CN103333257A

CN103333257A - 对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白及其制备方法

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Publication number: CN103333257A
Application number: CN2013102855777A
Authority: CN
Inventors: 许颖
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2013-10-02
Also published as: CN103816531A; CN103816531B; CN104277114A; CN104277114B

Abstract

本发明对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白及其制备方法，本发明涉及重组蛋白技术领域，旨在解决现有辐射防护制剂存在较大的毒性和副作用等诸多技术问题。本发明的对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白，其氨基酸序列为N-Flexiblepeptide-C形式，其中N来自嗜肺军团菌鞭毛蛋白N端蛋白成分，Flexiblepeptide为柔性肽段，C来自嗜肺军团菌鞭毛蛋白C端蛋白成分。

Description

对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白技术领域，特别是生物对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

目前，放射治疗已经成为癌症治疗的最重要手段之一，我国约有70%以上的癌症需用放射治疗，美国统计也有50%以上的癌症需用放射治疗，对于许多癌症病人而言，放射治疗是唯一必须的治疗方法，高剂量辐射可以破坏或消灭癌细胞，但同时也损害正常细胞，导致副作用。同时，因核泄漏或恐怖事件所致人群的急性大剂量辐射暴露往往引起急性辐射综合症，对机体多种器官或组织造成不可逆的损伤，而目前的常规治疗手段仍然仅限于抗生素、输血及补液等对症治疗，一些抗癌药物也被用于此方面的治疗，但副作用巨大。

辐射防护药品的研究主要集中于生物制剂和化学制剂研发。Lyudmila GB等(Burdelya LG, Krivokrysenko VI, et al. Science, 320(5873): 226-230, 2008; Burdelya LG, Gleiberman AS, et al. Int J Radiat Oncol, 83 (1): 228-234, 2012）曾经用沙门氏菌的鞭毛蛋白经改造后得到TLR-5的激动剂CBLB502蛋白，在辐射损伤保护性研究方面取得较大进展，目前已在美国国防部资助下投入了1.56亿美元开展三期临床实验，在人体试验中证明其良好的辐射防护效果（目前报道最有效的生物类辐射保护剂）。同时，Ex-RAD、AEOL-10150、CLT-008等生物药物也正在加紧研发阶段（Willyard C. nature medicine. 2011, 17(4): 391）。该类药物虽具有良好的辐射防护效果，但均为美国具有自主知识产权的辐射防护药物，基于该类药物良好的军事应用前景及美国国防部资助背景，其使用必然受到美国相关法律法规的保护。国内生物蛋白辐射防护药物的研发较为薄弱，目前报道较多的均为美国研发的CBLB502的克隆复制(王磊，王治东等，国际药学研究杂志，39(3)：225- 230，2012；王治东，葛常辉等，中华放射医学与防护杂志. 30(2)：169-172,2010；周仕香.苏州大学学位论文，2011)，缺乏自主研发、具有自主知识产权的生物制剂。

以阿米福斯汀（美国 FDA于1996年批准上市的第1个泛细胞保护剂，目前最有效的辐射保护剂之一）为代表的合成化学试剂在临床应用较广，但其有效剂量接近其耐受剂量(Burdelya LG, Krivokrysenko VI, et al. Science, 2008;320(5873): 226-230)，且具有较大的毒性和副作用，限制了此类药物的推广应用(Weiss JF. Environ Health Perspect. 1997, 105 (Suppl 6) :1473-1478)。

发明内容

本发明旨在解决现有辐射防护生物制剂存在较大的毒性和副作用等诸多技术问题，以提供能有效防护机体大剂量的辐射暴露损伤、具有低毒和低副作用特点的融合蛋白及其制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明的对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白，其氨基酸序列为N-Flexible peptide-C形式，其中N为嗜肺军团菌鞭毛蛋白N端蛋白成分，Flexible peptide为柔性肽段，C为嗜肺军团菌鞭毛蛋白C端蛋白成分。

本发明的对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白，其中所述的柔性肽段氨基酸序列为SPGISGGGGGILDSMG。

本发明的对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白的制备方法，包含如下步骤：

a) 直接合成氨基酸对应的基因片段；

b) 通过分子重组，将目的基因克隆到相应载体中；

c) 将重组质粒转入宿主细胞诱导表达；

d) 用亲和层析方法纯化目的蛋白，并进行蛋白复性。

首先，查询NCBI嗜肺军团菌鞭毛蛋白氨基酸序列，将N端和C端反转录成DNA序列后，通过密码子优化得到目的基因，在N端和C端之间插入柔性肽片段基因序列，合成基因序列后，连接至pUC57保存备用。目的基因连接至pET30a载体后，转入感受态BL21中，IPTG诱导表达。融合蛋白产物的提纯一般采用亲和层析和分子筛层析，也不排除疏水层析，离子交换层析和HPLC的使用及今后推出的新型层析材料和层析方式的使用。

融合蛋白的鉴定采用SDS-PAGE、质谱分析法鉴定。预实验表明，在33KD处可见明显的表达带（见图1，其中M：maker；1、2为融合蛋白），经纯化后，可得到一单一蛋白带（见图2，其中1：沉淀；2：上清；M：蛋白质maker），经大量表达纯化后（见图3，其中M：蛋白质maker；1：纯化后原样），复性得到FlaA N/C蛋白（见图4，其中M：蛋白质maker；1：复性后原样）。

用上述纯化蛋白FlaA N/C进行了以下研究：

1. 细胞因子刺激试验

FlaA N/C融合蛋白1μg/g皮下注射BABLc小鼠后IL-6水平显著升高，峰值在注射后两小时左右，注射后8小时内均可保持较高水平，持续到24h恢复正常，其他细胞因子水平无明显变化（图5）。近期KrivokrysenkoVI等（KrivokrysenkoVI, Shakhov AN, et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2012, DOI:10.1124/ jpet.112.196071)的研究结果表明，CBLB502刺激后，IL-6的水平与辐射保护效应呈正相关。本发明蛋白能够高效刺激IL-6的表达，提示其良好的辐射防护效果。

2. 高剂量辐射损伤后小鼠存活情况

如图6所示，BABLc小鼠在13Gy全身辐照前一小时皮下注射FlaA N/C蛋白1μg/g，FlaA N/C能够使小鼠的存活率保持在60%，略高于阿米福斯汀的辐射保护效果，FlaA N和FlaA C单独注射效果弱于FlaA N/C。

3. 高剂量辐射暴露后，不同时间段注射融合蛋白的辐射保护效果

在13Gy全身辐照后，BABLc小鼠于5min、15min、30min、60min皮下注射FlaA N/C后，观察小鼠的生存时间。结果表明，全身辐照5min后皮下注射FlaA N/C的效果最差，全身辐照后30min皮下注射FlaA N/C的效果优于15min，60min注射对辐射防护的效果最优（图7）。同等条件下运用阿米斯汀进行辐射后应急注射保护效果研究，结果显示（图8），全身辐照5min、15min、30min、60min后进行FlaA N/C和阿米斯汀的注射，除15min FlaA N/C和阿米斯汀的保护效果基本相同以外，其他时间段注射FlaA N/C的辐射损伤保护效果均优于阿米斯汀效果。15min后腹腔注射阿米斯汀辐射损伤保护效果最佳，小鼠存活时间可达19天，但仍远远低于全身辐照后60min皮下注射FlaA N/C的效果（23天）。鉴于BABLc小鼠在13Gy TBI后，其存活期最多为12天（图6），结果提示，作为辐射暴露后用药，FlaA N/C可显著延长小鼠的生存时间，其效果远远优于阿米斯汀用药效果。

本发明对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白及其制备方法的有益效果：本发明的融合蛋白能够有效防护机体大剂量的辐射暴露损伤，同时，其作用机制为刺激机体NF-κB途径，诱导IL-6等细胞因子分泌，从而保护机体抵抗大剂量辐射，因此，具有低毒和低副作用特点，未来可应用于肿瘤放射治疗以及自然或人为因素造成的大剂量辐射暴露的预防性和应急性治疗，具有良好的经济和社会价值。

既往研究表明，目前临床应用较广且辐射保护性最好的阿米斯汀在13Gy全身辐照剂量照射前腹腔注射，NIH小鼠有54%的存活率（Weiss JF. Environ Health Perspect. 1997, 105 (Suppl 6) :1473-1478），本发明研究结果显示腹腔注射阿米斯汀后，BABLc 小鼠有55%的存活率，与国外研究基本一致。本发明的FlaA N/C蛋白在相同条件下对BABLc小鼠有60%的保护效果，IHC研究结果表明，FlaA N/C的作用机制可能是激活机体的NF-κB途径，从而刺激细胞因子如IL-6的分泌（结果未展示），因此，其作用机制是刺激自身的先天性免疫因子水平升高，从而达到辐射防护作用，具有低毒和低副作用特点，鉴于阿米斯汀的毒性效应和副作用，FlaA N/C蛋白具有更好的应用前景，既往研究提示，尤其是对于头颈部癌症来讲，辐射治疗剂量即使仅提高10-20%，对于癌症细胞的杀灭都可能产生质的区别（Bhide SA, Nutting CM. Oral Oncol, 2010, 46(6):439-441 ），因此，本发明FlaA N/C蛋白60%的辐射保护效果将能够使辐射治疗剂量得到较大的提升，为更好杀灭癌症细胞提供药物支持。同时，小鼠在高剂量辐照后，在15min-60min内注射本蛋白，均能够显著延长生存时间，其效果优于阿米斯汀效果，提示本蛋白后续研究可应用于大剂量辐射意外暴露后的应急性用药研发。

目前美国研发的CBLB502已基本形成产品，其在灵长类动物的辐射防护实验表明，可使灵长类动物的存活率由20%提高到70%，在13Gy全身辐照剂量下，NIH小鼠有87%的存活率。本发明的蛋白在13Gy全身辐照剂量下，BABLc小鼠有60%的存活率，低于CBLB502辐射防护效果，优于或者等于阿米斯汀的辐射保护效果。在急性高剂量辐射暴露的情况下，CBLB502可有效保护胃肠道和造血系统，本发明的FlaA N/C融合蛋白为独立研究获得蛋白，具有原创性，其研究结果显示，与CBLB502的辐射防护作用机制较为相似，未来可应用于高剂量辐射预防和辐射暴露后的应急性用药研发。

附图说明

图1融合蛋白表达图谱

图2 FlaA N/C大量表达胶图谱

图3 FlaA N/C纯化蛋白电泳图谱

图4 FlaA N/C复性后电泳图谱

图5 FlaA N、FlaA C和FlaA N/C蛋白注射后IL-6水平图谱

图6高剂量辐射预防性注射FlaA N/C蛋白保护效果示意图

图7 BABLc小鼠高剂量辐射后注射FlaA N/C蛋白保护效果示意图

图8 BABLc小鼠高剂量辐射后腹腔注射阿米斯汀保护效果示意图

具体实施方式

本发明的应用原理、作用与功效，通过如下实施方式予以说明。

实施例1 FlaA N/C克隆、表达

1）合成基因序列：

ATTAACACCAACGTGGCGAGCCTGACCGCGCAGCGTAACCTGGGCGTGAGCGGCAACATGATGCAGACCAGCATTCAGCGTCTGAGCAGCGGCCTGCGTATTAACAGCGCGAAAGATGATGCGGCGGGCCTGGCGATTAGCCAGCGTATGACCGCGCAGATTCGTGGCATGAACCAGGCGGTGCGTAACGCGAACGATGGCATTAGCCTGGCGCAGGTGGCGGAAGGCGCGATGCAGGAAACCACCAACATTCTGCAGCGTATGCGTGAACTGAGCGTGCAGGCGGCGAACAGCACCAACAACAGCAGCGATCGTAGCAGCATTCAGAGCGAAATTAGCCAGCTGAAAAGCGAACTGGAACGTATTGCGCAGAACACCGAATTTAACGGCCAGCGTATTCTGGATGGCAGCTTTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCAGCATTAAACGTATTGATGCGGCGCTGAACAGCGTGAACAGCAACCGTGCGAACATGGGCGCGCTGCAGAACCGTTTTGAAAGCACCATTGCGAACCTGCAGAACGTGAGCGATAACCTGAGCGCGGCGCGTAGCCGTATTCAGGATGCGGATTATGCGGCGGAAATGGCGAGCCTGACCAAAAACCAGATTCTGCAGCAGGCGGGCACCGCGATGCTGGCGCAGGCGAACAGCCTGCCGCAGAGCGTGCTGAGCCTGCTG

2）将目的基因双酶切克隆至pUC57保存备用。

3）双酶切pUC57-FlaA-N/C质粒和pET30a质粒并纯化回收

pUC57-FlaA-N/C质粒双酶切体系：pUC57-FlaA-N/C质粒 10μl，buffer H 5μl，EcoRⅠ 2μl，XhoⅠ 2μl，ddH2O 31μl，37℃过夜反应后进行凝胶电泳，割胶回收目标片段（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI）。pET30a质粒双酶切体系：5 μl 载体（pET30a质粒），2 μl EcoR I，2 μl XhoI，8 μl 10×Buffer， 63 μl ddH2O，37℃过夜反应后进行凝胶电泳，割胶回收目标片段（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI）。

4）连接、转化

连接：1 μl 载体，4 μl 酶切回收产物，5 μl 连接酶混合物（TaKaRa，DNA ligation Kit Ver 2.0），混匀，室温反应30 min以上。

转化：取出－80℃保存的感受态细胞（BL21），放在冰上缓慢解冻。将感受态细胞加入连接产物中混匀，冰上放置30 min。42℃热激90 s。冰浴2 min后，加入800 μl 无抗性的LB培养基，37℃培养45 min。5000 rpm离心3 min，弃大部分上清，留约100-150 μl，重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板，晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。

5）表达

从转化的平板挑单克隆到1.5 ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养。培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5 mM）诱导，37℃，200 rpm培养2 h。取1 ml诱导的菌液，12000 rpm，离心1 min，弃上清，沉淀用50-100 μl 10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与缓冲液等体积的 2×loading buffer，100℃煮5 min，电泳检测（见图1）。

6）测序验证序列

7）大量表达

挑选测序正确的菌株，接1-2 μl活化的菌液到5 ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm，培养。将培养的菌液转接到500 ml LB液体培养基混合，37℃，200 rpm，培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5 mM）,21℃诱导过夜。用400 ml大离心筒，6000 rpm，离心5 min，弃上清，沉淀用20-30 ml 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）溶液吹散，超声破菌。

电泳确定表达形式：取100 μl超声（500 W ,30次，每次10 s，间隔15 s）后的菌悬液，12000 rpm，离心10 min，取50 μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50 μl 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）溶液吹散，加入50 μl 2×loading buffer，100℃煮5 min，电泳（包涵体，见图2）。

实施例2 FlaA N/C蛋白纯化

20~30 ml 10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10 min。12000 rpm，离心10 min，上清转入另一管中保存。20~30 ml 10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，静置10 min。12000 rpm，离心10min，弃上清。重复步骤：20~30 ml 10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，静置10 min，12000 rpm，离心10min，弃上清。先加入少量的10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，再加5~10 ml含8 M尿素的10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液溶解蛋白。12000 rpm，离心10 min，收集上清，取50μl电泳（见图3）。

蛋白复性

用样品体积20倍的透析Buffer（1%甘氨酸、0.1% SDS、5%甘油、10 mM Tris-HCl，pH 8.0，含尿素的浓度梯度分别是6 M，4 M，2 M），4℃透析复性。每个尿素浓度3 h，最后一级过夜透析。用1%甘氨酸、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）透析2次，每次3 h。12000 rpm离心10min，取上清，电泳检测（图4）。

实施例3 细胞因子刺激试验

BABLc小鼠共18只，每组3只，取FlaA N/C融合蛋白1μg/g进行皮下注射，在注射后oh，2h，4h，8h，12h和24h眼眶取血进行检测，每份血清平行测试两次，运用细胞因子试剂盒检测了IL-6, IL-1-beta, TNF-α, TGF-β1 and IL-12等细胞因子（按照试剂盒说明进行操作），结果显示（见图5），IL-6水平显著升高，峰值在注射后两小时左右，注射后8小时内均可保持较高水平，持续到24h恢复正常，其他细胞因子水平无明显变化。近期KrivokrysenkoVI等（KrivokrysenkoVI, Shakhov AN, et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2012, DOI:10.1124/ jpet.112.196071)的研究结果表明，CBLB502刺激后，IL-6的水平与辐射保护效应呈正相关。本发明蛋白能够高效刺激IL-6的表达，提示其良好的辐射防护效果。

实施例4小鼠预防性注射后辐射保护实验

BABLc小鼠共5组，FlaA N/C组、FlaA N组、FlaA C组、阿米福斯汀组及PBS组，每组10只，FlaA N/C、FlaA N、FlaA C蛋白1μg/g进行皮下注射，阿米福斯汀150μg/g腹腔注射，在注射后1小时进行13Gy辐照，观察小鼠生存时间。结果显示，FlaA N/C融合蛋白具有良好的保护效果，FlaA N/C能够使小鼠的存活率保持在60%，略高于阿米福斯汀的辐射保护效果，FlaA N和FlaA C单独注射效果弱于FlaA N/C。

实施例5 小鼠辐照后注射FlaA N/C辐射保护实验

BABLc小鼠共4组，FlaA N/C组、阿米福斯汀组、FlaA N/C+阿米福斯汀组、PBS组，每组40只，每个注射时像点10只小鼠。在13Gy辐照后，FlaA N/C蛋白1μg/g进行皮下注射，阿米福斯汀150μg/g腹腔注射，注射时间点分别为5分钟、15分钟、30分钟、60分钟，观察小鼠生存时间。结果显示，全身辐照5min、15min、30min、60min后进行FlaA N/C和阿米斯汀的注射，除15min FlaA N/C和阿米斯汀的保护效果基本相同以外，其他时间段注射FlaA N/C的辐射损伤保护效果均优于阿米斯汀效果。15min后腹腔注射阿米斯汀辐射损伤保护效果最佳，小鼠存活时间可达19天，但仍远远低于全身辐照后60min皮下注射FlaA N/C的效果（23天）。鉴于BABLc小鼠在13Gy TBI后，其存活期最多为12天（见图6），结果提示，作为辐射暴露后用药，FlaA N/C可显著延长小鼠的生存时间，其效果远远优于阿米斯汀用药效果。

[0035]

序列表

<110> 许颖

<120> 对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白及其制备方法

<160> 1

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 1

Claims

1.一种对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白，其氨基酸序列为N-Flexible peptide-C形式，其中N为嗜肺军团菌鞭毛蛋白N端蛋白成分，Flexible peptide为柔性肽段，C为嗜肺军团菌鞭毛蛋白C端蛋白成分。

2.根据权利要求1所述的一种对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白，其中所述的柔性肽段氨基酸序列为SPGISGGGGGILDSMG。

3.一种对大剂量辐射具有高效防护效果的融合蛋白的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

a)直接合成氨基酸对应的基因片段；

b)通过分子重组，将目的基因克隆到相应载体中；

c)将重组质粒转入宿主细胞诱导表达；

d)用亲和层析方法纯化目的蛋白，并进行蛋白复性。