CN101492651A - 一种含有原核基因pprI的真核重组质粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有原核基因pprI的真核重组质粒，所述重组载体为pCMV－HA－pprI，所述重组质粒可以通过活体电转染进入动物体内，表达pprI基因蛋白，对动物急性重度放射损伤具有显著的抗放和救治作用，并且半寿期长，无毒副作用。

Description

一种含有原核基因pprI的真核重组质粒及其用途

技术领域

本发明属于基因重组载体领域，尤其涉及含有原核基因pprI的真核重组质粒及其用途。

背景技术

随着核科学技术的迅猛发展，核辐射已广泛用于国防、工业、农业和医学等各个领域造福于人类。然而，无论在平时还是战时，核爆炸、核恐怖、核事故等核突发事件所产生的大剂量电离辐射，对生物机体可引起严重的急性放射性损伤(ARI)，死亡率极高。急性重度放射损伤的防治一直是国际放射医学和国防医学领域研究的重点和难点之一。

近年来，随着分子生物学和蛋白质工程学研究的迅速发展和应用，细胞因子已试用于急性放射损伤的临床救治。我们的研究表明，放射损伤时细胞因子分泌显著降低或相对低下，是放射损伤难以修复的主要原因之一。细胞因子的持续可控性释放，可能是治愈急性放射损伤的关键。

目前应用细胞因子蛋白或质粒的方式主要为皮下或肌肉注射，由于细胞因子蛋白价格昂贵、在生物体内半寿期短、而增加注射频率或增大用药剂量，则易产生严重毒副作用而使病人无法耐受。这些弊端限制了细胞因子在放射损伤临床中的应用。

抗辐射菌(Deinococcus radiodurans)是1956年由美国科学家Arthur WAnderson等人首次从辐射灭菌后变质的肉类罐头中分离出来的需氧型、非孢子型、革兰氏阳性四联体微球菌，是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的微生物之一。因其对电离辐射、紫外线等辐射引起的致死和突变效应具有极强抗性，近年来倍受生物医学界和环境工程界的关注和重视。抗辐射菌能在辐照后几小时内准确无误地修复每条染色体至少150多个DNA双链断裂(DSB)。指数生长期的抗辐射菌对电离辐射的抗性是大肠杆菌的200倍，可耐受几百Gy电离辐射的照射。这种极强的抗辐射能力可能与该菌染色体的环状紧密结构、高效精确的DNA损伤修复系统尤其是对双链DNA断裂极强的修复能力有关，也可能与抗辐射菌胞质锰(cytosolicmanganese)的高含量和铁的低含量能够保护蛋白(而不是DNA)免遭电离辐射引起的氧化损伤有关。

促DNA修复多效蛋白诱导因子(inducer of pleiotropic proteins promotingDNA repair，pprI)是一种在抗辐射球菌新发现的调节蛋白。pprI基因含有987bp，编码328个AA，其产物PprI的分子量约为37KD。pprI在抗辐射菌的抗放作用中起着十分重要的作用，它能刺激辐射后reeA基因转录增加。pprI作为一个开关基因，可能通过调节recA、pprA等下游基因的表达而加速DNA电离辐射损伤的修复。研究表明，抗辐射菌的PprI蛋白在大肠杆菌中表达可使大肠杆菌对高剂量的γ射线的辐射抗性及抗氧化能力都明显提高。

抗辐射菌属原核生物，与真核生物哺乳动物在进化上存在着巨大差异，基因组成和蛋白表达不同，并且存在密码子的偏爱性问题。因此，原核基因在哺乳动物细胞中表达几乎是不可能的。哺乳动物细胞不含pprI基因或同源类似物，那么能否将抗辐射菌pprI基因导入哺乳动物细胞，并且该基因能否表达和发挥其抗辐射损伤的作用呢？这一科学难题迄今在国内外文献中尚未见有关报道。

发明内容

本发明目的是提供一种含有原核基因pprI的真核重组质粒，从而使pprI原核基因在真核细胞中成功表达，实现pprI基因在两大种系间的跨越和蛋白表达；本发明的另一目的是提供含有原核基因pprI的真核重组质粒的用途。

为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种含有原核基因pprI的真核重组质粒，所述重组质粒为pCMV-HA-pprI，将该质粒转化到大肠杆菌中保藏，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2008年12月11日；保藏编号CCTCC M 208253；分类命名：大肠杆菌DH5α/pCMV-HA-pprI；Escherichia coli DH5α/pCMV-HA-pprI；

上述技术方案中pCMV-HA-pprI重组质粒的构建，包括以下步骤：

(1)以5’-ATGCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTT-3’为上游引物，5’-TCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTCGTCC-3’为下游引物，以D.radiodurans R1基因组为模板，PCR扩增得到pprI基因；

(2)回收步骤(1)所得PCR产物，与pGEM-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑选阳性克隆，抽提质粒；

(3)以5’TCGAATTCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTTGC-3’为上游引物，其中划线部分GAATTC为EcoRI酶切位点；以5’TTCTCGAGTTTCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTC-3’为下游引物，其中划线部分CTCGAG为xhoI酶切位点；以测序正确的pGEM-T-pprI质粒为模板，应用PCR扩增，并割胶纯化回收目的片段；

(4)用EcoRI酶和XhoI酶对pprI片段及pCMV-HA载体进行双酶切，纯化酶切产物后，用T4连接酶将pprI片段与pCMV-HA载体按摩尔比5∶1进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取阳性克隆做煮菌PCR验证，并抽提质粒进行DNA测序，将测序正确的克隆保菌。

上述技术方案中，所述pCMV-HA载体为现有载体，其结构示意图见图4；载体的多克隆位点(MCS)的序列以及其中限制性酶切位点位置如下所示：

本发明还包括所述的含有原核基因pprI的真核重组质粒在制备抗辐射损伤药物中的应用。

本发明还包括一种预防或治疗辐射损伤的药物，所述药物含有权利要求1所述的含有原核基因pprI的真核重组质粒。

本发明中重组质粒pCMV-HA-pprI保存于大肠杆菌DH5α中，抽提质粒方法：接大肠杆菌DH5α于5ml含100ug/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇菌12h后，用质粒小量抽提试剂盒抽提即可。

由于上述技术方案运用，本发明具有下列优点：

(1)本发明应用自行设计的两对上下游引物，成功构建了真核重组质粒PCMV-HA-pprI，该载体可以成功地在哺乳动物细胞表达PprI蛋白，攻克了原核基因在真核细胞难以成功转染和表达的科学难题。

(2)本发明构建的真核重组质粒PCMV-HA-pprI经活体电转染后，对动物急性放射损伤具有显著的预防和救治作用，并且半寿期长，无毒副作用。

附图说明

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2008年12月11日；保藏编号CCTCC M 208253；分类命名：大肠杆菌DH5α/pCMV-HA-pprI；Escherichia coli DH5α/pCMV-HA-pprI；

图1.实施例一中以D.radiodurans R1基因组为模板PCR扩增得到pprI片段电泳图；

其中，M：DL2000Marker；1：pprI片段约1000bp；

图2.实施例一中煮菌PCR验证结果；

其中，3：阳性克隆，M：DL2000Marker；

图3.实施例二中用Western blotting检测pprI蛋白在293T细胞中的表达电泳图；

其中，pCMV-HA-pprI为重组质粒，pCMV-HA为空载体，表达的PprI蛋白约为37KD；

图4.本发明实施例中pCMV-HA载体的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实验材料：

pGEM-T载体(Promega)，pCMV-HA载体(Clontech)，Taq DNA聚合酶(上海笛川生物科技有限公司)，PCR产物纯化试剂盒(上海中科英达生物技术公司)，限制性内切酶EcoRI，xhoI(BioLabs公司)，DNA连接试剂盒(Promega公司)，琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(QIAGEN)小量质粒抽提试剂盒(Roche)，Lipofectinamine2000(invitrogen)，小牛血清和DMEM高糖(Gibco)，HA-Tag的鼠单克隆抗体(Cell Signaling Technology)，山羊抗鼠IgG(H+L)HRP结合物(Cell Signaling Technology)。

抗辐射菌D.radiodurans R1在30℃培养于TGY(0.5％胰蛋白胨、0.1％葡萄糖、0.3％酵母提取物，其中百分数均为质量分数)培养基中；大肠杆菌DH5α本室保存，37℃培养于LB(1％Typtone，0.5％Yeast extract，1％NaCl，其中百分数均为质量分数)培养基中；人胚肾细胞293T在37℃、5％CO₂培养箱中用含10％小牛血清的DMEM高糖培养。

实施例一，pCMV-HA-pprI重组质粒的构建

(1)pprI基因的克隆

提取D.radioduransR1基因组DNA，根据该基因组序列设计克隆引物：

上游引物：5’-ATGCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTT-3’

下游引物：5’-TCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTCGTCC-3’

以D.radiodurans R1基因组为模板进行PCR扩增，扩增条件：94℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。

扩出目的条带约为1kb，经割胶回收后用1％琼脂糖胶电泳检测，得到1条目的条带(图1)，并用PCR产物纯化试剂盒纯化产物和定量。

(2)PCMV-HA-pprI载体的构建

2.1pGEM-T-pprI质粒的构建：

将PCR产物经割胶回收后，将目的条带与pGEM-T载体进行连接反应，16℃过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布于含100ug/ml的氨苄青霉素的LB平板上37℃培养12h后挑取阳性克隆做煮菌PCR验证，并将验证结果为阳性的克隆抽提质粒进行DNA测序。

2.2pCMV-HA-pprI重组质粒的构建：

以测序正确的pGEM-T-pprI质粒为模板，设计下列含酶切位点的引物：

上游引物为：5’TCGAATTCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTTGC-3’，划线部分为EcoRI酶切位点；下游引物为5’TTCTCGAGTTTCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTC-3’，划线部分为xhoI酶切位点。

应用PCR扩增，并割胶纯化回收目的片段。用EcoRI酶和XhoI酶对pprI片段及pCMV-HA载体进行双酶切，纯化酶切产物后，1％琼脂糖胶电泳定量，将pprI片段与载体按5∶1(摩尔比)进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布于氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取阳性克隆做煮菌PCR验证，可见3号为阳性克隆，它扩出了单一目的条带(图2)，取3号克隆接种培养12h后，抽质粒并测序，正向测序结果如序列表中SEQ ID NO.1所示，反向测序结果如序列表中SEQ ID NO.2所示；测序结果用NCBI blast-n进行比对，结果显示与pprI(NCBI：编号为DR 0167)的核苷酸序列一致，将测序正确的克隆保菌。

实施例二，pCMV-HA-pprI质粒转染293T细胞及表达鉴定

将293T细胞以1×10⁵cells/ml的密度，1ml的量接种在35mm的细胞培养皿中，用10％小牛血清的DMEM培养基培养18h，待细胞生长汇片70％-80％后，将细胞培养基换为无血清培养基optimen(Gibco)，再将1μg的PCMV-HA-pprI质粒与3μl的Lipofectinamine2000脂质体转入293T细胞中，同时转入1ug的空载体作为对照。4-6h后将无血清培养基optimen换为含10％小牛血清的DMEM，培养24h。

Western blotting检测pprI蛋白的表达：将细胞离心，用细胞裂解液裂解，将其上清与上样缓冲液混匀后取20ul做SDS-PAGE电泳，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转至硝酸纤维素薄膜，将膜置于20ml用5％脱脂奶粉配置的封闭缓冲液中，室温下置于摇床震荡1.5h；将鼠抗HA的抗体以1∶1000稀释于5％脱脂奶粉中，4℃摇床震荡过夜。按1∶5000将抗鼠二抗稀释于5％脱脂奶粉，室温下置于摇床震荡孵育1h，显色，X片曝光显影，结果表明：转染的细胞中可检测到PprI蛋白的表达，约为37KD，如图3所示；而转染了空载体的细胞则没有检测到PprI蛋白的表达。

由此可见，原核生物抗辐射菌的PprI蛋白可以在真核细胞293T中表达。

实施例三，pCMV-HA-pprI重组质粒活体电转染对急性重度放射损伤的防治作用

1.1实验动物及分组

采用清洁级纯品系雄性BALB/c小鼠，体重18±2g，由四川大学医学部实验动物中心提供。经一周左右适应期饲养，将BALB/c小鼠随机分为正常对照组、单纯照射组、转基因药物组。

单纯照射组和转基因药物组接受中子或γ射线照射，照后小鼠置于无菌室饲养；并于照后第1、7、14、21和28天，每组处死4只小鼠取样检测。

1.2pprI基因小鼠活体电转染

转基因组小鼠于照射前24h，在小鼠股前肌肌肉注射自行构建的pCMV-HA-pprI质粒50μg/50μl TE液，应用优化的活体基因电转导技术，给予电场强度200v/cm、持续时间20ms和频率1Hz的电脉冲8个。

1.3小鼠急性重度放射损伤模型的制作

1.3.1中子辐射

采用四川绵阳中科院物理与化学研究所K-400型DT中子发生器，中子能量为14MeV，小鼠全身照射，吸收剂量分别为0.2Gy、0.6Gy、1.0Gy和2.0Gy，其中0.6Gy组分为单纯照射组与转基因药物组。

1.3.2γ射线照射

采用⁶⁰Coγ射线，小鼠全身照射，剂量率为1Gy/min，吸收剂量为6Gy。

1.4pprI基因小鼠活体电转染防治效果观察

1.4.1小鼠死亡率观察：死亡率观察组小鼠随机分成4组进行全身中子照射，吸收剂量和动物数量分别为0.2Gy8只、0.6Gy16只、1.0Gy8只和2.0Gy20只。照射后小鼠置于无菌室喂养，观察30天受照小鼠死亡的时间与数量，计算小鼠死亡率。不同剂量中子辐射所致小鼠死亡率的变化列于表1。

表1中子辐射小鼠死亡率的变化

由表1可见，小鼠30天死亡率随中子辐射全身吸收剂量的增加而增高。0.6Gy中子引起小鼠急性重度放射损伤，转基因组小鼠死亡率(12.5％)明显低于单纯照射组(37.5％)。2.0Gy照射组小鼠于照后第4、5天全部死亡。

1.4.2组织病理学检测

取单纯照射组、转基因组小鼠肝脏、肾脏、睾丸用10％中性甲醛固定，常规脱水，包埋，5μm切片，HE染色，光镜观察。

肝脏组织病理学变化：照后第1天，单纯照射组小鼠肝脏小叶中央静脉周围血窦出现充血、扩张，静脉壁未见明显变化，肝细胞出现变性并有少量坏死，第7天中央静脉充血显著，静脉壁开始有胶原纤维沉着，肝细胞出现大片变性、坏死，于照后第14天肝细胞坏死更加广泛，并出现纤维组织增生。转基因组于照后第1天出现肝细胞水肿，与对照组相比坏死程度明显轻微，坏死极少，第7天水肿加重，有较少坏死，第14天开始明显恢复，并于第28天基本恢复正常。

肾脏组织病理学变化：照后第1天，单纯照射组小鼠肾脏未见明显病理学变化，肾小球形态规整，肾小管未见异常，髓质内亦未见充血或水肿。第7天，肾小球毛细血管出现轻微玻璃样变，小球囊腔内亦见少量液体，集合管中亦出现玻璃样变，髓质有水肿。照后第14天，肾脏各部分病理变化较第七天明显加重，肾小球毛细血管出现明显的玻璃样变并伴血浆侵润，髓质水肿加重。转基因组小鼠照后第1天亦未见有明显病理改变，第7天肾小球毛细血管出现玻璃样变，但较单纯照射组为轻，髓质未见水肿，第14天开始出现恢复，至第28天基本恢复正常。

1.4.3外周血白细胞计数观察

小鼠眼球取血，置于含有EDTA的采血管中，取20ul加入0.38ml 2％的乙酸中，混匀、灌板并静置5min，低倍镜下进行白细胞计数。

各实验组小鼠外周血白细胞总数的变化列于表2。

表2.小鼠照后不同时间外周血白细胞的变化(x±s)

注：与对照组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与单纯对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

由表2可见，照后第一天单纯照射组与转基因组白细胞计数出现明显降低，照后第七天降至最低值，照后第14天开始出现恢复。各时间点转基因组白细胞计数均高于单纯照射组，其中第1、14、21和28天具有非常显著性统计学差异(P＜0.01)。

1.4.4外周血白细胞计数以及淋巴细胞分类观察

小鼠眼球取血，制备血涂片，应用瑞氏染液染色，镜下进行淋巴细胞分类计数。中子照射后不同时间外周血淋巴细胞百分率的变化列于表3。

表3.小鼠照后不同时间外周血淋巴细胞百分率的变化(x±s)

注：与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与单纯对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

由表3可见，与对照组比较，在观察期内单纯照射组和转基因组淋巴细胞百分率均显著降低，具有显著性或非常显著性统计学差异(P＜0.05或0.01)。单纯照射组和转基因组淋巴细胞百分率于照后第1天降低，第7天降至最低值，14天开始缓慢恢复。与单纯照射组比较，转基因组淋巴细胞百分率均高于单纯照射组，但未见统计学差异(P＞0.05)。

1.4.5骨髓细胞、脾脏与胸腺淋巴细胞凋亡检测

小鼠处死取脾和胸腺，用梳刮法制备淋巴细胞单细胞悬液。取股骨，用1ml注射器用PBS冲洗骨髓腔，制备骨髓细胞单细胞悬液。细胞悬液离心(1500rpm，10min)，弃去上清，用冷PBS重新悬浮细胞。再次离心细胞，弃去上清，使用1x Annexin-V结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁶个/ml。每100ul的细胞悬液加5ul的Alexa Fluor488 Annexin-V和1ul PI工作液(100ug/ml)，室温孵育15min。细胞悬液中加入400ul的1x Annexin-V结合缓冲液，置冰上轻轻混匀样品。应用流式细胞仪(美国BD公司)进行凋亡检测，结果以细胞凋亡率(％)表示。

各实验组小鼠中子照后骨髓细胞凋亡率的变化列于表4。

表4小鼠照后不同时间骨髓细胞凋亡率的变化(x±s)

注：与对照组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与单纯对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

由表4可见，与对照组比较，中子照后第1天，单纯照射组骨髓细胞凋亡率出现显著增高(p＜0.01)，而转基因组凋亡率轻微升高但无统计学差异；照后第7天，单纯照射组与转基因组骨髓细胞凋亡率均显著增高并达到最大值；照后14d，单纯照射组与转基因组骨髓细胞凋亡逐渐减低；第28d，转基因组骨髓细胞凋亡率显著降低，与对照组无统计学差异。转基因组骨髓细胞凋亡率始终低于单纯照射组，具有显著或非常显著性统计学差异(p＜0.05～0.01)。

各实验组小鼠中子照后脾细胞凋亡率的变化列于表5。

表5.小鼠中子照后不同时间脾细胞凋亡率的变化(x±s)

注：与对照组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与单纯对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

由表5可见，中子照后1-28天，单纯照射组和转基因组脾淋巴细胞凋亡率与对照组比较显著增高，具有非常显著性统计学差异(p＜0.01)，照后第7天，凋亡率均达到最大值。与单纯照射组比较，转基因组脾淋巴细胞凋亡率显著降低，始终维持在一个较低的水平，具有非常显著性统计学差异(p＜0.01)。

各实验组小鼠中子照射后胸腺细胞凋亡率的变化列于表6。

表6.小鼠中子照后不同时间胸腺细胞调亡率的变化(x±s)

注：与对照组相比^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01；与单纯对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

由表6可见，与前述骨髓细胞以及脾脏淋巴细胞相比，胸腺淋巴细胞凋亡率显著增高。在照后第1天，单纯照射组胸腺淋巴细胞凋亡率即出现明显增高，并于第7天达到最大值，第14天出现回落，至第28天时仍维持在一个相对较高的水平。而转基因组胸腺淋巴细胞第1天凋亡率稍低于对照组，在第7天时开始出现明显升高，而后逐渐下降，第28天时恢复至较低的水平。在整个实验过程中，转基因组胸腺淋巴细胞凋亡率始终低于单纯照射组，具有显著或非常显著性统计学差异(p＜0.05～0.01)。

注：实验中统计学分析是使用SAS 9.0软件进行两样本均数差别的t检验。

以上实施例证明了：在中子或γ射线引起的急性重度放射损伤中，将pprI基因载体作为药物通过活体电转染进入小鼠体内，能有效降低小鼠死亡率，显著减少白细胞下降的数量和程度，显著降低骨髓细胞、脾脏与胸腺淋巴细胞凋亡率，可明显减轻肝脏和肾脏水肿与坏死的范围和程度，促进肝肾组织的修复，对重度放射损伤具有显著的抗放和治疗作用。

SEQUENCE LISTING

<110>苏州大学

<120>一种含有原核基因pprI的真核重组质粒及其用途

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>853

<212>DNA

<213>抗辐射菌(Deinococcus radiodurans)

<400>1

tggggatggg gagtggtact tctgctctaa agctgcggaa ttgtacccgc gggcccacca 60

tgtacccata cgatgttcca gattacgctc ttatggccat ggaggcccga attcccagtg 120

ccaacgtcag ccccccttgc ccctctgggg taaggggcgg ggggatgggg ccaaaagcta 180

aagctgaagc ctccaagccc cacccccaaa tccctgttaa gctcccattc gtgaccgccc 240

ccgacgccct cgccgccgcc aaagccagga tgcgcgacct ggcggcggcc tacgtggcgg 300

ccctgcccgg acgcgacacc cacagcctga tggcgggggt gcccggcgta gacctcaaat 360

tcatgccgct cggctggcgc gacggggcgt tcgaccccga gcacaacgtc atcctcatca 420

actcggcggc ccgccccgaa cgccagcgct tcaccctcgc ccacgaaatc gggcacgcga 480

ttttactcgg cgacgacgac ctgctctccg acatccacga cgcctacgag ggcgagcggc 540

tcgaacaggt catcgaaacg ctgtgcaacg tggcggcggc ggcgattttg atgcccgaac 600

ccgtcatcgc ggaaatgctg gaacgcttcg gccccaccgg gcgcgccctc gccgaactcg 660

ccaagcgggc cgaagtcagc gcgtcgtcgg cgctctacgc cctgaccgag cagaccccgg 720

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acgaggacgc tggcccaagc acagaaagag tcctgacggt ccgcgccagc agctcgacgc 840

ggggcgtcaa gta                                                    853

<210>2

<211>845

<212>DNA

<213>抗辐射菌(Deinococcus radiodurans)

<400>2

atttccaaaa ttaaagcatt ttttttcctg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 60

aatgtatctt accatgtctg gatccccgcg gccgcggtac ctcgagtttc actgtgcagc 120

gtcctgcggc tcgtcccggt cggcctgctc gctgtccttg cggcccaggc gggcggggtc 180

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ggcaagcgcc gccgggtggt cggcgggtac cggcgtgccg ctcgccaggg tgtacttgac 360

gccccgcgtc gagctgctgg cgcggaccgt caggactttt tctgtgcttg ggccagcgtc 420

ctcgtcgctt gcggcctgct cacgcggagg cttgcccggc gcacagaccg cgtagatgac 480

gggcaccggg gtctgctcgg tcagggcgta gagcgccgac gacgcgctga cttcggcccg 540

cttggcgagt tcggcgaggg cgcgcccggt ggggccgaag cgttccagca tttccgcgat 600

gacgggttcg ggcatcaaaa tcgccgccgc cgccacgttg cacagcgttt cgatgacctg 660

ttcgagccgc tcgccctcgt aggcgtcgtg gatgtcggag agcaggtcgt cgtcgccgag 720

taaaatcgcg tgcccgattt cgtgggcgag ggtgaagcgc tggcgttcgg ggcgggccgc 780

cgagttgatg aggatgacgt tgtgctcggg gtcgaacgcc ccgtcgcgcc agccgagcgg 840

catga                                                             845

Claims (4)

1.一种大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌为DH5α/pCMV-HA-pprI，其保藏编号为：CCTCC NO：M208253。

2.一种重组质粒，其特征在于：所述重组载体为pCMV-HA-pprI，制备所述重组质粒的方法包括以下步骤：

(1)以5’-ATGCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTT-3’为上游引物，以5’-TCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTCGTCC-3’为下游引物，以D.radiodurans R1基因组为模板，PCR扩增得到pprI基因；

(2)回收步骤(1)所得PCR产物pprI基因，与pGEM-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑选阳性克隆，抽提质粒pGEM-T-pprI；

(3)以5’-TCGAATTCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTTGC-3’为上游引物，以5’-TTCTCGAGTTTCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTC-3’为下游引物，以测序正确的pGEM-T-pprI质粒为模板，应用PCR扩增，并割胶纯化回收目的片段；

(4)用EcoRI酶和XhoI酶对pprI片段及pCMV-HA载体进行双酶切，纯化酶切产物后，用T4连接酶将pprI片段与pCMV-HA载体连接得到pCMV-HA-pprI重组质粒。

3.权利要求2所述重组质粒在制备抗辐射损伤药物中的应用。

4.一种预防或治疗辐射损伤的药物，其特征在于：含有权利要求2所述重组质粒。

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