CN1410127A - 一种卡介苗热休克蛋白65和多表位her-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗 - Google Patents

一种卡介苗热休克蛋白65和多表位her-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组蛋白疫苗,它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合而形成的融合蛋白,在应用于人体后可有效地预防和治疗乳腺癌。本发明还提供了编码该重组蛋白疫苗的基因。

Description

一种卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原 融合蛋白重组蛋白疫苗
发明领域
本发明涉及一种基因工程重组蛋白疫苗,特别是涉及一种预防和治疗人乳腺癌的疫苗。本发明还涉及编码该疫苗的基因。
发明背景
传统的乳腺癌治疗方法有手术、放射疗法、化学疗法、激素疗法和抗体疗法等几种,但这些方法均各自具有局限性。
HER-2蛋白(以下简称HER-2)由定位于人的第17号染色体的q21的c-erbB-2基因编码,是一种具有酪氨酸激酶的活性跨膜糖蛋白,和表皮生长因子受体有很高的同源性(Tadashi Yamamoto,et al.Similarity ofprotein encoded by the human c-erbB-2 gene to epidermal growth factorreceptor.Nature vol319 16 January 1986,230-234)。HER-2编码基因的扩增和过度表达可引起细胞的转化。在10-40%的人乳腺肿瘤细胞有HER2蛋白的过度表达,因此,以HER-2为靶点可能研制出预防和治疗乳腺癌的制剂。科学家已在这方面进行了多方面的研究。
Wei WZ等证明,用突变的重组HER-2蛋白免疫小鼠可使其在一定程度上获得抑制表达HER-2的小鼠乳腺细胞的生长的能力(Wei WZ,et al.Protection against mammary tumor growth by vaccination with full-length,modified human ErbB-2 DNA.Int J Cancer 1999 May 31;81(5):748-54)。Dakappagari NK等证明,用含B细胞表位的HER-2多肽免疫转基因小鼠,可激发其抑制过度表达HER-2的肿瘤细胞在其体内的生长的机制(Dakappagari NK,et al.Prevention of mammary tumors with a chimericHER2 B cell epitope peptide vaccine,Cancer Res2000 Jul 15;60(14):3782-9)。在临床实验中,HER2蛋白特异性单克隆抗体(Herceptin)对过度表达HER-2的乳腺腺瘤有明显的疗效(Dillman RO,Perceptions of Herceptin:amonoclonal antibody for the treatment of breast cancer.Cancer BiotherRadiopharm 1999 Feb;14(1):5-10)。用HER-2蛋白抗原肽(VLRENTSPK)装载的树突状细胞体外免疫可诱导CTL,此CTL可杀伤表达HLA-3和相应肿瘤抗原的肿瘤细胞(Kawashima I,et al.Identification of HLA-3-restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from carcinoembryonic antigen andHER-2/neu by primary in vitro immunization with peptide-pulsed dendriticcells.Cancer Res1999 Jan 15:59(2):431-5)。HLA A2限制性HER-2蛋白抗原肽(IISAVVGIL)在结直肠癌患者也可诱生出T细胞反应(Nagorsen D,et al.Natural T cell response against MHC class I epitopes of epithelial celladhesion molecule,her-2/neu,and caicinoembryonic antigen in patients withcolorectal cancer.Cancer Res2000 Sep 1;60(17):4850-4).
热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是存在于多种生物体内的一个分子伴侣蛋白质家族。在免疫应答的过程中,热休克蛋白可表现如下三种基本的功能:1、协助抗原性物质进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞;2、在抗原提呈细胞中和加工处理的抗原物质相互作用使之进入MHC I类抗原提呈途径,进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL);3、刺激树突状细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子。
近年的研究表明,HSP可使非共键结合的肿瘤抗原在抗原提呈细胞内加工后和MHC I类分子结合并提呈在其表面,有效地激活CTL去高效杀伤表达特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞。注射从自体肿瘤提取的热休克蛋白-抗原肽复合物可抑制荷瘤小鼠原发肿瘤的生长、降低肿瘤的转移率,延长荷瘤小鼠的生存时间(Tamura Y.Peng P,Liu K,Daou M,Srivastava PK.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock proteinpreparations.Science 1997 Oct 3;278(5335):117-20)。
CTL是人体杀伤肿瘤细胞的最高效的免疫细胞。任何一种激发机体抗肿瘤免疫的疫苗是否有效,决定于这种疫苗是否能激发肿瘤特异性CTL。外源性的蛋白类肿瘤抗原在免疫人体后,通常被抗原提呈细胞摄取、加工,进入MHC II类提呈途径,激发体液免疫反应(Heikema A,Agsteribbe E,WilschutJ,Huckriede A.Generation of heat shock protein-based vaccines by intracellular loading of gp96 with antigenic peptides.Immunol Lett 1997 Jun 1;57(1-3):69-74),但不能有效激活肿瘤特异性的CTL的产生,因而不能产生有效的肿瘤预防和治疗作用。因此,赋予多表位HER-2抗原基因工程疫苗特异性激活CTL的性质就成为研究以HER-2多表位为抗原的、预防和治疗人乳腺癌疫苗的一个技术关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组蛋白疫苗,它是将卡介苗热休克蛋白65(HSP65)和多表位HER-2抗原融合在一起而生产的、对人乳腺癌有预防和治疗作用的基因工程重组疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的疫苗的基因。
本发明提供了一种重组蛋白疫苗,它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合而形成的融合蛋白,其中,所述的多表位HER-2抗原是由选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,和SEQ IDNO:4所示的序列中的一个或多个相互连接形成的。本发明的重组蛋白疫苗中,卡介苗热休克蛋白65可以位于该融合蛋白的氨基端,多表位HER-2抗原位于该融合蛋白的羧基端。本发明的重组蛋白疫苗中,所述的多表位HER-2抗原最好具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。本发明的重组蛋白疫苗最优选具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码本发明的重组蛋白疫苗的基因。该基因可以具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
多表位HER-2抗原是由多个人HER-2蛋白分子中的抗原表位相连接形成的多肽,由HER-2分子上的4个肽段组成,序列可以如SEQ ID NO:8所示。将多表位HER-2抗原和卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白(序列可以如SEQ ID NO:5所示)在进入人体后可刺激人体的细胞毒性T细胞(CTL)发动对表达HER-2的乳腺癌细胞的攻击和杀伤,因而对乳腺癌有预防和治疗的作用。一个CTL表位可由8个氨基酸残基组成,因而SEQ ID NO:4所示的多表位HER-2抗原可含有多个CTL表位。多表位HER-2抗原由HER-2蛋白的四个肽段组成,它们的序列分别是:Met Glu His Leu   Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn   Ile Gln Glu Phe AlaGly Cys Lys Lys Ile   Phe Gly Ser Leu Ala   Phe Leu Pro Glu Ser     Phe Asp GlyAsp Pro  Ala Ser Asn Thr Ala    Pro Leu Gln Pro Glu  Gln Leu Gln Val Phe    GluThr Leu Glu Glu   Ile(SEQ ID NO:1);Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn     Thr Ser Pro Lys Ala  Asn Lys Glu(SEQ ID NO:2);Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val(SEQ ID NO:3);Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu(SEQ ID NO:4)。
我们将这四个肽段的编码基因相连在一起,生成了一种新的基因,这一基因编码编码的多肽即为多表位HER-2抗原。在多表位HER-2抗原进行人工点突变或以插入、两侧连接的方式进行改造所得的多肽也和可能表现预防和治疗乳腺癌的作用。将单一CTL表位HER-2抗原和卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白,在进入人体后可刺激人体的细胞毒性T细胞(CTL)发动对表达HER-2的乳腺癌细胞攻击和杀伤细胞,因而对乳腺癌有预防和治疗的作用,但其作用弱于将多表位HER-2抗原和卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白。
卡介苗热休克蛋白65是一种来源于卡介苗的蛋白质,它在和多表位HER-2抗原形成融合蛋白后,可以协助多表位HER-2抗原进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞,并进入MHC I类途径加工提呈,进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)对表达HER-2的乳腺癌细胞进行攻击和杀伤。此外,卡介苗热休克蛋白65还可刺激包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子,这些协同刺激分子(如B7等)和细胞因子可激活细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
本发明的重组蛋白疫苗具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码本发明的重组蛋白疫苗的基因。该基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
所述的HER-2多表位基因的序列具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列;所述的HER-2多表位基因编码的氨基酸的序列是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
本发明的重组蛋白疫苗可通过已知的方法进行生产。
实施例
实施例1获取卡介苗65KD热休克蛋白(HSP65)的编码基因
卡介苗来源于长春生物制品研究所。采用苏通马铃薯培养基培养卡介苗,培养的温度为37-39℃,生长出的卡介苗呈现干皱浅黄色的菌膜。收集菌膜,从中提取卡介苗基因组DNA。
提取卡介苗基因组DNA的方法参照Molecular Cloning一书(J.Sambrook,Isolation of high-molecular-weight DNA from mammaliancells,9.16-9.22,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Molecularcloning,1989)。
采用PCR方法自卡介苗分离热休克蛋白65(HSP65)结构基因。采用的5’端引物序列为5’CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3’,3’(SEQID NO:21)端引物序列为5’ACC GAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CATGCC ACC CAT 3’(SEQ ID NO:22)。
所述PCR操作程序是:在一500μl微量离心管中加入下列试剂:
模板cDNA 5μl(mmol/L)
10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μl
dNTPs(10mmol/L)1μl
5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各0.5μl
Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl
加去离子水至终体积50μl
混合后加入矿物油3滴
反应条件:94℃,30″;55℃,1’;72℃,2’,30个循环周期后,72℃延伸10分钟。
采用TA克隆方法克隆PCR产物,方法见文献(于永利,麻彤辉,杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序:介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志,1994,10(1):5)。
按常规方法(J.Sambrook,Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Molecular cloning,1989)提取质粒,采用双脱氧末端终止法,对插入片段进行序列测定。
实施例2.合成多表位HER-2抗原基因
采用四轮PCR合成多表位HER-2抗原基因1)第一轮PCR引物1的序列为:5′TGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTA TTTGAGACTCTGGAA3′(SEQ ID NO:9)引物1’的序列为:5’TGTTAGCTTTCGGGGAGGTGTTTTCACGCAGAACCTTGATAGCAACGATTTC TTCCAGAGTCTCAAA3′(SEQ ID NO:10)第一轮PCR合成的产物的序列是:5’TGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACA3’(SEQ ID NO:11)2)第二轮PCR引物2的序列是:5’CTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTT TGACGGCGACCCGGC3’(SEQ IDNO:12)引物2’的序列是 5’ACCAACTACAGCGGAGATGATAGAAGTCAGCGGTTCTT TGTTAGCTTTCGGGG3’(SEQID NO:13)产物的序列是:5’CTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACCGCTGACTTCTATCATCTCCGCTGTAGTTGGT3’(SEQ ID NO:14)3)第三轮PCR引物3的序列是:5’TCTGCAAACATCCAGGAGTTCGCAGGTTGTAAAAAAAT CTTCGGCTCTCTCGC3’(SEQ IDNO:15)引物3’的序列是:5’ACGGAGAACCAACGCCAGCCATAACGTATGCTTCGTCTACTACTACCAGCAGGAT ACCAAC TACAGCGGA3’(SEQ ID NO:16)产物的序列是:5’TCTGCAAACATCCAGGAGTTCGCAGGTTGTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACCGCTGACTTCTATCATCTCCGCTGTAGTTGGTATCCTGCTGGTAGTAGTAGACGAAGCATACGTTATGGCTGGCGTTGGTTCTCCGT3’(SEQ ID NO:17)4)第四轮PCR引物4的序列是:5’CCGGAATTCATGGAACACCTGCGTGAGGTTCGTGCTGTTACT TCTGCAAACATCCAG3’(SEQ ID NO:18)引物4’的序列是 5’AATGTTAAGCTTCAGGAGGCGAGAAACGT ACGGAGAACCAACGC3’(SEQ ID NO:19)产物的序列是:5’CCGGAATTCATGGAACACCTGCGTGAGGTTCGTGCTGTTACTTCTGCAAACATCCAGGAGTTCGCAGGTTGTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACCGCTGACTTCTATCATCTCCGCTGTAGTTGGTATCCTGCTGGTAGTAGTAGACGAAGCATACGTTATGGCTGGCGTTGGTTCTCCGTACGTTTCTCGCCTCCTGAAGCTTAACATT3’(SEQ ID NO:20),此序列代表的是HER-2多表位基因。
PCR的反应条件为:94℃,30″;55℃,1’;72℃,4’,30个循环周期后,72℃延伸10分钟。
实施例3.构建卡介苗HSP-65和多表位HER-2抗原基因融合基因
将卡介苗65KD热休克蛋白(HSP65)的编码基因和多表位HER-2抗原基因分别用EcoRI消化,37℃,2小时。采用琼经脂糖凝胶电泳分离
消化产物。电泳的条件是:1%琼脂糖凝胶,1×TAE缓冲液,150-200mA,电泳0.5-1小时。
20×TAE缓冲液:0.8mol/L Tris base
0.4mol/L NaOAc
0.04mol/L Na2 EDTA
用冰醋酸调pH8.3。
在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带。将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下,置-70℃冷冻15分钟,然后在65℃水浴中使胶融化;加入等倍体积TE-饱合酚,剧烈振荡30秒钟,然后-70℃冷冻15分钟;室温融化后,12,000rpm离心5分钟,将上层液相移至另一管中,用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA。
将经EcoRI消化的结核杆菌(卡介苗)65KD热休克蛋白(HSP65)的编码基因和多表位HER-2抗原基因用连接酶连接。
连接反应:
结核杆菌(卡介苗)65KD热休克蛋白(HSP65)基因DNA(0.5μg/μl)2μl
多表位HER-2抗原基因DNA(50ng/μl)2μl
10×连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide,p57,Promega
Corporation,Second Edition,1991)1μl
T4 DNA连接酶1μl
用双蒸水补齐至10μl
混合后置14-16℃水浴6-12小时。
实施例3卡介苗HSP-65和多表位HER-2抗原基因融合基因的克隆
用NcoI和HindIII在37℃消化得自实施例3的连接物,时间为2小时。消化产物琼经脂糖凝胶电泳分离。电泳的条件是:1%琼脂糖凝胶,1×TAE缓冲液,150-200mA,电泳0.5-1小时。20×TAE缓冲液:0.8mol/L Tris base 0.4mol/L NaOAc 0.04mol/L Na2 EDTA用冰醋酸调pH8.3。
在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带。将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下,置-70℃冷冻15分钟,然后在65℃水浴中使胶融化;加入等倍体积TE-饱合酚,剧烈振荡30秒钟,然后-70℃冷冻15分钟;室温融化后,12,000rpm离心5分钟,将上层液相移至另一管中,用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA。
将回收的DNA片段 克隆入经限制性内切酶NcoI和HindIII消化 的原核细胞表达载体pET-28a(+)质粒(美国Novagen公司)的6聚组氨酸(histidine)密码子的上游。
质粒DNA的消化反应:
1μg质粒DNA
1μl 10×缓冲液(见Promega Corporation产品说明书)。
1μl限制性内切酶NcoI(10单位/μl)
1μl限制性内切酶HindIII(10单位/μl)
用双蒸水补齐至10μl
混合后37℃温育30-120分钟。
连接反应:
质粒DNA(0.5μg/μl)2μl
DNA插入片段(300ng/μl)5μl
10×连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide,p57,
Promega Corporation,Second Edition,1991)1μl
T4 DNA连接酶1μl
用双蒸水补齐至10μl
混合后置14-16℃水浴6-12小时。
将含卡介苗HSP-65-多表位HER-2抗原基因融合基因的重组pET-28a(+)质粒转化大肠杆菌。
感受态细胞的制备:
a、将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线,37℃培养12-16小时;
b、次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中,37℃以225rpm速度震荡培养12-16小时;
c、取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中,37℃以225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(大约3小时);
d、将菌液冰浴2小时,然后2,500Xg,4℃离心20分钟收集菌体;
e、加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/LCaCl2,70mmol/L MgCl2,40mmol/L醋酸钠,pH5.5),混匀,置冰上45分钟;
f、l,800Xg,4℃离心10分钟,弃上清,加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞;
g.按每份200ul分装,4℃可保存1-2周。若需长期保存,可加甘油至终浓度为15%,置-70℃备用。
转化方法:
a、将200ul感受态细胞置冰上融化,然后加入3ul DMSO或β-巯基乙醇,混合后,加入3-5μl连接反应液(含重组质粒),温和混匀,置冰上30分钟;
b、42℃ 45秒,然后迅速放回冰中1-2分钟;
c、加入2ml LB培养液,37℃以225rpm的速度摇荡培养1小时;
d、4,000Xg离心10秒钟,弃上清,用200ul LB培养液重悬菌体;
e、将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上,涂匀,室温放置20-30分钟,倒置于37℃孵箱中培养12-16小时。用限制性内切酶消化的方法鉴定重组克隆。
f、质粒和菌株的保存:质粒冰冻保存于-20℃。菌株在含20-50%甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。
卡介苗HSP-65和人多表位HER-2抗原基因的融合基因的测序(采用双脱氧末端终止法,具体方法见文献:于永利,麻彤辉,杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序:介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志,1994,10(1):5)结果表明,所得到的卡介苗HSP-65和人多表位HER-2抗原基因的融合基因和设计的完全一致。
实施例4卡介苗HSP-65和多表位HER-2抗原基因融合基因的表达
将单菌落的细菌接种于50ml LB培养基中,于250ml三角烧瓶中,37C水浴震荡培养至OD600为0.6。加入IPTG使其终浓度为0.4mM,37C水浴震荡培养2-3小时。三角烧瓶于冰上5分钟,4C离心5分钟(5000xg)。吸弃上清,收集细菌,立即使用或冻存。
实施例5
卡介苗HSP-65和多表位HER-2抗原基因融合蛋白的纯化
将大肠杆菌细胞(3g湿重)于室温下解冻。组织经组织破碎器短暂匀浆后,重悬于20ml含0.2%脱氧胆酸钠(DOC)的缓冲液A。
缓冲液A(1000ml)的配制:
终浓度1mol/L Tris.HCL(pH7.9)50ml 50mmol/L
0.5mol/L EDTA 1ml 0.5mmol/L
5mol/L NaCL 10ml 50mmol/L
100% 甘油50ml 5%
用台式超声细胞破碎仪(SANYO,MSE SONIPREP150),设8个循环和50%的时间间隔,在冰浴中超声90秒破菌,搅拌10-20min。
加DOC,使终浓度为0.2%(即,加约240ul的20%脱氧胆酸钠(DOC)。混匀,静置10min。20%脱氧胆酸钠(DOC)贮存液应提前1天配制,配方为10g无水DOC,溶于水中,调体积至50ml。得粗制裂解物(A)
13000rpm,4℃离心10min。轻轻倾出上清。加18ml缓冲液A和2ml 20%DOC贮存液于包涵体沉淀。用组织破碎器充分重悬沉淀,室温下静置至少10分钟。将悬液于4℃离心10min,13000rpm。
加39.4ml缓冲液A和0.6ml 20%十二烷基肌氨酸钠(SKL)储液(SKL净浓度为0.3%)。剧烈搅动使沉淀慢慢溶解。静置至少30分钟。
十二烷基肌氨酸钠(SKL)储液:10g无水十二烷基肌氨酸钠(SKL),溶于H2O中,调体积至50ml。
将悬液于4℃离心10min,13000rpm。用缓冲液A+0.3% SKL稀释溶解的蛋白质使其浓度为lmg/ml。用缓冲液A将溶解的蛋白质稀释10倍,使其浓度为0.1mg/ml,SKL的终浓度为0.03%。
在4℃溶解的蛋白质制备物(体积约为400ml)对缓冲液A(体积约为4000ml)透析8小时,同时充分搅拌。然后换新鲜缓冲液并重复。
从透析袋(口径1cm)中移出经透析的蛋白质溶液,4℃、8000rpm离心20min,去除所有的的聚集物。留取上清,做镊-Saphrose-4-B层析分离HSP-65和前列腺特异性抗原(PSA)的T细胞表位的融合基因融合蛋白。
采用常规的SDS-PAGE方法(J.Sambrook,Polyacrylamide gelelectrophoresis 6.36-6.49,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Molecular cloning,1989)。鉴定HSP-65和HER-2多表位基因融合蛋白纯度为:97%。一、体内抑制转染HER-2 SP2/0细胞生长实验1、材料
转染HER-2 SP2/0细胞。SP2/0细胞是来源于BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞,为H-2d单倍型。转染HER-2 SP2/0细胞可在小鼠形成原位实体肿瘤。2、实验动物:7周的雄性BALB/c小鼠,疫苗组和对照组各20只。3、实验方法
1)采用DMEM培养基培养转染HER-2的SP2/0细胞。在DMEM培养基中含10%的灭活胎牛血清,2mM L-谷胱甘肽,100单位/ml青霉素,100μg/ml链霉素。在注射之前,用无血清DMEM将细胞洗三次。每只小鼠注射2×105个转染HER-2的SP2/0细胞,注射部位是小鼠两肩胛骨间皮下。在接种疫苗后的第25天,测量小鼠肿瘤块基底部的面积。
2)在接种肿瘤30天前和15天前,疫苗组分别腹腔注射100μg卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗;对照组分别腹腔注射同疫苗组同体积生理盐水。4、实验结果及结论
动物肿瘤块基底部面积的平均值:疫苗组为30mm2,对照组为200mm2
结论是此卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗能明显抑制表达HER-2的肿瘤细胞的生长。二、体内延长转染HER-2 SP2/0细胞成瘤潜伏期实验1、材料
转染HER-2 SP2/0细胞。SP2/0细胞是来源于BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞,为H-2d单倍型。转染HER-2 SP2/0细胞可在小鼠形成原位实体肿瘤。2、实验动物:7周的雄性BALB/c小鼠,疫苗组和对照组各20只。3、实验方法
1)采用DMEM培养基培养转染HER-2的SP2/0细胞。在DMEM培养基中含10%的灭活胎牛血清,2mM L-谷胱甘肽,100单位/ml青霉素,100μg/ml链霉素。在注射之前,用无血清DMEM将细胞洗三次。每只小鼠注射2×105个转染HER-2的SP2/0细胞,注射部位是小鼠两肩胛骨间皮下。在接种疫苗后的第15天开始,每天测量小鼠肿瘤的形成情况,以可触摸到肿瘤块的时间为肿瘤出现的天数。
2)在接种肿瘤30天前和15天前,疫苗组分别腹腔注射100μg卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗;对照组分别腹腔注射同疫苗组同体积生理盐水。4、实验结果及结论
动物肿瘤出现的平均天数:疫苗组为60.3天,对照组为16.9天。
结论是此卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗能明显抑制表达HER-2的肿瘤细胞形成肿瘤。
                        序列表<110>北京迪威华宇生物技术有限公司<120>一种卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗<130>I2001265<160>22<170>PatentIn version3.1<210>1<211>60<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln1               5                   10                  15Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro
        20                  25                  30Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro
    35                  40                  45Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
50                  55                  60<210>2<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys1               5                   10                  15Glu<210>3<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val1               5                   10                  15Val<210>4<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg1               5                   10                  15Leu Leu<210>5<211>2016<212>DNA<213>Artificial<220><221>CDS<222>(1)..(2016)<223><400>5atg gcc aag aca att gcg tac gac gaa gag gcc cgt cgc ggc ctc gag    48Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu1               5                   10                  15cgg ggc ttg aac gcc ctc gcc gat gcg gta aag gtg aca ttg ggc ccc    96Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
        20                  25                  30aag ggc cgc aac gtc gtc ctg gaa aag aag tgg ggt gcc ccc acg atc    144Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile
    35                  40                  45acc aac gat ggt gtg tcc atc gcc aag gag atc gag ctg gag gat ccg    192Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro
50                  55                  60tac gag aag atc ggc gcc gag ctg gtc aaa gag gta gcc aag aag acc    240Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr65                  70                  75                  80gat gac gtc gcc ggt gac ggc acc acg acg gcc acc gtg ctg gcc cag    288Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln
            85                  90                  95gcg ttg gtt cgc gag ggc ctg cgc aac gtc gcg gcc ggc gcc aac ccg    336Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
        100                 105                 110ctc ggt ctc aaa cgc ggc atc gaa aag gcc gtg gag aag gtc acc gag    384Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu
    115                 120                 125acc ctg ctc aag ggc gcc aag gag gtc gag acc aag gag cag att gcg    432Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala
130                 135                 140gcc acc gca gcg att tcg gcg ggt gac cag tcc atc ggt gac ctg atc    480Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile145                 150                 155                 160gcc gag gcg atg gac aag gtg ggc aac gag ggc gtc atc acc gtc gag    528Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu
            165                 170                 175gag tcc aac acc ttt ggg ctg cag ctc gag ctc acc gag ggt atg cgg    576Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg
        180                 185                 190ttc gac aag ggc tac atc tcg ggg tac ttc gtg acc gac ccg gag cgt    624Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg
    195                 200                 205cag gag gcg gtc ctg gag gac ccc tac atc ctg ctg gtc agc tcc aag    672Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys
210                 215                 220gtg tcc act gtc aag gat ctg ctg ccg ctg ctc gag aag gtc atc gga    720Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly225                 230                 235                 240gcc ggt aag ccg ctg ctg atc atc gcc gag gac gtc gag ggc gag gcg    768Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala
            245                 250                 255ctg tcc acc ctg gtc gtc aac aag atc cgc ggc acc ttc aag tcg gtg    816Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val
        260                 265                 270gcg gtc aag gct ccc ggc ttc ggc gac cgc cgc aag gcg atg ctg cag    864Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln
    275                 280                 285gat atg gcc att ctc acc ggt ggt cag gtg atc agc gaa gag gtc ggc    912Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly
290                 295                 300ctg acg ctg gag aac gcc gac ctg tcg ctg cta ggc aag gcc cgc aag    960Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys305                 310                 315                 320gtc gtg gtc acc aag gac gag acc acc atc gtc gag ggc gcc ggt gac   1008Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp
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    355                 360                 365aag ctg gcc ggt ggt gtc gcg gtc atc aag gcc ggt gcc gcc acc gac   1152Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Asp
370                 375                 380gtc gaa ctc aag gag cgc aag cac cgc atc gag gat gcg gtt cgc aat   1200Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn385                 390                 395                 400gcc aag gcc gcc gtc gag gag ggc atc gtc gcc ggt ggg ggt gtg acg   1248Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr
            405                 410                 415ctg ttg caa gcg gcc ccg acc ctg gac gag ctg aag ctc gaa ggc gac   1296Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp
        420                 425                 430gag gcg acc ggc gcc aac atc gtg aag gtg gcg ctg gag gcc ccg ctg   1344Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu
    435                 440                 445aag cag atc gcc ttc aac tcc ggg ctg gag ccg ggc gtg gtg gcc gag   1392Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu
450                 455                 460aag gtg cgc aac ctg ccg gct ggc cac gga ctg aac gct cag acc ggt   1440Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly465                 470                 475                 480gtc tac gag gat ctg ctc gct gcc ggc gtt gct gac ccg gtc aag gtg   1488Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val
            485                 490                 495acc cgt tcg gcg ctg cag aat gcg gcg tcc atc gcg ggg ctg ttc ctg   1536Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu
        500                 505                 510acc acc gag gcc gtc gtt gcc gac aag ccg gaa aag gag aag gct tcc   1584Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser
    515                 520                 525gtt ccc ggt ggc ggc gac atg ggt ggc atg gat ttc cat atg gct agc   1632Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe His Met Ala Ser
530                 535                 540gaa ttc atg gaa cac ctg cgt gag gtt cgt gct gtt act tct gca aac   1680Glu Phe Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn545                 550                 555                 560atc cag gag ttc gca ggt tgt aaa aaa atc ttc ggc tct ctc gca ttc   1728Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe
            565                 570                 575ctg cca gaa tct ttt gac ggc gac ccg gca tct aat acc gca ccg ctt   1776Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu
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            85                  90                  95Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
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    115                 120                 125Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala
130                 135                 140Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile145                 150                 155                 160Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu
            165                 170                 175Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg
        180                 185                 190Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg
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210                 215                 220Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly225                 230                  235                240Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala
            245                 250                 255Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val
        260                 265                 270Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln
    275                 280                 285Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly
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            645                 650                 655Leu Leu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His
        660                 665                 670<210>7<211>336<212>DNA<213>Artificial<220><221>CDS<222>(1)..(336)<223><400>7atg gaa cac ctg cgt gag gtt cgt gct gtt act tct gca aac atc cag    48Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Glnl               5                   10                  15gag ttc gca ggt tgt aaa aaa atc ttc ggc tct ctc gca ttc ctg cca    96Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro
        20                  25                  30gaa tct ttt gac ggc gac ccg gca tct aat acc gca ccg ctt caa ccg   144Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro
    35                  40                  45gaa caa ctg caa gta ttt gag act ctg gaa gaa atc gtt gct atc aag   192Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Val Ala Ile Lys
50                  55                  60gtt ctg cgt gaa aac acc tcc ccg aaa gct aac aaa gaa ccg ctg act   240Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Pro Leu Thr65                  70                  75                  80tct atc atc tcc gct gta gtt ggt atc ctg ctg gta gta gta gac gaa   288Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Asp Glu
            85                  90                  95gca tac gtt atg gct ggc gtt ggt tct ccg tac gtt tct cgc ctc ctg   336Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu
        100                 105                 110<210>8<211>112<212>PRT<213>Artificial<400>8Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln1               5                   10                  15Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro
        20                  25                  30Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro
    35                  40                  45Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Val Ala Ile Lys
50                  55                  60Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Pro Leu Thr65                  70                  75                  80Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Asp Glu
            85                  90                  95Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu
        100                 105                 110<210>9<211>70<212>DNA<213>Artificial<400>9tgacggcgac ccggcatcta ataccgcacc gcttcaaccg gaacaactgc aagtatttga      60gactctggaa                                                             70<210>10<211>67<212>DNA<213>Artificial<400>10tgttagcttt cggggaggtg ttttcacgca gaaccttgat agcaacgatt tcttccagag      60tctcaaa                                                                67<210>11<211>122<212>DNA<213>Artificial<400>11tgacggcgac ccggcatcta ataccgcacc gcttcaaccg gaacaactgc aagtatttga      60gactctggaa gaaatcgttg ctatcaaggt tctgcgtgaa aacacctccc cgaaagctaa     120ca                                                                    122<210>12<211>48<212>DNA<213>Artificial<400>12cttcggctct ctcgcattcc tgccagaatc ttttgacggc gacccggc                  48<210>13<211>53<212>DNA<213>Artificial<400>13accaactaca gcggagatga tagaagtcag cggttctttg ttagctttcg ggg           53<210>14<211>193<212>DNA<213>Artificial<400>14cttcggctct ctcgcattcc tgccagaatc ttttgacggc gacccggcat ctaataccgc    60accgcttcaa ccggaacaac tgcaagtatt tgagactctg gaagaaatcg ttgctatcaa   120ggttctgcgt gaaaacacct ccccgaaagc taacaaagaa ccgctgactt ctatcatctc   180cgctgtagtt ggt                                                      193<210>15<211>53<212>DNA<213>Artificial<400>15tctgcaaaca tccaggagtt cgcaggttgt aaaaaaatct tcggctctct cgc           53<210>16<211>70<212>DNA<213>Artificial<400>16acggagaacc aacgccagcc ataacgtatg cttcgtctac tactaccagc aggataccaa    60ctacagcgga                                                           70<210>17<211>286<212>DNA<213>Artificial<400>17tctgcaaaca tccaggagtt cgcaggttgt aaaaaaatct tcggctctct cgcattcctg    60ccagaatctt ttgacggcga cccggcatct aataccgcac cgcttcaacc ggaacaactg   120caagtatttg agactctgga agaaatcgtt gctatcaagg ttctgcgtga aaacacctcc   180ccgaaagcta acaaagaacc gctgacttct atcatctccg ctgtagttgg tatcctgctg   240gtagtagtag acgaagcata cgttatggct ggcgttggtt ctccgt                  286<210>18<211>57<212>DNA<213>Artificial<400>18ccggaattca tggaacacct gcgtgaggtt cgtgctgtta cttctgcaaa catccag      57<210>19<211>44<212>DNA<213>Artificial<400>19aatgttaagc ttcaggaggc gagaaacgta cggagaacca acgc                   44<210>20<211>357<212>DNA<213>Artificial<400>20ccggaattca tggaacacct gcgtgaggtt cgtgctgtta cttctgcaaa catccaggag     60ttcgcaggtt gtaaaaaaat cttcggctct ctcgcattcc tgccagaatc ttttgacggc    120gacccggcat ctaataccgc accgcttcaa ccggaacaac tgcaagtatt tgagactctg    180gaagaaatcg ttgctatcaa ggttctgcgt gaaaacacct ccccgaaagc taacaaagaa    240ccgctgactt ctatcatctc cgctgtagtt ggtatcctgc tggtagtagt agacgaagca    300tacgttatgg ctggcgttgg ttctccgtac gtttctcgcc tcctgaagct taacatt       357<210>21<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>21ccatggccaa gacaattgcg                                                 20<210>22<211>39<212>DNA<213>Artificial<400>22accgaattcg ctagccatat ggaaatccat gccacccat                           39

Claims (6)

1、一种重组蛋白疫苗,它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合而形成的融合蛋白,其中,所述的多表位HER-2抗原是由选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,和SEQ ID NO:4所示的序列中的一个或多个相互连接形成的。
2.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗,其中,卡介苗热休克蛋白65位于该融合蛋白的氨基端,多表位HER-2抗原位于该融合蛋白的羧基端。
3、按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗,其中,所述的多表位HER-2抗原具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
4.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗,它具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
5.一种编码权利要求1至5中任意一项权利要求所述的重组蛋白疫苗的基因。
6.按照权利要求6所述的基因,它具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
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