CN103816531B

CN103816531B - 融合蛋白制备治疗和/或预防辐射损伤的药物、保健食品或者食品中的用途

Info

Publication number: CN103816531B
Application number: CN201410075339.8A
Authority: CN
Inventors: 许颖
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2034-03-03
Also published as: CN104277114A; CN103816531A; CN103333257A; CN104277114B

Abstract

本发明公开了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白在制备治疗和/或预防辐射损伤的药物、保健食品或者食品中的用途。本发明还公开了一种新的治疗和/或预防辐射损伤的药物、保健食品或者食品，以及一种新的联合用药物。本发明融合蛋白对辐射损伤有非常良好的保护作用，毒性小，可用于治疗和/或预防辐射损伤，具有良好的应用前景。

Description

融合蛋白制备治疗和/或预防辐射损伤的药物、保健食品或者食品中的用途

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白在制备治疗和/或预防辐射损伤的药物、保健食品或者食品中的用途及其用途。

背景技术

随着核能、电磁能等在军事、科技、医学及日常生活中的广泛应用，人们接触辐射的机会越来越多，当辐射剂量超过一定范围时,就会给人们造成辐射损伤。同时，放射治疗是已经成为癌症治疗的最重要手段之一，我国约有70%以上的癌症需用放射治疗，美国统计也有50%以上的癌症需用放射治疗，对于许多癌症病人而言，放射治疗是唯一必须的治疗方法，然而，高剂量辐射可以破坏或消灭癌细胞，但同时也会损害正常细胞，引起机体损伤。另外，因核泄漏或恐怖事件所致人群的急性大剂量辐射暴露往往引起急性辐射综合症，对机体多种器官或组织造成不可逆的损伤。

目前，常见的辐射损伤防治药物有四大类：含硫化合物类、激素类、中药类、细胞因子类。其中，含硫化合物类治疗辐射损伤的药效较强，是临床应用较广的辐射防护药，如，阿米福汀，又称氨磷汀，为Amifostine与甘露醇混合的灭菌冻干粉剂，是冷战期间美国Walter-Reed陆军研究所合成的4,000余种放射保护剂中最有效的防护核辐射的药物，目前常用于减轻化疗药物所致肾脏、骨髓、心脏、耳及神经系统的毒性的常用药物，但是，该类药物为化学药物，治疗辐射损伤的有效剂量接近其耐受剂量，毒性大，引起的副作用强，安全性差。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的治疗和/或预防辐射损伤的药物。

首先，本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白在制备治疗和/或预防辐射损伤的药物、保健食品或者食品中的用途。

本发明还提供了一种治疗和/或预防辐射损伤的药物、保健食品或者食品，其特征在于：它是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白为活性，加上药品、保健食品或食品上可接受的辅料或者辅助性成分制成的制剂。

其中，所述制剂为液体制剂、气体制剂、固体制剂或半固体制剂。

本发明还提供了一种治疗和/或预防辐射损伤的联合用药物，它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或依次给予氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白与含硫化合物，以及药学上课接受的载体。

其中，所述含硫化合物是阿米福汀。

其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白与含硫化合物的重量配比为1:150。

本发明氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白，对辐射损伤有非常良好的保护作用，毒性小，可有效预防和/或治疗辐射损伤，为预防和/或治疗辐射损伤药物提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 融合蛋白表达图谱

图2 FlaA N/C大量表达胶图谱

图3 FlaA N/C纯化蛋白电泳图谱

图4 高剂量辐射预防性保护效果示意图

图5 BABLc小鼠高剂量辐射后注射FlaA N/C蛋白保护效果示意图

图6 BABLc小鼠高剂量辐射后腹腔注射阿米福汀保护效果示意图

具体实施方式

实验材料：

实施例1 本发明SEQ ID NO.2所示融合蛋白的制备

1、融合蛋白制备

1）合成目的基因FlaA N/C：

序列（SEQ ID NO.1所示序列）如下：

ATTAACACCAACGTGGCGAGCCTGACCGCGCAGCGTAACCTGGGCGTGAGCGGCAACATGATGCAGACCAGCATTCAGCGTCTGAGCAGCGGCCTGCGTATTAACAGCGCGAAAGATGATGCGGCGGGCCTGGCGATTAGCCAGCGTATGACCGCGCAGATTCGTGGCATGAACCAGGCGGTGCGTAACGCGAACGATGGCATTAGCCTGGCGCAGGTGGCGGAAGGCGCGATGCAGGAAACCACCAACATTCTGCAGCGTATGCGTGAACTGAGCGTGCAGGCGGCGAACAGCACCAACAACAGCAGCGATCGTAGCAGCATTCAGAGCGAAATTAGCCAGCTGAAAAGCGAACTGGAACGTATTGCGCAGAACACCGAATTTAACGGCCAGCGTATTCTGGATGGCAGCTTTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCAGCATTAAACGTATTGATGCGGCGCTGAACAGCGTGAACAGCAACCGTGCGAACATGGGCGCGCTGCAGAACCGTTTTGAAAGCACCATTGCGAACCTGCAGAACGTGAGCGATAACCTGAGCGCGGCGCGTAGCCGTATTCAGGATGCGGATTATGCGGCGGAAATGGCGAGCCTGACCAAAAACCAGATTCTGCAGCAGGCGGGCACCGCGATGCTGGCGCAGGCGAACAGCCTGCCGCAGAGCGTGCTGAGCCTGCTG

2）将目的基因FlaA N/C双酶切克隆至pUC57保存备用。

3）双酶切pUC57-FlaAN/C质粒和pET30a质粒，并纯化回收

pUC57-FlaAN/C质粒双酶切体系：pUC57-FlaAN/C质粒10μl，buffer H5μl，EcoR Ⅰ 2μl，Xho Ⅰ 2μl，ddH₂O 31μl，37℃过夜反应后进行凝胶电泳，割胶回收目标片段（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI）。pET30a质粒双酶切体系：5μl载体（pET30a质粒），2μl EcoR I，2μl XhoI，8μl 10×Buffer，63μl ddH₂O，37℃过夜反应后进行凝胶电泳，割胶回收目标片段（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI）。

4）连接、转化

连接：1μl pET30a载体，4μl酶切回收产物，5μl连接酶混合物（TaKaRa，DNA ligation Kit Ver2.0），混匀，室温反应30min以上。

转化：取出－80℃保存的感受态细胞（大肠杆菌BL21），放在冰上缓慢解冻。将感受态细胞加入连接产物中混匀，冰上放置30min。42℃热激90s。冰浴2min后，加入800μl无抗性的LB培养基，37℃培养45min。5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100-150μl，重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板，晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。

5）表达

从转化的平板挑单克隆到1.5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养。培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5mM）诱导，37℃，200rpm培养2h。取1ml诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50-100μl、10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，100℃煮5min，电泳检测（见图1）。

6）测序验证序列

7）大量表达

挑选测序正确的菌株，接1-2μl活化的菌液到5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养。将培养的菌液转接到500ml LB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD=0.6-0.8，IPTG（0.5mM）,21℃诱导过夜。用400ml大离心筒，6000rpm，离心5min，弃上清，沉淀用20-30ml10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液吹散，超声破菌。

电泳确定表达形式：取100μl超声（500W,30次，每次10s，间隔15s）后的菌悬液，12000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50μl10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50μl2×loading buffer，100℃煮5min，电泳。

结果如图2所示，本发明融合蛋白以包涵体的形式存在。

8）蛋白纯化

蛋白变性

20～30ml 10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min。12000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存。20～30ml 10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，静置10min。12000rpm，离心10min，弃上清。重复步骤：20～30ml 10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，静置10min，12000rpm，离心10min，弃上清。先加入少量的10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液溶解蛋白。12000rpm，离心10min，收集上清。

蛋白复性

用样品体积20倍的透析Buffer（1%甘氨酸、0.1%SDS、5%甘油、10mMTris-HCl，pH8.0，含尿素的浓度梯度分别是6M，4M，2M），4℃透析复性。每个尿素浓度3h，最后一级过夜透析。用1%甘氨酸、10mM Tris-HCl（pH8.0）透析2次，每次3h。12000rpm离心10min，取上清，电泳检测（图3）。

电泳检测结果如图3所示，本发明分离纯化得到纯品的融合蛋白，其分子量为30KD，氨基酸序列（SEQ ID NO.2所示序列）如下：

INTNVASLTAQRNLGVSGNMMQTSIQRLSSGLRINSAKDDAAGLAISQRMTAQIRGMNQAVRNANDGISLAQVAEGAMQETTNILQRMRELSVQAANSTNNSSDRSSIQSEISQLKSELERIAQNTEFNGQRILDGSFSGGGGSGGGGSIKRIDAALNSVNSNRANMGALQNRFESTIANLQNVSDNLSAARSRIQDADYAAEMASLTKNQILQQAGTAMLAQANSLPQSVLSLL。

2、毒性检测

方法：取禁食12～16h的小鼠20只，雌雄各半，按剂量为28mg/kg给小鼠灌胃给药1次，连续观察7天，记录小鼠给药后外观、行为、饮食、分泌物、排泄物等的变化。

实验结果发现，7天内未见任何动物死亡，说明本发明蛋白的最大耐受量（MTD）不低于28mg/kg。

实施例2 本发明融合蛋白的小鼠预防性注射后辐射保护实验

1、实验材料

FlaA N/C蛋白：实施例1制备的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白；

阿米福汀：市售品。

2、实验方法

BABLc小鼠共4组，阴性对照组（PBS组）、阳性对照组（阿米福汀组）、本发明实验组（FlaA N/C组）、联合用药组（FlaA N/C+阿米福斯汀组），每组10只。

在辐照前，阳性对照组腹腔注射阿米福汀150μg/g；本发明实验组皮下注射1μg/g的FlaA N/C蛋白；联合用药组在腹腔注射阿米福汀150μg/g的同时，皮下注射1μg/g的FlaA N/C蛋白；PBS组仅接受等体积PBS溶液。

在给药后1小时，对所有小鼠进行γ射线（剂量为13Gy）辐照，观察小鼠存活率。

3、实验结果

实验结果如图4和表1所示：

表1小鼠死亡情况

组别	阴性对照组	阳性对照组	本发明实验组	联合用药组
					存活率	0%	50%	60%	80%

由图4和表1可以看出，阴性对照组（PBS组）全部死亡，存活率为0%。阳性对照组（阿米福汀组）的保护率为50%，本发明实验组（FlaA N/C组）的保护率为60%，联合用药组的保护率为80%。

实验结果说明：

本发明FlaA N/C融合蛋白对辐射导致的损伤有良好的预防性保护作用，与阳性药物阿米福汀相比，在使用剂量大大降低的情况下，治疗效果反而更优。

本发明FlaA N/C在使用剂量为1μg/g时即可发挥药效，远远低于其耐受剂量（不低于28mg/kg），副作用小，安全性高。

将本发明FlaA N/C融合蛋白与阿米福汀联合使用，可以进一步提高保护效果，可以将二者制成联合用药物。

实施例3 本发明融合蛋白的小鼠辐照后保护实验

1、实验材料

阿米福汀：市售品。

2、实验方法

BABLc小鼠共2组，阳性对照组（阿米福汀组）、本发明实验组（FlaA N/C组），每组40只。

先对所有小鼠进行γ射线（剂量为13Gy）辐照；阳性对照组腹腔注射阿米福汀150μg/g；本发明实验组皮下注射1μg/g的FlaA N/C蛋白，注射时间点分别为5分钟、15分钟、30分钟、60分钟。

观察小鼠生存时间。

3、实验结果

实验结果如图5～6和表2所示：

表2小鼠存活时间

如图5～6和表2～3所示：

与阳性对照组（阿米福汀组）相比，本发明实验组可以更有效地延长小鼠存活时间，其中，在辐照后30min、60min给药时，本发明实验组的存活时间远远长于阳性对照组。

实验结果说明：

本发明FlaA N/C融合蛋白可以有效治疗辐射导致的损伤，与阳性药物阿米福汀相比，在使用剂量大大降低的情况下，治疗效果反而更优。

综上，本发明氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白，对辐射损伤有非常良好的预防和治疗作用，效果优于临床常用药物阿米福汀，预防和治疗辐射损伤的有效剂量远远低于其耐受剂量，安全性高，可应用于肿瘤放射辅助治疗，以及自然或人为因素造成的辐射损伤的预防性和应急性治疗，临床应用前景良好。

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白在制备治疗和/或预防辐射损伤的药物中的用途。

2.一种治疗和/或预防辐射损伤的药物，其特征在于：它是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白为活性成分，加上药品上可接受的辅助性成分制成的制剂。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：所述制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂。

4.一种治疗和/或预防辐射损伤的联合用药物，其特征在于：它包含不同规格的单位制剂，用于同时或分别给予氨基酸序列如SEQID NO.2所示的融合蛋白与含硫化合物，以及药学上可接受的载体；所述含硫化合物是阿米福汀。

5.根据权利要求4所述的联合用药物，其特征在于：所述分别给予氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白与含硫化合物是依次给予氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白与含硫化合物。

6.根据权利要求4所述的联合用药物，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白与含硫化合物的重量配比为1:150。