要求4所述的蛋白、权利要求5所述的疫苗在弓形虫感染预防中的应用。

7.大量制备pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1重组质粒的方法，步骤如下：

（1）、将含有pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1质粒的菌液在Kan⁺ LB固体选择培养基上过夜培养，接种到Kan⁺ LB液体选择培养基中进行扩大培养；

（2）、将步骤（1）得到的细菌培养物离心取沉淀，重悬菌体；

（3）、将步骤（2）得到的菌液先后用Solution II和Solution III混匀，离心取上清；

（4）、将步骤（3）得到的上清用0.6倍体积±1ml的异丙醇混匀，离心取沉淀，将沉淀先用ddH₂O溶解，再加入LiCl溶液混匀，离心取上清，加入异丙醇混匀后离心弃上清，控干，得白色沉淀物；

（5）、将步骤（4）制备的白色沉淀物除RNA，加入无水乙醇和NaAc溶液混匀后离心取沉淀，洗脱沉淀。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（2）后不包含加入溶菌酶溶液振荡混匀的步骤。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（3）中Solution II和Solution III加入的时间间隔控制在5min以内。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（5）中离心取沉淀的方法为将上清吸出，再倒置于滤纸上控干。

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