CN103146734B - 抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合基因HSP65-PEAⅠ，它是由结核杆菌热休克蛋白65的基因和PEA受体结合亚基基因连接制得的融合基因，用该基因表达的融合蛋白HSP65-PEAⅠ在不加任何佐剂的情况下免疫小鼠，3倍LD₅₀剂量PEA天然毒素攻毒，保护率均达到100%，5倍LD₅₀剂量攻毒，保护率均达到80%以上，家兔在三次免疫后，制造三度烧伤多器官功能衰竭动物模型，并人为感染绿脓杆菌PA103菌，免疫实验组10天内无多器官衰竭症状发生并全部存活；融合蛋白HSP65-PEAⅠ作为抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗，可用于创烧伤高危作业人员，特别是战前参战人员的预防或紧急免疫，预防绿脓杆菌感染，防止创烧伤感染多器官衰竭综合症和休克的发生，增加战场烧烫伤抢救成活率。

Description

抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗

技术领域

本发明属于生物工程及疾病防治领域，具体地涉及一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ，以及融合蛋白HSP65-PEAⅠ作为疫苗在防治绿脓杆菌感染，特别是预防烧烫伤感染多器官衰竭、休克中的应用。

背景技术

烧伤，是重要的战伤之一。不同国家军队，不同对手的战争，烧伤比例差别很大。美军在一、二次世界大战以及朝鲜战争、越南战争中，平均烧伤比例为总受伤人数的6%。第三世界国家军队由于面对大规模杀伤性武器如凝固汽油弹、白磷弹，烧伤比例要比美军高的多，可以达到16%。在现代高技术局部战争条件下，随着导弹、贫铀弹、燃料空气弹、联合攻击弹药、油气炸弹、微波武器等高压高温高爆性武器的大范围应用，参战人员烧伤发生率急剧增加，所以，对烧伤的有效救治，降低严重烧伤感染死亡率是战伤医学的一项重要任务。

烧伤引起伤员的免疫抑制状态，继发细菌感染，引起机体败血症，在细菌毒素和炎症反应的双重作用下，导致多器官衰竭，这是烧伤死亡的主要原因，严重烧伤抢救成功与否的关键之一是抗感染。其中烧伤感染中绿脓杆菌的感染最为突出和棘手，感染后细菌产生的毒素更是引起伤员休克和多器官衰竭致死的首要原因。战争恶劣条件下烧伤后严重感染致死形势则更为严峻，尤其是烧伤后感染绿脓杆菌，绿脓杆菌清创后检出率为2.7%，20天后检出率为34.4%，不仅检出率越来越高，而且抗药性也越来越强，致使临床对烧伤感染的治疗不能收到理想的效果，死亡率仍然很高。有调查显示，在烧伤患者中绿脓杆菌的检出率高居各种感染菌首位。此外，在严重呼吸道和泌尿道感染也很常见。

绿脓杆菌外毒素A（PEA）是引起伤员死亡的主要原因，识别和结合PEA的受体广泛存在于人体所有细胞上，可造成人体细胞大范围死亡，引起组织坏死、器官功能衰竭，最终导致伤员因肺脏、心脏、肾脏、肝脏等多系统器官衰竭（MODS）而死亡。

绿脓杆菌对人和各种动物均具有易感性，属人兽共患性病原菌，广泛分布于土壤、水和空气中，其生态多样性决定了它的代谢多样性。该菌属机会致病菌，常存在于动物和人的皮肤、呼吸道、消化道和泌尿道中，在正常防御能力机体中，绿脓杆菌作为常居菌与宿主共生，成为健康携带菌者，而不会发病，只有当宿主防御功能不健全或受损时，这种共生状态才会发生紊乱，发生异常增殖并具有致病性。严重烧伤、外科创伤或术后的免疫虚损宿主、插管治疗病人、癌症、器官移植病人、慢性消耗性疾病、原发或继发性免疫缺陷病人、中性粒细胞减少症、HIV、严重营养不良造成的免疫功能低下及广泛应用抗生素者以及新生儿、早产儿等免疫机能不健全者都易发生绿脓杆菌感染，广泛侵袭机体各个脏器组织，引起各种病变和炎症，甚至发生败血症。在对医院主要致病菌的调查中显示，绿脓杆菌位列第三位，仅次于大肠杆菌和克雷伯氏菌。绿脓杆菌感染人主要发生在大面积烧伤后的继发感染和囊性纤维化患者（CF），严重者可引起全身性败血症、脑膜炎或多器官衰竭，一旦发生败血症，其死亡率高达44%～81%，多器官衰竭达70%，整体死亡率高达50%。由于绿脓杆菌具有天然耐药性以及广谱抗生素的泛滥使用，使得多重耐药绿脓杆菌感染的情况日益严重。

绿脓杆菌菌能产生外毒素A（PEA）、内毒素(LPS)、外膜蛋白、纤毛、肠毒素、溶血酶、杀白细胞素、弹性蛋白酶、胶原酶、胰肽酶及多种胞外S、磷脂酶C（或白细胞素）等致病因子，能广泛侵袭机体各个脏器组织，引起各种病变和炎症。菌体崩解后释放出的内毒素，主要成分为毒力相对较弱的LPS，2～3mg才能致死20g体重小白鼠；另一种毒素为是一种溶血物质：磷脂酶C，它能给入侵的细菌提供营养，增强其毒力，用磷脂酶C注射小白鼠，24小时内可以将小鼠致死。PEA是该菌毒力最强的毒力因子，是一种致死性的外毒素，是其内毒素毒力的1万倍，PEA注入动物体后，其主要靶器官肝脏会出现细胞肿胀、脂肪变性及坏死性病变；其他脏器病变有肺出血和肾脏坏死等，其中以肝细胞坏死最为严重，使肝脏内组织病理学改变，诱导肝细胞凋亡。

绿脓杆菌外毒素A是绿脓杆菌的代谢产物，是一种热不稳定单链多肽分子，分子量为66KDa，毒力很强，用5～10倍LD50腹腔注射小白鼠可引起白细胞、血小板迅速减少，凝血时间延长，外周血液中消失的血小板沉积于肺中。PEA可用甲醛或戊二醛脱毒使其毒力减弱，作为类毒素防治绿脓杆菌感染的作用。近几年来，科学家们研究的焦点主要集中在PEA的分子结构与其毒力强弱的关系上，通过基因工程技术对外毒素A基因定点敲除的方式进行改造，研制无毒性或者毒性很弱的突变体，为外毒素疫苗的研究创造了良好的条件。在对PEA的分子结构与作用机制有一定研究的基础上，利用PEA的细胞毒性作用制成免疫毒素，作为治疗癌症的药物；人们又利用基因工程技术将其改造为具有医疗用途的蛋白质，利用PEA良好的免疫原性制备基因工程疫苗，防治绿脓杆菌感染；利用PEA的载体蛋白功能，可携带外源蛋白或DNA进入细胞中用于基因治疗；同时PEA也是优良的疫苗佐剂和疫苗载体，可以大大增强疫苗的免疫原性，然而绿脓杆菌菌株多，毒力差异大，GeneBank已发表的全长PEA序列只有三个(AEO04091，strainPA01；Cp000438，strainUCBpp-PA14；KO1397；strainPA103)，Blast序列比对分析结果显示，PEA碱基序列与氨基酸序列之间均存在明显差异。研究不同菌株间PEA碱基序列、分子结构和PEA蛋白生物活性的差异可以很好的揭示PEA结构与细胞毒性及免疫原性的关系，为PEA更好的应用于免疫毒素、疫苗研究和基因治疗打下了良好的基础。

绿脓杆菌外毒素A是一种外分泌性蛋白，属于细菌性ADP核糖基转移酶家族的一员，它与白喉毒素(DT)，霍乱毒素等一样。在菌体内以638个氨基酸的前体形式合成，经翻译加工后分泌至胞外，在氨基末端有25个氨基酸的高度疏水的先导肽，并以酶前体的形式（即检测不到其ADP-核糖基化活性）分泌到绿脓杆菌的周质空间内，在周质空间内被酶切后成为含有613个氨基酸的成熟毒素蛋白并分泌到细菌细胞外。成熟的PEA是由613个氨基酸组成，分子量是66.58KD，等电点是5.0，由三个结构域组成，当在酸性条件下时，由于毒素蛋白结构会受pH影响而伸长，使得酶切位点暴露出来，而能够被蛋白酶进行酶切，酶切后的部分包含第三结构域部分因为空间结构改变使得核糖基转移活性区域暴露而具有核糖基转移酶的活性，来催化NAD+和真核蛋白延长因子-2（EF-2）的核糖基化反应。在体内只有PEA进入动物细胞浆后才有活性，而在体外则需经过尿素（4.0mol/L）或二巯基乙醇（1%）处理后才能检测到活性。

PEA的编码结构基因经测定位于细菌染色体上，是单一顺反子。经X射线衍射晶体可知：PEA含有三个不同的结构域（Domain，D），即Domain I（受体结合区）、DomainⅡ（跨膜区）和DomainⅢ（催化区）。其中Domain I又包含Domain Ia和Domain Ib两部分，它们在空间结构上靠近，但在一级结构中并不相连。Domain Ia由第1～252位的氨基酸组成，DomainⅡ由第253～364位的氨基酸组成，DomainⅢ由第400～613位的氨基酸组成。Domain I位于PEA分子的氨基端（N端），占整个分子的1/3，呈一反向平行的β结构，由17个β片段组成。DomainⅡ由六个连续的α螺旋构成，其中前两个螺旋A与B之间有一个二硫键，即Cys265与Cys287；DomainⅢ位于羧基端，呈伸展的裂口状。

PEA含有8个Cys，按前后排列顺序依次两两形成四对二硫键，即Cys11与Cys15，Cys197与Cys214、Cys265与Cys287、Cys372与Cys379，其中两个在Domain I，一个在DomainⅡ，一个在DomainⅢ，DomainⅡ中的两个Cys之间存在一个类furin蛋白酶酶切位点。

缺失突变研究表明，Domain Ia为结合细胞功能（即与相应的受体结合，介导对真核细胞的识别）所不可缺少的部分，DomainⅡ有转位功能（即毒素跨越细胞膜，进入细胞浆介导毒素蛋白的移位），而DomainⅢ和Domain Ib的最后5个氨基酸所组成具有催化作用的多肽（亦即第400-613位氨基酸），具有ADP-核糖基化活性。

Domain I位于氨基末端，包括氨基酸残基1-252和365-399，分别称为亚单位Ia和Ib，形成逆平行的β折叠构象，在蛋白质结晶时，它们空间结构相互毗邻，但在氨基酸序列中两者分开，PEA的Domain Ia具有结合到细胞表面CD91受体上的功能，是其细胞毒性作用所必需的。Domain Ib的功能尚不清楚，可能与PEA的分子连接与调节作用有关，对敏感细胞的细胞膜受体有结合的功能；对PEA的体外分泌过程可能有促进作用。但缺失大部分氨基酸缺失对PEA的生物活性并无明显影响。

DomainⅡ较小，位于中心，包括氨基酸残基253-364，由6个连续的α螺旋组成，Huang等通过对DomainⅡ部分缺失突变研究证明，DomainⅡ是PEA进入细胞内时跨膜所必需的结构。在毒素分子结合到细胞表面后能够介导细胞内吞，跨膜转运PEA分子与细胞膜受体复合物，将PEA分子转移到细胞内，这个过程亦称为内化作用(endocytosis)，并且其上的类furin蛋白酶的酶切位点能够使其被切开以便于Domain Ⅲ发挥酶催化的功能。

Domain Ⅲ包括氨基酸残基400-613，第400-492位氨基酸亦是维持PEA分子ADP核糖基化转移酶活性所必需的部分。DomainⅢ的空间构象中有一条延伸的深沟，是PEA的催化中心，在毒素进入细胞后，能够通过转移NAD⁺上面的ADP基团转移到EF-2上面，完成核糖基转移酶活性，不可逆的将EF-2灭活，而抑制真核细胞蛋白质的合成，最终导致细胞死亡。第385-613位氨基酸序列对维持PEA分子的ADP核糖基化转移酶活性亦是必须的。DomainⅢ删除Glu553会消除ADP-核糖基酶活性形成无毒的PE（ntPE）；His426则是PEA结合eEF-2不可缺少的部分，因为当它与eEF-2的结合过程遭到破坏时可直接导致ADP-核糖基转移酶活性的丧失。

Chaudhary等研究发现，PEA的最后5个氨基酸即Arg609、Glu610、Asp611、Leu612、Lys613，缩写为REDLK，是其毒素作用所必需的。由于这一结构与内质网滞留序列Lys-Asp-Glu-Leu（简写为KDEL极其相似，所以在PEA的跨膜运输过程可引导加工后的PEA进入内质网。一旦发生突变或缺失，即使PE具有ADP-核糖基化活性，却对靶细胞无杀伤作用，所以说该结构对PEA的跨膜运输很重要。另外，Ogata等研究证明，由上述位点突变得到的无细胞毒素作用的PEA突变体均像天然PEA分子一样可结合靶细胞并发生内吞作用，生成28KD的N端片段和37KD的C端片段。但是，若将内质网滞留序列KDEL连接到上述无细胞毒素作用的PEA突变体的C末端即可恢复其细胞毒性作用。此外还有研究发现，霍乱毒素和大肠杆菌热毒素的C末端分别含有与内质网滞留序列KDEL相似的序列，即Lys-Asp-Glu-Leu和Arg-Asp-Glu-Leu，说明它们的细胞转位跨膜机很有可能与PEA相类似。

PEA的细胞毒作用与白喉毒素几乎相同。1972年，Pavlovskis首次报道了PEA的作用机理是PEA通过催化细胞内延长因子-2使核糖基化途径阻断细胞内的蛋白质合成从而杀死靶细胞。1977年，Iglewski等进一步发现，PEA是通过阻断细胞蛋白质合成肽链延长阶段实现阻断细胞蛋白质合成的。目前认为PEA的作用机理为：PEA分子的受体结合区与靶细胞表面特异性受体相结合，形成毒素-受体-膜复合物；在跨膜区的作用下，通过受体介导的内吞作用和内化内涵体(early endosome)毒素进入细胞。细胞膜内陷将复合物内化形成胞吞小泡即早期内涵体进入细胞浆，在早期内涵体氢离子泵作用下使胞内迅速酸化（一般为5.5左右），酸性环境对PEA的跨膜转运过程有促进作用，低pH值的内吞小泡对PEA的加工至关重要，也是PEA跨膜转运不可缺少的。毒素和插入的囊泡膜引起一个易位内结构域的构象变化，PEA分子中二硫键被断裂还原，毒素分子在酸性条件下肽链结构更加伸展变长并暴露出疏水区相关蛋白酶切位点，有利于其与细胞膜磷脂双层靠近、融合，最后，酶的活性毒素片段将被输送到靶细胞的胞质中；在类furin的作用下第Arg279、Gly280之间断裂，将PEA分成N端的28KD片段和C端37KD片段两部分。前者可进一步降解并产生25KD和18KD两部分，后者比较稳定，C末端形成的37KD分子片断被跨膜转运到高尔基复合体上，经穿梭泡携带至内质网，进而将37KD的分子片断分泌入胞浆。在胞浆内，该分子片断依靠末端特异的REDLK序列固定在肽链上，催化区在NAD⁺存在的条件下，表达出活化的ADP-核糖基化转移酶的活性，催化NAD+上的核糖体部分释放出ADP-核糖，并与EF-2的His进行共价结合发生催化反应，使EF-2被ADP-核糖基化而失活。

EF-2是真核生物细胞内蛋白质合成过程中肽链延长阶段的必须因子，使多肽转运RNA从80S核糖体P位点（氨酰位）转移到A位点（肽位），EF-2的失活将导致蛋白质合成过程中肽链延长被终止，最终导致靶细胞因蛋白质合成阻断死亡。

PEA除具有细胞毒性外，还具有较强的抗原性，经过脱毒改造的PEA细胞毒性会明显下降或消失，但其免疫原性基本保持不变，所以脱毒改造后的PEA常被作为疫苗佐剂和疫苗载体。过去人们常通过甲醛处理PEA来得到毒性降低的类毒素，进一步用做疫苗载体或佐剂，但由于以此方法获得的PEA常有毒副作用，所以人们尝试用基因工程技术改造并筛选出低毒突变体作为疫苗载体，进而结合多糖疫苗制成多糖蛋白结合苗。

PEA除具有“与抗体结合制成免疫重组毒素用于靶向治疗”以及“开发各种疫苗以预防和治疗绿脓杆菌感染”的用途外，在食品中绿脓杆菌的鉴定、癌症治疗及作为抗原携带蛋白生产去势疫苗等方面都有广泛应用，如在食品方面利用PCR鉴定技术、开发具有灵敏度高、特异性强的PEA酶标抗体试剂盒检测食品中绿脓杆菌的污染；利用重组DNA技术，把去毒性的PEA作为携带蛋白与促性腺素释放激素(GnRH) 接合，免疫动物能够产生很强的抗GnRH的抗体，抑制动物的性腺发育和生殖功能，与传统外科手术去势的方法相比较，去势疫苗不仅简单、方便、而且降低了对动物的伤害。

近年来随着绿脓杆菌病的不断报道，该病在国内外均已引起了广泛的重视，并在防治绿脓杆菌感染方面做了大量的工作，对绿脓杆菌基因组、蛋白组学及其抗原分子生物学等特点进一步深入，有效提高了绿脓杆菌感染的早期诊断和鉴别诊断，利用基因工程技术手段深入研究PEA的结构和功能，对PEA细胞毒性机理（如转位机理、受体的本质等）研究更加成熟，利用PEA构建重组毒素的研究有了很大进展。

绿脓杆菌感染治疗困难，其外膜通透性降低，对多种药物敏感性低，部分患者由于无药可用而死于绿脓杆菌感染。绿脓杆菌产生的多种β-内酰胺酶使其具有耐药性，如质粒介质的头孢菌素酶(AmpC)和金属酶等，使细胞外膜通透性降低及菌体蛋白结构与功能发生变化。

治疗和防止烧伤中绿脓杆菌的感染，目前常用的方法是抗生素法和毒素中和免疫疗法，毒素的免疫疗法分主动免疫和被动免疫。目前临床应用的主动免疫主要是绿脓杆菌菌苗，被动免疫是绿脓杆菌免疫球蛋白或高价免疫血清（或血浆）。美国、日本、苏联、法国和罗马尼亚等国家，先后报道了有关绿脓杆菌疫苗、超免疫血浆和高效价免疫球蛋白以及单克隆抗体的研究结果，但均没有真正实现大规模临床应用。时至近年人们抗菌时才重视细菌毒素的存在，PEA是其重要的致死性毒素，可造成低血压、中毒性休克和多系统器官功能衰竭，并有明显的致死作用，针对PEA的治疗方法也可分为主动免疫和被动免疫两种。但由于应用异源动物血清治疗，不可避免的造成严重过敏反应。

免疫佐剂是一种非特异性的免疫增强剂，其本身不具备免疫原性，但是可以增强机体对与其共同注入体内的抗原的免疫应答。例如，弗氏佐剂：弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂两种，可根据不同的免疫需求来应用，弗氏完全佐剂通常用于初始免疫，以后的加强免疫中只用弗氏不完全佐剂，抗原与佐剂的体积一般各占50%，最终所形成的混合物是典型的“油包水”乳胶混合体。弗氏佐剂属于含油佐剂，是目前应用最为广泛的实验用佐剂，它的优势在于具有较强的免疫增强效应，包括细胞免疫和体液免疫，虽然这类佐剂在提高抗体效价的幅度和免疫持久性方面，远优于铝佐剂，但产生不良反应严重，注射后常引起肉芽肿和无菌化脓，油长期储留于组织中不能及时代谢，易引起过敏反应，因此，此类佐剂只用于动物实验。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种融合基因HSP65-PEAⅠ及其表达的融合蛋白HSP65-PEAⅠ。

一种融合蛋白基因HSP65-PEAⅠ，它是由结核杆菌热休克蛋白65的基因HSP65和PEA受体结合亚基基因PEAⅠ顺序连接制得。

所述的PEA受体结合亚基基因PEAⅠ，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

所述的结核杆菌热休克蛋白65基因HSP65，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述的一种融合基因HSP65-PEAⅠ，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ，它是由所述的一种融合基因HSP65-PEA表达的蛋白。

一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

本发明的另一个目的是提供一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ制备方法，它包括以下步骤：

1）用引物：

Fh： GCCCATGGATGGCCAAGACAATTGCGTACGA  NcoI酶切位点

Rh：ACGAATTCTTAGCTAGCCATATGGAAATCCATGC   EcoRⅠ酶切位点

Fp： CGGAATTCCTGGTCGCCAGCCTCGGCC  EcoRⅠ酶切位点

Rp： CCCAAGCTTTTAGTCGACCTGGTTCCACGACAG HindⅢ酶切位点

以含有PEA受体结合亚基和HSP65基因片段为模板；分别扩增PEA受体结合亚基基因片段PEAⅠ和基因片段HSP65；

2）将质粒pET28a和基因片段HSP65用NcoI和EcoRⅠ双酶切， T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-HSP65，再将重组质粒pET28a-HSP65和目的基因（PEAⅠ）用EcoRⅠ和HindⅢ酶切连接，得重组质粒pET28a-HSP65-PEAⅠ；

3）重组质粒pET28a-HSP65-PEAⅠ转化至大肠杆菌中表达、纯化。

一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ疫苗，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示的融合蛋白。

一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ在制备预防绿浓杆菌感染及烧烫伤感染多器官衰竭药物中的应用。

本发明从细菌毒素入手，研究抗烧伤感染后多器官衰竭的主动免疫制剂，防止烧伤后伤员感染恶化，从根本上减少或杜绝感染后多器官衰竭综合症的发生，极大提高救治力度和康复水平。采用基因工程手段将序列高度保守、免疫原性突出的PEA受体结合亚基与有免疫增强作用的热休克蛋白65融合表达，构建表达了免疫原和佐剂一体的PEA受体结合区蛋白与结核杆菌热休克蛋白HSP65融合蛋白，该蛋白既具有诱导机体产生抗PEA抗体的能力，又具备免疫佐剂提高免疫效果的能力，在感染动物模型中有效抵御PEA的侵袭，且抗体滴度更高，安全性更好；通过动物攻毒保护实验、创烧伤感染多器官衰竭动物模型免疫保护实验和过敏原性实验，确定了免疫程序和剂量。利用基因工程表达的融合蛋白HSP65-PEAⅠ，不用加兔疫佐剂，免疫小鼠，产生抗体后，采用天然PEA攻毒，动物攻毒保护率达到100%。

高表达PEA受体结合亚基-热休克蛋白，发挥一体双效的作用，一方面高度保守的PEA受体结合亚基诱发机体产生针对多血清型的PEA抗体，另一方面利用热休克蛋白的免疫提呈增强、免疫原复性、体内蛋白保护、抗炎症扩散等作用刺激机体产生高效价抗体。制品与类毒素、灭活毒素相比去除了毒素的转膜亚基和毒性亚基，而保留了抗原性较好的受体结合亚基，在免疫效果不受影响的前提下提高了制品的安全性。另外，构建的HSP65-PEAⅠ具备导向性，一方面更好地发挥HSPA65的免疫识别功能，使抗原组分尽快大量集中在T细胞表面，使之产生强烈的免疫应答，另一方面，HSP65在前可以阻止-PEAⅠ与体细胞的结合作用，使之更好地发挥抗原作用。 

本发明提供的一种融合基因HSP65-PEAⅠ，它是由结核杆菌热休克蛋白65的基因和PEA受体结合亚基基因连接制得的融合基因，用该基因表达的融合蛋白HSP65-PEAⅠ在不加任何佐剂的情况下免疫小鼠， 3倍LD50剂量PEA天然毒素攻毒，保护率均达到100%，5倍LD₅₀剂量攻毒，保护率均达到80%以上，家兔在三次免疫后，制造三度烧伤多器官功能衰竭动物模型，并人为感染绿脓杆菌PA103菌，免疫实验组10天内无多器官衰竭症状发生并全部存活；融合蛋白HSP65-PEAⅠ作为抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗，可用于创烧伤高危作业人员，特别是战前参战人员的预防或紧急免疫，预防绿脓杆菌感染，防止创烧伤感染多器官衰竭综合症和休克的发生，增加战场烧烫伤抢救成活率。

附图说明

图1为PEAⅠ基因PCR产物电泳结果；其中1：PEAⅠ基因PCR产物；2：DNA Marker DL2000；

图2为PCR鉴定重组质粒pET28a-HSP65-PEAⅠ电泳结果图；其中：1：质粒以引物Fh、Rh扩增HSP65；2：质粒以引物Fp、Rp扩增PEAⅠ；3：DNA Marker DL2000；4质粒以引物Fh、Rp扩增HSP65-PEAⅠ；

图3为重组蛋白表达量鉴定：其中M：蛋白质marker；1：空白受体菌对照；2：诱导菌体；

图4为重组蛋白表达形式鉴定：其中1：空白对照受体菌超声上清；2：空白对照受体菌超声沉淀；3：诱导菌超声上清；4：诱导菌超声沉淀；

图5为重组蛋白HSP65-PEAⅠ纯化电泳结果图：其中1：初纯化蛋白；M：蛋白质marker；2：纯化的HSP65-PEAⅠ蛋白。

具体实施方式     

实施例1：PEAⅠ区基因扩增及与pET28a-HSP65连接

设计HSP65片段的引物，各引物内分别含有NcoI和EcoRⅠ酶切位点（下划线部分）及保护性碱基。合成PEAⅠ区的引物并分别设计EcoRI、HindⅢ内切酶识别位点，用于扩增PEAⅠ区基因片段。

Fh：5`GCCCATGGATGGCCAAGACAATTGCGTACGA3`，TM=68含NcoⅠ；

Rh：5`ACGAATTCTTAGCTAGCCATATGGAAATCCATGC3`，TM=68含EcoRⅠ。

Fp：5`CGGAATTCCTGGTCGCCAGCCTCGGCC3`，TM=68含EcoRⅠ；

Rp：5`CCCAAGCTTTTAGTCGACCTGGTTCCACGACAG,TM=68含HindⅢ；

以含有HSP65全基因序列（吉林大学白求恩医学院 王丽颖教授惠赠）为模板，用引物Fh和Rh扩增得到1600bp的目的基因序列，扩增产物和质粒pET28a用NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收目的片段， T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗性的琼脂平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒，得到重组质粒pET28a-HSP65；

以pET28c-B10（含有PEAⅠ区基因片段）为模板，Fp和Rp为引物进行扩增反应， PCR扩增得到的基因片断；进行琼脂糖凝胶电泳分析，可见到大小约为1000bp的目的基因（PEAⅠ），与预期的大小相符（见图1）；扩增产物和质粒pET28a-HSP65用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收目的片段， T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗性的琼脂平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒，得到重组质粒pET28a-HSP65-PEAⅠ。

PCR鉴定，以重组质粒为模板，分别以引物Fp、Rp扩增PEAⅠ片段；Fh、Rh扩增HSP65片段；Fh、Rp扩增HSP65-PEAⅠ片段，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1000bp、1600bp、2700bp片段，并进行序列的测定，证明PEA目的片段正确插入载体中，成功构建了重组质粒pET28a-HSP65-PEAⅠ（见图2）；

实施例2：发酵罐高密度发酵，利用发酵技术大规模制备工程菌，产量达到36.5g/L发酵液，于接种3小时菌体生长达到诱导最佳时机，诱导2小时后菌体开始产碱，蛋白开始大量表达，诱导5小时后放罐。

实施例3：重组蛋白HSP65-PEA的表达、纯化，及蛋白性质研究

将重组质粒pET28a-HSP65-PEAⅠ转化表达菌-大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白HSP65-PEAⅠ在93KD左右处有一明显表达带，大小与理论值相符，融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的33.3%（见图3。

将重组蛋白表达菌裂解液上清和沉淀同时做SDS-PAGE电泳，结果显示，目的蛋白绝大多数在上清中，沉淀中相应位置也存在少量目的蛋白，认为通过诱导条件的优化，在适宜的诱导环境下能够以可溶形式表达（见图4）。

融合蛋白HSP65-PEAⅠ的纯化，重组蛋白表达菌体经超声裂解，盐析分步沉淀法和层析纯化技术制备融合蛋白抗原，蛋白质纯度达到95%以上，热原质检测<20EU/mg，满足蛋白性质研究及动物攻毒保护性试验研究的需要（见图5）。

实施例4：攻毒保护性实验

PEA天然毒素的攻毒剂量研究，以96小时为攻毒全程时间，确定了PEA对昆明系纯种小鼠的LD₅₀为20μg/Kg体重。利用纯化的融合蛋白HSP65-PEAⅠ皮下注射免疫小鼠100μg/只，每两周加强免疫一次，共对小鼠进行了三次免疫，最后一次免疫1周后采用天然PEA攻毒，3倍LD₅₀剂量进行动物攻毒，保护率均达到100%，5倍LD₅₀剂量进行动物攻毒，保护率均达到80%以上，攻毒保护效果明显优于基因工程单纯PEAⅠ蛋白。

实施例5：动物模型：抗烧伤感染多器官衰竭实验

20只实验家兔随机分成两组，一组进行皮下注射融合蛋白HSP65-PEAⅠ免疫，1000μg/只，另一组作为对照，免疫组在三免后一周时抗体滴度达到1：4000，三免2周后两组动物均进行三度烧伤多器官功能衰竭（MODS）动物模型：兔乙醚吸入法全身麻醉后，火焰烧伤其背部及躯干两侧30秒，造成30%体表面积烧伤（三度30%TBSA），造模当天两组动物均进行人为感染绿脓杆菌PA103菌，每间隔一天检测对照组及烧伤组的平均动脉血压，中心静脉压、心输出量。测定血中肌酸磷酸激酶，谷丙转氨酶、尿素、血小板等反应心肺肝肾血液功能的一系列指标，分析两组家兔心肝肺肾功能下降达到衰竭程度以及存活率。试验结果表明，对照组在感染后4-10天相继出现多器官衰竭症状并死亡，10天以后对照组动物仅存活2只，免疫实验组动物10天内无多器官衰竭症状发生并全部存活，结果表明HSP65-PEAⅠ融合蛋白疫苗对动物抗烧伤感染多器官衰竭效果非常明显。

<110>   中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

 

<120>   抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗

 

<160>   4

 

<210>   1

<211>   1077

<212>   DNA

<213>   人工

 

<400>    1

 

atgggcagca  gccatcatca  tcatcatcac  agcagcggcc  tggtgccgcg  cggcagccat  60

atggctagca  tgactggtgg  acagcaaatg  ggtcggatcc  ccctggtcgc  cagcctcggc  120

ctgctcgccg  gcggctcgtc  cgcgtccgcc  gccgaggaag  ccttcgacct  ctggaacgaa  180

tgcgccaaag  cctgcgtgct  cgacctcaag  gacggcgtgc  gttccagccg  catgagcgtc  240

gacccggcca  tcgccgacac  caacggccag  ggcgtgctgc  actactccat  ggtcctggag  300

ggcggcaacg  acgcgctcaa  gctggccatc  gacaacgccc  tcagcatcac  cagcgacggc  360

ctgaccatcc  gcctcgaagg  cggcgtcgag  ccgaacaagc  cggtgcgcta  cagctacacg  420

cgccaggcgc  gcggcagttg  gtcgctgaac  tggctggtac  cgatcggcca  cgagaagccc  480

tcgaacatca  aggtgttcat  ccacgaactg  aacgccggca  accagctcag  ccacatgtcg  540

ccgatctaca  ccatcgagat  gggcgacgag  ttgctggcga  agctggcgcg  cgatgccacc  600

ttcttcgtca  gggcgcacga  gagcaacgag  atgcagccga  cgctcgccat  cagccatgcc  660

ggggtcagcg  tggtcatggc  ccagacccag  ccgcgccggg  aaaagcgctg  gagcgaatgg  720

gccagcggca  aggtgttgtg  cctgctcgac  ccgctggacg  gggtctacaa  ctacctcgcc  780

cagcaacgct  gcaacctcga  cgatacctgg  gaaggcaaga  tctaccgggt  gctcgccggc  840

aacccggcga  agcatgacct  ggacatcaaa  cccacggtca  tcagtcatcg  cctgcacttt  900

cccgagggcg  gcagcctggc  cgcgctgacc  gcgcaccagg  cttgccacct  gccgctggag  960

actttcaccc  gtcatcgcca  gccgcgcggc  tgggaacaac  tggagcagtg  cggctatccg  1020

gtgcagcggc  tggtcgccct  ctacctggcg  gcgcggctgt  cgtggaacca  ggtcgac     1077

 

<210>   2

<211>  1638

<212>   DNA

<213>   人工

 

<400>   2

 

atggccaaga  caattgcgta  cgacgaagag  gcccgtcgcg  gcctcgagcg  gggcttgaac  60

gccctcgccg  atgcggtaaa  ggtgacattg  ggccccaagg  gccgcaacgt  cgtcctggaa  120

aagaagtggg  gtgcccccac  gatcaccaac  gatggtgtgt  ccatcgccaa  ggagatcgag  180

ctggaggatc  cgtacgagaa  gatcggcgcc  gagctggtca  aagaggtagc  caagaagacc  240

gatgacgtcg  ccggtgacgg  caccacgacg  gccaccgtgc  tggcccaggc  gttggttcgc  300

gagggcctgc  gcaacgtcgc  ggccggcgcc  aacccgctcg  gtctcaaacg  cggcatcgaa  360

aaggccgtgg  agaaggtcac  cgagaccctg  ctcaagggcg  ccaaggaggt  cgagaccaag  420

gagcagattg  cggccaccgc  agcgatttcg  gcgggtgacc  agtccatcgg  tgacctgatc  480

gccgaggcga  tggacaaggt  gggcaacgag  ggcgtcatca  ccgtcgagga  gtccaacacc  540

tttgggctgc  agctcgagct  caccgagggt  atgcggttcg  acaagggcta  catctcgggg  600

tacttcgtga  ccgacccgga  gcgtcaggag  gcggtcctgg  aggaccccta  catcctgctg  660

gtcagctcca  aggtgtccac  tgtcaaggat  ctgctgccgc  tgctcgagaa  ggtcatcgga  720

gccggtaagc  cgctgctgat  catcgccgag  gacgtcgagg  gcgaggcgct  gtccaccctg  780

gtcgtcaaca  agatccgcgg  caccttcaag  tcggtggcgg  tcaaggctcc  cggcttcggc  840

gaccgccgca  aggcgatgct  gcaggatatg  gccattctca  ccggtggtca  ggtgatcagc  900

gaagaggtcg  gcctgacgct  ggagaacgcc  gacctgtcgc  tgctaggcaa  ggcccgcaag  960

gtcgtggtca  ccaaggacga  gaccaccatc  gtcgagggcg  ccggtgacac  cgacgccatc  1020

gccggacgag  tggcccagat  ccgccaggag  atcgagaaca  gcgactccga  ctacgaccgt  1080

gagaagctgc  aggagcggct  ggccaagctg  gccggtggtg  tcgcggtgat  caaggccggt  1140

gccgccaccg  aggtcgaact  caaggagcgc  aagcaccgca  tcgaggatgc  ggttcgcaat  1200

gccaaggccg  ccgtcgagga  gggcatcgtc  gccggtgggg  gtgtgacgct  gttgcaagcg  1260

gccccgaccc  tggacgagct  gaagctcgaa  ggcgacgagg  cgaccggcgc  caacatcgtg  1320

aaggtggcgc  tggaggcccc  gctgaagcag  atcgccttca  actccgggct  ggagccgggc  1380

gtggtggccg  agaaggtgcg  caacctgccg  gctggccacg  gactgaacgc  tcagaccggt  1440

gtctacgagg  atctgctcgc  tgccggcgtt  gctgacccgg  tcaaggtgac  ccgttcggcg  1500

ctgcagaatg  cggcgtccat  cgcggggctg  ttcctgacca  ccgaggccgt  cgttgccgac  1560

aagccggaaa  aggagaaggc  ttccgttccc  ggtggcggcg  acatgggtgg  catggatttc  1620

catatggcta  gcgaattc                                                    1638

 

<210>   3

<211>  2624

<212>   DNA

<213>   人工

 

<400>   3

 

ccatggccaa  gacaattgcg  tacgacgaag  aggcccgtcg  cggcctcgag  cggggcttga  60

acgccctcgc  cgatgcggta  aaggtgacat  tgggccccaa  gggccgcaac  gtcgtcctgg  120

aaaagaagtg  gggtgccccc  acgatcacca  acgatggtgt  gtccatcgcc  aaggagatcg  180

agctggagga  tccgtacgag  aagatcggcg  ccgagctggt  caaagaggta  gccaagaaga  240

ccgatgacgt  cgccggtgac  ggcaccacga  cggccaccgt  gctggcccag  gcgttggttc  300

gcgagggcct  gcgcaacgtc  gcggccggcg  ccaacccgct  cggtctcaaa  cgcggcatcg  360

aaaaggccgt  ggagaaggtc  accgagaccc  tgctcaaggg  cgccaaggag  gtcgagacca  420

aggagcagat  tgcggccacc  gcagcgattt  cggcgggtga  ccagtccatc  ggtgacctga  480

tcgccgaggc  gatggacaag  gtgggcaacg  agggcgtcat  caccgtcgag  gagtccaaca  540

cctttgggct  gcagctcgag  ctcaccgagg  gtatgcggtt  cgacaagggc  tacatctcgg  600

ggtacttcgt  gaccgacccg  gagcgtcagg  aggcggtcct  ggaggacccc  tacatcctgc  660

tggtcagctc  caaggtgtcc  actgtcaagg  atctgctgcc  gctgctcgag  aaggtcatcg  720

gagccggtaa  gccgctgctg  atcatcgccg  aggacgtcga  gggcgaggcg  ctgtccaccc  780

tggtcgtcaa  caagatccgc  ggcaccttca  agtcggtggc  ggtcaaggct  cccggcttcg  840

gcgaccgccg  caaggcgatg  ctgcaggata  tggccattct  caccggtggt  caggtgatca  900

gcgaagaggt  cggcctgacg  ctggagaacg  ccgacctgtc  gctgctaggc  aaggcccgca  960

aggtcgtggt  caccaaggac  gagaccacca  tcgtcgaggg  cgccggtgac  accgacgcca  1020

tcgccggacg  agtggcccag  atccgccagg  agatcgagaa  cagcgactcc  gactacgacc  1080

gtgagaagct  gcaggagcgg  ctggccaagc  tggccggtgg  tgtcgcggtg  atcaaggccg  1140

gtgccgccac  cgaggtcgaa  ctcaaggagc  gcaagcaccg  catcgaggat  gcggttcgca  1200

atgccaaggc  cgccgtcgag  gagggcatcg  tcgccggtgg  gggtgtgacg  ctgttgcaag  1260

cggccccgac  cctggacgag  ctgaagctcg  aaggcgacga  ggcgaccggc  gccaacatcg  1320

tgaaggtggc  gctggaggcc  ccgctgaagc  agatcgcctt  caactccggg  ctggagccgg  1380

gcgtggtggc  cgagaaggtg  cgcaacctgc  cggctggcca  cggactgaac  gctcagaccg  1440

gtgtctacga  ggatctgctc  gctgccggcg  ttgctgaccc  ggtcaaggtg  acccgttcgg  1500

cgctgcagaa  tgcggcgtcc  atcgcggggc  tgttcctgac  caccgaggcc  gtcgttgccg  1560

acaagccgga  aaaggagaag  gcttccgttc  ccggtggcgg  cgacatgggt  ggcatggatt  1620

tccatatggc  tagcgaattc  ctggtcgcca  gcctcggcct  gctcgccggc  ggctcgtccg  1680

cgtccgccgc  cgaggaagcc  ttcgacctct  ggaacgaatg  cgccaaagcc  tgcgtgctcg  1740

acctcaagga  cggcgtgcgt  tccagccgca  tgagcgtcga  cccggccatc  gccgacacca  1800

acggccaggg  cgtgctgcac  tactccatgg  tcctggaggg  cggcaacgac  gcgctcaagc  1860

tggccatcga  caacgccctc  agcatcacca  gcgacggcct  gaccatccgc  ctcgaaggcg  1920

gcgtcgagcc  gaacaagccg  gtgcgctaca  gctacacgcg  ccaggcgcgc  ggcagttggt  1980

cgctgaactg  gctggtaccg  atcggccacg  agaagccctc  gaacatcaag  gtgttcatcc  2040

acgaactgaa  cgccggcaac  cagctcagcc  acatgtcgcc  gatctacacc  atcgagatgg  2100

gcgacgagtt  gctggcgaag  ctggcgcgcg  atgccacctt  cttcgtcagg  gcgcacgaga  2160

gcaacgagat  gcagccgacg  ctcgccatca  gccatgccgg  ggtcagcgtg  gtcatggccc  2220

agacccagcc  gcgccgggaa  aagcgctgga  gcgaatgggc  cagcggcaag  gtgttgtgcc  2280

tgctcgaccc  gctggacggg  gtctacaact  acctcgccca  gcaacgctgc  aacctcgacg  2340

atacctggga  aggcaagatc  taccgggtgc  tcgccggcaa  cccggcgaag  catgacctgg  2400

acatcaaacc  cacggtcatc  agtcatcgcc  tgcactttcc  cgagggcggc  agcctggccg  2460

cgctgaccgc  gcaccaggct  tgccacctgc  cgctggagac  tttcacccgt  catcgccagc  2520

cgcgcggctg  ggaacaactg  gagcagtgcg  gctatccggt  gcagcggctg  gtcgccctct  2580

acctggcggc  gcggctgtcg  tggaaccagg  tcgactaaaa  gctt                    2624

 

<210>   4

<211>  871

<212>   PRT

<213>   人工

 

<400>   4

 

ID NO.4；

Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu

                 5                  10                  15

Arg Gly Leu Asn  Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro

             20                 25                  30

Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile

         35                 40                  45

Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro

     50                 55                  60 

Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr

 65                 70                  75               80

Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln

                85                  90               95

Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro

            100                 105             110              

Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu

        115                 120             125

Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala

130                 135                 140                 145 

Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile

                150                 155                 160

Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu

            165                 170                 175

Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg

        180                 185                 190

Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg

    195                 200                 205

Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys

210                 215                 220                 225

Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly

                230                 235                 240

Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala

                245                 250                 255

Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val

            260                 265                 270  

Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln

        275                 280                 285   

Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly

    290                 295                 300     

Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys

305                 310                 315                 320

Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp

               325                 330                 335

Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu

            340                 345                 350

Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala

        355                 360                 365

Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu

370                 375                 380

Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn

385                 390                 395                 400

Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr

                405                 410                 415

Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp

            420                 425                 430

Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu

        435                 440                 445

Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu

    450                 455                 460

Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly

465                 470                 475                 480    

Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val

                485                 490                 495    

Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu

            500                 505                 510    

Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser

        515                 520                 525    

Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe His Met Ala Ser

    530                 535                 540    

Glu Phe Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu Leu Ala Gly Gly Ser Ser Ala

545                 550                 555                560

Ser Ala Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala

                565                 570                 575

Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val

            580                 585                 590

Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser

        595                 600                 605

Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn

    610                 615                 620

Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly

625                 630                 635                 640

Val Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg

                645                 650                 655

Gly Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro

            660                 665                 670

Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu

        675                 680                 685

Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu

    690                 695                 700

Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser

705                 710                 715                 720

Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val

                725                 730                 735    

Val Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp

            740                 745                 750    

Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr

        755                  760                765    

Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly

    770                 775                 780    

Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp

785                 790                 795                 800

Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly

                805                 810                 815

Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu

            820                 825                 830

Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln

        835                 840                 845

Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg

    850                 855             860

Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp

865                 870 871

 

Claims (4)

1.一种融合基因HSP65-PEAⅠ，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

2.一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ，其特征在于：其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求2所述的一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ的制备方法，它包括以下步骤：

1）用引物：

Fh： GCCCATGGATGGCCAAGACAATTGCGTACGA  

Rh：ACGAATTCTTAGCTAGCCATATGGAAATCCATGC  

Fp： CGGAATTCCTGGTCGCCAGCCTCGGCC  

Rp： CCCAAGCTTTTAGTCGACCTGGTTCCACGACAG 

以含有PEA受体结合亚基和HSP65基因片段为模板；分别扩增PEA受体结合亚基基因片段PEAⅠ和基因片段HSP65；

2）将质粒pET28a和基因片段HSP65用NcoI和EcoRⅠ双酶切， T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-HSP65，再将重组质粒pET28a-HSP65和目的基因PEAⅠ用EcoRⅠ和HindⅢ酶切连接，得重组质粒pET28a-HSP65-PEAⅠ，

3）重组质粒pET28a-HSP65-PEAⅠ转化至大肠杆菌中表达、纯化。

4.权利要求1所述的一种融合基因HSP65-PEAⅠ或权利要求2所述的一种融合蛋白HSP65-PEAⅠ在制备防治绿脓杆菌感染导致的烧烫伤感染多器官衰竭药物中的应用。