CN104800843B - 一种用于弓形虫感染预防的药剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于弓形虫感染预防的药剂，所述药剂是用氢氧化铝佐剂吸附TLR7/8激动剂CL097制备而成的。本发明的药剂作为免疫佐剂能够增强弓形虫疫苗的免疫效果，并能够单独作为弓形虫疫苗使用。
Description
技术领域
本发明属于免疫疫苗技术领域，具体涉及一种用于弓形虫感染预防的药剂。
背景技术
弓形虫病(toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)感染引起的一种普遍存在的人兽共患胞内寄生虫病，可导致孕畜流产死胎、生产力低下，给畜牧业造成巨大的经济损失。人类如果误食未煮熟的食物或接触环境中的卵囊可导致感染。目前全世界约有1/3的人患有弓形虫病，免疫正常的成年人多不出现明显症状，但免疫功能低下或受损者(如孕妇，器官移植者，HIV病人等)常常导致严重甚至致命的伤害。然而，由于弓形虫生活史及其感染的复杂性，目前尚未有安全有效的药物和疫苗来对抗弓形虫感染，因此研制安全有效的弓形虫疫苗在人与动物弓形虫病防控中具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种用于弓形虫感染预防的药剂。
本申请人研究发现，CL097为TLR7/8受体的一种配体，可以作为激动剂通过与相应的TLRs结合激活免疫细胞，并调节适应性免疫反应的强度，或改变反应的类型。而氢氧化铝佐剂(Imject Alum)可以通过表面电荷效应能够高效地吸附CL097，在小鼠体内可诱导出抗弓形虫免疫应答。因此，本发明中，采用Imject Alum吸附制备含有5μg CL097/100μl，制成佐剂“Imject Alum+CL097”，并选用弓形虫疫苗“PvAX-GRA16+PvAX-NF3”与“Imject Alum+CL097”联合使用进行免疫效果评估。TLR7/8蛋白结构较为保守，在人与小鼠体内均存在，能高效地诱导小鼠体内产生Th1型免疫应答。CL097作为配体能够刺激TLR7/8蛋白产生Th1型免疫反应。
本发明提供一种用于弓形虫感染预防的药剂，所述药剂是用氢氧化铝佐剂吸附TLR7/8激动剂CL097制备而成的。
优选地，每100μl药剂中所述CL097的含量大于0μg，小于等于5μg；作为优选，每100μl药剂中含3-5μg的CL097；最优选地，每100μl药剂中含5μg的CL097。
在药剂中只要含有CL097，就能够提升免疫疫苗的免疫效果，但是每100μl药剂CL097的含量需要小于等于5μg，否则作为免疫佐剂或疫苗使用后，小鼠会产生其他不良反应。每100μl药剂中含3-5μg的CL097时，作为免疫佐剂或疫苗的效果较佳，当每100μl药剂中含5μg的CL097时，作为免疫佐剂或疫苗的效果最好。
进一步地，所述药剂中还包括缓冲液，所述缓冲液为PBS，所述PBS的含量小于等于药剂总体积的60％；作为优选，所述PBS的含量为药剂总体积的40％-60％；最优选地，所述PBS的含量为药剂总体积的50％。
PBS的体积不能超过药剂总体积的60％，PBS体积含量过高时，氢氧化铝佐剂不能被吸附，短时间内会分层，导致没有效果。在药剂中也可以不加入PBS，此时药剂也具有免疫佐剂和免疫疫苗的功效，但是免疫后小鼠会有一些副作用。经试验，当PBS的含量为药剂总体积的40％-60％时，制备的药剂在具有良好免疫佐剂和免疫疫苗功效的同时，不会产生不良反应；当PBS的含量为药剂总体积的50％时，制备的药剂作为免疫佐剂和免疫疫苗的效果最佳。
进一步地，所述药剂的制备方法为：在常温下温育PBS和氢氧化铝佐剂，再加入TLR7/8激动剂CL097，冰上吸附，完成免疫佐剂的制备。
本发明还提供上述药剂的制备方法，是在常温下温育PBS和氢氧化铝混合液，再加入TLR7/8激动剂CL097，冰上吸附后完成免疫佐剂的制备。
作为优选，每100μl药剂中所述CL097的含量大于0μg，小于等于5μg；作为优选，每100μl药剂中含3-5μg的CL097；最优选地，每100μl药剂中含5μg的CL097。
进一步地，所述PBS的含量小于等于药剂总体积的60％；作为优选，所述PBS的含量为药剂总体积的40％-60％；最优选地，所述PBS的含量为药剂总体积的50％。
更进一步地，是在常温下将pH7.4的PBS与50体积氢氧化铝温育30min，再加入10体积CL097置于冰上吸附30min，完成免疫佐剂的制备。
本发明的第三个目的是提供上述药剂在制备增强弓形虫疫苗免疫效果的免疫佐剂中的应用。
优选地，所述弓形虫疫苗为GRA16和NF3的联合疫苗。
本发明的第四个目的是提供上述药剂在制备增强弓形虫免疫预防的疫苗中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种联合疫苗，由GRA16、NF3和本发明的药剂组成。
本发明的药剂作为免疫佐剂能够增强弓形虫疫苗的免疫效果，并能够单独作为弓形虫疫苗使用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为弓形虫RH株在不同免疫情况下的存活时间折线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下40μl pH7.4的PBS与50μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为5μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例2
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下50μl pH7.4的PBS与45μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为5μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例3
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下60μl pH7.4的PBS与50μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为5μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例4
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下50μl pH7.4的PBS与40μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为5μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例5
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下60μl pH7.4的PBS与30μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为5μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例6
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下55μl pH7.4的PBS与35μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为5μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例7
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下50μl pH7.4的PBS与40μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为4μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例8
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下50μl pH7.4的PBS与40μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为3μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例9
本发明的一种用于弓形虫感染预防的药剂，它是用氢氧化铝佐剂(Imject Alum)吸附TLR7/8激动剂CL097制备得到的，其吸附步骤为：常温下50μl pH7.4的PBS与40μlImject Alum温育30min，再加入10μl含量为1μg的CL097，冰上吸附30min后，完成免疫佐剂的制备。使用时，用其注射小鼠腿部肌肉。氢氧化铝佐剂(Imject Alum)含量为40mg/ml的氢氧化铝与40mg/ml氢氧化镁。
实施例10
本发明的药剂提升免疫因子(GRA16与TgNF3)基因联合免疫效果和作为免疫疫苗增强弓形虫免疫预防的试验如下：
一、设计弓形虫GRA16基因和NF3基因引物序列
(1)参照弓形虫GRA16基因序列，设计了扩增弓形虫GRA16基因引物序列，包括：
G16F:5’-CGGGGTACCATGTATCGAAACCACTCAG-3’；
G16R:5’-CCGGAATTCTCACATCTGATCATTTTTCC-3’。
(2)参照弓形虫NF3基因序列，设计了扩增NF3基因的引物序列。包括：
N3F:5’-CGGGGTACCATGTTCTACGGTGTCGTTG-3’；
N3R:5’-CCGGAATTCTCATTTCAGCGAGCACAC-3’。
二、弓形虫RH株pVAX-GRA16重组质粒、pVAX-NF3重组质粒的制备
(1)虫体基因组DNA及RNA制备：将弓形虫RH虫株从液氮中取出，37℃水浴解冻，接种小鼠腹腔(100μl/只)连续传三代后，抽取腹水1.5ml，5000r/min离心10min，去掉上清液，沉淀用于提取DNA或RNA，采用现有技术中的通用方法提取DNA和RNA。GRA16的核苷酸序列参见序列表SEQ ID No.1，NF3的核苷酸序列参见序列表SEQ IDNo.2。
(2)GRA16基因扩增：以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应的体系为：Ex－Taq酶12.5μL，DNA模板1.5μL，G16F、G16R(50μmol/l)上下引物各0.5μL，ddH2O补足25μL。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s、57℃退火35s、72℃延伸90s，反应35个循环，最后72℃延伸10min。
(3)NF3基因的RT-PCR扩增：以弓形虫RH株的总RNA为模板，用引物NF3F/NF3R扩增TgNF3基因。一步法RT-PCR体系25μL：PrimeScript One Step Enzyme Mix 1μL，2×OneStep Buffer 12.5μL，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，RNA模板1.5μL，无RNA酶的ddH2O补至25μL。反应条件：50℃反转录30min；94℃预变性30s；94℃变性2min，68.9℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
(4)纯化产物的连接及序列测定：将胶回收纯化后的GRA16及NF3产物按照18-T Vector简易操作步骤说明进行连接，4℃连接过夜或16℃连接8h，连接产物分别命名为PMD-GRA16，PMD-NF3。阳性菌株送上海生工生物工程有限公司测序。
(5)质粒小量提取：按天根生化科技(北京)有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit的使用说明书分别提取。
(6)GRA16及NF3目的片段回收及载体连接：用Kpn I和EcoR I酶分别双酶切pVAXI质粒及PMD-GRA16、PMD-NF3重组质粒，切胶回收载体及目的片段，定向亚克隆到pVAX载体，16℃连接8h或4℃连接过夜。连接产物10μl转化到大肠杆菌JM109，阳性的菌株命名为pVAX-GRA16、pVAX-NF3。
三、弓形虫RH株pVAX-IL15重组质粒的制备
pVAX-IL15重组质粒为本实验室保存，取出备用，该重组质粒是参照中国专利CN103083660A中的方法制备得到的。
四、大量质粒的制备及检测
将pVAX-GRA16，pVAX-NF3，pVAX-IL15和pVAXI菌液用液体培养基进行大量振荡过夜培养，用于提取核酸疫苗。具体实验方法和操作步骤参见天根生化科技北京有限公司高纯质粒大提试剂盒。以ddH2O为空白对照。
五、本发明的药剂作为免疫佐剂和免疫疫苗免疫效果的评估实验
1、昆明鼠免疫与分组：昆明鼠购自兰州生物制品研究所。购买回饲养10d左右，以减少应激反应，将其随机分为8个组，每组35只，分别进行腿部肌肉注射，具体分组见表1。
表1 免疫实验分组情况
其中，Ⅰ-Ⅵ为对照组；Ⅶ和Ⅷ为实验组。第Ⅰ组为空白对照组；第Ⅱ组每只小鼠每次免疫注射100μl的PBS；第Ⅲ组每只小鼠每次免疫注射含有100μg/100μL的pVAXI质粒稀释液100μL；第Ⅳ组每只小鼠每次免疫注射含有100μg/100μL的pVAX-IL15稀释液100μL；第Ⅴ组每只小鼠每次免疫注射分别含有100μg/100μL pVAX-GRA16和pVAX-NF3的稀释液100μL；第Ⅵ组每只小鼠每次免疫注射分别含有100μg/100μL pVAX-GRA16、pVAX-NF3和pVAX-IL15的稀释液100μL；第Ⅶ组每只小鼠每次免疫左腿注射分别含有100μg/100μLpVAX-GRA16和pVAX-NF3的稀释液100μL，右腿注射100μL的本发明的免疫佐剂“CL097+Imject Alum”的混合液，第Ⅷ组每只小鼠每次免疫注射100μL的本发明的免疫疫苗“CL097+Imject Alum”的混合液；间隔14天后各加强免疫一次，共免疫3次，均为腿部肌肉注射。
2、免疫之后利用弓形虫RH株和PRU株分别进行攻毒检测
(1)腹腔注射感染弓形虫RH株：弓形虫RH株速殖子按200μl/103个每只小鼠剂量，腹腔接种第三次免疫之后的小鼠，每组10只，观察并记录存活时间，具体结果参见表2。
表2 感染弓形虫RH株后小鼠存活情况
| 组别 | 存活天数(mean±S.D.) |
| 第I组 | 6.3±1.45 |
| 第II组 | 6.2±1.26 |
| 第III组 | 6.1±0.91 |
| 第IV组 | 7±0.22 |
| 第V组 | 8.4±1.5 |
| 第VI组 | 8.7±1.16 |
| 第VII组 | 21.7±6.24 |
| 第VIII组 | 18.2±5.46 |
(2)灌胃感染弓形虫PRU株：按照10个包囊/只的剂量，以灌胃的方式感染小鼠，每组10只，攻虫后30天进行脑包囊计数，具体结果参见表3。
表3 PRU脑包囊计数和减少数
由表2和表3可知：与对照组(blank control、PBS、“pVAXI”)相比，实验疫苗组“CL097+Imject Alum”与佐剂疫苗组“PVAX-GRA16+PVAX-NF3+CL097+Imject Alum+PBS”，在RH株攻虫实验中小鼠存活时间显著增加(表2，图1)。PRU攻虫实验中上述佐剂可保护小鼠至脑包囊数明显减少，减少率高达30.41％和56.91％(表3)。因此，无论是RH株还是PRU株，本发明的药剂“CL097+Imject Alum+PBS”都能作为良好的佐剂抗弓形虫感染，可以作为抗弓形虫疫苗的佐剂使用。另外，本发明的药剂在单独使用时也具有良好的抗弓形虫感染效果，能够独立作为增强弓形虫感染的免疫疫苗使用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种用于弓形虫感染预防的药剂及应用
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1518
<212> DNA
<213> GRA16核苷酸序列
<400> 1
atgtatcgaa accactcagg gatacggctt gcctgcaggc tcttcgaagt tggagctctc 60
gttttagctt tagaaaatgt ctctggtatt caccggttcg tcgccgggat tgagtggaac 120
gaagggaaag aggattttca gtacacgacg tctccttggg tgattccacc tgacggatta 180
gtcagtcggc gacttgctga ggaacctcct agaaagcgct tgcgaaaaac aaacaaatca 240
gatcgtgact cagattctgc tcaaggttcc aggacgactt ctcctggcag tctgggcggt 300
tttggtgcaa cagttgggcg tgttgccact ccgcgaatac ggagtggtgt tgtggcgtcg 360
gaggcgatcc gaggtacaat ttggaggagg ccaggtgaag tcgaaagcac cttgaagctt 420
cgtagaacca ggcctcaata ttcacaaaca gatggagatg gcttgcaggg gaacaggctt 480
tcatcgacag gggaacgatc aggaatatcg catggggcgc agtctctggc aatgcgccca 540
aggacaatgg gacaaacaat gaaatctttg gagagctcat gggattcgga tccactcgaa 600
ggaacatcac gggattggca atatgtacca acgagtgaga cagctgcttc gcccggcctt 660
accggccttg gagggattgg tagaaagttt gcccctcttt acgtacgaga taggaaattt 720
gacttacttc aatttgtgaa tctgacgagg agcaagaaac agaaactctt aatgtcatca 780
aagagcccct cgctcagaag gctcctcatg aacgacatgg cccaggaatg ggctctagga 840
attttgcaga tcgcgttgca gggacgacaa agagctctgc aggcttccca caccacgcga 900
actacagaac ccgcaagtgg tactgacggc actagtaaat cgtcggaaga cgaagcaaca 960
cgcgccagtg agggcaacgc ttccgtcaac cagacatccc ccgccgcgtc atatccgcga 1020
cggccctctt ccgacgaagg gcaggacagc ggacgtagaa agtgttcaaa gcgaagtccg 1080
tctcgtctcg tacagaacgc tcctcttttt ctgaaggatg atagtcattc actgaaggac 1140
acgctggatt tagtaaaaaa caagaaccga gagctgacgg agaaggggag ggtacatgcc 1200
acccccctga gggtagtttt gttaaatagt atcatgatga agaaacttga gaaggtcttg 1260
ccagtcgtcg aaagcatgga cagagcactg atggctcgtc agacgtcttc cgaagcagcg 1320
actgtggacg actctagcac ttcaatttca catggtatgc agggtagtac cacctcaggt 1380
gcagctgctg tacagggtcc cagcacttca gttccaggtg cttcgggagg tcttggtcct 1440
tcggggggga agcggaaacc cgacgacgaa gatgattttg actgttcacg cgcgaagcgg 1500
aaaaatgatc agatgtga 1518
<210> 2
<211> 936
<212> DNA
<213> NF3核苷酸序列
<400> 2
atgttctacg gtgtcgttgt caagcctggc cagaccgtca ctctctcccc tgaagatggc 60
ggcgaggttc ttcacttgtc tcaggtttgc atgccccagc ccaaggatgg gggccgcacc 120
tacgtccagg tgatccaaga gggcaagacc tactctgtct gcatgcttca gaaagacaag 180
ctggagttca ccagcctgga ccttttcctc tccactcgtc agggcatcac catcaagact 240
gagggtggga agaacgaggt ccacttgacc ggctacttcg agcctgacgc cgagggactc 300
gacagcgacg aagacgagga ggaatcggaa tccgacatgg aagagaacgt catgcaccac 360
gccagaaagc acatccctac caagggagga aagatcgaag atttggatgg caatgacgag 420
gaggaggagg acgaggatga agatgaggat gatgacgacg aggatgacga tgaggatgac 480
gccgagatga aggccctcac cgccggcgat gacgatgagg acgacgagga tgagaacgag 540
gagggcagtg atgacgatga tgaggacatg gagaacggaa tcggtgaaga ctccgaggat 600
gaggacgacg aagaagacga ggaggaagag gcgtctcctc aaaacaagaa ggccagcgtg 660
ggggacaaga agcgcaaggc tgtcgaagtc gctcaggcct ccaacaagaa ggccaagccg 720
tctgctgctc ctagcaaggg cgctccccag aagggcgacg ctgccgcgta caaaagtgca 780
ttggtagatt tcttgaagaa gaacgggaag accccgttgg caactctcgg ccagaaggtg 840
aagaagcccg caggtgttag cgagaagatg gctcagttcc tcaaggcgaa cgcgtcgacg 900
ttcgatgttt cgaacggcgt gtgctcgctg aaatga 936
Claims (20)
1.一种用于弓形虫感染预防的药剂，其特征在于：所述药剂是用氢氧化铝佐剂吸附TLR7/8激动剂CL097制备而成的。
2.根据权利要求1所述的药剂，其特征在于：每100μl药剂中所述CL097的含量大于0μg，小于等于5μg。
3.根据权利要求2所述的药剂，其特征在于：每100μl药剂中含3-5μg的CL097。
4.根据权利要求3所述的药剂，其特征在于：每100μl药剂中含5μg的CL097。
5.根据权利要求1-4任一所述的药剂，其特征在于：所述药剂中还包括缓冲液，所述缓冲液为PBS，所述PBS的含量小于等于药剂总体积的60%。
6.根据权利要求5所述的药剂，其特征在于：所述PBS的含量为药剂总体积的40%-60%。
7.根据权利要求6所述的药剂，其特征在于：所述PBS的含量为药剂总体积的50%。
8.根据权利要求1-4、6或7所述的药剂，其特征在于：所述药剂的制备方法为：在常温下温育PBS和氢氧化铝佐剂30min，再加入TLR7/8激动剂CL097，冰上吸附30min，完成免疫佐剂的制备。
9.根据权利要求5所述的药剂，其特征在于：所述药剂的制备方法为：在常温下温育PBS和氢氧化铝佐剂30min，再加入TLR7/8激动剂CL097，冰上吸附30min，完成免疫佐剂的制备。
10.权利要求1-9任一所述的药剂的制备方法，其特征在于：是在常温下温育PBS和氢氧化铝混合液，再加入TLR7/8激动剂CL097，冰上吸附后完成免疫佐剂的制备。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：每100μl药剂中所述CL097的含量大于0μg，小于等于5μg。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：每100μl药剂中含3-5μg的CL097。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：每100μl药剂中含5μg的CL097。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述PBS的含量小于等于药剂总体积的60%。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述PBS的含量为药剂总体积的40%-60%。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述PBS的含量为药剂总体积的50%。
17.权利要求1-9任一所述的药剂在制备增强弓形虫疫苗免疫效果的免疫佐剂中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于：所述弓形虫疫苗为GRA16和NF3的联合疫苗。
19.权利要求1-9任一所述的药剂在制备增强弓形虫免疫预防的疫苗中的应用。
20.一种联合疫苗，其特征在于：所述联合疫苗由GRA16、NF3和权利要求1-9任一所述的药剂组成。
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