CN101993883A - 一种人LIGHT-Fc融合蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白的方法，步骤包括(1)构建重组表达质粒pPIC9K-LIGHT-Fc；(2)表达人LIGHT-Fc融合蛋白酵母工程菌的制备及筛选；(3)人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定。本发明弥补了传统人LIGHT制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化人LIGHT蛋白的生产，则具有操作简单，原料生物体生长周期短，生产规模大(可以高密度发酵)，提取成本低，产物活性高等优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

Description

一种人LIGHT-Fc融合蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程药物领域，具体涉及重组质粒LIGHT-Fc-pPIC9K的构建及LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达的方法。

背景技术

LIGHT(homologous to lymphotoxins exhibiting inducible expression andcompeting with herpes simplex virus glycoprotein D for herpesvirus entrymediator[HVEM]，a receptor expressed by T lymphocytes)最早是Mauri等在对单纯疱疹病毒入侵活化T细胞的研究中发现的，又称为HVEM-L(herpesvirus entrymediator-ligand)，属于TNF超家族的第14个成员(TNFSF14)。目前发现它有3个受体：HVEM、LTβR及TR6。LIGHT通过与这3个受体相互作用而发挥不同的生物学功能。其中HVEM主要在T细胞上表达，与LIGHT结合后可以共刺激T细胞活化并调节T细胞免疫应答，介导同种异体移植排斥反应。LTβR主要在非淋巴细胞如上皮细胞和基质细胞上表达，LIGHT-LTβR信号途径可以诱导细胞凋亡，促进多种细胞因子产生，参与淋巴结的发生发育以及二级淋巴组织结构和功能的恢复。TR6是LIGHT的一个可溶性受体，它的mRNA在人体许多正常组织如胃、脊髓、结肠、淋巴结、脾都有高表达，但在胸腺中表达很少，在外周血淋巴细胞中不表达。TR6通过竞争结合LIGHT，抑制LIGHT与HVEM或LTβR的相互作用，从而干扰或阻断LIGHT-HVEM及LIGHT-LTβR所引发的生物学效应。另外，TR6还可以与FasL竞争性结合以阻断其诱导的细胞凋亡，从而有助于肿瘤免疫逃逸及自身免疫病的发生。因此，LIGHT在肿瘤等多种免疫相关疾病中发挥着非常重要的作用，有很大的应用前景，克隆LIGHT基因并获得重组蛋白对其生物学功能的研究具有重要意义。

毕赤酵母是一种嗜甲醇酵母，能以甲醇为唯一碳源，是继酿酒酵母之后发展起来的一种新型酵母表达系统，毕赤酵母能在体外大规模高密度发酵，并受醇氧化酶强启动子的控制，在甲醇存在条件下诱导表达，使表达量大幅度提高，并能精密控制；另外，酵母属于真核生物，对表达的蛋白质能进行如：蛋白质的裂解、二硫键的形成等翻译后的加工、修饰，并具有适于真核基因表达产物正确折叠的细胞内环境和糖基化系统，表达产物以活性形式存在，因此，很多在大肠杆菌中以非活性的包涵体形式存在的蛋白质，在毕赤酵母中可以以活性蛋白形式得到表达；毕赤酵母还能很好的分泌外源蛋白，几乎不受分子量限制，且其自身蛋白很少分泌到培养基中，为后续的纯化带来了极大的方便。

目前，在原核细胞和哺乳动物细胞中表达人LIGHT蛋白的方式已有报道，但尚未有人在酵母中进行尝试。探索人LIGHT在毕赤酵母中的表达条件，寻找一种更为高效、简单、大规模易工业化的LIGHT蛋白制备方式极为必要。

发明内容

本发明的目的在于运用毕赤酵母表达系统获得人LIGHT-Fc融合蛋白，为人LIGHT蛋白的生物学功能及肿瘤免疫治疗的研究提供一种新型的生物制剂。

本发明所提供的获取人LIGHT-Fc融合蛋白的方法，包括以下步骤：

1、重组质粒LIGHT-Fc-pPIC9K的构建

(1)人LIGHT胞外段cDNA的PCR体外扩增

根据GenBank公布的人LIGHT基因序列设计如下引物：

Primer 1：5′-CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG-3′(划线部分为EcoR I酶切位点，178-197)

Primer 2：5′-CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT-3′(划线部分为BamH I酶切位点，701-720)

以pET32a-LIGHT重组质粒为模板，进行PCR反应扩增人LIGHT胞外段基因。

(2)将含Fc片段的重组质粒pKS-IL-15-Fc用EcoR I和BamH I双酶切后回收大片段(含pKS载体部分和Fc片段)，与用EcoR I和BamH I双酶切后的PCR产物于16℃过夜连接，经转化和酶切鉴定后得到pKS-LIGHT-Fc重组质粒。

(3)EcoR I和Not I双酶切pKS-LIGHT-Fc重组质粒回收LIGHT-Fc融合基因，与用相同限制性内切酶双酶切的pPIC9K质粒于16℃过夜连接，酶切鉴定及测序正确的重组质粒命名为：pPIC9K-LIGHT-Fc。

2、人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

①将构建的重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc用Sal I酶切线性化，同时将空载体pPIC9K相同酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中。电转化GS115感受态细胞，涂布MD平板，所得的his+转化子又涂布含不同浓度G418的YPD平板，获得高G418抗性的阳性克隆。

②提取多拷贝转化子的基因组，以基因组为模板，PCR扩增其Aox1基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定，仅出现一条带(1726bp)者为甲醇利用慢型(Mut^s)，出现两条带(上述条带及2.2Kb条带)者为甲醇利用快型(Mut⁺)。

3、人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达

(1)在毕赤酵母中诱导表达LIGHT-Fc融合蛋白

将筛选出的重组子接种5m1YPD试管，30℃，250rpm振荡培养16-18h，再以1％接种量接种至20mL BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养至OD600＝2-6，离心收集菌体，用等体积的BMMY培养基重悬(若为Mut⁺型转化子，则加入等体积的BMMY培养基，若为Mut^s型转化子，则加入1/5倍体积的BMMY培养基)，30℃，250rpm振荡培养96h，每隔24h补加甲醇至0.5％，分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取1mL培养基分析表达水平，以确定最佳收菌时间。

(2)LIGHT-Fc融合蛋白的鉴定

①抽提诱导后酵母菌体的总RNA，以Primer 1、Primer 2为引物进行RT-PCR反应。

②重组子经过甲醇诱导后，收集其培养基，加入上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳。

③以鼠抗人LIGHT血清为一抗，以HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，Western Blot鉴定人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重组子中的表达。

本发明所用的酵母电转化的条件为：电压1500V，电容25uF，电阻200。

本发明进行多拷贝转化子筛选时所用的G418的最大浓度为：4.0mg/ml。

本发明中制备人LIGHT-Fc融合蛋白的方法具有操作简单、成本低、所表达的蛋白能进行正确的加工、修饰，从而表达具有完整生物活性蛋白的特点。分泌表达的产物中杂蛋白少，易于对目的蛋白的分离纯化。而且，融合蛋白中的人类免疫球蛋白Fc片段既不影响LIGHT蛋白的生物学活性，又可使融合蛋白不容易被蛋白酶降解，从而在体内外应用过程中具有较好的稳定性。

附图说明

图1为重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc构建流程图

图2为重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc的酶切鉴定图(EcoR I/BamH I)，图中：1为DL 2000分子量标准；2为EcoR I/BamH I双酶切后的pPIC9K-LIGHT-Fc；3为未酶切的pPIC9K-LIGHT-Fc。

图3为重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc的酶切鉴定图(EcoR I/Not I)，图中：1为DL 2000分子量标准；2为EcoR I/Not I双酶切后的pPIC9K-LIGHT-Fc；3为未酶切的pPIC9K-LIGHT-Fc。

图4为酵母转化子的表型鉴定图，图中：1为500bp DNA Ladder；2为未转化GS115的鉴定结果；3为GS115/pPIC9K转化子的鉴定结果；4～13为GS115/pPIC9K-LIGHT-Fc转化子的鉴定结果。

图5为酵母转化子表达的RT-PCR鉴定结果，图中：1为DL 2000分子量标准；2为GS115/pPIC9K转化子的鉴定结果；3为GS115/pPIC9K-LIGHT-Fc转化子的鉴定结果。

图6为酵母表达的SDS-PAGE分析图，图中：1为蛋白质分子量标准；2为GS115空菌体的分析结果；3为GS115/pPIC9K转化子的分析结果；4为GS115/pPIC9K-LIGHT-Fc转化子的分析结果。

图7为酵母表达产物的Western blot分析图，图中：1为蛋白质分子量标准；2为GS115空菌体的分析结果；3为GS115/pPIC9K转化子的分析结果；4为GS115/pPIC9K-LIGHT-Fc转化子的分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

重组质粒LIGHT-Fc-pPIC9K的构建流程图如图1所示，具体步骤如下：1.根据Genebank公布的人LIGHT基因序列设计如下引物：

Primer 1：5′-CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG-3′(划线部分为EcoR I酶切位点，178-197)

Primer 2：5′-CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT-3′(划线部分为BamH I酶切位点，701-720)

以pET32a-LIGHT重组质粒为模板，以Primer 1和Primer 2分别为上下游引物进行PCR反应。

反应程序：95℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环后，72℃继续延伸10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收并纯化，得到5′端为EcoR I、3′端为BamH I酶切位点的PCR产物。2.将含Fc片段的重组质粒pKS-IL-15-Fc用EcoR I和BamH I双酶切后回收大片段(含pKS载体部分和Fc片段)，与用EcoR I和BamH I双酶切后的PCR产物于16℃过夜连接，经转化和酶切鉴定后得到pKS-LIGHT-Fc重组质粒。3.EcoR I和Not I双酶切pKS-LIGHT-Fc重组质粒回收LIGHT-Fc融合基因，与用相同限制性内切酶双酶切的pPIC9K质粒于16℃过夜连接，酶切鉴定及测序正确的重组质粒命名为：pPIC9K-LIGHT-Fc。

经双酶切鉴定所构建的重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc正确(图2和图3)，经基因测序分析证实重组质粒中LIGHT基因序列与GenBank公布的基因序列(AF036581)一致。

实施例2

将实施例1中所构建的重组质粒转化毕赤酵母感受态并筛选多拷贝转化子，具体步骤如下：

1.制备感受态毕赤酵母GS115

(1)取冻存的GS115酵母菌株，在YPD平板上划线，30℃静置培养36-48h待其长出单克隆菌落。

(2)挑单克隆菌落接种至5mLYPD培养基中，30℃，250rpm振荡培养12-16h。

(3)取0.2mL菌液转接至100mL YPD培养基中，30℃，250rpm振荡培养12-16h，至OD600＝1.3-1.5。

(4)4℃、1500rpm离心5min，弃上清，加100mL冰预冷的无菌双蒸水重悬沉淀。

(5)4℃、1500rpm离心5min，弃上清，加50mL冰预冷的无菌双蒸水重悬沉淀。

(6)4℃、1500rpm离心5min，弃上清，加5mL冰预冷的1mol/L山梨醇重悬沉淀。

(7)4℃、1500rpm离心5min，弃上清，加0.2mL冰预冷的1mol/L山梨醇重悬沉淀，冰浴备用。

2.重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc的预处理

(1)用Sal I酶切重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc，使其完全线性化。酶切后取3μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

(2)线性化质粒去磷酸化处理，于37℃水浴30min。

(3)线性化质粒的纯化：

a)加入等体积的酚/氯仿抽提2次。

b)入等体积的氯仿抽提1次。

c)加入2.5倍的冷乙醇，混匀，-20℃下放置30-60min。

d)12000rpm离心10min，弃上清。沉淀用200ul 70％冷乙醇洗净，减压干燥。

e)加20μl以下的TE缓冲液溶解沉淀。

3.电转化毕赤酵母感受态菌

(1)取10μl上述线性化重组质粒(10-20ug)，加入80μl感受态毕赤酵母GS115，混匀后转入冰冷的0.2cm电转化杯中，冰浴10min。

(2)电击：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω。

(3)电击一次后，立即加入1ml 1mol/L山梨醇，混匀。

(4)取转化液，涂布MD平板。30℃静置培养48h至长出单克隆菌落。

4.筛选多拷贝转化子

(1)在MD平板上挑单克隆接种至96孔细胞培养板中，每孔200μl YPD培养基，30℃静置培养24h。

(2)取10μl菌液接种至新的96孔细胞培养板中，每孔加190μl YPD培养基，30℃静置培养24h。

(3)重复上步操作一次。

(4)取2μl菌液分别接种至含0、0.5、1.0、2.0、4.0mg/ml G418的YPD平板上，30℃静置培养至长出单克隆菌落。

5.转化子表型鉴定

(1)转化子酵母基因组的抽提

a)在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆至5ml YPD液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养12-16h。

b)取1ml菌液，2500rpm离心5min。

c)弃上清，500μl PBS悬浮沉淀，2500rpm离心3min。

d)100μl TE悬浮沉淀，煮沸10min。

e)-80℃冷冻30min。

f)再次煮沸10min。

g)1500rpm离心5min，取上清。

(2)PCR

Primer 3：5’-GAC TGG TTC CAA TTG ACAAGC-3’(5’AOX1 Primer)

Primer 4：5’-GCAAAT GGC ATT CTG ACA TCC-3’(3’AOX1 Primer)

以上一步得到的酵母基因组为模板，以Primer 3、Primer 4为引物进行PCR反应。反应程序：95℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃3min，30个循环后，72℃继续延伸10min。

扩增结束后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定转化子表型(见图4所示)，仅出现一条带(1726bp)者为甲醇利用慢型(Mut^s)，出现两条带(上述条带及2.2Kb条带)者为甲醇利用快型(Mut⁺)。

实施例3

将实施例2经G418筛选和表型鉴定为阳性的酵母转化子在甲酵诱导下表达LIGHT-Fc融合蛋白，具体步骤如下：

1.在毕赤酵母中诱导表达LIGHT-Fc融合蛋白

(1)挑取单克隆，接种至5ml YPD培养基中，30℃，250rpm振荡培养16-18h。

(2)取200μl菌液接种于20mL BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝2-6。

(3)室温，1500-3000rpm离心5min，去上清。

(4)用无菌水洗涤菌体沉淀一次。

(5)用BMMY培养基重悬菌体沉淀(若为Mut⁺型转化子，则加入等体积的BMMY培养基，若为Mut^s型转化子，则加入1/5倍体积的BMMY培养基)，30℃，250rpm振荡培养96h，每隔24h补加甲醇一次。

(6)分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取1mL培养基至Ependorf管中，离心，分离培养及和菌体沉淀，分析表达水平，以确定收集菌体的最佳时间。

2.LIGHT-Fc融合蛋白表达情况的鉴定

(1)Trizol法抽提酵母重组子的总RNA，以oligo dT(20)为引物进行反转录，并以Primer 1和Primer 2为引物进行PCR反应，若含有LIGHT片断，则说明目的基因可以在酵母中进行转录反应。

(2)酵母重组子经过诱导表达后，收集培养基，加入SDS上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳分析。

(3)以鼠抗人LIGHT血清为一抗，以HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，WesternBlot鉴定人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重组子中的表达。

RT-PCR结果显示，有一特异性DNA条带出现(见图5所示)。SDS-PAGE检测结果显示，在相对分子量45KD～66.2KD之间有一特异性条带(见图6所示)，与预期融合蛋白的分子量相同。Western blot结果显示，该蛋白具有很好的特异性，可与鼠抗人LIGHT抗体发生特异性结合(见图7所示)，证实该表达蛋白是LIGHT-Fc融合蛋白。

 

核苷酸序列表

<110>华东师范大学

<120>一种人LIGHT-Fc融合蛋白的制备方法

 

<160>4

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>根据GenBank提供的人LIGHT的基因序列设计和人工合成而得，用作引

     物。

 

<400>1

ccggaattcc agctgcactg gcgtctagg 29

 

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据GenBank提供的人LIGHT的基因序列设计和人工合成而得，用作引

     物。

 

<400>2

cgcggatccc accatgaaag ccccgaagt 29

 

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>根据毕赤酵母AOX1的基因序列设计和人工合成而得，用作引物。

 

<400>3

gactggttcc aattgacaag c 21

 

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据毕赤酵母AOX1的基因序列设计和人工合成而得，用作引物。

 

<400>4

gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (3)

1.一种人LIGHT-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc的构建

①人LIGHT胞外段cDNA的PCR扩增

根据GenBank公布的人LIGHT基因序列设计如下引物：

Primer 1：5′-CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG-3′，划线部分为EcoR I酶切位点，178-197

Primer 2：5′-CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT-3′，划线部分为BamH I酶切位点，701-720

以pET32a-LIGHT重组质粒为模板，进行PCR反应扩增人LIGHT胞外段基因；

②将含Fc片段的重组质粒pKS-IL-15-Fc用EcoR I和BamH I双酶切后回收含pKS载体和Fc的大片段，与用EcoR I和BamH I双酶切后的PCR产物于16℃过夜连接，经转化和酶切鉴定后得到pKS-LIGHT-Fc重组质粒；

③EcoR I和Not I双酶切pKS-LIGHT-Fc重组质粒回收LIGHT-Fc融合基因，与用相同限制性内切酶双酶切的pPIC9K质粒于16℃过夜连接，酶切鉴定及测序正确的重组质粒命名为：pPIC9K-LIGHT-Fc；

(2)人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

①将构建的重组质粒pPIC9K-LIGHT-Fc用Sal I酶切线性化，同时将空载体pPIC9K相同酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；电转化GS115感受态细胞，涂布MD平板，所得的his+转化子又涂布含不同浓度G418的YPD平板，获得高G418抗性的阳性克隆；

②提取多拷贝转化子的基因组，以基因组为模板，PCR扩增其Aox1基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定，仅出现一1726bp条带者为甲醇利用慢型，即Mut^s型，出现上述条带及一2.2Kb条带者为甲醇利用快型，即Mut⁺型；

(3)人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达

①在毕赤酵母中诱导表达LIGHT-Fc融合蛋白

将筛选出的重组子接种5ml YPD试管，30℃，250rpm振荡培养16-18h，再以1％接种量接种至20mL BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝2-6，离心收集菌体。若为Mut⁺型转化子，则加入等体积的BMMY培养基重悬，若为Mut^s型转化子，则加入1/5倍体积的BMMY培养基重悬；30℃，250rpm振荡培养96h，每隔24h补加甲醇至0.5％，分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取1mL培养基分析表达水平，以确定最佳收菌时间；

②LIGHT-Fc融合蛋白的鉴定

A)抽提诱导后酵母菌体的总RNA，以Primer 1、Primer 2为引物进行RT-PCR反应；

B)重组子经过甲醇诱导后，收集其培养基，加入上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳；

C)以鼠抗人LIGHT血清为一抗，以HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，Western Blot鉴定人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重组子中的表达。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述酵母电转化的条件为：电压1500V，电容25uF，电阻200Ω。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述G418的最大浓度为：4.0mg/ml。

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