JPH0669373B2 - 新規制限酵素 - Google Patents
新規制限酵素Info
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- JPH0669373B2 JPH0669373B2 JP2166164A JP16616490A JPH0669373B2 JP H0669373 B2 JPH0669373 B2 JP H0669373B2 JP 2166164 A JP2166164 A JP 2166164A JP 16616490 A JP16616490 A JP 16616490A JP H0669373 B2 JPH0669373 B2 JP H0669373B2
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- enzyme
- sse8387i
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Y10S435/886—Streptomyces
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、二重鎖デオキシリボ核酸（DNA）中の特定の
８塩基配列を特異的に認識、切断するII型制限酵素に関
する。
８塩基配列を特異的に認識、切断するII型制限酵素に関
する。
制限酵素とはDNA中のある特定の塩基配列を認識し、切
断することのできるエンド型ヌクレアーゼであり、数多
くの制限酵素が見出されている。分子遺伝学や、生化学
の発展により、DNAが遺伝をつかさどる本体であること
が明らかになつて以来、制限酵素は遺伝病解明のための
利用や、遺伝子操作での利用等現在広く用いられている
有用な酵素である。近年、染色体DNAなどの巨大DNAを解
析する研究が注目されており、制限酵素はその重要性が
高まつている。しかしながら、今までの制限酵素は、ほ
とんどが４塩基ないし６塩基認識であり、巨大なDNAを
解析するにはDNA上の切断部位数が多く、解析の困難な
ことが多い。そのため巨大なDNAを解析するには、切断
部位の出現頻度の少ない、すなわち８塩基認識以上の制
限酵素が要望されている。しかし現在までのところ、下
記の３種類の８塩基認識制限酵素 〔式中Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示し、ＮはＧ、
Ｃ、チミン（Ｔ）、又はアデニン（Ａ）のいずれでも良
い〕 が見出されているのみである。
断することのできるエンド型ヌクレアーゼであり、数多
くの制限酵素が見出されている。分子遺伝学や、生化学
の発展により、DNAが遺伝をつかさどる本体であること
が明らかになつて以来、制限酵素は遺伝病解明のための
利用や、遺伝子操作での利用等現在広く用いられている
有用な酵素である。近年、染色体DNAなどの巨大DNAを解
析する研究が注目されており、制限酵素はその重要性が
高まつている。しかしながら、今までの制限酵素は、ほ
とんどが４塩基ないし６塩基認識であり、巨大なDNAを
解析するにはDNA上の切断部位数が多く、解析の困難な
ことが多い。そのため巨大なDNAを解析するには、切断
部位の出現頻度の少ない、すなわち８塩基認識以上の制
限酵素が要望されている。しかし現在までのところ、下
記の３種類の８塩基認識制限酵素 〔式中Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示し、ＮはＧ、
Ｃ、チミン（Ｔ）、又はアデニン（Ａ）のいずれでも良
い〕 が見出されているのみである。
上記３種の８塩基認識II型制限酵素は、いずれもGCのみ
の認識であり、時にほ乳動物より分離されたDNAは、
５′−CG−３′配列の内、Ｃがメチル化されている場合
が多く、必ずしも認識配列のすべてが切断されるとはい
えないという問題点を有している。
の認識であり、時にほ乳動物より分離されたDNAは、
５′−CG−３′配列の内、Ｃがメチル化されている場合
が多く、必ずしも認識配列のすべてが切断されるとはい
えないという問題点を有している。
本発明の目的は、DNA中の８塩基配列、及びその周辺配
列中に５′−CG−３′を含まない塩基配列を認識し、か
つ切断する能力を有する遺伝子工学に有用な制限酵素を
提供することにある。
列中に５′−CG−３′を含まない塩基配列を認識し、か
つ切断する能力を有する遺伝子工学に有用な制限酵素を
提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は制限酵素に
関し、この制限酵素は二重鎖DNA中の下記塩基配列を特
異的に認識し、かつ矢印の位置で特異的に切断する能力
を有し、約37℃の至適温度及び至適pH範囲7.0〜9.0を有
することを特徴とする。
関し、この制限酵素は二重鎖DNA中の下記塩基配列を特
異的に認識し、かつ矢印の位置で特異的に切断する能力
を有し、約37℃の至適温度及び至適pH範囲7.0〜9.0を有
することを特徴とする。
また、本発明の第２の発明は第１の発明の制限酵素の生
産能を有する生産菌に関し、ストレプトマイセスエスピ
ー8387（FERM BP−3028）であることを特徴とする。
産能を有する生産菌に関し、ストレプトマイセスエスピ
ー8387（FERM BP−3028）であることを特徴とする。
本発明のII型制限酵素としては上記塩基配列を特異的に
認識し、かつ切断する能力を有する酵素であれば良く、
これらの酵素は上記二重鎖DNAの８塩基を認識する制限
酵素生産能を有する菌株、あるいは、これらの菌株の変
異株、あるいはこれら菌株より、通常の遺伝子操作手法
を用いて、本酵素生産能をコードする遺伝子を単離し、
他の生物に導入した組換え体のいずれによつても生産す
ることができる。
認識し、かつ切断する能力を有する酵素であれば良く、
これらの酵素は上記二重鎖DNAの８塩基を認識する制限
酵素生産能を有する菌株、あるいは、これらの菌株の変
異株、あるいはこれら菌株より、通常の遺伝子操作手法
を用いて、本酵素生産能をコードする遺伝子を単離し、
他の生物に導入した組換え体のいずれによつても生産す
ることができる。
上記８塩基認識制限酵素生産能を有する菌株の具体例と
しては、例えば、ストレプトマイセス エスピー8387
（Streptomyces sp 8387）が挙げられる。本菌は、土
壌中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その
菌学的性質は次のとおりである。
しては、例えば、ストレプトマイセス エスピー8387
（Streptomyces sp 8387）が挙げられる。本菌は、土
壌中より本発明者らが新たに検索して得た菌株で、その
菌学的性質は次のとおりである。
（１）形態的性質 基生菌糸は、長く伸長し、よく分岐するが、通常は分断
しない。胞子は、オートミール寒天培地、イースト・麦
芽寒天培地で良く形成される。顕微鏡で観察すると、気
菌糸の分岐方法は、単純分岐で、輪生分岐は見られな
い。気菌糸先端の形状は、直状ないしかぎ型である。
しない。胞子は、オートミール寒天培地、イースト・麦
芽寒天培地で良く形成される。顕微鏡で観察すると、気
菌糸の分岐方法は、単純分岐で、輪生分岐は見られな
い。気菌糸先端の形状は、直状ないしかぎ型である。
胞子は通常30〜50個の連鎖が認められ、表面はスムーズ
である。胞子の形状は円筒形ないし橢円形で、その大き
さは0.8〜0.9×1.5〜2.0μｍである。
である。胞子の形状は円筒形ないし橢円形で、その大き
さは0.8〜0.9×1.5〜2.0μｍである。
胞子のう、運動性胞子、菌核などは観察されない。
（２）各種培地上での生育状態 各種培地に27℃で14日間培養したときの肉眼での観察結
果を第１表に示す。
果を第１表に示す。
（３）生理的性質 （イ）生育温度範囲（酵素・麦芽寒天培地）： 10〜37℃の温度範囲で生育し、25〜30℃で良好に生育す
る。
る。
（ロ）ゼラチンの液化：陰性 （ハ）スターチの加水分解：良好 （ニ）脱脂乳のペプトン化：陰性 脱脂乳の凝固：陰性 （ホ）メラニン様色素の生育：陰性 （４）炭素源の利用（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地
上で27℃、14日間培養） （イ）利用する：フルクトース、グルコース、ラフイノ
ース、ガラクトース、マンノース （ロ）利用しない：イノシトール、スクロース、キシロ
ース、ラムノース 以上の性状により、本菌株は、放射菌の中でストレプト
マイセス属に属し、気菌糸の色調は“白色”〜“灰色”
シリーズ、気菌糸先端は直状ないしかぎ型で、胞子表面
はスムーズ、コロニー裏面の色調は白色〜淡褐色で、メ
ラニン様色素を生産しない菌株と要約される。
上で27℃、14日間培養） （イ）利用する：フルクトース、グルコース、ラフイノ
ース、ガラクトース、マンノース （ロ）利用しない：イノシトール、スクロース、キシロ
ース、ラムノース 以上の性状により、本菌株は、放射菌の中でストレプト
マイセス属に属し、気菌糸の色調は“白色”〜“灰色”
シリーズ、気菌糸先端は直状ないしかぎ型で、胞子表面
はスムーズ、コロニー裏面の色調は白色〜淡褐色で、メ
ラニン様色素を生産しない菌株と要約される。
本発明者らは、本菌株をストレプトマイセスエスピー83
87と称し、本菌株はStreptomycessp 8387と表示し、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第3028号
（FERM BP−3028）として、寄託されている。
87と称し、本菌株はStreptomycessp 8387と表示し、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第3028号
（FERM BP−3028）として、寄託されている。
ストレプトマイセス エスピー8387株の生産する８塩基
認識制限酵素は下記塩基配列を認識し、矢印の箇所： を切断し、Sse8387Iと命名されている。
認識制限酵素は下記塩基配列を認識し、矢印の箇所： を切断し、Sse8387Iと命名されている。
本発明による制限酵素Sse8387Iの製造方法について更に
詳細に説明する。まず、培養の際、培地に加える栄養源
は使用する菌株が利用し、Sse8387Iを生産するものであ
ればよく、炭素源としては、例えばグルコース、マルト
ース、グリセリンなどが利用でき、窒素源としては、酵
母エキス、ペプトン、コーンスチープリカー、肉エキス
などが適当である。その他にリン酸塩、カリウム塩、マ
グネシウム塩などの無機質及び金属塩類を加えても良
い。
詳細に説明する。まず、培養の際、培地に加える栄養源
は使用する菌株が利用し、Sse8387Iを生産するものであ
ればよく、炭素源としては、例えばグルコース、マルト
ース、グリセリンなどが利用でき、窒素源としては、酵
母エキス、ペプトン、コーンスチープリカー、肉エキス
などが適当である。その他にリン酸塩、カリウム塩、マ
グネシウム塩などの無機質及び金属塩類を加えても良
い。
Sse8387Iの生産量は、培養条件により変動するが、一般
に培養温度20〜35℃、培地のpH6〜８が良く、１〜３日
間の通気かくはん培養で制限酵素Sse8387Iの生産は最高
に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応
じ、生産量が最大になる様設定するのは当然である。
に培養温度20〜35℃、培地のpH6〜８が良く、１〜３日
間の通気かくはん培養で制限酵素Sse8387Iの生産は最高
に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応
じ、生産量が最大になる様設定するのは当然である。
本発明の菌株の培養によつて生成された制限酵素Sse838
7Iは主に菌体内に存在する。培養液からの菌体の分離
は、例えば遠心分離によつて行うことができる。本酵素
の抽出、精製は、一般の制限酵素精製法に従つた方法で
実施しうる。例えば菌体を緩衝液に懸濁後、超音波処理
により破砕し、細胞内酵素の抽出を行う。次に、細胞残
渣を超遠心分離により除去後、抽出液を硫酸アンモニウ
ムで塩析する。沈殿物を、緩衝液Ａ（20mMトリス−HCl
pH7.5、10mM2−メルカプトエタノール、５％グリセリ
ン）に溶解し、同緩衝液にて透析後、イオン交換クロマ
ト方法、分子ふるいクロマト方法、及びアフイニテイー
クロマト方法等による精製を行い、本制限酵素を得るこ
とができる。
7Iは主に菌体内に存在する。培養液からの菌体の分離
は、例えば遠心分離によつて行うことができる。本酵素
の抽出、精製は、一般の制限酵素精製法に従つた方法で
実施しうる。例えば菌体を緩衝液に懸濁後、超音波処理
により破砕し、細胞内酵素の抽出を行う。次に、細胞残
渣を超遠心分離により除去後、抽出液を硫酸アンモニウ
ムで塩析する。沈殿物を、緩衝液Ａ（20mMトリス−HCl
pH7.5、10mM2−メルカプトエタノール、５％グリセリ
ン）に溶解し、同緩衝液にて透析後、イオン交換クロマ
ト方法、分子ふるいクロマト方法、及びアフイニテイー
クロマト方法等による精製を行い、本制限酵素を得るこ
とができる。
制限酵素Sse8387Iの活性測定法を以下に示す。
下記第２表に示す組成の反応液50μｌを予め37℃で予熱
した後、本酵素を加え酵素反応を進める。10分後に酵素
反応停止液（１％SDS、50％グリセロール、0.02％ブロ
ムフエノールブルー）を５μｌ添加して反応を停止させ
る。
した後、本酵素を加え酵素反応を進める。10分後に酵素
反応停止液（１％SDS、50％グリセロール、0.02％ブロ
ムフエノールブルー）を５μｌ添加して反応を停止させ
る。
第 ２ 表 10 mM トリス−HCl、pH8.0 10 mM MgCl2 7 mM ２−メルカプトエタノール 50 mM NaCl 1.0 μｇ λ−DNA 反応液を0.7％アガローススラブゲルに重層し、10V／cm
の定電圧下で約１時間から２時間、電気泳動を行う。電
気泳動様緩衝液は90mMトリス−ほう酸緩衝液（pH8.3）
2.5mM EDTAを用いる。ゲルに前もつて0.5μｇ／mlのエ
チジウムブロマイドを含ませておくことにより、UV照射
でDNAのバンドが検出可能である。DNAフラグメントのバ
ンドの数と量が変化しなくなつた時を終点とする。
の定電圧下で約１時間から２時間、電気泳動を行う。電
気泳動様緩衝液は90mMトリス−ほう酸緩衝液（pH8.3）
2.5mM EDTAを用いる。ゲルに前もつて0.5μｇ／mlのエ
チジウムブロマイドを含ませておくことにより、UV照射
でDNAのバンドが検出可能である。DNAフラグメントのバ
ンドの数と量が変化しなくなつた時を終点とする。
活性の定義は37℃で１時間に１μｇのλ−DNAを完全に
切断する酵素活性を１単位とする。
切断する酵素活性を１単位とする。
制限酵素Sse8387Iは、以下のような理化学的性質を持つ
ている。
ている。
（１）作用及び基質特異性 本酵素は二本鎖DNA配列中の という塩基配列を認識し、かつ矢印の位置で切断する酵
素である。
素である。
本発明の制限酵素Sse8387Iの認識部位の決定は以下の様
に行つた。
に行つた。
制限酵素Sse8387Iは、λ−DNAを５カ所、AD−2DNAを３
カ所、pUC18DNA、Ｍ 13mp18DNAを各１カ所切断した。
しかし、SV40、Col EI、pBR322、φx174DNAは切断しな
かつた。この結果、及び得られたDNA断片の鎖長を検索
したところ、この酵素は、DNA配列中の ５′−CCTGCAGG−３′ を認識している事が示唆された。この８塩基配列には、
内部に、６塩基認識制限酵素PstI（５′−CTGCAG−
３′）を含んでいる事より、λ−DNA、AD−2DNA、pUC18
DNA、M13mp18DNAそれぞれを、PstIで切断後、更にSse83
87Iで切断を行つたが、得られるDNA断片のパターンに全
く変化がなく、制限酵素Sse8387Iは、５′−CCTGCAGG−
３′を認識していると結論された。
カ所、pUC18DNA、Ｍ 13mp18DNAを各１カ所切断した。
しかし、SV40、Col EI、pBR322、φx174DNAは切断しな
かつた。この結果、及び得られたDNA断片の鎖長を検索
したところ、この酵素は、DNA配列中の ５′−CCTGCAGG−３′ を認識している事が示唆された。この８塩基配列には、
内部に、６塩基認識制限酵素PstI（５′−CTGCAG−
３′）を含んでいる事より、λ−DNA、AD−2DNA、pUC18
DNA、M13mp18DNAそれぞれを、PstIで切断後、更にSse83
87Iで切断を行つたが、得られるDNA断片のパターンに全
く変化がなく、制限酵素Sse8387Iは、５′−CCTGCAGG−
３′を認識していると結論された。
制限酵素Sse8387Iの切断部位の決定はM13mp18一本鎖DNA
と、５′末端塩基を放射性リン酸化したプライマー （５′−GTTTCCCAGTCACGAC−３′）をアニール後、大腸
菌DNAポリメラーゼＩクレノー断片により、二本鎖を合
成し、その二本鎖DNAを本酵素により切断し、変性ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により、切断断片の鎖長を
測定する方法を用い行つた。この時、生成物として得ら
れた鎖長は の矢印の所で切断されたスポツトとして検出され、また
T4DNAポリメラーゼによるブランテイング処理により4bp
短いスポツトとして検出されたことより、本酵素は、 を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
と、５′末端塩基を放射性リン酸化したプライマー （５′−GTTTCCCAGTCACGAC−３′）をアニール後、大腸
菌DNAポリメラーゼＩクレノー断片により、二本鎖を合
成し、その二本鎖DNAを本酵素により切断し、変性ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により、切断断片の鎖長を
測定する方法を用い行つた。この時、生成物として得ら
れた鎖長は の矢印の所で切断されたスポツトとして検出され、また
T4DNAポリメラーゼによるブランテイング処理により4bp
短いスポツトとして検出されたことより、本酵素は、 を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
（２）至適酵素活性条件 Ｉ）至適温度 Sse8387Iの至適温度は約37℃であつた。
II）至適pH Sse8387Iの至適pHは、pH7.0〜9.0の範囲にある。
III）塩濃度 Sse8387Iの至適塩濃度は、NaClの場合、０〜150mMであ
つた。
つた。
IV）MgCl2濃度 Sse8387IはMgCl2濃度がが5mM〜20mMの存在下で酸素反応
が活性化された。
が活性化された。
Ｖ）分子量 Sse8387IはセフアデツクスＧ−200を用いたゲルろ過方
法で、分子量12万〜14万である。
法で、分子量12万〜14万である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。
明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例 １ 30容のジヤーフアーメンターに下記第３表に示す培地
20を仕込み常法により培地を滅菌した。
20を仕込み常法により培地を滅菌した。
上記と同じ培地で30℃で48時間振とう培養したスレプト
マイセス エスピー8387（FERM BP−3028）の種培養液5
00mlを上記ジヤーフアーメンターに移植し、通気量0.5v
vm、かくはん数250rpm、30℃で18時間培養を行つた。次
いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液20から湿
重量にして約480gの菌体が得られた。
マイセス エスピー8387（FERM BP−3028）の種培養液5
00mlを上記ジヤーフアーメンターに移植し、通気量0.5v
vm、かくはん数250rpm、30℃で18時間培養を行つた。次
いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液20から湿
重量にして約480gの菌体が得られた。
第 ３ 表 グルコース 10g 酵母エキス 10g ポリペプトン 10g 食塩 5g 脱イオン水 １ pH7.2 得られた菌体のうち、72gの菌体を360mlの緩衝液Ａに懸
濁し、超音波破砕機を用いて破砕後、100000×ｇで１時
間遠心分離を行い、残渣を除去、抽出液400mlを得た。
得られた抽出液に4gのストレプトマイシンを添加し、４
℃、１時間放置後、10000×ｇで10分遠心距離を行い、
上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを80
％飽和になるように加え、沈殿物を遠心分離にて集め、
緩衝液Ａ＋0.2M KClに溶解後、同緩衝液で一晩透析を行
つた。
濁し、超音波破砕機を用いて破砕後、100000×ｇで１時
間遠心分離を行い、残渣を除去、抽出液400mlを得た。
得られた抽出液に4gのストレプトマイシンを添加し、４
℃、１時間放置後、10000×ｇで10分遠心距離を行い、
上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを80
％飽和になるように加え、沈殿物を遠心分離にて集め、
緩衝液Ａ＋0.2M KClに溶解後、同緩衝液で一晩透析を行
つた。
次に透析内液を予め0.2M KClを含む緩衝液Ａで平衡化さ
せておいたホスホセルロース（ワツトマン製品P11）100
mlのカラムに吸着させ、0.2M KClを含む緩衝液Ａで洗浄
後、0.2M〜1.0M KClの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶
出させた。得られた活性画分を合せ、10mMのリン酸カル
シウム緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト（バイ
オラツド製品）30mlのカラムに吸着させ、10mMのリン酸
カリウム緩衝液で洗浄後、10〜500mMの直線濃度勾配を
持つリン酸カリウム緩衝液で溶出させた。
せておいたホスホセルロース（ワツトマン製品P11）100
mlのカラムに吸着させ、0.2M KClを含む緩衝液Ａで洗浄
後、0.2M〜1.0M KClの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶
出させた。得られた活性画分を合せ、10mMのリン酸カル
シウム緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト（バイ
オラツド製品）30mlのカラムに吸着させ、10mMのリン酸
カリウム緩衝液で洗浄後、10〜500mMの直線濃度勾配を
持つリン酸カリウム緩衝液で溶出させた。
得られた活性画分を合せ緩衝液Ａで４時間透析後、透析
内液を予め緩衝液Ａで平衡化したヘパリン−セフアロー
ス（フアルマシア製品）30mlのカラムに吸着させ、緩衝
液Ａで十分洗浄後、0.2〜0.8MのKClの直線濃度勾配を持
つ緩衝液Ａで溶出し、本酵素の標品を得た。
内液を予め緩衝液Ａで平衡化したヘパリン−セフアロー
ス（フアルマシア製品）30mlのカラムに吸着させ、緩衝
液Ａで十分洗浄後、0.2〜0.8MのKClの直線濃度勾配を持
つ緩衝液Ａで溶出し、本酵素の標品を得た。
この酵素標品には非特異的なDNA分解酵素及びホスフア
ターゼはきよう雑していなかつた。
ターゼはきよう雑していなかつた。
以上述べた方法により72gの湿菌体より50万単位の活性
が得られた。
が得られた。
以上詳細に説明したとおり、本発明により二重鎖DNAの
８塩基配列認識し、切断する制限酵素が提供された。本
発明の酵素は遺伝子工学の分野において、長鎖DNAの解
析等に非常に有用である。
８塩基配列認識し、切断する制限酵素が提供された。本
発明の酵素は遺伝子工学の分野において、長鎖DNAの解
析等に非常に有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (2)
- 【請求項１】二重鎖デオキシリボ核酸中の下記塩基配列
を特異的に認識し、かつ矢印の位置で特異的に切断する
能力を有し、約37℃の至適温度及び至適pH範囲7.0〜9.0
を有することを特徴とする制限酵素。 （式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｃ
はシトシンを示す） - 【請求項２】請求項１に記載の制限酵素の生産能を有す
るストレプトマイセス エスピー8387（FERM BP−302
8）。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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