CN103333900B - 一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，含有选自以下的核苷酸序列：1）SEQ？ID？No.3中所示的第724-第1470位核苷酸序列；和/或SEQ？ID？No.1中所示的第724-第2472位核苷酸序列；2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。本发明的pVAX-CDPK1可有效地预防和控制弓形虫动物模型（昆明鼠）的感染，同时，pVAX-IL21-IL15不仅单独使用可有效地预防和控制弓形虫的感染，而且作为细胞因子佐剂可有效地提升疫苗pVAX-CDPK1的免疫效果。

Description

一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学领域,，尤其是涉及一种用于弓形虫感染预防的重组质粒。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii，T.gondii)是一种专性细胞内寄生的机会致病性原虫，属于孢子虫纲(Sporozoasida)真球虫目(Eucoccidiida)肉孢子虫科(Sarcocystidae)。所致的弓形虫病呈世界性范围分布，全球约1/3的人受感染，严重危害人类和动物的健康。弓形虫作为一种机会感染因子，可在免疫抑制或免疫缺陷患者中(如艾滋病患者、器官移植及恶性肿瘤患者等)引起严重的器官损害。妇女孕期首次感染弓形虫可引起流产、死胎以及胎婴先天性缺陷或畸形等。作为人兽共患病，弓形虫病对动物的影响也受到广泛关注。感染弓形虫可引起家畜发热、腹泻、呼吸困难及中枢神经系统疾病，可导致怀孕家畜流产、产弱胎或死胎，给畜牧业带来巨大的经济损失。弓形虫也可经肉、乳、蛋类大量流入食品市场，成为人类的传染源。猫是弓形虫的终末宿主，犬是中间宿主，作为伴侣动物，它们在弓形虫病的传播中也具有不可忽视的作用。因此，动物弓形虫病的流行和爆发也必将导致人类弓形虫病的流行和高发。弓形虫感染带来的危害如此严重，防治此病已刻不容缓。然而，由于弓形虫生活史复杂，目前还没有明确的、彻底的药物来预防弓形虫感染。虽然临床常以磺胺嘧啶和乙胺嘧啶联合用药为来治疗弓形虫病，但存在疗程长、不良反应多，疗效上不很理想，不能杀灭包囊等缺陷。因此目前，免疫预防尤其是DNA疫苗被认为是控制弓形虫病流行的重要措施。

目前，DNA疫苗已在抗寄生虫如：血吸虫，蛔虫，尤其是在原虫，包括疟原虫、利什曼原虫，锥虫等寄生虫的防治中得到广泛的应用，而且在抗弓形虫感染的疫苗研究也迈入了一个新的阶段，然而研究抗弓形虫的核酸疫苗却未取得较为理想的效果。究其原因，弓形虫生活史复杂，形态多样，宿主范围广泛，不同性质的抗原其免疫原也不同，而其包囊和速殖子的致病机制也存在差异，虽然能找到各种不同的单一抗原成分为基础的疫苗候选抗原，但是由于其含有的淋巴细胞结合位点少、受机体主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex,MHC)限制性大，而难以形成有效的抵抗力对抗弓形虫不同形态的攻击感染，因此仅靠少数的候选抗原基因也很难达到理想的效果，而找到更多的，更好的来源于不同弓形虫阶段的DNA疫苗候选抗原，尤其是与弓形虫毒力相关的抗原基因是研究抗弓形虫疫苗的一个重要途径。

同时，科研学者们提出核酸疫苗研究是否成功的关键，与多种因素相关，如佐剂、辅料、疫苗载体、给药途径等，因此这些理论证明在抗弓形虫的DNA疫苗中加入佐剂将极大的提高其免疫效果。大量的研究表明细胞因子具有明显的免疫佐剂效应，其可以纯化的蛋白质形式共同或提前免疫动物，也可将其编码的某些基因片段与疫苗DNA重组共同释放表达，从而调节免疫应答，增强和保护机体免受病毒、细菌和寄生虫的侵袭。截止到目前已有不少的细胞因子佐剂应用于抗弓形虫的疫苗研究中，如IL-2，IL-12，IL-7以及最近于我们实验室研究的IL-18(已发表的文章)等，这些细胞因子佐剂均能显著的增强疫苗的免疫保护效率。因此，细胞因子佐剂已逐渐成为弓形虫疫苗研究的又一趋势。

发明内容

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的基因，能有效的对抗弓形虫不同形态的攻击感染，可以应用其来制备感染预防弓形虫的疫苗。

弓形虫钙离子依赖蛋白酶1(CDPK1)是钙离子依赖性的胞吐作用所必要的调控酶，其能调控钙离子依赖的微线体(MICs)的分泌。当条件性敲除该蛋白时，弓形虫的一些重要表型就会被抑制如：虫体活力，入侵和逸出宿主细胞。这种重要功能的与弓形虫入侵有关的蛋白提示其能成为抗弓形虫的疫苗候选抗原。

IL-15是维持内环境“稳态”的细胞因子之一，能够显著的增强抗弓形虫的CD8+T淋巴细胞介导的免疫应答，并延长免疫记忆T淋巴细胞的存活。同时，还发现IL-21对于抗慢性病毒感染是十分必要的，将IL-21和IL-15联合免疫能显著的提高抗原特异性的CD8+T细胞的效应功能。而且研究还表明IL-15和IL-21的联合能增强DNA疫苗抗HIV病毒感染的免疫保护性效果。因此IL-15和IL-21的联合具有成为抗弓形虫细胞因子佐剂的前景。

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：

1)SEQIDNo.3中所示的第724-第1470位核苷酸序列；和/或

SEQIDNo.1中所示的第724-第2472位核苷酸序列；

2)与1)中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

3)对上述1)或2)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，例如所述载体为pVAX1载体。

本发明的第三个目的是提供一种重组质粒，其为SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列；和/或SEQIDNo.3中所示的核苷酸序列。

本发明的第四个目的是提供一种蛋白，其氨基酸序列由权利要求3所述的重组质粒编码。

本发明的第五个目的是提供一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。

本发明的第六个目的是提供权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的载体、权利要求3所述的重组质粒、权利要求4所述的蛋白、权利要求5所述的疫苗在弓形虫感染预防中的应用。

本发明的第七个目的是提供大量制备pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1重组质粒的方法，步骤如下：

(1)、将含有pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1质粒的菌液在Kan⁺LB固体选择培养基上过夜培养，接种到Kan⁺LB液体选择培养基中进行扩大培养；

(2)、将步骤(1)得到的细菌培养物离心取沉淀，重悬菌体；

(3)、将步骤(2)得到的菌液先后用SolutionII和SolutionIII混匀，离心取上清；

(4)、将步骤(3)得到的上清用0.6倍体积±1ml的异丙醇混匀，离心取沉淀，将沉淀先用ddH₂O溶解，再加入LiCl溶液混匀，离心取上清，加入异丙醇混匀后离心弃上清，控干，得白色沉淀物；

(5)、将步骤(4)制备的白色沉淀物除RNA，加入无水乙醇和NaAc溶液混匀后离心取沉淀，洗脱沉淀。

进一步地，步骤(2)后不包含加入溶菌酶溶液振荡混匀的步骤。

进一步地，步骤(3)中SolutionII和SolutionIII加入的时间间隔控制在5min以内。

进一步地，步骤(5)中离心取沉淀的方法为将上清吸出，再倒置于滤纸上控干。

本发明的pVAX-CDPK1可有效地预防和控制弓形虫动物模型(昆明鼠)的感染，同时，pVAX-IL21-IL15不仅单独使用可有效地预防和控制弓形虫的感染，而且作为细胞因子佐剂可有效地提升疫苗pVAX-CDPK1的免疫效果。由此认为pVAX-CDPK1可作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫感染，而且重组的pVAX-IL21-IL15可以作为免疫治疗剂或细胞因子佐剂用于抗弓形虫的感染。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是pVAX-CDPK1构建路线；

图2是pVAX-IL21-IL15构建路线；

图3是弓形虫RH株死亡曲线图；

图4是pMD18-T质粒；

图5是pVAX1质粒。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

雌性KM鼠，6w龄左右，体重20±2g，购自兰州大学医学实验中心。

宿主菌，弓形虫RH、PRU株，pVAX1真核表达载体等材料，均为中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫功能基因组学研究室保存并提供。

PrimeScript^TMOneStepRT-PCRKitVer.2(货号：RR055B)、10×PCRBuffer(Mg^{2 +}free)、MgCl₂(25mmol/L)、dNTPMixture(2.5mmol/Leach)、Ex-Taq(5U/μL)(货号：DDR100D)、pMD18-TVector(货号：D103A)、BamHI(货号：D1010A)、XhoI(货号：D1094A)、KpnI(货号：D1068A)、PstI(货号：D1073A)、XbaI(货号：D1093A)、10×MBuffer、10×KBuffer、10×和6×LoadingBuffer：购自TaKaRa公司；

SVGenomicDNAPurificationSystem(货号：A2360)、Tris-Cl、EDTA、IPTG、X-gal、T4DNA连接酶：购自Promega公司；

RNAprepPureTissueKit(货号：DP431)、TIANprepMiniPlasmidKit(货号：DP103-02)、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：货号：DP209-02)、普通DNA产物纯化试剂盒(货号：DP204-02)：购自天根生化科技(北京)有限公司；

氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、琼脂糖：购自Sigma公司；

其他化学试剂如NaCl、、无水乙醇等均为国产分析纯级产品。

一、pVAX-CDPK1重组质粒的制备步骤如下：

1.弓形虫RH株总RNA的提取：将弓形虫RH株腹腔接种KM鼠，96h后，经颈椎脱臼致死，无菌收集小鼠腹水1.0mL，在10000转/分钟转速下离心3～5min，弃上清，备用。用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒RNAprepPureTissueKit提取弓形虫RH株总RNA，提取的具体方法和步骤参见说明书。

2.RT-PCR扩增：以所提取的弓形虫RH株总RNA为模板，用大连宝生物工程公司PrimeScript^TMOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒进行CDPK1基因的RT-PCR扩增，使用方法参见说明书。其中，

上游引物：FCDPK1：5′-CGGGGTACCATGGGGCAGCAGGAAAGCAC-3′；

下游引物：RCDPK1：5′-GCTCTAGATTAGTTTCCGCAGAGCTTCAAGA-3′；

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58.8℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环，最后，72℃延伸10min。

3.PCR扩增产物的连接与转化：将步骤2中的扩增产物与pMD连接，连接反应使用TaKaRa公司的pMD^TM18-TVector，使用方法参见说明书，连接条件为16℃反应2～4h或4℃连接过夜，连接产物标记为pMD18-CDPK1。

4.CDPK1的序列测定：将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。测序结果见SEQIDNo.1中所示的第724-第2472位核苷酸序列。其编码的蛋白序列见SEQIDNo.2。

5.pVAX1质粒的小量提取：用天根生化科技(北京)有限公司的TIANprepMiniPlasmidKit进行质粒提取，使用方法参照说明书。

6.pVAX1载体(图5所示)及CDPK1目的片段的回收：用KpnI和XbaI分别双酶切pVAX1质粒及pMD18-CDPK1重组质粒，并用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体及目的片段，使用方法参照说明书。

7.pVAX1载体及CDPK1目的片段的连接：将经切胶回收纯化得到的CDPK1基因片段定向亚克隆至pVAX1载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-CDPK1。其核苷酸序列见SEQIDNo.1，其中，第724-第2472位核苷酸序列为CDPK1的核苷酸序列(已用下划线标出)。

8.连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化至大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。产物标记为pVAX-CDPK1。pVAX-CDPK1构建路线参照图1。

二、KM鼠pVAX-IL21-IL15重组质粒的构建

1.KM鼠脾脏总RNA的提取：弓形虫RH株腹腔接种KM鼠72h后，将其经颈椎脱臼致死，并将其置75％乙醇溶液中浸泡2～3min，无菌取出脾脏。将脾脏装入一个RNase-Free离心管，用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒RNAprepPureTissueKit提取KM鼠脾脏总RNA，提取的具体方法和步骤参见说明书；

2.RT-PCR扩增目的片段：以KM鼠脾脏总RNA为模板，用大连宝生物工程公司PrimeScript^TMOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒进行IL21和IL15基因序列的RT-PCR扩增，使用方法参见说明书。其中：

IL15基因引物序列：

上游引物：F_15B：5′-AACTGCAGATGAACTGGATAGATGTAAGATATG-3′；

下游引物：R_15B：5′-TGCTCTAGATCAGGACGTGTTGATGAAC-3′；

IL21基因引物序列：

上游引物：F₂₁：5′-CGGGGTACCATGCATAAATCAAGCCCCCAAG-3′；

下游引物：R₂₁：5′-AACTGCAGCTAGGAGAGATGCTGATGAATC-3′；

IL21RT-PCR反应条件为：

IL15RT-PCR反应条件为：

3.RT-PCR扩增产物的连接：将步骤2中的扩增产物分别与pMD连接，连接反应使用TaKaRa公司的pMD^TM18-TVector，使用方法参见说明书；连接条件为16℃反应2～4h或4℃连接过夜，产物依次标记为pMD18-IL21和pMD18-IL15。

4.pMD18-IL21和pMD18-IL15重组质粒的小量提取：用天根生化科技(北京)有限公司的TIANprepMiniPlasmidKit进行质粒提取，使用方法参见说明书。

5.IL21和IL15的序列测定：将经菌液PCR和双酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。

6.pVAX1及目的片段IL15的回收与连接：用PstI和XbaI双酶切pVAX1质粒和pMD18-IL15重组质粒，用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体及目的片段，使用方法参见说明书。然后将经切胶回收纯化得到的IL15基因片段定向亚克隆到相应pVAX1载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-IL15。

7.连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化至大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。

8.pVAX-IL15和pMD18-IL21重组质粒的小量提取：用天根生化科技(北京)有限公司的TIANprepMiniPlasmidKit进行质粒提取，使用方法参见说明书。

9.pVAX-IL15及目的片段IL21的回收与连接：用KpnI和PstI双酶切pVAX-IL15和pMD18-IL21重组质粒。用天根生化科技(北京)有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收线性载体pVAX-IL15及目的片段IL21，使用方法参见说明书，将经切胶回收纯化得到的IL21基因片段定向亚克隆到pVAX-IL15载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-IL21-IL15。pVAX-IL21-IL15构建路线参照图2。

10.连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化至大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。

11.pVAX-IL21-IL15的序列测定与保存：将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，于-20℃进行保存，送到上海生工生物工程有限公司测序。pVAX-IL21-IL15的序列见SEQIDNo.3。其中，第724-1116位核苷酸序列为IL21基因序列，第1123-1470为核苷酸序列为IL15基因序列(已分别用下划线标出)。IL21基因编码的蛋白序列见SEQIDNo.4，IL15基因编码的蛋白序列见SEQIDNo.5。

三、培养基和溶液的配制：

a、溶液的配制：

(1)LB液体培养基

称取LB粉末5.0g，加适量的去离子水溶解，并定容至200mL，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

(2)LB固体培养基

于LB液体培养基中加入2.0％(m/V)琼脂粉，121℃高压灭菌20min，待其冷却到55℃～65℃时倾注平板，待凝固后4℃保存备用。

(3)Kan⁺LB选择液体培养基

待(1)中制备的LB液体培养基高压灭菌后冷却至50℃～55℃时，加入Kan(卡那霉素)(终浓度为1000IU/mL)，摇晃混匀后4℃保存。

(4)Kan⁺LB固体选择培养基

待(2)中制备的LB固体培养基灭菌后冷却至50℃～55℃时，加入Kan(终浓度为1000IU/mL)并轻轻摇动，混匀后迅速倾注平板，室温凝固并于4℃保存备用。

b、质粒大量提取时溶液的配制：

(1)0.25mol/LTris-Cl溶液(pH8.0)

称取Tris-Cl粉末6.055g，并将其溶解到100mLddH₂O中，调节pH值为8.0，定容到200mL，高压灭菌后4℃保存备用。

(2)0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)

称取Na₂EDTA37.22g，溶于200mLddH₂O中，振荡混匀，调节pH值为8.0，高压灭菌后4℃保存备用。

(3)TE溶液(pH8.0)

先将(1)中制备的0.25mol/LTris-Cl溶液和(2)中制备的0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)稀释，并分别吸取10mmol/LTris-Cll.0mL与1mmol/LEDTA0.2mL，加入无菌ddH₂O后定容到100mL，4℃保存备用。

(4)10％SDS溶液(pH7.2)

称取SDS(十二烷基磺酸钠)粉末10g，加入去离子水90mL后60℃水浴溶解，用浓HCl将其pH值调为7.2，并定容到100mL，现配现用，不宜长期保存。

(5)2mol/LNaOH溶液

先于烧杯中加入去离子水160mL，称取NaOH粉末16.0g并缓缓加入到去离子水中，边加边混匀，定容到200mL后于塑料瓶中4℃保存。

(6)SolutionI

取(1)中制备的0.25mol/LTris-C110mL，(2)中制备的0.5mol/LEDTA2mL，加去离子水定容到100mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

(7)SolutionII

取2mol/LNaOH10mL，10％SDS10mL，加去离子水定容到100mL，现配现用，常温保存，不宜长时间存放。

(8)SolutionIII

称取KAc粉末58.884g，与冰乙酸23mL混合，加入适量去离子水溶解后定容到200mL，4℃保存。

(9)3mol/LNaAc溶液(pH5.2)

称取无水NaAc49.22g，加去离子水定容到200mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

(10)5mol/LLiCl溶液

称取无水LiCl42.4g，加去离子水定容到200mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

(11)10mg/mL溶菌酶

使用前，称取10mg的溶菌酶，加10mmol/L的Tris-Cl(PH8.0)即刻溶解定容至1mL，-20℃保存。

四、大量制备质粒

1.挑取步骤(一)和(二)中制备的已保存于-20℃的含有目的质粒(pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1)的阳性菌液于Kan⁺LB固体选择培养基上划线，37℃培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于12mLKan⁺LB液体选择培养基中，摇床37℃，以180～220转/分钟的转速培养12～16h。将上述培养菌液以体积比1：100的比例接种到装有400mLKan⁺LB液体选择培养基的1000mL锥形瓶中，摇床37℃，在180～220转/分钟转速下培养过夜。

2.将步骤1得到的细菌培养物置于冰中或4℃冰箱数分钟，4℃，以9000转/分钟转速离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清(利用移液器小心吸出上清)，倒置离心管使上清尽量流出。用10mL4℃预冷的SolutionI重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在SolutionI中完全分散。(由于旋涡振荡和SolutionI的加入已足够是菌液裂解分散，为了简化操作，此处省去现有技术中进一步裂解分散的步骤：加入1mL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液(pH8.0)，震荡混匀)。

3.在步骤2得到的菌液中加入20mL新配制的SolutionII，轻摇并上下颠倒混匀2～4次。再加入15mL4℃预冷的SolutionIII，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或-20℃冰箱放置10min。加SolutionII和SolutionIII的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，利用4层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中。

4.将步骤3得到的上清与14-16mL异丙醇(现有技术中此处需加入0.6倍体积的异丙醇的方法，本申请人通过实验发现，异丙醇的加入量在0.6倍体积上下各1ml的范围内，是不影响产物的提取质量和产量的)混匀，室温放置10min。室温下，在11000转/分钟下离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上数分钟，除去残余。加入3mLddH₂O充分溶解，再加入3mL预冷的5mol/LLiCl溶液(此时需先加ddH₂O，后加LiCl，才能使沉淀充分溶解，颠倒步骤易造成沉淀溶解不充分或不溶解)，充分混匀，此处不可用吹打的方式混匀。吹打混匀易使提取的质粒发生断裂，两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积(12mL)预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，小心弃上清，倒置控干管内液体，一般倒置10～15min即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。

5.在步骤4制备的白色沉淀物中加入3mLddH₂O或TE溶液(pH8.0)溶解沉淀，并加入30μL10mg/mLRNaseA(Takara公司产品)，37℃水浴1h除去RNA。加入2倍体积(8mL)无水乙醇和1/10体积(400μL)的3mol/LNaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min。4℃，在11000转/分钟下离心10min，小心将上清吸出(勿用倾倒的方式除去上清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出)，并将离心管倒置于滤纸上控干(主要控干残余的试剂如：乙醇和NaAc，减少杂质，提高质粒的纯度)。加入100μLddH₂O或TE溶液(pH8.0)，充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，测出的浓度为10000mg/mL。因此，我们将以保存浓度为1000mg/mL(十倍稀释)的量分装于1.5mL离心管中，即每管保存有1000mg质粒，体积为1mL，分装封口后于-20℃保存备用。

五、质粒DNA的纯度检测

以ddH₂O或TE(pH8.0)为空白对照，用分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。双链DNA纯品的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8，若样品OD₂₆₀/OD₂₈₀值低于1.8，说明样品可能被蛋白质污染，需进一步纯化。

六、重组质粒的免疫效果评价

1.KM鼠免疫与分组：为了降低应激反应，KM鼠买回后需饲养1周，然后将其随机分为6个组，每组30只，每组进行的免疫实验情况见表1。

表1实验动物分组

以左后腿胫后肌注射途径进行免疫，首先将空载体pVAX1和提取纯化的重组质粒pVAX-IL21-IL15、pVAX-CDPK1用PBS(pH7.4)溶液稀释至100μg/100μL，分别给第3～5组中每只小鼠各注射100μL；再将纯化的重组质粒pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1用PBS(pH7.4)溶液稀释至200μg/100μL，然后将pVAX-IL21-IL15与pVAX-CDPK1等体积混合，混匀后于第6组中每只小鼠各注射100μL。初次免疫后，按照同样的剂量，于第2周和第4周对第Ⅱ组至第Ⅵ组加强免疫一次。

2.腹腔注射感染弓形虫RH株：弓形虫RH株的复苏需在攻虫前2周进行。从液氮罐中取出保存有弓形虫RH株虫体的冻存管，并立即将其放入37℃温水中进行解冻。将冻存管中的液体混匀，每只小鼠腹腔注射200μL，进行第一次传代。待感染小鼠发病(4～6d)，颈椎脱臼处死后无菌采集小鼠腹水1～2mL。混匀后，吸取10μL腹水进行镜检。按照上述方式进行第二和第三次传代。将经第三次传代纯化后所得虫体按1×10³个速殖子/只的剂量，腹腔接种各组小鼠各15只，观察并记录其存活时间。见表2。

3.灌胃感染弓形虫PRU株：弓形虫PRU株的准备需在攻虫前30天进行。颈椎脱臼处死被弓形虫PRU株感染的小鼠，75％酒精浸泡2～3min。取出并于超净工作台中，无菌采集脑组织并将其置于研钵中，加入1mL生理盐水进行研磨。待研磨完全后，吸取10μL进行镜检，并观察计数。按10个包囊/只的剂量，以灌胃的方式感染各组小鼠各6只，攻虫后30天进行脑包囊计数。见表3。

本发明的有益效果将通过以下数据说明：

表2弓形虫RH株死亡情况：

表3PRU脑包囊计数和减少率：

如图2所示，与对照组(Control，PBS和pVAX1)相比，实验组小鼠存活时间均显著性增加，pVAX-IL21-IL15+pVAX-CDPK1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-CDPK1的存活时间分别为19.3±5.19^D，12.0±2.01^B，17.3±4.31^C；与pVAX-IL21-IL15或pVAX-CDPK1相比，pVAX-IL21-IL15+pVAX-CDPK1更能显著性增加实验鼠感染T.gondiiRH株后的存活天数；6d内对照组小鼠无存活。

从上述表格可以看出，无论是减少PRU脑包囊数目，还是延缓RH的死亡时间，都说明重组质粒pVAX-CDPK1可有效地起到良好的免疫效果，重组细胞因子质粒pVAX-IL21-IL15与pVAX-CDPK1的联合使用能进一步地有效地提升pVAX-CDPK1的免疫效果，可作为一种良好的免疫佐剂应用于实际的弓形虫感染预防中。

综上所述，本发明的pVAX-CDPK1可有效地预防和控制弓形虫动物模型(昆明鼠)的感染，同时，pVAX-IL21-IL15不仅单独使用可有效地预防和控制弓形虫的感染，而且作为细胞因子佐剂可有效地提升疫苗pVAX-CDPK1的免疫效果。由此可认为pVAX-CDPK1可作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫感染，而且重组的pVAX-IL21-IL15可以作为免疫治疗剂或细胞因子佐剂用于抗弓形虫的感染。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种用于弓形虫感染预防的基因及其应用

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>4679

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gactcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttatta60

atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata120

acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat180

aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga240

ctatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc300

ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt360

atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat420

gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag480

tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc540

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ggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcga660

aattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggt720

accatggggcagcaggaaagcactcttgggggtgcggccggggagcctcgctcgcgcggt780

catgcggcggggaccagcggtggaccaggagaccatctccacgcgacgcccgggatgttc840

gttcagcattcgactgcgatcttctccgaccggtacaagggacagcgggtgttggggaag900

gggtcttttggtgaggtgattctgtgcaaagacaagatcaccggtcaggagtgtgcggtg960

aaggtcattagcaagcgccaagtgaagcagaagacggacaaggagtctctgcttcgcgag1020

gtgcagttgctgaagcagctggaccaccccaacatcatgaagctgtatgaattcttcgag1080

gacaaaggctacttctacctcgtcggcgaagtgtacacgggaggcgagttgttcgacgag1140

atcatttcccgcaagcgcttcagcgaagtcgatgcggcgcggatcatccgccaagtcctc1200

agcggcatcacgtacatgcacaaaaataaaatcgtacatcgggacctcaaaccggaaaac1260

ctgctcctggaaagcaaaagcaaggacgcgaacatccgcatcatcgactttggcctcagc1320

actcacttcgaagcgagcaagaagatgaaggacaaaatcggaactgcatactacatcgca1380

cccgaggtcctccacggcacttacgacgagaaatgcgacgtatggtcgaccggtgttatt1440

ctctacatccttctttccggtgagtctgtaccgcgcagtgctttcccggtctctcctcgc1500

tcttcaagttctttttgctcttcaagttcgttttgctctccaggtctcccggtgtacctg1560

cagaaaagagagataaaatcttgtgttgctttctatgtggggatgcagagggatgcatgt1620

gcactcatatatctgggaacgcaggatgccagagcaggcgcatttttccccgacgagaag1680

ccaagatgcccacccttcaatggagcaaacgagtacgacatcctgaagaaggttgagaaa1740

ggcaagtacacctttgaactgcctcagtggaagaaagtgtcagagagcgcaaaagatttg1800

attcgcaaaatgctgacctacgtccccagcatgagaatcagcgcgcgagatgctctggac1860

cacgagtggatccagacctacacgaaggagcagatcagcgtggacgttccgtctctggac1920

aacgccattctcaacatccgacagttccaaggcactcagaagctcgcgcaagctgcgctg1980

ctctacatgggctcgaaactgacaagccaagacgaaacgaaggaactgacggccatcttc2040

cataagatggacaagaatggagacgggcaactggaccgtgcagagctcatcgaagggtac2100

aaggagttgatgcggatgaagggccaagatgcgagcatgctcgacgcgagcgctgttgaa2160

cacgaagttgaccaggtcttggacgcagtcgacttcgacaaaaacggctacatcgagtac2220

tctgagttcgtcaccgtggcgatggacagaaagacgctgctttcgcgagaacgcctggag2280

cgcgccttccggatgtttgactccgacaactcaggaaagatttcttccactgagctggcc2340

accatctttggcgtctccgacgtggacagcgaaacatggaagagcgtgctgtctgaggtc2400

gacaagaataacgacggcgaagtcgactttgacgagtttcaacagatgctcttgaagctc2460

tgcggaaactaactagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttcta2520

gttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgcca2580

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attctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaata2700

gcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactgggcggttttatggacagc2760

aagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagt2820

aaactggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatca2880

agagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctcc2940

ggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctc3000

tgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccga3060

cctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccac3120

gacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggct3180

gctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaa3240

agtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgccc3300

attcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtct3360

tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgc3420

caggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctg3480

cttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggct3540

gggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagct3600

tggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgca3660

gcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaattt3720

cctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacaggtggc3780

acttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaat3840

atgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacgtgctaaaa3900

cttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaa3960

atcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaagga4020

tcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccg4080

ctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaact4140

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cacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtg4260

gctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccg4320

gataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcga4380

acgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc4440

gaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacg4500

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tgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgcc4620

agcaacgcggcctttttacggttcctgggcttttgctggccttttgctcacatgttctt4679

<210>2

<211>582

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

MetGlyGlnGlnGluSerThrLeuGlyGlyAlaAlaGlyGluProArg

151015

SerArgGlyHisAlaAlaGlyThrSerGlyGlyProGlyAspHisLeu

202530

HisAlaThrProGlyMetPheValGlnHisSerThrAlaIlePheSer

354045

AspArgTyrLysGlyGlnArgValLeuGlyLysGlySerPheGlyGlu

505560

ValIleLeuCysLysAspLysIleThrGlyGlnGluCysAlaValLys

65707580

ValIleSerLysArgGlnValLysGlnLysThrAspLysGluSerLeu

859095

LeuArgGluValGlnLeuLeuLysGlnLeuAspHisProAsnIleMet

100105110

LysLeuTyrGluPhePheGluAspLysGlyTyrPheTyrLeuValGly

115120125

GluValTyrThrGlyGlyGluLeuPheAspGluIleIleSerArgLys

130135140

ArgPheSerGluValAspAlaAlaArgIleIleArgGlnValLeuSer

145150155160

GlyIleThrTyrMetHisLysAsnLysIleValHisArgAspLeuLys

165170175

ProGluAsnLeuLeuLeuGluSerLysSerLysAspAlaAsnIleArg

180185190

IleIleAspPheGlyLeuSerThrHisPheGluAlaSerLysLysMet

195200205

LysAspLysIleGlyThrAlaTyrTyrIleAlaProGluValLeuHis

210215220

GlyThrTyrAspGluLysCysAspValTrpSerThrGlyValIleLeu

225230235240

TyrIleLeuLeuSerGlyGluSerValProArgSerAlaPheProVal

245250255

SerProArgSerSerSerSerPheCysSerSerSerSerPheCysSer

260265270

ProGlyLeuProValTyrLeuGlnLysArgGluIleLysSerCysVal

275280285

AlaPheTyrValGlyMetGlnArgAspAlaCysAlaLeuIleTyrLeu

290295300

GlyThrGlnAspAlaArgAlaGlyAlaPhePheProAspGluLysPro

305310315320

ArgCysProProPheAsnGlyAlaAsnGluTyrAspIleLeuLysLys

325330335

ValGluLysGlyLysTyrThrPheGluLeuProGlnTrpLysLysVal

340345350

SerGluSerAlaLysAspLeuIleArgLysMetLeuThrTyrValPro

355360365

SerMetArgIleSerAlaArgAspAlaLeuAspHisGluTrpIleGln

370375380

ThrTyrThrLysGluGlnIleSerValAspValProSerLeuAspAsn

385390395400

AlaIleLeuAsnIleArgGlnPheGlnGlyThrGlnLysLeuAlaGln

405410415

AlaAlaLeuLeuTyrMetGlySerLysLeuThrSerGlnAspGluThr

420425430

LysGluLeuThrAlaIlePheHisLysMetAspLysAsnGlyAspGly

435440445

GlnLeuAspArgAlaGluLeuIleGluGlyTyrLysGluLeuMetArg

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MetLysGlyGlnAspAlaSerMetLeuAspAlaSerAlaValGluHis

465470475480

GluValAspGlnValLeuAspAlaValAspPheAspLysAsnGlyTyr

485490495

IleGluTyrSerGluPheValThrValAlaMetAspArgLysThrLeu

500505510

LeuSerArgGluArgLeuGluArgAlaPheArgMetPheAspSerAsp

515520525

AsnSerGlyLysIleSerSerThrGluLeuAlaThrIlePheGlyVal

530535540

SerAspValAspSerGluThrTrpLysSerValLeuSerGluValAsp

545550555560

LysAsnAsnAspGlyGluValAspPheAspGluPheGlnGlnMetLeu

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LeuLysLeuCysGlyAsn

580

<210>3

<211>3678

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata120

acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat180

aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga240

ctatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc300

ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt360

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gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag480

tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc540

aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga600

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aattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggt720

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ttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgta2340

ctcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcg2400

cgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcg2460

tgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggat2520

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gtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggta2640

tcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaa2700

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ataatagcacgtgctaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttt2940

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gcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaac3120

tctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagt3180

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gctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttgga3300

ctcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcac3360

acagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatg3420

agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggt3480

cggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcc3540

tgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcg3600

gagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctgggcttttgctggcc3660

ttttgctcacatgttctt3678

<210>4

<211>130

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

MetHisLysSerSerProGlnGlyProAspArgLeuLeuIleArgLeu

151015

ArgHisLeuIleAspIleValGluGlnLeuLysIleTyrGluAsnAsp

202530

LeuAspProGluLeuLeuSerAlaProGlnAspValLysGlyHisCys

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LeuSer

130

<210>5

<211>115

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

MetAsnTrpIleAspValArgTyrAspLeuGluLysIleGluSerLeu

151015

IleGlnSerIleHisIleAspThrThrLeuTyrThrAspSerAspPhe

202530

HisProSerCysLysValThrAlaMetAsnCysPheLeuLeuGluLeu

354045

GlnValIleLeuHisGluTyrSerAsnMetThrLeuAsnGluThrVal

505560

ArgAsnValLeuTyrLeuAlaAspSerThrLeuSerSerAsnLysAsn

65707580

ValAlaGluSerGlyCysLysGluCysGluGluLeuGluGluLysThr

859095

PheThrGluPheLeuGlnSerPheIleArgIleValGlnMetPheIle

100105110

AsnThrSer

115

Claims (4)

1.重组质粒组，其特征在于：所述重组质粒组由SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列和SEQIDNo.3中所示的核苷酸序列组成。

2.蛋白组，其氨基酸序列由权利要求1所述的重组质粒组编码。

3.一种疫苗，其包括权利要求1所述的重组质粒组，以及医学上可接受的载体。

4.权利要求1所述的重组质粒组或权利要求2所述的蛋白组在制备弓形虫感染预防的疫苗中的应用。