CN1257274C - 一种高产量大规模质粒制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种高产量大规模质粒制备方法，包括菌落培养与收集：原生质体制备：质粒的抽提纯化：用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定；本工艺与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法所制备质粒的纯度相当，而产量却大幅度提高，每1000ml大肠杆菌培养物的质粒产量达到15-23mg。第一次在上清中沉淀质粒使用20%的PEG8000而不使用异丙醇，并将沉淀加入18TE溶液溶解，加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K消化。其内毒素含量极低，与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法的相当。
Description
技术领域：
本发明提供一种高产量大规模质粒制备方法，涉及对碱变性-PEG沉淀法的改进，属于分子生物学，基因治疗，基因免疫技术领域。
背景技术：
质粒大规模制备的经典方法是碱变性-CsCl密度梯度超速离心法和碱变性-PEG沉淀法。碱变性-CsCl密度梯度超速离心法能够制备得到高质量的质粒，但对设备条件要求高，成本高，产量少，已很少有人使用。应用碱变性-PEG沉淀法制备质粒的产量较大，每1000ml菌的产量约为4-10mg，大大高于碱变性-CsCl密度梯度超速离心法和柱层析试剂盒制备质粒的产量，其质量也较好，能满足多数分子生物学实验的要求，如酶切、连接，DNA序列测定等。但其质量和纯度不如碱变性-CsCl密度梯度超速离心法和柱层析试剂盒制备的质粒，所含细菌内毒素(LPS)量过高，不太合适用于人体或动物机体的基因治疗和基因免疫。
发明内容：
本发明提供了一种高产量大规模质粒制备方法，是对碱变性-PEG沉淀法进行了改进，使其产量大大提高，最高可达到23mg/1000ml细菌培养物。
本发明的技术解决方案包括以下步骤：
1、重组菌的培养与收集：挑目的单菌落接种至LB培养基，加入相应量抗生素，至细菌生长至密度为OD600≈0.6，将其再接种至20倍体积的LB培养基中培养12-16小时左右，5000rpm，10分钟离心，弃尽上清，收集菌体；
2、原生质体的制备：用溶菌酶将上述收集细菌的细胞壁水解，制成原生质体；
3、质粒的抽提纯化：①用SDS-碱变性法将质粒从细菌中释放出来至溶液中，在该步骤中，溶液I先使用标准溶液I的4～6倍浓度，在原生体分散均匀后，用蒸馏水调整至标准溶液I的浓度(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA pH8.0)；并向溶液I中加入高浓度的RNA酶A。质粒从细菌中释放出来至溶液后，离心取上清暂保存；
②向以往弃丢的沉淀物中加入3～4体积的TE悬浮，加入终浓度为50-80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，摇床震摇(210～230rpm)，再次悬浮消化至适当；8000rpm，离心10分钟，取上清；
将①和②的上清合并，加入1/2体积20％的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液)，冰浴30-60分钟或放4℃冰箱过夜；12000g，离心5分钟或8000g，15分钟；弃上清，沉淀加入18ml TE溶解；加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提，直至无蛋白带出现；取上清，加入0.1体积3M NaAC(pH5.2)，2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻吹吸或摇晃后，4℃，30分钟以上；12000rpm，离心10分钟，弃上清；加入少量70％的乙醇，轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类，然后置室温凉干；
4、适量双蒸水或PBS溶解质粒沉淀，用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定；
5、鉴定后分装，-20℃保存。
本发明的积极效果在于：本工艺与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法所制备质粒的纯度相当，而产量却大幅度提高，每1000ml大肠杆菌培养物的质粒产量达到15-23mg。第一次对上清中沉淀质粒使用20％的PEG8000而不使用异丙醇，并将沉淀加入18TE溶液溶解，加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K消化。其内毒素含量极低，与碱变性-CsCl密度梯度超速离心法的相当。
具体实施方式：
实施例1
1、重组菌的培养与收集：挑目的单菌落接种55ml LB培养基(加入相应量抗性药物，以下相同)至OD600≈0.6，→取50ml(另5ml作小提鉴定)倒入1000ml LB培养基中培养12-16小时左右；→5000rpm，10分钟离心，弃尽上清，收集菌体。
2、原生质体制备：细菌沉淀中加入50ml含20％蔗糖、50mMTris-HCl(pH8.0)，吹打悬浮；→冰浴3-5分钟；→加入10ml用预冷的0.25M Tris-HCl(pH8.0)配制的新鲜溶菌酶液(5mg/ml)，冰浴5分钟；→加入20ml预冷的0.25M EDTA(pH8.0)，冰浴5分钟；→加入20ml预冷的0.25M Tris-HCl(pH8.0)，37℃水浴5分钟；→立即4℃，6000rpm，10分钟，弃上清。(冰浴条件和作用时间很关键)
3、质粒的抽提纯化：于原生质体沉淀中加入6ml 5倍的溶液I(0.25M葡萄糖，75mM Tris-HCl，50mM EDTA pH8.0)，吹打悬浮后，加入23ml蒸馏水，再加入0.6mg RNA酶A(溶于1ml 10mMpH7.5的Tris-HCl，15mM NaCl)；→37℃作用15分钟；→加入蛋白酶K至终浓度为80ug/ml，37℃，再作用15分钟；→加入30ml溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，轻轻地上下颠倒离心瓶以便混匀充分，冰上放置5分钟；→加入30ml冰预冷的溶液III(60％5M KAC，11.5％冰醋酸)，震摇混匀，冰浴5分钟；→7500rpm，15分钟。
①取上清暂保存；
②对沉淀物加入25ml TE悬浮，加入终浓度为50-80μg/ml的蛋白酶K，置37℃摇床剧烈振摇(210-230rpm)，再次悬浮消化1～2小时；8000rpm，离心10分钟，取上清。
将①和②的上清，加入1/2体积20％的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液)，冰浴30-60分钟或放4℃冰箱过夜；→12000g，离心10分钟或8000g，15分钟；→弃上清，沉淀加入18ml TE溶解；→加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；→加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提，直至无蛋白带出现；→取上清，加入0.1体积3M NaAC(pH5.2)，2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻吹吸或摇晃后，4℃，30分钟以上；→12000g，离心5分钟，弃上清；→加入少量70％的乙醇，轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类，然后置室温凉干。
用适量PBS溶解质粒沉淀，用DNA检测仪测定质粒含量。结果共得到pIRESNeol质粒15mg，
实施例2：
从BL21(DE3)转化重组菌中纯化pcDNA3质粒，2000LB培养基，46mg质粒。
1.菌落培养与收集：挑取pcDNA3转化的单菌落接种110ml LB培养基(加氨苄青霉素至60μg/ml)至OD600≈0.6，→取100ml倒入2000ml LB培养基中培养12-16小时左右；
→5000rpm，10分钟离心，弃尽上清，收集菌体。
2.原生质体制备：细菌沉淀中加入100ml含20％蔗糖、50mMTris-HCl(pH8.0)，吹打悬浮；
→冰浴5分钟；
→加入20ml用预冷的0.25M Tris-HCl(pH8.0)配制的新鲜溶菌酶液(5mg/ml)，冰浴5分钟；
→加入40ml预冷的0.25M EDTA(pH8.0)，冰浴5分钟；
→加入40ml预冷的0.25M Tris-HCl(pH8.0)，37℃水浴5分钟；
→立即4℃，6000rpm，10分钟，弃上清。
(冰浴条件和作用时间很关键)
3.质粒的抽提纯化：
将获得的原生质体沉淀，及时加入15ml 4倍的溶液I(0.20M葡萄糖，60mM Tris-HCl，40mM EDTA pH8.0)，吹打悬浮后，加入43ml蒸馏水，再加入1.2mg RNA酶A(溶于2ml 10mM pH7.5的Tris-HCl，15mM NaCl)；
→37℃作用15分钟；
→加入蛋白酶K至终浓度为80ug/ml，37℃，再作用15分钟；
→加入60ml溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，轻轻地上下颠倒离心瓶以便混匀充分，冰上放置5分钟；
→加入60ml冰预冷的溶液III(60％5M Kac，11.5％冰醋酸)，震摇混匀，冰浴5分钟；→7500rpm，15分钟：
①取上清暂保存；
②对沉淀物加入50ml TE悬浮，加入终浓度为80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，摇床震摇(230rpm)2小时；8000rpm，离心10分钟，取上清。
将①和②的上清，加入1/2体积20％的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液)，放置4℃冰箱过夜；
→12000rpm，离心10分钟或8000rpm，15分钟；
→弃上清，沉淀加入36ml TE溶解；
→加入终浓度为100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；
→加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提，直至无蛋白带出现；
→取上清，加入0.1体积3M NaAc(pH5.2)，2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻吹吸或摇晃混匀；
→12000rpm，离心10分钟，弃上清；
→加入少量70％的乙醇，轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类，然后置室温凉干。
4.用20ml PBS溶解质粒沉淀，用DNA检测仪测定质粒含量，结果共得到pcDNA3质粒46mg。即23mg/1000ml。
实施例3：
从JM109转化重组菌中纯化pVAX1质粒，1000LB培养基，21mg质粒
1.菌落培养与收集：挑pVAX1转化的JM109单菌落接种55ml LB培养基(卡那霉素至30μg/ml)至OD600≈0.6，→取50ml(另5ml作小提鉴定)倒入1000ml LB培养基中培养14小时左右；
→5000rpm，10分钟离心，弃尽上清，收集菌体。
2.原生质体制备：细菌沉淀中加入50ml含20％蔗糖、50mMTris-HCl(pH8.0)，吹打悬浮；
→冰浴5分钟；
→加入10ml用预冷的0.25M Tris-HCl(pH8.0)配制的新鲜溶菌酶液(5mg/ml)，冰浴5分钟；
→加入20ml预冷的0.25M EDTA(pH8.0)，冰浴5分钟；
→加入20ml预冷的0.25M Tris-HCl(pH8.0)，37℃水浴5分钟；
→立即4℃，6000rpm，10分钟，弃上清。
(冰浴条件和作用时间很关键)
3.质粒的抽提纯化：
将获得的原生质体沉淀，及时加入5ml 6倍的溶液I(0.30M葡萄糖，90mM Tris-HCl，60mM EDTA pH8.0)，吹打悬浮后，加入23ml蒸馏水，再加入0.6mg RNA酶A(溶于1ml 10mM pH7.5的Tris-HCl，15mM NaCl)；
→37℃作用15分钟；
→加入蛋白酶K至终浓度为80ug/ml，37℃，再作用15分钟；
→加入30ml溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，轻轻地上下颠倒离心瓶以便混匀充分，冰上放置5分钟；
→加入30ml冰预冷的溶液III(60％5M Kac，11.5％冰醋酸)，震摇混匀，冰浴5分钟；→7500rpm，15分钟：
①取上清暂保存；
②对沉淀物加入25ml TE悬浮，加入终浓度为50-80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，摇床震摇(210-230rpm)1.5小时；8000rpm，离心10分钟，取上清。
将①和②的上清，加入1/2体积20％的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液)，冰浴60分钟；
→12000rpm，离心10分钟或8000rpm，15分钟；
→弃上清，沉淀加入18ml TE溶解；
→加入终浓度为50ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；
→加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提，直至无蛋白带出现；
→取上清，加入0.1体积3M NaAc(pH5.2)，2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻吹吸或摇晃混匀；
→12000rpm，离心10分钟，弃上清；
→加入少量70％的乙醇，轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类，然后置室温凉干。
4.用10mlPBS溶解质粒沉淀，用DNA检测仪测定质粒含量。结果pVAX1的浓度为2.1mg/ml，共得到质粒21mg。
Claims (1)
1、一种高产量大规模质粒制备方法，包括以下步骤：
1)菌落培养与收集：挑目的单菌落接种LB培养基，加入相应量抗性药物，至OD600≈0.6，取50ml倒入1000ml LB培养基中培养12-16小时左右，5000rpm，10分钟离心，弃尽上清，收集菌体；
2)原生质体制备：细菌沉淀中加入50ml含20％蔗糖、50mMTris-HCl、pH 8.0，吹打悬浮；冰浴3-5分钟；加入10ml用预冷的0.25M Tris-HCl、pH 8.0配制的新鲜溶菌酶液5mg/ml，冰浴5分钟；加入20ml预冷的0.25M EDTA、pH 8.0，冰浴5分钟；加入20ml预冷的0.25M Tris-HCl、pH 8.0，37℃水浴5分钟；立即4℃，6000rpm，10分钟，弃上清；
3)质粒的抽提纯化：将获得的原生质体沉淀，及时加入6ml 5倍由0.25M葡萄糖，75mM Tris-HCl，50mM EDTA pH 8.0配制的溶液I，吹打悬浮后，加入23ml蒸馏水，再加入0.6mg RNA酶A，37℃作用15分钟；加入蛋白酶K至终浓度为80ug/ml，37℃，再作用15分钟；加入30ml由0.2M NaOH，1％SDS配置的溶液，轻轻地上下颠倒离心瓶以便混匀充分，冰上放置5分钟；加入30ml冰预冷由60％ 5M KAC，11.5％冰醋酸配制的溶液，震摇混匀，冰浴5分钟；7500rpm，15分钟：
①取上清暂保存；
②对沉淀物加入25ml TE悬浮，加入终浓度为50-80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，摇床震摇210-230rpm，再次悬浮消化至适当；8000rpm，离心10分钟，取上清；
将①和②的上清，加入1/2体积20％的PEG8000溶于2.4M的NaCl溶液，冰浴30-60分钟或放4℃冰箱过夜；12000g，离心5分钟或8000g，15分钟；弃上清，沉淀加入18ml TE溶解；加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提，直至无蛋白带出现；取上清，加入0.1体积3M NaAC、pH 5.2，2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻吹吸或摇晃后，4℃，30分钟以上；12000rpm，离心10分钟，弃上清；加入少量70％的乙醇，轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类，然后置室温凉干；
4)适量双蒸水或PBS溶解质粒沉淀，用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定；
5)鉴定后分装，-20℃保存。
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| CN103333900B (zh) * | 2013-06-18 | 2016-06-01 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用 |
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