CN1062904C - 限制性核酸内切酶 - Google Patents

限制性核酸内切酶 Download PDF

Info

Publication number
CN1062904C
CN1062904C CN95108991A CN95108991A CN1062904C CN 1062904 C CN1062904 C CN 1062904C CN 95108991 A CN95108991 A CN 95108991A CN 95108991 A CN95108991 A CN 95108991A CN 1062904 C CN1062904 C CN 1062904C
Authority
CN
China
Prior art keywords
restriction endonuclease
dna
sse
nucleotide sequence
strictly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN95108991A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1120069A (zh
Inventor
野村佳子
石野良纯
加藤郁之进
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Shuzo Co Ltd
Original Assignee
Takara Shuzo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Shuzo Co Ltd filed Critical Takara Shuzo Co Ltd
Publication of CN1120069A publication Critical patent/CN1120069A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1062904C publication Critical patent/CN1062904C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

一种限制性核酸内切酶，其可以识别双链DNA下列化学结构式1的核苷酸序列，并在箭头所示位点上严格裂解上述核苷酸序列。核酸内切酶可通过培养能产生它的链霉菌属的菌株(FERMBP-5022)来制备。
(化学结构式1)

Description

限制性核酸内切酶
本发明涉及一种Ⅱ类限制性核酸内切酶，其可以识别双链脱氧核糖核酸(DNA)分子中7碱基的严格序列并在严格位点上裂解所述的DNA分子。
限制性核酸内切酶是可以识别DNA分子中特异性碱基序列并在特异性位点上裂解DNA链的核酸内切酶。迄今发现了多种限制性核酸内切酶。随着分子遗传学和生物化学的进展，DNA已被证明是遗传信息的载体，自那时起限制性核酸内切酶已广泛用于多种目的，如在基因操作方面搞清遗传病等上的应用。
其中，Ⅱ类限制性核酸内切酶可识别特异性DNA序列和特异性地消化序列中的DNA链，这种酶极为重要，主要应用于遗传工程技术。
尽管已分离出300多种Ⅱ类限制性核酸内切酶，但仍有许多不具同源限制性核酸内切酶的DNA序列(其不能被任何已知的限制性核酸内切酶所识别)有待发现。因而，需要作出努力以便发现具有识别和消化这些序列能力的新的Ⅱ类限制性核酸内切酶，这样研究者就有更多的机会在适用于各项试验的位置上切割其DNA。
另外，具有低切割频率的限制性核酸内切酶更便于高分了量DNA的结构分析，如几种生物的基因组分析方案，并且需要发现能识别6个碱基以上的长DNA序列的Ⅱ类限制性核酸内切酶。
本发明的目的在于提供一种新的Ⅱ类限制性核酸内切酶，它具有识别和切割新DNA序列的能力，适用于遗传工程研究(包括对高分子量DNA的分析)。
本发明的第一方面，提供了一种限制性核酸内切酶，该酶可严格地识别DNA分子中下列化学结构式1的核苷酸序列并在箭头所示位点上严格地裂解所述的核苷酸序列，
[化学结构式1]
Figure 9510899100041
其中A、G、T和C分别代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。
在本发明的第二方面，提供了一种生产上述限制性核酸内切酶的方法，该方法包括培养一种属于链霉菌属并具有链霉菌种YH8647(FERM BP-5022)所有鉴别特性的微生物，该微生物能产生上述限制性核酸内切酶，并从培养液中回收所生成的限制性核酸内切酶。
本发明中的Ⅱ类限制性核酸内切酶可以是能严格地识别和裂解上述核苷酸序列的任何限制性核酸内切酶，该限制性核酸内切酶可通过下述方法得到：培养能产生限制性核酸内切酶的菌株或该菌株的突变体，或对由分离所述限制性核酸内切酶生产的编码基因并用普通遗传操作技术将其转化到不同种类的宿主生物中而制备出的重组体进行培养。
能产生识别上述七核苷酸序列的限制性核酸内切酶的实际菌株为链霉菌种YH8647。该菌株分离自收集并贮存于发明人实验室中的土壤。其细菌学特性如表1所示。[表1]*1利用硫酸的全细胞水解来实施。*2通过微孢子进行检验。
细胞壁组成分析如下列三种文献如述进行：日本放线菌学会(日本放线菌学会秘书处，1985)的Housenkin No doutei jikkenhou(第一版，放线菌鉴定的实验方法)；K.Komagata(Gakkai Syup-pan中心，1982)的Biseibufu no kagaku bunrui jikkenhou(第一版，微生物化学鉴定的实验方法)；E.Yabuuti等人(Saikon syuppan，1987)的Afarashii bunruigaku ni hansou suru Saikin douteihou(第一版，新分类中的微生物鉴定)。该菌株的细胞壁类型被确定为Ⅰ型。对苯醌组分的分析表明，该菌株具有甲基萘醌类，在多异戊二烯基链有6或8个饱和氯的9个异戊二烯单位。另外，从形态学观察中发现，该菌株具有气生菌丝体和孢子连锁。从以上分析可以看出，该菌株可确定为属于链霉菌属的一个菌种。
本菌株被称为链霉菌种YH8647。依据布达佩斯条约该菌株于1993年9月29日保藏于日本工业科技院生物科学及人类技术国立研究所中(1-3，Higashi，chome Tsukuba-shi Ibaraki-kan 305，日本)，注册号为FERMBP-5022。
分离自具有7个碱基的识别序列的链霉菌种YH8647的限制性核酸内切酶具有如上所述的特性，被称为Sse 8647Ⅰ。
下面详述生产限制性核酸内切酶Sse 8647Ⅰ的方法。
可将所用菌株能同以来生产Sse 8647Ⅰ的任何营养物加入到培养基中。可用葡萄糖、麦芽糖、甘油等物作碳源，而用醋母膏、胨、玉米浆、肉汤等物作氮源。另外，也可以加入矿物质和金属盐、如磷酸盐、钾盐和镁盐。
Sse 8647Ⅰ的产量因培养条件的变化而不同。良好的结果通常在温度范围为20-35℃和PH值范围为6-8条件下获得。可通过在通气、搅拌下培养1-3天达到最高产量。不用说，应根据所使用的菌株和培养基的组成来酌情选择最适培养条件。
用本发明的方法生产的限制性核酸内切酶Sse 8647Ⅰ主要在微生物细胞中浓集。可通过诸如离心等方法从培养液中分离出生长细胞。使用通常用于限制性核酸内切酶的已知技术能够分离和纯化所形成的限制性核酸内切酶。例如，将所收集的微生物细胞分散于缓冲液中，然后通过超声波处理打碎细胞而提取限制性核酸内切酶。
在利用超速离心法除去细胞碎片后，例如，将所得到的上清液溶于缓冲液A(含20mM磷酸钾、PH 7.5、10mM2-巯基乙醇和5％的甘油)或缓冲液B(含20mM Tris-Hcl、PH7.5、10mM 2-巯基乙醇)中，将溶液对同样的缓冲液透析。然后通过离子交换色谱法、分子筛色谱法或亲和色谱法来提纯透析液，由此得到本发明的限制性核酸内切酶。例如，向提取液中加入硫酸铵进行盐析，将发离出的沉淀物溶于缓冲液A或缓冲液B中，将溶液对同样的缓冲液透析。利用离子交换色谱法，分子筛色谱法或亲和色谱法来提纯透析液，由此得到本发明的限制性核酸内切酶。
根据下述方法来确定该限制性核酸内切酶的活性。
制备组成如表2所示的底物溶液。[表2]
Figure 9510899100071
将该溶液(48ml)预热至37℃，然后加入所要测试的Sse 8647Ⅰ(2μl)样品使酶反应此温度下进行，10分钟后加入5μl终止溶液(1％SDS、5％甘油和0.02％溴酚蓝)使反应停止。
将反应混合液施于0.7％的醇脂糖平板凝胶上，在10V/cm恒压下进行电泳约1-2小时。电泳所用缓冲液为含2.5mM EDTA的90mM Tris-硼酸盐缓冲液(PH8.3)。如果事先向凝胶中加入0.5Mg/ml溴化乙锭，则可通过紫外辐射来检测DNA带。当DNA片段带的数目和强度不再变化时，认为电泳已进行完全。
将37℃下反应1小时后确保1μg腺病毒-2DNA(由Bethesda研究实验室生产)完全消化的限制性核酸内切酶活性定义为一个单位。
限制性核酸内切酶Sse 8647Ⅰ具有如下所述的物理化学特性。
(1)作用和底物特异性
此限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子中下列化学结构式1的核苷酸序列并在箭头所示位点上将其裂解。
[化学结构式1]
Figure 9510899100081
如下所述确定限制性核酸内切酶Sse 8647Ⅰ所识别的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶Sse 8647Ⅰ在8个位点上裂解腺病毒-2DNA，但不能裂解λ-DNA、PUC18、M13mp18、SV40、C01EI、PBR322和φX173 DNA。
除了上述的DNA分子切割频率之外，根据每一个所消化的DNA片段的大小，该限制性核酸内切酶可望识别DNA分子中下列化学结构式2的核苷酸序列。
[化学结构式2]
Figure 9510899100091
上示7碱基核苷酸序列包括Ava Ⅱ限制性核酸内切酶识别序列的5个碱基(化学结构式3)。
[化学结构式3]
因此进行了一项实验，其中腺病毒-2 DNA在用Sse 8647Ⅰ消化前先用Ava Ⅱ消化。这些DNA片段所形成的电泳图谱与Sse8647Ⅰ单一消化的电泳图谱完全相同。从这些结果可以得示以下结论：限制性核酸内切酶Sse 8647Ⅰ可识别化学结构式2所示的核苷酸序列。
为了确定Sse 8647Ⅰ的裂解位置，含有腺病毒-2 DNA之HpaⅠ-Bgl Ⅱ片段的M13RF衍生物是通过将该片段插入M13mp18(由Takara Shu20有限公司生产)的SmaⅠ-Bam HⅠ位点而构建。上述Hpa Ⅰ-Bgl Ⅱ片段之核苷酸序列(包括Sse 8647Ⅰ的一个识别序列)如SEQ ID NO：1所示。通过常用方法由M13 RF衍生物制备出单链DNA。M13引物M4(由Takara Shuzo有限公司生产)如SEQ ID NO：2所示，其结合于M13RF的多克隆位点附近的位点上，利用荧光化合物在5’未端对其进行未端标记。用如上制备的单链DNA对该引物进行退火，并用来自芽孢扩菌属B.caldote-nax的DNA聚合酶(Bca BEST DNA聚合酶，由Takara Shuzo有限公司生产)将其延长。用Sse 8647Ⅰ消化所生成的双链DNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析所消化的DNA片段的大小。经检测上述消化反应的产物为在下列化学结构式4箭头所示位点上消化的带。
[化学结构式4]
Figure 9510899100101
另外，利用T4 DNA聚合酶(由Takare Shuzo有限公司生产)来钝反未端便消化产物转变为三碱基长产物。由这些实验得出以下结论：Sse 8647Ⅰ可识别化学结构式1所示的核苷酸序列，可在化学结构式4箭头所示位点上消化DNA。
(2)酶活性的最适条件
(Ⅰ)最适温度
Sse 8647Ⅰ之最适温度约为30℃。
(Ⅱ)最适PH
Sse 8647Ⅰ之最适PH范围为7.5～9.5。
(Ⅲ)盐浓度
Sse 8647Ⅰ之最适盐浓度范围为0．mM KCl或NaCl。
(Ⅳ)MgCl2浓度
在MgCl2浓度范围为5mM-20mM时活化Sse 8647Ⅰ的酶反应。
(3)分子量的确定
可利用平衡密度梯度离心来确定天然蛋白质之Sse 8647Ⅰ的分子量。利用表3所示的缓冲液中的甘油来制备密度梯度。
[表3]
在5ml的试管中，制备出4.8ml连续10-25％(从上至下)梯度，在200μl的同样缓冲液中的Sse 8647Ⅰ蛋白质通过梯度沉降。作为对比，标记蛋白质CSDS-PAGE分子量标准低范围，由Bio-Rad股分有限公司实验室生产)通过相同梯度沉降。
在摇摆式T转器中以45，000rpm对梯度进行离心，温度为4℃，时间为21小时。
离心以后，从梯度上部收集250μl部分，部分计数为1-20。
测定这些部分的酶活性。在第12部分测到最高活性。从沉降后经SDS-PAGE进行标记蛋白质分析得到的标准曲线内推Sse8647Ⅰ蛋白质的沉降系数。
对Sse 8647Ⅰ近天然分子量进行计算，约为60，000-75，000。
下列实施例进一步说明本发明，但不是为了限制本发明的范围。
实施例1：
(1)Sse 8647Ⅰ的制备
制备如表4所示的培养基。将含有20ml该培养基的容积为100ml的一个烧瓶和含有500ml该培养基的容积为2L的4个烧瓶用常用方法进行灭菌。
在上述100ml烧瓶中，链霉菌种YH8647(FERM BP-5022)在震荡下生长48小时，温度为30℃。将此培养液转移至2L的烧瓶中(每瓶5ml)，继续震荡48小时，温度为30℃。对这些培养液进行冷冻离心，收获得到43.3g细胞。
[表4]
将上面得到的43.3g微生物细胞悬浮于130ml的缓冲液B(20mM Tris-HCl，PH7.5、10mM2-巯基乙醇)中，用超声压碎机对悬浮液进行处理以破碎细胞壁，对所得混合液进行离心(100，000xg，1小时)以除去残渣。向所得到的上清液(148ml)中加入KCl至0.2M，然后将该溶液吸附于70ml磷酸纤维素P11(由Whetman公司生产)填充柱上，P11预先曾用含0.2M KCl的缓冲液B平衡过。用上述相同缓冲液冲洗后，用含0.2M-0.8MKCl的缓冲液B对吸附部分进行洗脱(线性浓度梯度技术)。
将如此得到的活性部分混合起来，将混合液对缓冲液B透析，将透析物再次吸附于8.5ml DEAE-纤维素DE52(由Whatman公司生产)填充柱上，DE52预先曾用缓冲液B平衡过。在用上述同样缓冲液彻底冲洗后，用含0M-0.8M KCl的缓冲液B对所吸附部分进行洗脱(线性浓度梯度技术)。
另外，将这样得到的活性部分混合起来，将混合液对缓冲液B透析4小时，将透析物再次吸附于2ml肝素琼脂糖(由Pharmacia生物技术公司生产)填充柱上，琼脂糖预先曾用缓冲液B平衡过。在用上述同样缓冲液彻底冲洗后，用含有0M-0.8M KCl的缓冲液B对吸附部分进行洗脱(线性浓度梯度技术)，得到限制性核酸内切酶Sse 8647Ⅰ的标准样品。
该标准样品没有任何非特异性脱氧核糖核酸酶或磷酸酶。
上述纯化方法从43．3g微生物湿细胞中给出600单位的活性。
本发明提供了一种新的限制性核酸内切酶，其能够识别和裂解双链DNA分子中7碱基序列。本发明的核酸内切酶在遗传工程领域中具有重大利用价值，例如可用于长链DNA分子的分析及其它用途。
序列目录SEQ ID NO：1长度：253类型：核酸链次：双链拓扑学：纯性分子类型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO：1AACCTACACC  AGTGTAAAAG  AGGTATCTTT  TGTGTGGTCA  AGCAGGCCAA  ACTTACCTAC  60GAAAAAACCA  CTACCGGCAA  CCGCCTCAGC  TACAAGCTAC  CCACCCAGCG  CCAAAAACTG  120GTGCTTATGG  TGGGAGAAAA  ACCTATCACC  GTCACCCAGC  ACTCGGCAGA  AACAGAGGGC  180TGCCTGCACT  TCCCCTATCA  GGGTCCAGAG  GACCTCTGCA  CTCTTATTAA  AACCATGTGT  240GGTATTAGAG  ATC                                                         253SEQ ID NO：2长度：17类型：核酸链次：单链拓扑学：线性分子类型：其它核酸(合成DNA)序列描述：SEQ ID NO：2：GTTTT CCCAG TCACGAC 17

Claims (2)

1．一种限制性核酸内切酶，其严格地识别双链脱氧核糖核酸中下列化学结构式1的核苷酸序列，并在箭头所示位点上严格地裂解所述核苷酸序列，
Figure 9510899100021
其中A、G、T和C分别代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，并且所述限制性核酸内切酶具有下列物理化学特性：
(a)最适温度：30℃
(b)最适pH：7.5-9.5
(c)分子量：60，000-75，000。
2．生产如权利要求1所述的限制性核酸内切酶的方法，该方法包括培养链霉菌属菌种YH8647(FERM BP-5022)，产生所述限制性核酸内切酶的菌株，并从培养液中回收所述限制性核酸内切酶。
CN95108991A 1994-07-28 1995-07-27 限制性核酸内切酶 Expired - Fee Related CN1062904C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP194602/94 1994-07-28
JP6194602A JP3017019B2 (ja) 1994-07-28 1994-07-28 新規制限酵素

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1120069A CN1120069A (zh) 1996-04-10
CN1062904C true CN1062904C (zh) 2001-03-07

Family

ID=16327284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN95108991A Expired - Fee Related CN1062904C (zh) 1994-07-28 1995-07-27 限制性核酸内切酶

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5726052A (zh)
EP (1) EP0698663B1 (zh)
JP (1) JP3017019B2 (zh)
CN (1) CN1062904C (zh)
DE (1) DE69516060T2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104877976A (zh) * 2010-09-16 2015-09-02 独立行政法人海洋研究开发机构 新的细胞外分泌型核酸酶

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101268187B (zh) * 2005-07-26 2011-07-06 宝生物工程株式会社 新的核糖核酸内切酶

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1532583A1 (ru) * 1988-03-15 1989-12-30 Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ Штамм бактерий PaRacoccUS DеNIтRIFIсаNS-продуцент эндонуклеазы рестрикции Р @ 121
SU1650697A1 (ru) * 1989-05-11 1991-05-23 Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ Штамм бактерий BacILLUS LIснеNI FоRмIS - продуцент рестриктазы В @ 13I
US5192675A (en) * 1990-03-20 1993-03-09 Life Technologies, Inc. Cloned KpnI restriction-modification system
EP0577254A1 (en) * 1992-05-12 1994-01-05 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the nael restriction endonuclease and methylase
US5300432A (en) * 1991-10-18 1994-04-05 Stratagene Octanucleotide restriction endonuclease, Srf I, and method for producing the same

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3420298A1 (de) * 1984-05-30 1985-12-05 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Restriktionsendonuklease dra ii, ihre gewinnung und verwendung
US4935357A (en) * 1986-02-05 1990-06-19 New England Biolabs, Inc. Universal restriction endonuclease
US4975376A (en) * 1988-04-02 1990-12-04 Boehringer Mannheim Gmbh Class II restriction endonuclease KspI and a process for obtaining it
JPH02255086A (ja) * 1989-03-29 1990-10-15 Nisshin Seito Kk 新規制限酵素及びその製造法
DE3938143A1 (de) * 1989-11-16 1991-05-23 Boehringer Mannheim Gmbh Typ ii-restriktionsendonuklease sgrai
JPH0669373B2 (ja) * 1990-06-25 1994-09-07 寳酒造株式会社 新規制限酵素
US5391487A (en) * 1993-08-13 1995-02-21 Promega Corporation Restriction endonuclease SgfI from Streptomyces griseoruber
EP0655496A3 (en) * 1993-11-30 1996-07-17 Takara Shuzo Co Restriction endonuclease Sse 1825I.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1532583A1 (ru) * 1988-03-15 1989-12-30 Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ Штамм бактерий PaRacoccUS DеNIтRIFIсаNS-продуцент эндонуклеазы рестрикции Р @ 121
SU1650697A1 (ru) * 1989-05-11 1991-05-23 Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ Штамм бактерий BacILLUS LIснеNI FоRмIS - продуцент рестриктазы В @ 13I
US5192675A (en) * 1990-03-20 1993-03-09 Life Technologies, Inc. Cloned KpnI restriction-modification system
US5300432A (en) * 1991-10-18 1994-04-05 Stratagene Octanucleotide restriction endonuclease, Srf I, and method for producing the same
EP0577254A1 (en) * 1992-05-12 1994-01-05 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the nael restriction endonuclease and methylase

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104877976A (zh) * 2010-09-16 2015-09-02 独立行政法人海洋研究开发机构 新的细胞外分泌型核酸酶
CN104877976B (zh) * 2010-09-16 2018-05-01 独立行政法人海洋研究开发机构 新的细胞外分泌型核酸酶

Also Published As

Publication number Publication date
EP0698663B1 (en) 2000-04-05
CN1120069A (zh) 1996-04-10
DE69516060T2 (de) 2001-01-11
JPH0838171A (ja) 1996-02-13
US5726052A (en) 1998-03-10
EP0698663A1 (en) 1996-02-28
JP3017019B2 (ja) 2000-03-06
DE69516060D1 (de) 2000-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Szalay et al. Separation of the complementary strands of DNA fragments on polyacrylamide gels
EP4028515A1 (en) Novel class 2 type ii and type v crispr-cas rna-guided endonucleases
CN1062904C (zh) 限制性核酸内切酶
CN1796561A (zh) 一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因及其制备方法
CN1216998C (zh) 大幅度提高海栖热袍菌木聚糖酶b基因表达水平的技术方案
US4430432A (en) Endo-deoxyribonuclease and process for the production thereof
CN108949901B (zh) 一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法
EP0464990B1 (en) New restriction enzyme
US5496717A (en) Restriction endonuclease
US4886756A (en) Novel restriction endonuclease SplI and process for the production of the same
RU2796504C1 (ru) Способ защиты от контаминации реакционных смесей для ПЦР
CN102660651A (zh) 用于检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物及其检测方法
JP3092817B2 (ja) 制限酵素の製造方法
JP3498806B2 (ja) 新規制限酵素
CN112646861A (zh) 一种芽孢杆菌的pcr模板及其制备方法和应用
JPH10127279A (ja) 制限酵素
JPH0116156B2 (zh)
GB2164946A (en) Restriction enzyme and process for producing the same
RU2044053C1 (ru) Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco27k1
Watanabe Studies on sheep kidney nuclease: II. Limited digestion of ФX174 single-strand DNA
CN1493582A (zh) 一种洁净简便高效降解核酸的方法
US5470732A (en) Restriction enzyme from Brevibacterium linens
US4724209A (en) Process for producing restriction enzyme
GB2183657A (en) New restriction enzyme and process for producing the same
CN1113954A (zh) 白细胞介素-6的生产工艺

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee