CN104830850A - 用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下任一组核苷酸序列：1）profilin的核苷酸序列；2）profilin、rop16、rop18、MIC6和CDPK3的核苷酸序列；3）profilin和IL15的核苷酸序列；4）rop16、rop18、MIC6和CDPK3的核苷酸序列；5）上述序列的互补序列；6）上述核苷酸序列取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。本发明的pVAX-profilin疫苗以及联合疫苗均能有效抑制弓形虫脑包囊的产生，取得了较好的免疫效果。

Description

用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用

技术领域

本发明涉及用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全球分布的顶复门原虫(Apicomplexa)，能够入侵包括人类在内的几乎所有的有核温血动物。据报道，世界上有三分之一的人群感染弓形虫，大多数人呈隐形感染，但免疫力低下或免疫缺陷(HIV携带者，器官移植者等)病人感染弓形虫却可引起严重的后果。弓形虫急性暴发流行时还可给畜牧业造成严重的经济损失。目前仍未有治疗弓形虫病的理想药物，因此研制安全有效的抗弓形虫疫苗在弓形虫病的防治中显得尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用，该核苷酸序列能够用于制备弓形虫感染预防的疫苗。

本发明提供用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下1)-6)之一的核苷酸序列：

1)序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列和IL15的核苷酸序列；

3)序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.2中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.4中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.5中所示的核苷酸序列；

4)序列表中SEQ ID No.2中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.4中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.5中所示的核苷酸序列；

5)与1)-4)任一所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

6)对上述1)-4)任一所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供重组载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。

优选地，所述载体为PVAX1载体。

本发明的第三个目的是提供重组质粒，其包括权利要求1所述核苷酸序列。

本发明的第四个目的是提供重组蛋白，其氨基酸序列由权利要求4所述的重组质粒编码。

本发明的第五个目的是提供一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。

优选地，所述疫苗还包括医学上可接受的载体。

本发明的第六个目的是提供上述核苷酸序列、重组载体、重组质粒、重组蛋白、疫苗在制备用于弓形虫感染预防的药物中的应用。

本申请人研究发现：弓形虫Profilin蛋白是弓形虫入侵宿主细胞过程中的关键蛋白之一，Profilin蛋白是肌动蛋白动力的调制器，能促进肌动蛋白的聚集，影响弓形虫的滑行运动，是调节弓形虫动力的关键蛋白。此外它还能被Toll样受体11(TLR11)识别，是TLR11的强效激动剂，而TLR11在白介素12(IL-12)的分泌过程中起着重要作用。本发明中将弓形虫Profilin基因制备成弓形虫核酸疫苗pVAX-profilin，并与弓形虫疫苗pVAX-rop16、pVAX-rop18、pVAX-MIC6、pVAX-CDPK3及pVAX-IL15联合应用进行抗弓形虫感染免疫效果评估。结果显示该疫苗以及联合疫苗均能有效抑制弓形虫脑包囊的产生，取得了较好的免疫效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

(一)弓形虫RH株pVAX-profilin的制备

1.从液氮中取出弓形虫RH虫株，37℃水浴解冻，腹腔注射昆明小鼠，连续3次传代后，分别收集感染RH虫株小鼠的腹水于1.5mL灭菌离心管中，室温6000rpm离心10min，弃去上清液，置于-80℃冰箱保存沉淀用于提取RNA。按照Total RNA Kit I(购自Omega公司)的操作说明提取重组总RNA。

2.Profilin基因的扩增：

2.1引物设计

参照弓形虫profilin基因序列，设计了扩增弓形虫profilin基因的引物序列，包括：

上游：5'-CGGGGTACCATGTCCGACTGGGACCCTGTTGTCAAGG-3'，

下游：5'-CCGGAATTCTTAGTACCCAGACTGGTGAAGATACTCG-3'，

其中划线部分分别为Kpn I和EcoR I酶切位点。

2.2PCR扩增

以弓形虫基因组RNA为模板，按照One Step RT-PCR试剂盒(购自大连宝生物公司)操作说明进行RT-PCR，反应体系为：RNA模板1μL，Prime Script 1StepEnzyme Mix 1μL，2×one Step Buffer 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，RNase free ddH₂O9.5μL。RT-PCR反应条件：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性1min，65.5℃退火45s，72℃延伸50s，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。

3.纯化产物的连接及序列测定：将回收纯化后的profilin产物与pMD18按照18-T Vector简易操作步骤说明进行连接，4℃连接过夜或16℃连接8h，连接产物命名为PMD-profilin。阳性菌株送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果显示，扩增的profilin的核苷酸序列参见序列表SEQ ID No.1。

4.质粒小量提取：按天根生化科技(北京)有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit的使用说明书进行提取。

5.目的片段回收及载体连接：将pVAXI质粒及PMD-profilin重组质粒用Kpn I和EcoR I分别进行双酶切，并进行切胶回收纯化，将profilin基因片段定向亚克隆到pVAX载体中，4℃连接过夜。连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，将鉴定为阳性的菌株命名为pVAX-profilin。

(二)pVAX-rop16、pVAX-rop18、pVAX-MIC6、pVAX-CDPK3及pVAX-IL15重组质粒的构建

1、pVAX-IL15重组质粒为本实验室保存，取出备用，该重组质粒是参照中国专利CN103083660 A中的方法制备得到的。

2、pVAX-rop16重组质粒的构建：取出复苏的虫体，按照DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)的操作说明提取虫体总DNA备用。参照弓形虫ROP16基因序列，设计扩增弓形虫ROP16基因的引物序列，包括：

上游：5’-GAATTCATGAAAGTGACCACGAAAGGGC-3’，

下游：5’-TCTAGACTACATCCGATGTGAAGAAAGTTCG-3’,

其中划线部分分别为EcoR I和Xba I酶切位点。

PCR反应体系为：DNA1μL，Premix exTaq 12.5μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O10.5μL。反应条件为94℃预变性2min，再94℃变性35s、46.1℃退火30s、72℃延伸5min反应35个循环。

PCR扩增后进行纯化，测序，双酶切，并连接于pVAXI中，具体方法与pVAX-profilin的制备相同。ROP16的核苷酸序列参见序列表SEQ ID No.2。

3、pVAX-rop18重组质粒的构建：取出复苏的虫体，按照DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)的操作说明提取虫体总DNA备用。参照弓形虫ROP18基因序列，设计扩增弓形虫ROP18基因的引物序列，包括：

上游：5’-GGATCCATGTTTTCGGTACAGCGGCCA-3’，

下游：5’-TCTAGATTATTCTGTGTGGAGATGTTCCTG-3’，

其中划线部分分别为BamH I和Xba I酶切位点。

PCR反应体系为：DNA1μL，Premix exTaq 12.5μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O10.5μL。反应条件为94℃预变性2min，再94℃变性35s、46.8℃退火30s、72℃延伸5min反应35个循环。

PCR扩增后进行纯化，测序，双酶切，并连接于pVAXI中，具体方法与pVAX-profilin的制备相同。ROP18的核苷酸序列参见序列表SEQ ID No.3。

4、pVAX-MIC6重组质粒的构建：取出复苏的虫体，按照DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)的操作说明提取虫体总DNA备用。参照弓形虫MIC6基因序列，设计扩增弓形虫MIC6基因的引物序列，包括：

上游：5’-GGATCCATGAGGCTCTTCCGGTGCT-3’，

下游：5’-CTCGAGTTAATCCCATGTTTTGCTATCC-3’，

其中划线部分分别是BamH I和Xba I酶切位点。

PCR反应体系为：DNA1μL，Premix exTaq 12.5μL，上下游引物各0.5μL，ddH₂O10.5μL。反应条件为94℃预变性2min，再94℃变性35s、39.3℃退火30s、72℃延伸5min反应35个循环。

PCR扩增后进行纯化，测序，双酶切，并连接于pVAXI中，具体方法与pVAX-profilin的制备相同。MIC6的核苷酸序列参见序列表SEQ ID No.4。

5、pVAX-CDPK3重组质粒的构建：取出复苏的虫体，按照Total RNA Kit I(购自Omega公司)的操作说明提取虫体总RNA备用。参照弓形虫CDPK3基因序列，设计扩增弓形虫CDPK3基因的引物序列，包括：

上游：5’-GCGGGTACCATGGCGGATCCGCTCTCGTTCTTCAAC-3’，

下游：5’-GGGCGGCCGCTCACTCATGTTGCGACTCAC-3’，

其中划线部分分别是Kpn I和NotI酶切位点。

RT-PCR的反应体系同实例1，反应条件为50℃反转录30min，然后94℃预变性2min，再94℃变性35s、56℃退火35s、72℃延伸1min 50s反应35个循环。

RT-PCR扩增后进行纯化，测序，双酶切，并连接于pVAXI中，各步骤制备条件与实施例1pVAX-profilin的制备条件相同。CDPK3的核苷酸序列参见序列表SEQ ID No.5。

(三)大量质粒的制备及检测

将pVAX-profilin、pVAX-rop16、pVAX-rop18、pVAX-MIC6、pVAX-CDPK3及pVAX-IL15菌液用LB液体培养基大量振荡过夜培养，用于大量提取质粒。具体实验方法和操作步骤按照天根生化科技北京有限公司高纯质粒大提试剂盒的使用说明书进行。以ddH₂O为空白对照。

(四)免疫效果的评估

1.昆明鼠免疫与分组：昆明鼠购自兰州生物制品研究所。将昆明鼠随机分为8个组，每组35只，分别进行腿部肌肉注射，具体分组见表1。

表1免疫实验分组情况

说明：Ⅰ-Ⅳ为对照组；Ⅴ-Ⅷ为实验组。第Ⅰ组为空白对照组；第Ⅱ组每只小鼠每次免疫注射100μl的PBS；第Ⅲ组注射含有100μg/100μL的pVAXI稀释液100μL；第Ⅳ组注射含有100μg/100μL的pVAX-IL15稀释液100μL；第Ⅴ组注射含有100μg/100μL的pVAX-profilin稀释液100μL；第Ⅵ组注射分别含有100μg/100μL的pVAX-profilin和pVAX-IL15稀释液100μL；第Ⅶ组注射分别含有100μg/100μL的pVAX-rop16、pVAX-rop18、pVAX-MIC6、pVAX-CDPK3的混合液100μL；第Ⅷ组每只小鼠分别注射含有100μg/100μL的pVAX-profilin稀释液100μL和含有100μg/100μL的pVAX-rop16、pVAX-rop18、pVAX-MIC6、pVAX-CDPK3的混合液100μL，每间隔14天后加强免疫一次，共免疫3次，均为腿部肌肉注射。

2.免疫之后利用弓形虫RH株和PRU株分别进行攻毒检测：

2.1腹腔注射感染弓形虫RH株：弓形虫RH株速殖子按200μl/10³个每只小鼠剂量，腹腔接种第三次免疫之后的小鼠，每组10只，观察并记录存活时间。

2.2灌胃感染弓形虫PRU株：按照10个包囊/只的剂量，以灌胃的方式感染小鼠，每组10只，攻虫后30天进行脑包囊计数。

本发明的有益效果通过以下数据说明：

表2感染弓形虫RH株后小鼠存活情况

组别	存活天数(mean±S.D.)
		第I组	6.3±1.45
第II组	6.2±1.26
		第III组	6.1±0.91
第IV组	7±0.22
		第V组	13.4±9.14
第VI组	8.4±1.66
		第VII组	8.4±0.516
第VIII组	8.5±0.707

表3.PRU脑包囊计数和减少数

由表2和表3可知：与对照组(Ⅰ-Ⅳ)相比，实验组(Ⅴ-Ⅷ)，在RH株攻虫实验中小鼠存活时间均有所增加，最好情况下增加了112.60％(第Ⅴ组)。PRU攻虫实验中上述佐剂可保护小鼠至脑包囊数显著减少，减少率高达41.54％、42.06％、61.05％和80.22％。因此，弓形虫profilin基因可作为制备抗弓形虫核酸疫苗的新基因，特别是与pVAX-rop16、pVAX-rop18、pVAX-MIC6、pVAX-CDPK3或pVAX-IL15等联合应用可以取得良好的免疫效果。pVAX-rop16、pVAX-rop18、pVAX-MIC6、pVAX-CDPK3四种联合应用也可以取得良好的免疫效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

      序列表

 

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  498

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgtccgact gggaccctgt tgtcaaggag tggcttgttg acacaggcta ctgctgcgca       60

 

ggcggcatcg ccaacgtaag cgcggaggac ggtgttgtgt tcgccgcggc ggctgatgat      120

 

gatgacggat ggtccaagct gtacaaggat gatcatgagg aggacactat cggagaggat      180

 

ggcaacgcgt gcggcaaggt gtcgatcaac gaggcctcca cgatcaaagc tgcagttgac      240

 

gatggcagtg cccctaacgg tgtttggatt ggcggccaga agtacaaggt tgtccgacct      300

 

gagaaaggat tcgagtacaa cgactgcacc ttcgacatca ccatgtgtgc acggtccaag      360

 

ggtggcgcgc acttgatcaa gaccccgaat ggctctatcg tcattgccct ttacgatgag      420

 

gagaaggaac aggacaaggg aaacagcagg acttcggcat tggcctttgc cgagtatctt      480

 

caccagtctg ggtactaa                                                    498

 

 

<210>  2

<211>  2124

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

atgaaagtga ccacgaaagg gcttgctttc gctcttgcac tgttgttttg tacacgctgc       60

 

gcaactgcac gatacatgtc gtttgaggaa gcgcaaaaag caagtgaagc agcgaagcgc      120

 

cagattgcga cactcccctc tccagattct cctctttcga atccaggtag caggcataga      180

 

aaccggggag ggtctcctac ggcagggcaa ccttctcaat ccacactaca acctgaacaa      240

 

gcggcggctg aagtaggtct cggtgctggt ggctcgactc aggggcaggg acgcaccggt      300

 

ggcagcgcgg gtgctagaga ggagcggagg agtccttccc ccgaatctgc ttatccggcg      360

 

actagctcag cctcgctaag gggctaccaa acccagcttt caccctcgca tcttccacca      420

 

cacagtagcg gaccgggagg atggtttcca acagagtcaa tatatacgct atggagttct      480

 

ccgccgcaac gattgacaca tcgaaagcca tctctatctg gggtggtcgt taccgaattt      540

 

caagagccac aagaacagta tggcgcagcg agcagtcttg cgtcctcgcc aaagggatac      600

 

gtcggtggcg caagctctag tgcattgtca ggaaaggcgg tgccgacgcc tgcgtcgctt      660

 

ggtcaagaaa atcctctttt tcctggtcag agcgctacat tggattcagg aatacagtct      720

 

ccggcacaaa agcgtcgggg atcccctcaa agacagagtg cgatgccgac cggaaatcca      780

 

gcagatagcg gcgcctcgca gcttgccttc agtcattcta gttatgtatc agtacaagct      840

 

tctcttgcga aacgttcaga acgcatccgg cgcgttcgac tttcagaaga gggtctggaa      900

 

gaagttcagc agctgaaagc agctgccgca cagcttctcg tagcggttcc ggactatgag      960

 

gcaatgcggg ctgttctgca agaggcggtc ctctcagaac agagggttgc tgcccgtaag     1020

 

cggaagagaa agcaacctcc aggagcggtg gagtcagctg ttgacgaagt gtttcctcca     1080

 

aatgagcgtg tcatgatgat aaatgccaac ggagtgccga tcgctctata caatcgtggg     1140

 

cacctcggca gtggacattt cggggctgtc atcaaggcca gcttagacga tgggacgctg     1200

 

tatgcagcga aggtgccgta cagccagatc gtcccgaatg ctgatgccac gtcagcagaa     1260

 

ctggaggcgg gaatttcctc agctagggcg gagttggtaa agacaattcg acaggagttg     1320

 

gatgttcggg ataagcttgt ggctaaaggg ctcacactta cagagactgt gagccaatac     1380

 

ggtctgccat tgtgccaaat gactttaacg cttcctgaga acaaagcaac cgtggtacgt     1440

 

cgaggttctc gactctttgt cgtgtccaaa gaagtcatgc tgctgccatt aattgatggc     1500

 

tccgcattga acagtctagt ccagtcgcaa ccaccatttc tcttccagcg agctgtggca     1560

 

agggaagcaa ttcttgcatt ggccaagctt cacgaacttg gattcgcgca tggagatgtt     1620

 

aaattgaaca acatgatgat cgatgtccac ggctttgggc atatgcttga catgggcagt     1680

 

gtgcggcctg ttgacagctg tgtaagcgag gaagataaat attacctgcg tttgtgggct     1740

 

cctgaacttg cgaaatcaca gcacacgtcg caaaagacat gtctgaagcg tggcgccctc     1800

 

gatgtgtggg ccttagggtt ggcaatcttc gagttcgtct gcttcaaccg acttccttac     1860

 

agcctttcga atctgccgag ttcattctgg tcgagagttg aacacctttc gcgccttcgc     1920

 

ctctcagatt tctctgtcaa ggattgtaac gaatctgatc cagcagtgat gggaattgtt     1980

 

gttcaatttc taaatccaga ccctcaagag cgccctgaac tcccgaaatt cgtcaacagt     2040

 

tacaccttct ttcagcaagc ccctggagtt acttctcatc tcactaggat tccaactacc     2100

 

gaactttctt cacatcggat gtag                                            2124

 

 

<210>  3

<211>  1665

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atgttttcgg tacagcggcc acctcttacg cgtaccgtcg tccgaatggg tttagcgact       60

 

cttctcccga agacagcctg tcttgcggtg ttaaatgtag cgcttgtctt cctgctcttc      120

 

caagtccagg atgggaccgg aatcacactt gatccttcaa aactcgactc caaaccgaca      180

 

agtttggatt cgcaacagca cgttgctgac aagcggtggc ctgctacagt tggccactac      240

 

aaatatttag caggagcgac agaaagcact cgagacgttt cattgctgga ggaaagggct      300

 

caacaccggg taaatgcgca agaaacaaac caacggcgca cgatttttca gaggcttctg      360

 

aatctcttga gacggagaga aagagatggt gaagtctcgg gttccgcagc tgatagctcc      420

 

tcgagacccc gtctgtccgt acgacagagg cttgctcaac tttggcgtaa agcgaaatcg      480

 

ttcttcacac gcggaatccc gaggtacttt tctcaagggc gtaaccgact gcgaagtttg      540

 

cgggcacaaa gacggcgatc tgaattgttt tttgagaagg cggattctgg atgcgtcatc      600

 

ggcaaacgca tcctggcgca catgcaagaa caaatcgggc agcctcaagc gctaggaaat      660

 

agtgaacgac tggatagaat tctgactgtc gctgcctggc ctccggacgt tccagaaaga      720

 

tttgtttctg tgactaccgg tgaaacccgg acgctggtga gaggtgcacc ccttggctct      780

 

ggtggattcg ccactgtata tgaggctaca gacgtggaga cgaatgaaga gttggctgtt      840

 

aaggttttca tgtcagaaaa ggagcccacc gatgagacta tgcgtgactt gcagagggag      900

 

tcgttctgct acaggaactt tagtctagcc aagacggcga aggatgccca ggaacgctgt      960

 

agattcatgg ttcctagtga tgttgtgatg ttagagggac agccagcatc cacagaggtc     1020

 

gtgattggtt tgacgactcg gtgggtacca aactattttc ttctcatgat gcgggcagaa     1080

 

acggacatga gcaaagtcat ttcatgggta tttggagatg cgtctgtcaa taacagtgaa     1140

 

ttaggcctgg tcgttcgaat gtacctatcc agtcaggcaa tcagactagt ggccaatgtt     1200

 

caagctcagg gaattgtgca tacggatatc aaaccggcga atttcctcct cttgaaagac     1260

 

ggtcgcctgt ttctcggcga cttcggaacg tatagaatca ataattcggt tggacccgcg     1320

 

ataggtactc ccggttacga gcctccggag cgaccgtttc agactacaga catcacctat     1380

 

acattcacca ctgacgcgtg gcaactcggt ataactttgt actgcatctg gtgcaaggaa     1440

 

cgtccaactc cggccgacgg catctgggac tacttacact tcgcagattg tccttccacg     1500

 

cctgagctgg ttcaagacct catccgaaac ctcttgaatc gagagcctca gaaacggatg     1560

 

ctcccgctac aagccttgga gaccgcagcg tttaacgaga tggattcagt agtaaaacgc     1620

 

gccgcgcaaa acttcgaaca gcaggaacat ctccacacag aataa                     1665

 

 

<210>  4

<211>  1050

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

atgaggctct tccggtgctg tgctgcggcc gttgtggcgg ccgaatcgtt actgtggctg       60

 

aagaacggct ccccgttttt tgcctttctt cctgggaatg gagagattgc agacaactgc      120

 

tctgggaatc catgcggtgg caccgcagct ggtacgtgca taaacacacc atctggatat      180

 

gattgcaggt gcgaaccagg ctacgttctg ggcgttgaaa atgaccaggt cacgtgcatg      240

 

atgccctcag gtgtacccat ggctaatttt gtacagctgt cggaaaagcc tgcagcttgc      300

 

agctcaaacc cttgtggacc tgaggcagcc ggcacctgca acgagacaaa cagtggttac      360

 

atttgccgct gtaatcaagg ctacagaata tctctcgacg ggacaggaaa cgtgacatgt      420

 

attgtaagac aggaaagcgg ctgtgaggaa aacgggtgtg ggccgccaga tgcagtacag      480

 

agttgccgcc gactaacagg gacggcaggt cgactatgtg tatgcaagga aaactttata      540

 

gcgacaatcg acgccagtgc ccatatcacc tgcaagcgtg tgcctcccca ttataggaag      600

 

cctcccttcg aatttggcaa gggaggtcat cctgtggact cagaaccatc gaaacgccag      660

 

agggaagatg aaggtgaaag tcgtgagcct gaaagcgact caacagaacc ggggagagat      720

 

caggaaagaa gaacaccact tgaggaaagc caggaaccgg aaggaagcac cccggacagt      780

 

cagcagagcc gaggtggttc tggtagcgac agtaccgaga gcgaggaaca aggaaaggag      840

 

agagaggaag gaagtggaca tgctggtgcg atcgctgggg gagttattgg aggcctgtta      900

 

cttctgagcg ctgccggagc gggtgttgca tacatgagaa agagtgggag cggtggaggg      960

 

gaggagatag aatacgagag gggtatcgag gctgcagagg ccagtgaagt cgaagtcctc     1020

 

gttgatttgg atagcaaaac atgggattaa                                      1050

 

 

<210>  5

<211>  1614

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

atggggtgcg tccactccaa gaatccccac tccaagcatg caggcgcagc tggagaaaaa       60

 

cccgacgcca gcctcgaaaa ggggggccag agcaagggga gcgcgccgtc gtcggggacc      120

 

ggcgacagcg gaaaaggaac tgggtctccc gacaccaaga gagactccat gcccatgact      180

 

ccaggcatgt acatcacgca gcagaaggcc catttgtctg accgctacca gcgcgtgaag      240

 

aagctcggaa gcggtgctta cggcgaggtg ctgctgtgca aggacaaact gacaggcgca      300

 

gagcgagcaa tcaaaatcat caaaaagtct tctgtcacga ccacgagcaa cagcggggct      360

 

ctcctcgacg aagtcgccgt gctgaaacag ctcgaccacc cgaacatcat gaagctctac      420

 

gagttcttcg aggacaagcg caactactac cttgtcatgg aggtgtaccg aggaggcgag      480

 

ttgtttgacg aaatcattct tcgtcagaag ttcagcgaag tggacgccgc tgtcatcatg      540

 

aaacaggtgc tctctggcac cacttacctg cacaaacaca acattgtgca tcgcgacctg      600

 

aagcccgaaa accttcttct cgagtcgaag agccgggacg ctcttatcaa gatcgtcgac      660

 

tttggtctct ctgcgcactt tgaagtcggc ggaaagatga aggagcgcct tggcacagcc      720

 

tactacattg ccccagaagt tctgagaaag aagtacgacg aaaaatgcga tgtctggtct      780

 

tgcggcgtta tcctctacat tctcctttgc ggctacccgc ccttcggagg tcaaaccgac      840

 

caggagatcc tcaagagggt cgagaaagga aagttttcct tcgacccgcc tgactggact      900

 

caagtgtcgg acgaggcgaa gcagctggtc aagctgatgc tgacctacga gccttcgaag      960

 

agaatttctg ctgaggaggc gctgaatcat ccgtggatcg tcaagttctg ctcccagaaa     1020

 

cacaccgacg tcggcaaaca cgctctcacg ggcgccctgg gcaacatgaa gaaattccag     1080

 

tcctcacaga agctggcgca agcggccatg ctgtttatgg ggagcaagct gacgactctg     1140

 

gaggagacga aggagctgac tcagatcttt cgtcaacttg acaacaacgg ggacggccaa     1200

 

ctggatcgca aggaactaat tgaaggttac agaaagctca tgcagtggaa gggcgacacc     1260

 

gtatctgact tggacagcag ccagatagag gcagaggtgg atcacattct ccaatctgtc     1320

 

gactttgaca gaaatggata cattgagtac tctgaatttg tgactgtgtg catggacaag     1380

 

cagcttctgc tgtcgcgcga gcgacttctt gctgccttcc aacagttcga cagcgacggc     1440

 

tcaggaaaaa tcacgaatga ggaactcggc agactctttg gtgtgacgga agtcgacgac     1500

 

gaaacgtggc accaggttct gcaagagtgc gacaagaaca acgatggaga ggtcgacttt     1560

 

gaggagtttg tggaaatgat gcagaagatc tgcgacgtca aagtgaagca ctga           1614

 

 

Claims (8)

1.用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其特征在于：其含有选自以下1）-6）之一的核苷酸序列：

1）序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；

2）序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列和IL15的核苷酸序列；

3）序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.2中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.4中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.5中所示的核苷酸序列；

4）序列表中SEQ ID No.2中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.4中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQ ID No.5中所示的核苷酸序列；

5）与1）-4）任一所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

6）对上述1）-4）任一所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

2.重组载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体为PVAX1载体。

4.重组质粒，其包括权利要求1所述核苷酸序列。

5.重组蛋白，其氨基酸序列由权利要求4所述的重组质粒编码。

6.一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括医学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2或3所述的重组载体、权利要求4所述的重组质粒、权利要求5所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的疫苗在制备用于弓形虫感染预防的药物中的应用。