CN1373214A - 一种高产量大规模质粒制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种高产量大规模质粒制备方法,包括菌落培养与收集:原生质体制备:质粒的抽提纯化:用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定;本工艺与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法所制备质粒的纯度相当,而产量却大幅度提高,每1000ml大肠杆菌培养物的质粒产量达到15-23mg。第一次在上清中沉淀质粒使用20%的PEG8000而不使用异丙醇,并将沉淀加入18TE溶液溶解,加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K消化。其内毒素含量极低,与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法的相当。
Description
技术领域:
本发明提供一种高产量大规模质粒制备方法,涉及对碱变性-PEG沉淀法的改进,属于分子生物学,基因治疗,基因免疫技术领域。
背景技术:
质粒大规模制备的经典方法是碱变性-CsCl密度梯度超速离心法和碱变性-PEG沉淀法。碱变性-CsCl密度梯度超速离心法能够制备得到高质量的质粒,但对设备条件要求高,成本高,产量少,已很少有人使用。应用碱变性-PEG沉淀法制备质粒的产量较大,每1000ml菌的产量约为4-10mg,大大高于碱变性-CsCl密度梯度超速离心法和柱层析试剂盒制备质粒的产量,其质量也较好,能满足多数分子生物学实验的要求,如酶切、连接,DNA序列测定等。但其质量和纯度不如碱变性-CsCl密度梯度超速离心法和柱层析试剂盒制备的质粒,所含细菌内毒素(LPS)量过高,不太合适用于人体或动物机体的基因治疗和基因免疫。
发明内容:
本发明提供了一种高产量大规模质粒制备方法,是对碱变性-PEG沉淀法进行了改进,使其产量大大提高,最高可达到23mg/1000ml细菌培养物。
本发明的技术解决方案包括以下步骤:
1、重组菌的培养与收集:挑目的单菌落接种至LB培养基,加入相应量抗生素,至细菌生长至密度为OD600≈0.6,将其再接种至20倍体积的LB培养基中培养12-16小时左右,5000rpm,10分钟离心,弃尽上清,收集菌体;
2、原生质体的制备:用溶菌酶将上述收集细菌的细胞壁水解,制成原生质体;
3、质粒的抽提纯化:①用SDS-碱变性法将质粒从细菌中释放出来至溶液中,在该步骤中,溶液I先使用标准溶液I的4~6倍浓度,在原生体分散均匀后,用蒸馏水调整至标准溶液I的浓度(50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl,10mM EDTA pH 8.0);并向溶液I中加入高浓度的RNA酶A。质粒从细菌中释放出来至溶液后,离心取上清暂保存;
②向以往弃丢的沉淀物中加入3~4体积的TE悬浮,加入终浓度为50-80ug/ml的蛋白酶K,置37℃,摇床震摇(210~230rpm),再次悬浮消化至适当;8000rpm,离心10分钟,取上清;
将①和②的上清合并,加入1/2体积20%的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液),冰浴30-60分钟或放4℃冰箱过夜;12000g,离心5分钟或8000g,15分钟;弃上清,沉淀加入18ml TE溶解;加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K,56℃,消化直至清亮;加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提,直至无蛋白带出现;取上清,加入0.1体积3M NaAC(pH 5.2),2倍体积预冷的无水乙醇,轻轻吹吸或摇晃后,4℃,30分钟以上;12000rpm,离心10分钟,弃上清;加入少量70%的乙醇,轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类,然后置室温凉干;
4、适量双蒸水或PBS溶解质粒沉淀,用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定;
5、鉴定后分装,-20℃保存。
本发明的积极效果在于:本工艺与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法所制备质粒的纯度相当,而产量却大幅度提高,每1000ml大肠杆菌培养物的质粒产量达到15-23mg。第一次对上清中沉淀质粒使用20%的PEG8000而不使用异丙醇,并将沉淀加入18 TE溶液溶解,加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K消化。其内毒素含量极低,与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法的相当。
具体实施方式:
实施例1
1、重组菌的培养与收集:挑目的单菌落接种55ml LB培养基(加入相应量抗性药物,以下相同)至OD600≈0.6,→取50ml(另5ml作小提鉴定)倒入1000ml LB培养基中培养12-16小时左右;→5000rpm,10分钟离心,弃尽上清,收集菌体。
2、原生质体制备:细菌沉淀中加入50ml含20%蔗糖、50mMTris-HCl(pH 8.0),吹打悬浮;→冰浴3-5分钟;→加入10ml用预冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)配制的新鲜溶菌酶液(5mg/ml),冰浴5分钟;→加入20ml预冷的0.25M EDTA(pH 8.0),冰浴5分钟;→加入20ml预冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0),37℃水浴5分钟;→立即4℃,6000rpm,10分钟,弃上清。(冰浴条件和作用时间很关键)
3、质粒的抽提纯化:于原生质体沉淀中加入6ml 5倍的溶液I(0.25M葡萄糖,75mM Tris-HCl,50mM EDTA pH 8.0),吹打悬浮后,加入23ml蒸馏水,再加入0.6mg RNA酶A(溶于1ml 10mMpH 7.5的Tris-HCl,15mM NaCl);→37℃作用15分钟;→加入蛋白酶K至终浓度为80ug/ml,37℃,再作用15分钟;→加入30ml溶液II(0.2M NaOH,1%SDS),轻轻地上下颠倒离心瓶以便混匀充分,冰上放置5分钟;→加入30ml冰预冷的溶液III(60%5M KAC,11.5%冰醋酸),震摇混匀,冰浴5分钟;→7500rpm,15分钟。
①取上清暂保存;
②对沉淀物加入25ml TE悬浮,加入终浓度为50-80μg/ml的蛋白酶K,置37℃摇床剧烈振摇(210-230rpm),再次悬浮消化1~2小时;8000rpm,离心10分钟,取上清。
将①和②的上清,加入1/2体积20%的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液),冰浴30-60分钟或放4℃冰箱过夜;→12000g,离心10分钟或8000g,15分钟;→弃上清,沉淀加入18ml TE溶解;→加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K,56℃,消化直至清亮;→加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提,直至无蛋白带出现;→取上清,加入0.1体积3M NaAC(pH 5.2),2倍体积预冷的无水乙醇,轻轻吹吸或摇晃后,4℃,30分钟以上;→12000g,离心5分钟,弃上清;→加入少量70%的乙醇,轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类,然后置室温凉干。
用适量PBS溶解质粒沉淀,用DNA检测仪测定质粒含量。结果共得到pIRESNeol质粒15mg,
实施例2:
从BL21(DE3)转化重组菌中纯化pcDNA3质粒,2000LB培养基,46mg质粒。
1.菌落培养与收集:挑取pcDNA3转化的单菌落接种110ml LB培养基(加氨苄青霉素至60μg/ml)至OD600≈0.6,→取100ml倒入2000ml LB培养基中培养12-16小时左右;
→5000rpm,10分钟离心,弃尽上清,收集菌体。
2.原生质体制备:细菌沉淀中加入100ml含20%蔗糖、50mMTris-HCl(pH 8.0),吹打悬浮;
→冰浴5分钟;
→加入20ml用预冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)配制的新鲜溶菌酶液(5mg/ml),冰浴5分钟;
→加入40ml预冷的0.25M EDTA(pH 8.0),冰浴5分钟;
→加入40ml预冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0),37℃水浴5分钟;
→立即4℃,6000rpm,10分钟,弃上清。
(冰浴条件和作用时间很关键)
3.质粒的抽提纯化:
将获得的原生质体沉淀,及时加入15ml 4倍的溶液I(0.20M葡萄糖,60mM Tris-HCl,40mM EDTA pH 8.0),吹打悬浮后,加入43ml蒸馏水,再加入1.2mg RNA酶A(溶于2ml 10mM pH7.5的Tris-HCl,15mM NaCl);
→37℃作用15分钟;
→加入蛋白酶K至终浓度为80ug/ml,37℃,再作用15分钟;
→加入60ml溶液II(0.2M NaOH,1%SDS),轻轻地上下颠倒离心瓶以便混匀充分,冰上放置5分钟;
→加入60ml冰预冷的溶液III(60% 5M Kac,11.5%冰醋酸),震摇混匀,冰浴5分钟;→7500rpm,15分钟:
①取上清暂保存;
②对沉淀物加入50ml TE悬浮,加入终浓度为80ug/ml的蛋白酶K,置37℃,摇床震摇(230rpm)2小时;8000rpm,离心10分钟,取上清。
将①和②的上清,加入1/2体积20%的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液),放置4℃冰箱过夜;
→12000rpm,离心10分钟或8000rpm,15分钟;
→弃上清,沉淀加入36ml TE溶解;
→加入终浓度为100ug/ml的蛋白酶K,56℃,消化直至清亮;
→加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提,直至无蛋白带出现;
→取上清,加入0.1体积3M NaAc(pH 5.2),2倍体积预冷的无水乙醇,轻轻吹吸或摇晃混匀;
→12000rpm,离心10分钟,弃上清;
→加入少量70%的乙醇,轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类,然后置室温凉干。
4.用20ml PBS溶解质粒沉淀,用DNA检测仪测定质粒含量,结果共得到pcDNA3质粒46mg。即23mg/1000ml。
实施例3:
从JM109转化重组菌中纯化pVAX1质粒,1000LB培养基,21mg质粒
1.菌落培养与收集:挑pVAX1转化的JM109单菌落接种55ml LB培养基(卡那霉素至30μg/ml)至OD600≈0.6,→取50ml(另5ml作小提鉴定)倒入1000ml LB培养基中培养14小时左右;
→5000rpm,10分钟离心,弃尽上清,收集菌体。2. 原生质体制备:细菌沉淀中加入50ml含20%蔗糖、50mMTris-HCl(pH 8.0),吹打悬浮;
→冰浴5分钟;
→加入10ml用预冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)配制的新鲜溶菌酶液(5mg/ml),冰浴5分钟;
→加入20ml预冷的0.25M EDTA(pH 8.0),冰浴5分钟;
→加入20ml预冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0),37℃水浴5分钟;
→立即4℃,6000rpm,10分钟,弃上清。
(冰浴条件和作用时间很关键)
3.质粒的抽提纯化:
将获得的原生质体沉淀,及时加入5ml 6倍的溶液I(0.30M葡萄糖,90mM Tris-HCl,60mM EDTA pH 8.0),吹打悬浮后,加入23ml蒸馏水,再加入0.6mg RNA酶A(溶于1ml 10mM pH7.5的Tris-HCl,15mM NaCl);
→37℃作用15分钟;
→加入蛋白酶K至终浓度为80ug/ml,37℃,再作用15分钟;
→加入30ml溶液II(0.2M NaOH,1%SDS),轻轻地上下颠倒离心瓶以便混匀充分,冰上放置5分钟;
→加入30ml冰预冷的溶液III(60% 5M Kac,11.5%冰醋酸),震摇混匀,冰浴5分钟;→7500rpm,15分钟:
①取上清暂保存;
②对沉淀物加入25ml TE悬浮,加入终浓度为50-80ug/ml的蛋白酶K,置37℃,摇床震摇(210-230rpm)1.5小时;8000rpm,离心10分钟,取上清。
将①和②的上清,加入1/2体积20%的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液),冰浴60分钟;
→12000rpm,离心10分钟或8000rpm,15分钟;
→弃上清,沉淀加入18ml TE溶解;
→加入终浓度为50uG/ml的蛋白酶K,56℃,消化直至清亮;
→加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提,直至无蛋白带出现;
→取上清,加入0.1体积3M NaAc(pH 5.2),2倍体积预冷的无水乙醇,轻轻吹吸或摇晃混匀;
→12000rpm,离心10分钟,弃上清;
→加入少量70%的乙醇,轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类,然后置室温凉干。
4.用10ml PBS溶解质粒沉淀,用DNA检测仪测定质粒含量。结果pVAX1的浓度为2.1mg/ml,共得到质粒21mg。
Claims (2)
1、一种高产量大规模质粒制备方法,包括以下步骤:
1)菌落培养与收集:挑目的单菌落接种至LB培养基,加入相应量抗生素,至细菌生长至密度为OD600≈0.6,将其再接种至20倍体积的LB培养基中培养12-16小时左右,5000rpm,10分钟离心,弃尽上清,收集菌体;
2)原生质体制备:用溶菌酶将上述收集细菌的细胞壁水解,制成原生质体。
3)质粒的抽提纯化:用SDS-碱变性法将质粒从细菌中释放出来至溶液中,在该步骤中,溶液I先使用标准溶液I的4~6倍浓度,在原生体分散均匀后,用蒸馏水调整至标准溶液I的浓度并向溶液I中加入高浓度的RNA酶A;质粒从细菌中释放出来至溶液后,离心取上清加入1/2体积20%的PEG8000溶于2.4M的NaCl溶液,冰浴30-60分钟或放4℃冰箱过夜;12000g,离心5分钟或8000g,15分钟;弃上清,沉淀加入18ml TE溶解;加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K,56℃,消化直至清亮;加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提,直至无蛋白带出现;取上清,加入0.1体积3M NaAC(pH 5.2),2倍体积预冷的无水乙醇,轻轻吹吸或摇晃后,4℃,30分钟以上;12000rpm,离心10分钟,弃上清;加入少量70%的乙醇,轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类,然后置室温凉干;
4)适量双蒸水或PBS溶解质粒沉淀,用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定;
5)鉴定后分装,-20℃保存。
2、根据权利要求1所述的质粒制备方法,其特征在于:可将质粒抽提纯化步骤中离心后的沉淀物利用,加入3~4体积的TE悬浮,加入终浓度为50-80ug/ml的蛋白酶K,置37℃,摇床震摇(210~230rpm),再次悬浮消化至适当;8000rpm,离心10分钟,取上清与抽提纯化离心的上清混合进一步抽提纯化。
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CN 02109351 CN1257274C (zh) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | 一种高产量大规模质粒制备方法 |
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CN103333900A (zh) * | 2013-06-18 | 2013-10-02 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用 |
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