CN104277114B

CN104277114B - 一种新的融合蛋白及用其制备的嗜肺军团菌疫苗

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Publication number: CN104277114B
Application number: CN201410039880.3A
Authority: CN
Inventors: 许颖
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2018-02-13
Anticipated expiration: 2034-01-27
Also published as: CN103816531A; CN104277114A; CN103333257A; CN103816531B

Abstract

本发明公开了一种新的融合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，还公开前述融合蛋白的制备方法和用途，以及采用前述融合蛋白制备的疫苗。本发明融合蛋白可以有效抑制嗜肺军团菌感染，具有良好的应用前景。

Description

一种新的融合蛋白及用其制备的嗜肺军团菌疫苗

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种新的融合蛋白及用其制备的嗜肺军团菌疫苗。

背景技术

嗜肺军团菌（Legionella pneumonia）广泛存在于自然界各种水体环境中，属于革兰氏阴性兼性胞内致病菌，可寄生于原虫中，作为一种病原体，它可侵入哺乳动物巨噬细胞，逃避吞噬体和溶酶体的杀伤作用，并在其中繁殖。

嗜肺军团菌可以感染人体或动物体，引起一种以非典型肺炎或pantiac热为主要表现常伴有多系统损害的急性细菌性传染病——军团病，病程进展快，免疫功能低下者易感染，由于其症状不典型，常备误诊误治，病死率高，易爆发流行，国外监测结果显示，嗜肺军团菌病例数逐年升高，且致死率较高，其引起的常见并发症如脓毒血症、多器官衰竭、间歇性肺炎、肺纤维化致死率均较高(Huang SW,Hsu BM,et al.Water Sci Technol,60(5):1303-1310,2009)，必须引起重视。

目前，军团病的治疗主要采用大环内酯类和喹诺酮类抗生素，但其临床有效率较低，还会导致机体产生耐药性。接种疫苗是一种比较好的防治方式，然而，尽管嗜肺军团菌疫苗的研制已有近20年的历史，也出现了灭活全菌疫苗、蛋白亚单位疫苗、基因疫苗等疫苗，但都引起各自的不足难以在临床推广应用，如，全菌体灭活疫苗在人类群体中普遍存在多种较严重的不良反应，DNA疫苗的研究虽然具有良好的实验前景，但其作用机制尚不明确，应用于人体后其安全性有待进一步评价，目前制备的亚单位疫苗对胞内菌清除效果不佳，免疫保护性低。

因此，研发安全有效的嗜肺军团菌疫苗成为迫切需要解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的融合蛋白及其用其制备的嗜肺军团菌疫苗。

本发明融合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.1所示的。

本发明重组载体，它包括SEQ ID NO.1核苷酸序列。优选地，它是pET30a重组载体。

本发明重组菌，它包括前述的重组载体。优选地，它为重组大肠杆菌。

本发明制备前述融合蛋白的方法，它包括如下步骤：

（1）取前述重组菌，接种到大肠杆菌培养基中，34～40℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8；

（2）加入IPTG至终浓度为0.4～0.6mmol/L，在15～25℃的条件下，诱导培养8～16小时；

（3）收集菌体，超声破菌，离心，取沉淀分离纯化，即得。

步骤（1）中，大肠杆菌培养基为LB液体培养基，培养温度为37℃。

步骤（2）中，IPTG的终浓度为0.5mmol/L，温度为21℃，培养时间为12h。

步骤（3）中，所述超声破菌的步骤是：将菌体置于10mmol/LTris-HCl溶液中，在功率500W的条件下处理30次，每次10s，间隔15s。

步骤（3）中，所述分离纯化方法的步骤如下：

a、蛋白变性：将沉淀用10mmol/L的Tris-HCl溶液重悬沉淀，静置10min，离心，弃上清；重复一次；用含有尿素的浓度为10mmol/LTris-HCl溶液溶解沉淀，其中，尿素浓度为8mol/L，在12000rpm的条件下离心10min，收集上清；

b、蛋白复性：将上清用尿素浓度为6mol/L、4mol/L和2mol/L的缓冲液依次透析，前两个浓度分别透析3h，最后一个浓度透析12h，所述缓冲液中还含有1%（w/v）甘氨酸、0.1%（w/w）SDS、5%（v/v）甘油、10mmol/L Tris-HCl；再用含有1%（w/v）甘氨酸的浓度为10mMTris-HCl溶液透析2次，每次3h；12000rpm离心10min，取上清，即可。

本发明还提供了前述融合蛋白在制备治疗和/或预防嗜肺军团菌感染性疾病的药物中的用途。优选地，所述嗜肺军团菌感染性疾病为军团病。

本发明还提供了一种嗜肺军团菌疫苗，它包括致免疫有效量的权利要求1所述的融合蛋白，以及药学上可接受的辅料或者载体。优选地，所述融合蛋白的免疫有效量以每人一次使用量计不低于0.11μg/g。

所述辅料或载体为水或缓冲液。优选地，所述水为生理盐水或蒸馏水。

本发明氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白FlaA N/C，包括嗜肺军团菌鞭毛蛋白的部分N端蛋白与部分C端蛋白，二者之间通过柔性肽段（氨基酸序列为SPGISGGGGGILDSMG）连接。

发明人在前期研究过程中，分别用嗜肺军团菌的鞭毛蛋白、鞭毛蛋白的N端蛋白、鞭毛蛋白的C端蛋白进行嗜肺军团菌的感染保护试验，结果发现，它们具有一定的保护效果，但效果不佳。发明人进一步将鞭毛蛋白N端和C端特定部分的蛋白通过柔性肽段（氨基酸序列为SPGISGGGGGILDSMG）连接后，其保护作用大大增加。

本发明从嗜肺军团菌鞭毛蛋白出发，用基因工程的方式制备得到了融合蛋白FlaAN/C，免疫保护作用优良，可有效预防嗜肺军团菌引起的感染性疾病，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1融合蛋白表达图谱

图2FlaA N/C大量表达胶图谱

图3FlaA N/C纯化蛋白电泳图谱

图4FlaA N、FlaA C和FlaA N/C蛋白注射后IL-6水平图谱

图5小鼠存活天数

图6小鼠感染情况

图7肺部组织NF-κB、SOD2、COX2表达（Western-blot）

图8注射FlaAN/C后不同剂量嗜肺军团菌感染A/J小鼠存活天数

具体实施方式

实验材料：

实施例1本发明融合蛋白的制备

1）合成目的基因FlaA N/C：

序列（SEQ ID NO.1所示序列）如下：

ATTAACACCAACGTGGCGAGCCTGACCGCGCAGCGTAACCTGGGCGTGAGCGGCAACATGATGCAGACCAGCATTCAGCGTCTGAGCAGCGGCCTGCGTATTAACAGCGCGAAAGATGATGCGGCGGGCCTGGCGATTAGCCAGCGTATGACCGCGCAGATTCGTGGCATGAACCAGGCGGTGCGTAACGCGAACGATGGCATTAGCCTGGCGCAGGTGGCGGAAGGCGCGATGCAGGAAACCACCAACATTCTGCAGCGTATGCGTGAACTGAGCGTGCAGGCGGCGAACAGCACCAACAACAGCAGCGATCGTAGCAGCATTCAGAGCGAAATTAGCCAGCTGAAAAGCGAACTGGAACGTATTGCGCAGAACACCGAATTTAACGGCCAGCGTATTCTGGATGGCAGCTTTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCAGCATTAAACGTATTGATGCGGCGCTGAACAGCGTGAACAGCAACCGTGCGAACATGGGCGCGCTGCAGAACCGTTTTGAAAGCACCATTGCGAACCTGCAGAACGTGAGCGATAACCTGAGCGCGGCGCGTAGCCGTATTCAGGATGCGGATTATGCGGCGGAAATGGCGAGCCTGACCAAAAACCAGATTCTGCAGCAGGCGGGCACCGCGATGCTGGCGCAGGCGAACAGCCTGCCGCAGAGCGTGCTGAGCCTGCTG

2）将目的基因FlaA N/C双酶切克隆至pUC57保存备用。

3）双酶切pUC57-FlaAN/C质粒和pET30a质粒，并纯化回收

pUC57-FlaAN/C质粒双酶切体系：pUC57-FlaAN/C质粒10μl，buffer H5μl，EcoRⅠ2μl，XhoⅠ2μl，ddH₂O31μl，37℃过夜反应后进行凝胶电泳，割胶回收目标片段（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI）。pET30a质粒双酶切体系：5μl载体（pET30a质粒），2μl EcoR I，2μl XhoI，8μl10×Buffer，63μl ddH₂O，37℃过夜反应后进行凝胶电泳，割胶回收目标片段（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI）。

4）连接、转化

连接：1μl pET30a载体，4μl酶切回收产物，5μl连接酶混合物（TaKaRa，DNAligation Kit Ver2.0），混匀，室温反应30min以上。

转化：取出－80℃保存的感受态细胞（大肠杆菌BL21），放在冰上缓慢解冻。将感受态细胞加入连接产物中混匀，冰上放置30min。42℃热激90s。冰浴2min后，加入800μl无抗性的LB培养基，37℃培养45min。5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100-150μl，重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板，晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。

5）表达

从转化的平板挑单克隆到1.5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养。培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5mM）诱导，37℃，200rpm培养2h。取1ml诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50-100μl、10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，100℃煮5min，电泳检测（见图1）。

6）测序验证序列

7）大量表达

挑选测序正确的菌株，接1-2μl活化的菌液到5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养。将培养的菌液转接到500ml LB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5mM）,21℃诱导过夜。用400ml大离心筒，6000rpm，离心5min，弃上清，沉淀用20-30ml10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液吹散，超声破菌。

电泳确定表达形式：取100μl超声（500W,30次，每次10s，间隔15s）后的菌悬液，12000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50μl10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50μl2×loading buffer，100℃煮5min，电泳。

结果如图2所示，本发明融合蛋白以包涵体的形式存在。

8）蛋白纯化

蛋白变性

20～30ml10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min。12000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存。20～30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，静置10min。12000rpm，离心10min，弃上清。重复步骤：20～30ml10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，静置10min，12000rpm，离心10min，弃上清。先加入少量的10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液溶解蛋白。12000rpm，离心10min，收集上清。

蛋白复性

用样品体积20倍的透析Buffer（1%甘氨酸、0.1%SDS、5%甘油、10mM Tris-HCl，pH8.0，含尿素的浓度梯度分别是6M，4M，2M），4℃透析复性。每个尿素浓度3h，最后一级过夜透析。用1%甘氨酸、10mM Tris-HCl（pH8.0）透析2次，每次3h。12000rpm离心10min，取上清，电泳检测（图3）。

电泳检测结果如图3所示，本发明分离纯化得到纯品蛋白，其分子量为30KD，其氨基酸序列（SEQ ID NO.2所示序列）如下：

INTNVASLTAQRNLGVSGNMMQTSIQRLSSGLRINSAKDDAAGLAISQRMTAQIRGMNQAVRNANDGISLAQVAEGAMQETTNILQRMRELSVQAANSTNNSSDRSSIQSEISQLKSELERIAQNTEFNGQRILDGSFSGGGGSGGGGSIKRIDAALNSVNSNRANMGALQNRFESTIANLQNVSDNLSAARSRIQDADYAAEMASLTKNQILQQAGTAMLAQANSLPQSVLSLL。

实施例2本发明融合蛋白的细胞因子刺激试验

1、实验方法

BABLc小鼠共18只，每组3只，取本发明FlaA N/C融合蛋白2μg/g进行皮下注射，在注射后0h，2h，4h，8h，12h和24h眼眶取血进行检测，每份血清平行测试两次，运用细胞因子试剂盒检测了IL-6,IL-1-beta,TNF-α,TGF-β1and IL-12等细胞因子（按照试剂盒说明进行操作）。

2、实验结果

结果如图4所示，注射本发明FlaA N/C融合蛋白后，血清中白细胞介素-6的水平显著升高，峰值在注射后两小时左右，注射后8小时内均可保持较高水平，持续到24h恢复正常。

白细胞介素-6为重要的细胞生长因子，其可以增强体液免疫，增强机体的抗感染能力。上述实验证明，本发明FlaA N/C融合蛋白可以促使血清中白细胞介素-6的水平显著升高，说明本发明FlaA N/C融合蛋白可以增强体液免疫，增强机体的抗感染能力。

实施例3小鼠在不同时间点预防性注射后抗致死剂量嗜肺军团菌感染能力

1、实验方法

6-8周龄的A/J小鼠（购自Jackson实验室）。A/J小鼠（N=10）在气管接种嗜肺军团菌（6.03×10⁸CFU）之前2小时、4小时皮下注射FlaA N/C（1μg/g，换算为人用剂量：0.11μg/g）。空白对照小鼠（n=10）仅接受生理盐水等体积。阴性对照小鼠（n=10）不注射FlaA N/C，直接感染嗜肺军团菌（6.03×10⁸CFU）。

每天观察小鼠存活情况，并在皮下注射FlaA N/C(1μg/g)后0小时、1小时、2小时、4小时取肺部组织进行SOD₂、COX₂、NF-κB表达水平检测（Western-blot），感染后第1天、第3天和第7天分别取肺部组织进行HE染色观察。

2、实验结果

存活情况和感染情况如图5～6和表1所示：

表1不同时间点预防性注射后的死亡情况和感染情况

由图5～6和表1可知，本发明FlaA N/C融合蛋白可以有效降低嗜肺军团菌的感染，提高小鼠存活率。

SOD₂、COX₂、NF-κB表达水平如图6所示，与阴性对照相比，在接种嗜肺军团菌之前，注射本发明FlaA N/C融合蛋白，小鼠的SOD₂、COX₂、NF-κB表达水平高，说明本发明FlaA N/C融合蛋白能够有效刺激机体的抗氧化、抗凋亡等功能。

实验结果说明，本发明FlaA N/C融合蛋白能够提高机体的抗氧化、抗凋亡功能，有效抑制嗜肺军团菌的感染，可以制备成为疫苗，预防嗜肺军团菌感染性疾病。

实施例4小鼠注射FlaA N/C后抵抗不同浓度嗜肺军团菌感染的能力

1、实验方法

6-8周龄的A/J小鼠（购自Jackson实验室）。小鼠观察期为16天。在感染前2小时、4小时皮下注射FlaA N/C1μg/g后，气管接种6.54×10⁷CFU、6.03×10⁸CFU、1.05×10⁹CFU后，阴性对照小鼠（n=10）不经FlaA N/C直接感染嗜肺军团菌，观察小鼠存活情况。

2、实验结果

实验结果如图5、8和表2所示：

表2FlaA N/C后抵抗不同浓度嗜肺军团菌感染的结果

由图5、8和表2可以看出，空白对照全部存活，阴性对照随着接种剂量的增加，小鼠死亡率增加，死亡速度更快。

在感染前2h注射本发明FlaA N/C，在致病菌感染剂量为6.54×10⁷CFU和6.03×10⁸CFU时，存活率为100%，在致病菌感染剂量高达1.05×10⁹CFU时，存活率降低，但与阴性对照相比，存活率更高，死亡速度更慢。而在感染前4h注射本发明FlaA N/C，在不同感染剂量下，小鼠存活率均为100%，保护效果优良。

实验结果说明，本发明FlaA N/C能够有效抑制嗜肺军团菌的感染，可以制备成为疫苗，预防嗜肺军团菌感染性疾病。

综上，本发明融合蛋白能够有效抑制嗜肺军团菌感染，可以制备成为嗜肺军团菌疫苗，用于制备治疗和/或预防嗜肺军团菌感染性疾病的药物，临床应用前景良好。

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是pET30a重组载体。

5.一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求3或4所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组载体为重组大肠杆菌。