NO337573B1 - Kimær nukleinsyresekvens omfattende Hsp70-sekvensen fra Arthrobacter og nukleinsyre-ekspresjonsvektor omfattende denne, vertcelle og fusjonsprotein, samt vaksinepreparet og anvendelser for fremstilling av et vaksinepreparat for vaksinering av fisk eller et medikament for forebyggelse eller behandling av infeksiøs sykdom hos fisk. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår varmesjokkprotein (hsp) gener og kodede proteiner fra Corynebakterier. Særlig angår oppfinnelsen den isolerte DNA-sekvens og aminosyresekvens av hsp70 fra genus Arthrobacter, og sekvenser som er homologe med denne. Videre angår oppfinnelsen varierte anvendelser av Arthrobacter hsp70for fremstilling av vaksiner, særlig vaksiner for fisk, som en adjuvan og som bærer for antigener.

En vellykket vaksine mot intracellulære patogener vil ikke bare stimulere den humorale immunresponsen via hovedhistokompatibilitetskompleks klasse II veien (Major Histocompatibility Complex - MHC), men (noe som er viktigere) vil også indusere destruering av infiserte celler via aktivering av MHC-klasse I veien. De sistnevnte responser oppnås gjennom cytosolisk nedbrytning av fremmedprotein i infiserte celler slik at fragmenter av det fremmede materialet fraktes til celleoverflaten for presentasjon til CD8<+->cytotoksiske T-celler (CTL). Manglende evne til å aktivere MHC-klasse I veien er en vanlig defekt for vaksiner basert på rensede, rekombinante antigener.

Varmesjokkproteiner ("Hsp") er en familie av molekylære chaperoneproteiner som fremstilles av prokaryotiske og eukaryotiske celler, og som kan spille vesentlige roller i et antall intra- og intercellulære prosesser, særlig i antigenprosessering og presentasjon av antigenfragmenter til MHC I-systemet på celleoverflaten. Fusjonsproteiner av visse hsp-proteiner med andre peptider har med hell vært benyttet in vivo for å utløse en CTL-respons som er spesifikk mot disse peptider.

Videre, er hsp'er nå kjente for å være mål for antipatogenimmunresponser mot et antall bakteriell, fungale, helmintiske og protozosykdommer. Immunisering av pattedyr med et antall forskjellige patogene hsp'er (hovedsakelig av mykobakteriell opprinnelse) induserer sterke immunresponser og gir beskyttelse mot sykdommer som forårsakes av disse patogener. Styrken for en mammalimmunrespons mot patogene hsp'er er antatt å skyldes delvis eksistensen av multiple B-celle- og T-celleepitoper på disse proteiner.

En levende, ikke-virulent stamme av Arthrobacter (et medlem av familien av Corynebacteria) markedsføres under navnet "Renogen" i en vaksine ment for å beskytte laks og annen oppdrettsfisk mot bakteriell nyresykdom (BKD). Karakteristika for denne stamme er beskrevet i WO 98/33884. Vaksinen er unik dit hen at den er den første levende kultur som er godkjent for anvendelse i aquakultur.

WO 0129233 beskriver farmasøytiske sammensetninger som stimulerer eller øker et antigens immunogenisitet eller stimulerer eller øker en cellullær immunrespons spesifikk for det antigenet. Sammensetningene inneholder kimære polypeptider som består av et karboksyterminalfragment av et varmesjokkprotein 70 (hsp70) fra Mycobacterium tuberculosis, en Flt-3 ligand (FL), et cytoplasmisk translokasjonsdomene fra et Pseudomonas eksotoksin A (ETA dll) eller en granulocytt-makrofagkoloni stimulerende faktor (GM-CSF) sekvens i kombinasjon med et antigenpolypeptid.

WO 0168865 beskriver en fiskevaksine beregnet for å beskytte laks mot Piscirickettsia salmonis infeksjon. Vaksinen inneholder et antigen utledet fra P. salmonis, bl. a. et hsp70 protein som induserer en immunrespons mot et overflateantigen på P. salmonis.

Overraskende er nå påvist at Arthrobacter hsp70 effektivt kan benyttes i vaksiner mot forskjellige fiskepatogener.

Foreliggende oppfinnelse angår således kimær nukleinsyresekvens kjennetegnet ved at den omfatter den isolerte Arthrobacter Hsp70-sekvensen fra Arthrobacter stammen

deponert under aksesjonsnr. ATCC 55921 fusert i ramme til en heterolog kodende sekvens.

Oppfinnelsen angår videre nukleinsyre-ekspresjonsvektor kjennetegnet ved at den omfatter en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen, operativt bundet til en transkripsjonen, regulatorisk sekvens.

Oppfinnelsen angår videre en vertscelle kjennetegnet ved at den er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår videre et vaksinepreparat kjennetegnet ved at det omfatter den kimære nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen, og en farmasøytisk akseptabel bærer for vaksinering av fisk.

Oppfinnelsen angår videre et fusjonsprotein kjennetegnet ved at det omfatter den isolerte aminosyresekvensen til Arthrobacter Hsp70 fra Arthrobacter stammen deponert under aksesjonsnr. ATCC 55921 bundet til et heterologt molekyl for å danne nevnte fusjonsprotein.

Oppfinnelsen angår videre et fusjonsprotein kjennetegnet ved at det omfatter en isolert Arthrobacter Hsp70 aminosyresekvens ifølge SEQ ID nr. 2, eller et Domene-II fragment av SEQ ID nr. 2 bestående av aminosyrene 162 til 365.

Oppfinnelsen angår videre et vaksinepreparat kjennetegnet ved at det omfatter et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen, og en farmasøytisk akseptabel bærer for vaksinering av fisk.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en Arthrobacter Hsp70- nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID nr. 1, eller en åpen leseramme fra nukleotidene 291 til 2156 ifølge SEQ ID nr. 1, eller en aminosyresekvens omfattende SEQ ID nr. 2 eller et Domene II-fragmet fra aminosyrene 162 til 365 ifølge SEQ ID nr. 2, som en vaksineadjuvans for fremstilling av et vaksinepreparat for vaksinering av fisk.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en Arthrobacter Hsp70 kimær nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen, eller et Arthrobacter Hsp70 fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen, for fremstilling av et medikament for forebyggelse eller behandling av infeksiøs sykdom hos fisk.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 viser SEQ ID nr. 1, dvs. DNA-seskvensen (5' til 3') av hsp70-genet isolert ira, Arthrobacter ATCC 55921, inkludert 5'- og 3'UTR-sekvensene. Figur 2 viser SEQ ID nr. 2, dvs. aminosyresekvensen som er predikert til å kodes av hsp70-gensekvensen i figur 1.

De nye sekvenser av det isolerte hsp70-genet ifølge oppfinnelsen og det kodede isolerte eller rensede protein, er vist i hhv. figur 1 og 2. Det beskrives videre nukleinsyresekvenser og aminosyresekvenser som idet vesentlige er homologe med sekvensene som vises i figurene. "Idet vesentlige homologe" betyr at en sekvens, sammenlignet med en referansesekvens, har minst 60% homologi og fortrinnsvis minst 70% homologi, mer foretrukket minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98% eller større homologi til referansesekvensen.

For å bestemme den prosentuale homologi for to aminosyresekvenser eller to nukleinsyresekvenser blir sekvensene lagt ved siden av hverandre for optimale sammenligningsformål (f. eks. kan gap innføres i sekvensen i en første aminosyre- eller nukleinsyresekvens for optimal innretning med en andre aminosyre-eller nukleinsyresekvens og de mellomliggende, ikke-homologe sekvenser i gapet behøver ikke tas med i betraktning for sammenligningsformål). Det er intet krav om at de to sekvenser skal ha samme lengde. Hvis ikke annet er sagt, er lengden av sekvensen over hvilke sekvensene sammenlignes, hele utstrekningen av innretningen. Eventuelt, er lengden av en referansesekvens som er innrettet for sammenligningsformål minst 30% og fortrinnsvis minst 40%, fortrinnsvis minst 50% og helst minst 60%, og allerhelst minst 70%, 80%, 90% eller mer av lengden av referansesekvensen. Det er mulig å begrense homologianalyse til en hvilken som helst spesiell del av referansesekvensen, f.eks. kan man når det gjelder hsp70 ønske å begrense referansesekvensen til aminoterminalhalvparten av genet eller protein, eller mer spesielt til den strukturelle lapp E (Flaherty et al. (1990) i Nature 346: 623-628 og Zhu et al. (1996) Science 272: 1606-1614).

Når en del av den første (referanse) sekvensen er opptatt av den samme aminosyrerest eller nukleotid som den tilsvarende posisjon i sekvensen, er molekylene homologe ved denne posisjon (dvs. det er identitet ved denne posisjon). Når det gjelder nukleinsyresekvenssammenligning er det også homologi ved en viss posisjon der kodontripletten inkludert nukleotidet koder den samme aminosyre i begge molekyler som sammenlignes, på grunn av degenerering av den genetiske kode.

Prosent homologi mellom to sekvenser er en funksjon av antallet av homologe posisjoner som deles av sekvensene (dvs. % homologi = antall homologe posisjoner/totalt antall posisjoner). Eventuelt, kan sammenligning av sekvensene og bestemmelse av prosent homologi gjennomføres ved bruk av en matematisk algoritme. Egnede algoritmer er innarbeidet i NBLAST- og XBLAST-programmene ifølge Altschul et al. (1990) i J. Mol. Biol. 215:430-10.

Videre beskrives sekvenser som hydriderer til referansen SEQ ID nr. 1 under stringente betingelser. "Stringente" hybridiseringsbetingelser innenfor oppfinnelsens kontekst er definert som de som er beskrevet av Sambrook et al. i Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press

(1989), 1.101-1.104, dvs. at et positivt hybridiseringssignal fremdeles observeres etter vasking i 1 time med lx SSC-buffer og 0,1% SDS ved 55°C, helst 62°C, og allerhelst 68°C, og særlig i 1 time i 0,2 x SSC-buffer og 0,1% SDS ved 55°C, helst 62°C og allerhelst 68°C.

Sekvensene inkluderer fragmenter av referansenukleinsyresekvensen eller aminosyresekvensen. Et "fragment" av hsp70-nukleinsyrereferansesekvens er en hvilken som helst del av denne sekvens omfattende minst 70, eventuelt minst 75 eller minst 100 konsekutive nukleotider.

Et "fragment" av et hsp70-protein er ment å bety et hvilket som helst peptidmolekyl som har minst 25, eventuelt minst 35, eller minst 45 tilstøtende aminosyre av referanse hsp70-aminosyresekvensen. Et "immunogent" proteinfragment er et som er i stand til å utløse antistoffer som nøytraliserer patogeninfektivitet og/eller medierer antistoffkomplementering eller antistoffavhengig cellecytotoksisitet for å tilveiebringe beskyttelse for en immunisert vert. Et eksempel på et immunogent fragment av Arthrobacter hsp70 er domene II-fragmentet, analogt med Mycobacterium domene II-fragmentet (Q. Huang et al. (2000) i J.Exp. Med. 191(2): 403-8). Domene II-fragmentet av Arthrobacter hsp70 er sekvensen fra aminosyre 162 til 365 av SEQ ID nr. 2 eller en del derav bestående av minst 100 etter hverandre følgende aminosyrer, mer spesielt minst 150 og allerhelst minst 200 etter hverandre følgende aminosyrer derav.

hsp70-nukleinsyresekvensene ifølge oppfinelsen inkorporerer den åpne leseramme, ORF, av hsp70-genet, men også de 5'- og 3'-ikke-translaterte områder, UTR'er. Oppfinnelsen inkluderer alle komponentpromoter-, -enhancer-, -regulatoriske, -terminator- og lokaliseringselementer, og bruken av disse elementer i forbindelse med heterologe gener.Det beskrives også en DNA-ekspresjonsvektor omfattende promotersekvensen av Arthrobacter hsp70 (som angitt i SEQ ID nr. 1), eller en idet vesentlige homolog sekvens, forbundet til et heterolog gen, for å drive ekspresjonen av dette gen.

Arthrobacter hsp70-sekvensen som angitt her (SEQ ID nr. 1) er sekvens for genet som er identifisert ved genomisk kloning til å være tilstede i Arthrobacter, og SEQ ID nr. 2 er aminosyresekvensen som er hentet derfra. En kultur av kilde Arthrobacter- stammen ble deponert under aksessnr. ATCC 55921 i "American Type Culture Collection" (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) den 20. desember 1996.

hsp-proteinene av spesier av samme genus er generelt meget høyt konservert slik at det er å forvente at sekvensene av hsp70-genene og proteiner somer native til andre Arthrobacter- spesier, ikke vil skille seg sterkt fra hhv. SEQ ID nr. 1 og SEQ ID nr. 2. Kjennskap til sekvensen for hsp70-genet fra en Corynebakteriell art letter isolering av de samme gener fra relaterte organismer. Prosedyrer for isolering av disse gener er velkjente i teknikken.

Et "isolert" hsp70-gen eller en nukleinsyresekvens er ment å bety genet eller sekvensen på en annen måte enn i sin naturlige kontekst i Arthrobacter- genomet. DNA-kodende hsp70'er kan oppnås fra et cDNA-bibliotek fremstilt fra cellematerialet som uttrykker hsp70 (hsp'er er ubikitøse og uttrykkes rikelig). Det hsp70-kodende gen kan også oppnås fra et genombibliotek, f. eks. ved å følge trinn som beskrevet i eksempel 1, eller ved oligonukleotidsyntese.

Native hsp70-proteiner kan isoleres fra bakterielle cellekilder ved et egnet renseskjema ved bruk av standard proteinrenseteknikker. Identiteten for proteinet kan f. eks. bekreftes ved Western blotting eller immunopresipitering ved bruk av antistoffer til Arthrobacter ATCC 5591 hsp70-antigen. N-terminal aminosyresekvensering av renset protein kan benyttes for å bestemme partielle eller fullstendige aminosyresekvenser. Dette muliggjør konstruksjon av prober for å lette isolering av den native hsp70-sekvens fra et cDNA- eller genomisk bibliotek.

Biblioteker kan screenes med prober (som antistoffer mot hsp70 eller oligonukleotider på minst rundt 20-80 baser) konstruert for å identifisere genet av interesse eller proteinet som kodes av dette. For eksempel kan probene være konstruerte for å være homologe med deler av Arthrobacter-<g>ensek<y>emen som her beskrives. Alternativt kan probene ha en høy grad av homologi med andre bakterielle hsp-gener som Vibrio hsp70-gensekvensen. Screening av dette cDNA- eller genomiske bibliotek med den valgte probe kan gjennomføres ved bruk av standard prosedyrer slik disse f. eks. er beskrevet av Sambrook et al. i Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Et alternativt middel for isolering av gen som koder hsp70 er å benytte PCR-metodologi [Sambrook et al. supra; Dieffenbach et al. i PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Sekvenser som identifiseres i slike bibliotekscreeningmetoder kan sammenlignes og innrettes til den hsp70 som er beskrevet i SEQ ID nr. 1 eller en annen kjent hsp-sekvens som er deponert og tilgjengelig i offentlige databaser som GenBank. Sekvensidentitet (på enten aminosyre- eller nukleotidnivå) innen de definerte områder av molekyl eller over hellengdesekvensen, kan bestemmes ved sekvensinnretning ved bruk av datamaskinprogrammer som BLAST, BLAST-2, ALIGN, DNAstar, og INHERIT som benytter forskjellige algoritmer for å måle homologi.

Arthrobacter hsp70-proteinet kan ses å bære en likhet til homologer i andre spesier, særlig bakterielle spesier. Det er kjent at hsp-gener er høyt konserverte mellom relaterte spesier. Imidlertid kom det som en overraskelse å finne at Arthrobacter hsp70 viser så å si identitet ved hsp70'ene fra Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium leprae i det N-terminale området (de første 20 aminosyrer er faktisk identiske).

I det forsøk som er angitt i eksempel 2, ble et rikelig Arthrobacter- overflateriTotem på rundt 67 kDa som tilsynelatende er bundet til celleveggpeptidoglykanet analysert ved N-terminal aminosyresekvensering. N-terminal aminosyresekvensen på 20 rester ble funnet å være identisk med den til Mycobacterium hsp70, og dette 67 kDa protein antas å tilsvare hsp70-proteinet ifølge oppfinnelsen. I et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert varmesjokkprotein på rundt 67 kDa målt ved SDS-PAGE som er lokalisert til celleveggen av Arthrobacter- celler og har N-terminal aminosyresekvensen:

(M) SRA VGIDLGTTNS V VS VLE.

Resultatet av søkers forsøk viser at immunogenisiteten for Arthrobacter hsp70 i fisk er sammenlignbar med den til Mycobacterium hsp70 i pattedyr. Med fordel av etterpåklokskap, antas det nå at Arthrobacter hsp70 i en viss grad står for den sykdomsbeskyttelse som oppnås av Renogen™ levende Arthrobacter- vaksine når denne benyttes for å vaksinere fisk.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således det første bevis på at et isolert og renset varmesjokkprotein av en hvilken som helst opprinnelse er effektiv i en vaksine for fisk. Immunsystemet hos fisk er ikke direkte sammenlignbart med det til andre spesier, og særlig pattedyr, og er lite forstått. Det er derfor overraskende at varmesjokkproteinene er i stand til å indusere en kraftig immunrespons i fisk. I et aspekt angår oppfinnelsen anvendelsen av et isolert eller renset varmesjokkprotein ved fremstilling av et vaksinepreparat for administrering til fisk. Fortrinnsvis benyttes varmesjokkproteinet som en adjuvant for vaksinepreparat, eller som en bærer for et heterologt molekyl i vaksinepreparater. Varmesjokkproteinet er fortrinnsvis medlem av hsp70-familien.

Den erkjennelse at Arthrobacter og Mycobacterium deler høyt homologe hsp70-gener åpner for mange uventede applikasjoner for Arthrobacter- homologen. Isolert Mycobacterium hsp70-protein er påvist å være brukbart som effektiv vaksineadjuvant. Arthrobacter hsp70 kan også benyttes som en adjuvant i ren eller isolert form i forbindelse med et antigen. En "adjuvant" som definert her er en substans som ikke spesifikt øker den spesifikke immunrespons mot et antigen ved administrering i forbindelse med antigenet eller ved administrering separat til det samme setet. I et aspekt ved oppfinnelsen, blir isolert eller renset Arthrobacter hsp70-protein benyttet som en adjuvant for en animal vaksine, spesielt en vaksine for fisk. I en relatert anvendelse, tilveiebringes hsp70-genet eller en del derav på en DNA-vektor for å adj uvere en nukleinsyrevaksine. Innenfor rammen av oppfinnelsen tilveiebringes det vaksinepreparater omfattende hsp70-aminosyre- eller nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen i forbindelse med minst et annet antigen eller antigenkodende nukleinsyresekvens, og en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser. Det andre antigen kan være et rekombinant eller isolert, enkelt antigen, eller det kan være en blanding av antigenmolekyler fra et patogen.

Bruken av Arthrobacter hsp70 som adjuvant tillater leger og veterinærer å bevege seg bort fra bruken av tradisjonelle, fortynnede, levende mycobakterielle adjuvanter, som representerer en risiko for dyrenes sunnhet p.g.a. faren for reversering til den virulente, bakterielle stamme. Det er en ytterligere fordel for aquakultur at injeksjon av Arthrobacter hsp70-nukleinsyre eller isolert protein i fisk ikke resulterer i svelling eller noduler på injeksjonssetet, noe som er vanlig med konvensjonelle adjuvanter og som reduserer fiskens kommersielle verdi.

Arthrobacter hsp70-proteinet er ikke bare effektivt ved adjuvering av vaksiner omfattende andre antigener, men har også en immunogen aktivitet per se. Arthrobacter hsp70 kan utgjøre den aktive bestanddel for en vaksine for å forhindre eller behandle et antall veterinærsykdommer inkludert sykdommer forårsaket av fiskepatogener, særlig, men ikke begrenset til, BKD og SRS (salmonid rickettsial septicemi). I et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen omfatter et vaksinepreparat isolert eller renset hsp70-protein som en antigen eller immunogen komponent, sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser.

Videre tilveiebringes det et nukleinsyrevaksinepreparat omfattende en ekspresjonsvektor omfattende en hsp70-nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen som koder et antigen som er en antigen eller immunogen komponent i vaksinepreparatet, sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser.

Det sterkt immunogene potensialet for Arthrobacter hsp70 som deduseres fra homologi til Mycobacterium og andre hsp70'er antyder også muligheten for å fremstille kovalente gen- eller peptidkonjugater (f.eks. kimeraer eller fusjoner) av et hsp70-protein med et heterologt (ikke-hsp70) molekyl, vanligvis, men ikke begrenset til, et ikke-hsp70-protein (f.eks. et hapten). På denne måten, virker Arthrobacter hsp70-proteinet som en adjuvantfri bærer for å stimulere den humurale eller cellulære immunrespons mot det ledsagende, heterologe molekyl. Som benyttet her, henviser uttrykket "bærer" til et molekyl inneholdende T-celleepitoper som, når de kovalent er bundet til et andre molekyl, hjelper til å elicitere og å forsterke immunresponsene mot det andre molekyl (som kan være et protein, peptid, oligonukleotid eller oligosakkarid).

Denne tilnærmelse til vaksineutviklingen er spesielt fordelaktig når det angjeldende antigene peptid ikke er meget stort og lite immunogent, men allikevel et egnet mål for en vaksine. Det heterologe molekyl som bæres av Arthrobacter hsp70 er fortrinnsvis et proteinhapten eller et ikke-proteinmolekyl, f.eks. en karbohydratdel.

Som benyttet her, omfatter et hsp70 "fusjonsprotein" et hsp70-polypeptid som operativt er bundet til et annet polypeptid (et "heterologt polypeptid"). Et "heterologt polypeptid" eller et "ikke-hsp70-polypeptid" henviser til et polypeptid med en aminosyresekvens som tilsvarer et protein som ikke idet vesentlige er homologt med et hsp70-protein. Innenfor et hsp70-fusjonsprotein kan hsp70-polypeptidet tilsvare hele eller en del av et hsp70-protein (f.eks. en domene II del). Innen fusjonsproteinet, antyder uttrykket "operativt bundet" at hsp70-polypeptidet og ikke-hsp70-polypeptidet er fusert i rammen til hverandre. Ikke-hsp70-polypeptidet kan være fusert til N-terminus eller C-terminus av hsp70-polypeptidet, eller kan være innleiret i hsp70-polypeptidet.

Det er mulig å forbinde et hsp70-polypeptid og et heterologt molekyl ved hjelp av en kovalent eller ikke-kovalent binding annen enn ved å skape et fusjonsprotein. Et "heterologt molekyl" er et hvilket som helst protein-, peptid-, oligonukleotid- eller oligosakkaridmolekyl annet enn et hsp70-protein. For eksempel, kan kjemiske avstandsgrupper være skutt inn mellom polypeptidene, f.eks. for å skape et molekyl med den generelle formel hsp70-X-heterologt polypeptid, der X er en avstandsgruppe eller spacergruppe, f.eks. en kort sekvens på en eller noen aminosyrer. Alternativt, kan hsp70-polypeptidet kovalent være bundet på annen måte enn via amidbindinger i en lineær kjede av aminosyrer, f.eks. ved kjemisk konjugering eller ved kjemisk, lys- (f.eks. UV) eller reaksjonsindusert fornetning til ikke-hsp-molekyler. Glutaraldehyd og merkaptobindende linkere er eksempler på egnede kjemiske krysslinkere. Spesifikke muligheter er EDC + NHS eller sulfo-NHS, sulfo-SMCC, sulfo-SBED og SÆD, som er kommersielt tilgjengelige i kitform.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er hsp70-polypeptidet konjugert til et hapten. Et hapten er en substans med lav molekylmasse (f.eks. et peptid eller et oligosakkarid) som kan binde antistoff, men som vil indusere en immunrespons kun ved kovalent festing til et stort bærermolekyl.

Det er mulig å konjugere hsp70 med hele populasjoner av proteiner fra antigee celler eller partikler ved in vitro kompleksdannelse av cellelysater, -fraksjoner, -ekstrakter, virale partikler og lignende.

De heterologe molekyler eller polypeptider kan stamme fra en hvilken som helst kilde, men er mest sansynlig komponenter av en patogen organisme. Særlig kan de være polypeptider fra virale, bakterielle, protozelle, helmintiske eller fungale patogener fra dyr, og særlig fra aquatiske dyr.

Det isolerte hsp70-gen kan eksploateres på konvensjonell måte ved kloning av genet inn i en ekspresjonsvektor for generering av store mengder renset eller isolert, rekombinant hsp70-protein (eller hsp70-fusjonsprotein). Et renset hsp70-antigen kan også oppnås ved ikke-rekombinante teknikker. Proteinet er rikelig og kan ekstraheres fra Arthrobacter- celler ved konvensjonelle rensemetoder. Alternativt kan hsp70-proteinet eller -polypeptidet syntetiseres kjemisk ved bruk av standard peptidsynteseteknikker. En vaksine omfattende dette rensede eller isolerte, rekombinante eller ikke-rekombinante protein kan kalles en antigenbasert vaksine.

Et "isolert" eller "renset" protein er definert til å være idet vesentlige fritt for cellulært materiale eller andre kontaminerende proteiner fra den celle- eller vevkilde hvorfra hsp70-proteinet er avledet, eller idet vesentlige fritt for kjemiske forløpere eller andre kjemikalier etter kjemisk syntetisering. Uttrykket "idet vesentlige fritt for cellulært materiale" inkluderer preparater av hsp70-protein hvori proteinet er separert fra cellulære komponenter fra de celler hvorfra de er isolert eller fremstilt rekombinant. I en utførelsesform, inkluderer uttrykket "idet vesentlige fritt for cellulært materiale" preparater av hsp70-protein med mindre enn rundt 30 tørrvekt-% ikke-hsp70-protein (her også kalt et "kontaminerende protein"), mer foretrukket mindre enn rundt 20%, helst mindre enn rundt 10% og allerhelst mindre enn rundt 5% ikke-hsp70-proein. Når hsp70-proteinet eller den biologisk aktive del derav produseres rekombinant, er det også fortrinnsvis idet vesentlige fritt for kulturmedium, dvs. at kulturmediet representerer mindre enn rundt 20%, fortrinnsvis mindre enn rundt 10% og helst mindre enn rundt 5% av volumet av proteinpreparatet.

Fortrinnsvis blir et hsp70-kimerisk eller fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen fremstilt ved standard rekombinante DNA-teknikker. For eksempel blir DNA-fragmenter som koder for forskjellige polypeptidsekvenser ligert sammen i rammen i henhold til konvensjonelle teknikker, f.eks. ved å benytte stumpendede eller staggerendede termini for ligering, restriksjonsenzymdigestering for å gå egnede termini, innfylling av kohesive ender etter behov, alkalisk fosfatasebehandling for å unngå uønsket forening og enzymatisk ligering. I en annen utførelsesform kan fusjonsgener syntetiseres ved konvensjonelle teknikker inkludert automatiserte DNA-syntetisører. Alternativt kan PCR-forsterkning av genfragementer gjennomføres ved bruk av ankerprimere som gir opphav til komplementære overheng mellom to konsekutive genfragmenter som deretter kan anneleres og reforsterkes for å generere en kimer gensekvens (se f.eks. Current Protocols in Molecular Biology, red. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).

Et annet aspekt ifølge oppfinnelsen angår vektorer og fortrinnsvis ekspresjonsvektorer, omfattende en nukleinsyresekvens som koder hsp70 (eller en del derav). Som benyttet her, angir "vektor" et nukleinsyremolekyl som er i stand til å transportere en annen nukleinsyre hvortil den er bundet.En type vektor er et "plasmid" som henviser til en sirkulær, dobbelttrådet DNA-løkke, hvori ytterligere DNA-segmenter kan ligeres. En annen type vektor er en viral vektor hvori ytterligere DNA-segmenter kan ligeres i det virale genom. Visse vektorer er i stand til å styre ekspresjonen av gener hvortil de operativt er bundet. Slike vektorer angis her som "ekspresjonsvektorer". Generelt, er ekspresjonsvektorer som er nyttige i rekombinante DNA-teknikker ofte i form av plasmider. Imidlertid, er oppfinnelsen ment å inkludere slike andre former for ekspresjonsvektorer som virale vektorer (f.eks. replikasjonsdefektive retroviruser, adenovimser og adeno-assosierte vimser), som tjener ekvivalente funksjoner.

De rekombinante ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen omfatter en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen i en form som er egnet for ekspresjon av nukleinsyren i en vertscelle, noe som betyr at det i rekombinante ekspresjonsvektorer inkluderer en eller flere regulatoriske sekvenser, valgt på basis av vertscellen som skal benyttes for ekspresjon, operativt bundet til nukleinsyren som skal uttrykkes. Ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen kan benyttes for ekspresjon inne i den tilsiktige resipient for hsp70-antigenet (som en DNA-vaksine) eller for ekspresjon i en vertsorganisme annen enn den endelige resipient (for produksjon av rekombinante antigenvaksiner).

Når det gjelder en ekspresjonsvektor er "operativt bundet" ment å bety at nukleotidsekvensen av interesse er forbundet med den eller de regulatoriske sekvenser på en måte som tillater ekspresjon av nukleotidsekvensen (f.eks. i et in vitro transkripsjons/translasjonssystem eller i en vertscelle når vektoren er innført i vertscellen). Uttrykket "regulatorisk sekvens" er ment å inkludere promotere, enhancere og andre ekspresjonskontrollelementer (f.eks. polyadenyleringssignaler). Slike regulatoriske sekvenser er f.eks. beskrevet av Goeddel i Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 1985, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Regulatoriske sekvenser inkluderer de som styrer konstitutiv ekspresjon for en nukleotidsekvens i mange typer av vertsceller og de som styrer ekspresjonen av nukleotidsekvensen kun i visse vertsceller (f.eks. vevspesifikke, regulatoriske sekvenser). Fagmannen på området vil erkjenne at konstruksjonen av ekspresjonsvektoren kan avhenge av faktorer som valget av vertscelle som skal transformeres, nivået av ønsket ekspresjonsprotein osv. Ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen kan innføres i vertscellen for derved å gi proteiner eller peptider, inkludert fusjonsproteiner eller -peptider, kodet av nukleinsyrer som beskrevet her (f.eks. hsp70-proteiner, mutante former av hsp70, fusjonsproteiner av hsp70 med et heterologt peptid, osv.).

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår vertsceller inn i hvilke det ved transformering er innført en rekombinant ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen. En vertscelle kan være en hvilken som helst prokaryotisk eller eukaryotisk celle (inkludert en eukaryotisk celle i en multicellulær, eukaryotisk ikke-human organisme). For eksempel kan hsp-protein uttrykkes i bakterieceller som E. coli, insektsceller (ved bruk av baculovirusekspresjonsvektorer), gjærceller eller pattedyrceller. Andre egnede vertsceller er velkjente for fagfolk på området, (se f.eks. Goeddel, supra). Den rekombinante ekspresjonsvektor kan være konstruert for ekspresjon i en vertsfiskecelle (etter DNA-vaksinering). Alternativt kan den rekombinante ekspresjonsvektor transkriberes og translateres in vitro, f.eks. ved bruk av T7-promoterregulatoriske sekvenser og T7-polymerase.

Ekspresjon av proteiner i prokaryoter utføres som regel i E. coli med vektorer inneholdende konstitutive eller induserbare promotere som styrer ekspresjonen av enten fusjons- eller ikke-fusjonsproteiner. Fusjonsvektorer adderer et antall aminosyrer til et protein som er kodet deri, vanligvis til aminoterminus av det rekombinante protein. Ofte er, i fusjonsekspresjonsvektorer, et proteolytisk spaltingssete innført i skjøten av fusjonsdelen og det rekombinante protein for å muliggjøre separering av det rekombinante protein fra fusjonsdelen etter rensing av fusjonsproteinet. Slike enzymer, og deres kognate gjenkjennelsessekvenser, inkluderer faktor Xa, trombin og enterokinase. Typiske fusjonsekspresjonsvektorer inkluderer pGEX (Pharmacia Biotech Inc., D.B. Smith og K.S. Johnson, (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) og pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) som fuserer glutation S-transferanse (GST), maltose E-bindende protein, hhv. protein A, til det rekombinante målprotein.

hsp70-genet kan innarbeids i en nuklensyrevaksine (NAV), hvorved denne NAV opptas av vertscellen i et levende dyr, og ekspresjonen av hsp70-genet skjer i cytosolen. Fordi korte peptider av intracellulære hsp70-antigener transporteres til celleoveflatene der de kan komme i kontakt med MHC I-systemet, er hsp70-antigener med opprinnelse i NAV ideelt posisjonert for innføring av en cellulær immunrespons.

Et hsp70-gen som er skutt inn i en DNA-vektor kan inokuleres direkte i en fisk (f.eks. oralt, intramuskulært eller intraperitonealt) for ekspresjon in vivo i fiskeceller. DNA-vaksinering kan også utføres i andre dyrespesier. Således tilveiebringes det i et aspekt av oppfinnelsen en nukleinsyrevaksine omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og et DNA-plasmid hvori en nukleinsyresekvens som koder Arthrobacter hsp70 operativt er forbundet til en transkripsjonen, regulatorisk sekvens. Transkripsjonelle, regulatoriske sekvenser inkluderer promotere, polyadenyleringssekvenser og andre nukleotidsekvenser som de immunstimulerte oligonukleotider med ikke-metylerte CpG-dinukleotider, eller nukleotidsekvenser som koder for andre antigene proteiner eller adjuvanterende cytokiner. Nærværet av en eller flere eukaryotiske eller virale, transkripsjonelle regulatoriske sekvenser tillater ekspresjon av hsp70-genet i fiskeceller. DNA-plasmidet per se kan replikeres i bakterieceller for å fremstille et vaksinepreparat, men mangler generelt transkripsjonelle, regulatoriske sekvenser som tillater hsp70-genekspresjon i prokaryotiske celler. For optimal in vivo ekspresjon kan det være å foretrekke å velge transkripsjonelle, regulatoriske sekvenser som er endogener til fisken som skal vaksineres. For eksempel, kan endogene cytokin- eller aktingenpromotere komme i betraktning. Den angjeldende DNA kan være tilstede i naken form eller kan administreres sammen med et middel som letter cellulært opptak (f.eks. liposomer eller kationiske lipider). Teknikken ved DNA-vaksinasjon av fisk er forklart i større detalj i US 5,780,448, som anses som del av beskrivelsen.

I en utførelsesform av oppfinnelsen benyttes promoteresekvensen av Arthrobacter hsp70-genet til å drive ekspresjonen av et heterologt gen, dvs. et gen forskjellig fra genet som kodor Arthrobacter hsp70. Promoteren kan være innskutt oppstrøms for et heterologt gen i den kromosomale DNA fra en organisme, eller i et ekstrakromosomalt plasmid eller en annen ekspresjonsvektor. I det tilfelle det er ønskelig å overuttrykke et endogent Arthrobacter- gen, eller å skyte inn et fremmed gen i et endogent plasmid av Arthrobacter, kan f.eks. en oppstrøms hsp70-promoter drive ekspresjonen av dette heterologe gen som svar på en stimulus som varmesjokk.

Vaksinene ifølge oppfinnelsen er egnet for administrering til fisk Arthrobacter hsp70 kan benyttes som adjuvans i en hvilken som helst vaksine forfisk (finnefisk). Tilsvarende Van Arthrobacter hsp70 benyttes i vaksiner som bærere for kovalent festede antigener, eventuelt med utelukkelse av en hvilken som helst konvensjonell adjuvans (såkalte "ikke-adjuvans" vaksiner). Arthrobacter hsp70 er også i stand til å kunne benyttes som et immunogen (eventuelt som det eneste immunogen) i en vaksine for å øke immunresponsen mot spesifikke sykdommer, særlig BKD, Salmonid Rickettsial septisemi (SRS) og andre infektiøse sykdommer hos fisk.

Uttrykket "vaksine" benyttes i den bredeste forstand og inkluderer ikke bare preparater som benyttes for immunisering mot patogener, men også anti-tumorvaksiner, vaksiner basert på autogene antigener (f.eks. for kjemisk kastrering), osv. For aquakultur kan vaksinen ifølge oppfinnelsen benyttes i skalldyr eller i finnefisk, spesielt for behandling av teleoster som laks, ørret, karpe, sjøbrasme, havabbor, "yellowtail", steinbit, kveite, hyse. Det finnes ingen grenser for kandidatantigener som er egnet for kombinasjon med Arthrobacter hsp70-sekvenser i en vaksine. Patogene antigener kan avledes fra bakterier, vimser, protozoer, nematoder og fungi. En spesiell fokus er på antigener og særlig overflateantigener fra fiskepatogene organismer.

Hsp70-aminosyre- eller nukleinsyresekvenser kan benyttes i vaksinepreparater i forbindelse med, eller konjugert til, bakterie-, protozo-, virale eller fungale antigener fra sykdommer som påvirker skalldyr eller finnefisk, inkludert antigener (eller deres kodende sekvenser) avledet fra: infektiøs lakseanemivims (ISAV), infektiøs pankreatisk nekrosevims (IPNV), infektiøs hematopoietisk nekrosevims (IHNV), iridovims, nervøst nekrosevims (NNV), laksepankreas sykdomsvims (SPDV), vårviremia av karpevirus (SVCV), viral hamorragisk septisemivims (VHSV), gulhodevirus (YHV), Taura syndromvirus (TSV), hvitflekksyndromvirus (WS SV), Renibacterium salmoninarum (kausativt middel av bakteriell nyresykdom), Piscirickettsia salmonis (kausativt middel av salmonid Rickettsial septisemi), Vibro spp, Aeromonas spp, Yersinia ruckerii, Pseudomonas spp, Photobacterium damselae, osv. Et stort og voksende antall polypeptider fra disse og andre patogene organismer er renset og/eller klonet og uttrykt og er tilgjengelig for konjugering til, eller å tilveiebringes i forbindelse med, Arthrobacter hsp70 eller dennes kodende sekvens i et vaksinepreparat. Foretrukne eksempler inkluderer IPNV-proteiner VP1, VP2, VP3 og NS og deres kodende nukleotidsekvenser; ISAV-proteiner som beskrevet i WO 01/10469 inkludert hemagglutinin, nukleokapsid, polymerase og segment 7 P4 og P5-proteiner og deres kodende nukleotidsekvenser; P. salmonis-<p>rotemeTsom beskrevet i WO 01/68865 inkludert OspA og IcmE og deres kodende nukleotidsekvenser; nodavirusproteiner som nukleokapsid; og strukturelle polypeptider fra SPDV og deres kodende nukleotidsekvenser som beskrevet i WO 99/58639). Et foretrukket vaksinepreparat ifølge oppfinnelsen omfatter en DNA-ekspresjonsvektor som bærer hsp70-nukleotidsekvensen fusert i rammen med IPNV VP2-sekvensen eller IPNV VP3-sekvensen. Eventuelt, omfatter vaksinen et første plasmid som bærer hsp70-VP2-fusjonen og et andre plasmid som bærer hsp70-VP3-fusjonen.

Oppfinnelsen omfatter anvendelsen av hsp70-sekvensene i forbindelse med et hvilket som helst av de ovenfor nevnte antigener eller deres kodende sekvenser ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for prevensjon eller terapi av sykdommer forårsaket av infeksjon med sykdomsmidlet hvorfra antigenet er avledet.

Vaksineantigenene som tilveiebringes i forbindelse med hsp70-genet eller -proteinet, kan være kjemisk konjugert til hsp70 (i et kimera- eller fusjonsprotein) eller kan tilveiebringes som separate molekyler sammen i et enkelt vaksinepreparat. Som en annen mulighet, kan hsp70-genet eller -proteinet tilveiebringes med et antigen eller en antigenkodende nukleinsyresekvens i et kit for separat, sekvensiell eller samtidig administrering. Vaksineantigenene som tilveiebringes i forbindelse med hsp70-genet eller -proteinet kan være bakteriner, celleekstrakter, rekombinante proteiner, plasmidbårede gener eller levende/fortynnede patogene stammer.

Det er mulig å immunisere et individ med de nøytrale eller saltformer av de foreliggende fusjonsproteiner eller isolert hsp70-protein, enten administrert alene eller i blanding med en farmasøytisk akseptabel vehikkel eller eksipiens. Typisk blir vaksiner fremstilt som flytende oppløsninger eller suspensjoner; faste former egnet for oppløsning i, eller suspendering i, flytende bærere før administrering kan også fremstilles. Preparatene kan emulgeres eller den aktive bestanddel innkapsles i liposomvehikler. De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan administreres i former for umiddelbar frigivning eller forlenget frigivning.

Farmasøytisk akseptable vehikler er f.eks. vann, saltoppløsning, dekstrose, glyserol, hjelpestoffer som fukte-eller emulgeringsmidler, massegivende midler, bindemidler, disintegranter, diluenter, smøremidler, pH-buffermidler eller konvensjonelle adjuvanser som muramyldipeptider, avridin, aluminiumhydroksid, oljer, saponiner, blokkopolymerer og andre substanser som velkjent i teknikken.

For å immunisere et individ, kan et hsp70-antigen eller en hsp70-genvektor administreres parenteralt ved bruk av intramuskulær injeksjon i en egnet vehikkel, men eventuelt subkutant, ved intravenøs injeksjon eller intradermal eller intranasal avlevering. Når det gjelder immunisering av fisk, er de typiske administreringsveier injeksjon i peritinealkaviteten, oralt i foret eller ved dypping. De foretrukne, antigene vaksinepreparater ifølge oppfinnelsen foreligger i en form egnet for administrering ved injeksjon eller dypping. DNA-vaksinering skjer generelt ved intramuskulær injeksjon.

Den effektive dosering kan variere avhengig av størrelse og art når det gjelder individet, og i henhold til administreringsmodus. Den optimale dosering kan bestemmes ved prøving og feil av en doktor eller veterinær. Karakteristisk vil en enkelt dose av hsp70-antigen ligge i området fra rundt 0,01 til 1 000 ug pr. kg kroppsvekt, fortrinnsvis 0,5 til 500 ug pr. kg og spesielt 0,1 til 100 ug pr. kg. For DNA-vaksiner, bør en minimumsdose på 10 pg opp til doser på 1 000 ug plasmid pr. dyr være tilstrekkelig for egnet ekspresjon av antigenet in vivo.

Eksempler

Eksempel 1: Isolering og sekvensering av hsp70-genet fra genomet av Arthrobacter ATCC 55921

En 5 ml kultur av Arthrobacter dyrkes over natten ved risting ved 30°C i LB inneholdende kanamycin (30 ug/ml). DNA-ekstrahering gjennomføres så ved bruk av et Puregene DNA-isoleringskit (Gentra) eller Instagene™ Resin i henhold til produsentens instruksjoner.

Degenerat-PCR

Områder med størst likhet mellom diverse mykobakterielle og streptomyces hsp70 (dnaK) sekvenser på nukleotidnivået benyttes for å kostruere degenerate primere for PCR og sekvensering. De valgte primere er dnak-lFdeg (5'-gtcggnatcgacctvggnac-3') og dnak-4Rdeg (5'-gcggtsggctcgttgac-3'). Disse primere benyttes for forsterkning av Arthrobacter- DNA i en PCR-reaksjon med en anneleringstemperatur på 50°C. Kvaliteten for den forsterkede DNA bedømmes ved gelelektroforese. En 10 ul alikvot elektroforeseres på en 0,8% agarosegel i IX Tris-boratelektroforesebuffer (TBE) ved 100V i rundt 1 time. 650 bp produkter skjæres så ut fra gelen og renses ved bruk av et Quaquick rensekit (Qiagen). PCR-produktet renses ved bruk av Qiagen PCR opprensingskit i henhold til produsentens instruksjoner og sekvensering i henhold til produsentens instruksjoner ved bruk av BidDye primerkjemi (Applied Biosystems) og hver av primerne benyttes for PCR. Forlengelsesreaksjonsblandingene fremstilles ved bruk av ABIPRISM (8r) BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reacting mix,~600 ng DNA-templat, 3,2 pmol av den egnede primer og ddH20 til 20 ul. Betingelser for syklussekvenseringen er som følger: termalsyklisereren settes til 25 sykler omfattende 96°C i 10 sekunder, 50°C i 5 sekunder og 60°C i 4 minutter. Sekvensen viser dette fragment til å inneholde de første ca. 400 bp av dnaK-genet.

For å oppnå ytterligere hsp70/dnaK-gensekvens, blir degenerate primere benyttet for å forsterke en nedstrømsdel av Arthrobacter hsp70-genet. Disse velges fra Galley et al. (1992) Biochemica et Biophysica Acta 1130: 203-208. [Fremoverprimer hsp70 universal-Fl (5' CARGCN CAN AAR GAY GCN GG 3'), reversprimer: hsp70 universal-Rl: (5' GCN CAN GCY TCR TCN GGR TT 3')]. Primerne er konstruert for å annelere til to høyt konserverte områder innen hsp70-genet for å generere et 650 bp produkt.

PCR-reaksjonen består av (i 50 ul totalvolum): 5 ul 10X PCR-buffer, 5 ul 25 mM MgCl2, 2,5 ul 10 mM av hver dNTP, 2 ul Hsp70 universal-Fl (200 uM), 2 ul Hsp70 universal-Rl (200 uM), 0,5 ul Amplitaq DNA-polymerase (5 U/ul), 10 ul Instagene ekstrahert DNA, 23 ul ddH20. PCR-reaksjonen sykliseres som følger: 2 min. ved 94°C, så 40 PCR-sykler bestående av: 1,0 min. ved 94°C, 0,5 min. ved enten 50°C eller 58°C, og 1,0 min. ved 72°C. PCR-syklisering fullføres med et 3,0 min. forlengelsestrinn ved 72°C. PCR-produktet elektroforeseres, renses og sekvenseres som beskrevet ovenfor. Sekvensen for dette fragment er funnet å overlappe og forlenge 3' av den~400 bp sekvens som ble identifisert i det første sekvenseringsforsøk.

Genomgang

Genomgang benyttes for å forlenge sekvensene 5' og 3' av de allerede identifisere sekvenser. Primere designeres fra sekvensene som er beskrevet i "Genome Walter" manualen (Clontech). Til å begynne med tildannes det fire genombiblioteker (Dral, EcoRV, PvuJJ, Stul) og deretter tildannes det ytterligere tre biblioteker (Alul, Seal og SnaFl). Alle bibliotekene og de etterfølgende PCR-reaksjoner er som beskrevet i Genome Walker-manualen.

5' genomgang gir et~500 bp fragment som overlapper med den tidligere oppnådde sekvens. 5' forlengelsen inneholder startkodonet og 5' UTR av hsp70-genet. 3' gang er ikke vellykket med henblikk på å forlenge genet.

RACE

3' RACE benyttes for å oppnå ytterligere 3'-sekvens. RNA isoleres fra en overnattkultur av Arthrobacter (dyrket som ovenfor), ved bruk av Purescript (Gentra) RNA-isoleringskit i henhold til produsentens instruksjoner. 3' RACE gjennomføres ved bruk av et Boehringer Mannheim 5'3' RACE-kit i henhold til produsentens instruksjoner. Primere for RACE er konstruert fra 3' enden av den kjente sekvens. PCR-reaksjonen gjennomføres som beskrevet bortsett fra at den inneholder 10% DMSO og har en anneleringstemperatur på 55°C. Et bånd på~1,0 kb forsterkes og klones inn i en pCR4-vektor ved bruk av Invitrogen's TOPO sekvenseringskit i henhold til den vedlagte protokoll. Kolonier screenes ved bruk av vektorprimere og valgte kloner dyrkes over natten hvoretter DNA-ekstraheringer gjennomføres ved bruk av Invitrogen's SNAP minoprepkit og sekvenseres ved bruk av vektorprimere som beskrevet ovenfor.

Contigs settes sammen ved bruk av Genecode's Sequencher program. Et Genebank søk ved bruk av de kontiggede sekvenser bekrefter at det er hsp70.

Resten av hsp70-genet og 3'UTR oppnås ved genomgang som beskrevet ovenfor. Nok en gang blir contigs identifisert ved bruk av Genecode's Sequencher program. Et Genebank søk ved bruk av de kontiggede sekvenser bekrefter at hsp70-genet inkludert 3'UTR og 5'UTR er inkludert.

Eksempel 2: Karakterisering av Arthrobacter- celleveggproteiner

Elektroforese og Western blotting

Arthrobacter ATCC 55921 cellesuspensjoner prepareres ved å fjerne subkulturelle bakterier direkte fra tryptisk soyaagar (TS A) plater etter inkubering i 48 timer ved 23°C. Bakterier resuspenderes i 10 ml "TET"

buffer bestående av 100 mM Tris-HCl-buffer ved pH 7,2, 1 mM EDTA og 0,1% Triton-X100 (BioRad

Laboratories, Hercules, CA), til en optisk densitet på rundt 50 OD660 enheter (der 1 OD600 er estimert til å være lxl 09 celler), og sentrifugeres ved 6 500 g. Supernatanten kasseres og cellene suspenderes i ytterligere 10 ml TET og sentrifugeringstrinnet gjentas. Cellepelleten resuspenderes i 4 m 1 TET og separeres som 1 m 1 alikvoter til 1,5 ml mikrorør. En av alikvotene ble blandet videre med 200 ul 5 mg ml"<1>hvitt kyllingegglysozym og inkuberes under risting over natten (18 timer) ved 37°C. Cellesuspensjonen sentrifugeres ved maksimal hastighet i 5 minutter i en benkemikrosentrifuge. 150 ul av den cellefrie supernatanten blandes med 50 ul NuPage 4X LDS-prøvebuffer (Invitrogen Carlsbad, CA) og inkuberes ved 70°C i 10 minutter under risting. 10 ul alikvoter av den resulterende supernatant analyseres på 8% Mini Protean II geler (BioRad) og Western blottes til PVDF (Millipore, Bedford, MA) med en halvtørr overføringsenhet (BioRad) i 30 minutter ved 20V. Umiddelbart etter blotting vaskes membranene i 0,1% Ponceau S (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige) i 1 minutt og avfarves ved flere vaskinger med destillert vann inntil blottede proteiner ble synlige. Molekylvektstandarder og visse proteiner markes med blyant for referansepunkter etter immunofarving før fjerning av rosa farve ved gjentatte vaskinger i destillert vann og lufttørking av membranen i forberedelse på ytterligere farving.

For Coomassie blå identifisering av proteinbånd for aminosyreseskvensering inkuberes de avfarvede membraner i et oppløsning inneholdende 50% metanol, 7% eddiksyre og 0,1% R-250 i 10 minutter etter avfarving av bakgrunnen ved bruk av oppløsningen ovenfor uten Coomassie blå. Blottet skylles deretter i destillert, deionisert vann i 10 minutter og tørkes i luft for N-terminal aminosyresekvensering ved Edman-nedbrytning ved bruk av en automatisert proteinsekvensør (Applied Biosystems).

Utvikling av immunoreaktive antigener oppnås ved inkubering av den tørkede blot med en 1:200 fortynning av antistoff (polyklonal kanin anti- Arthrobacter) i 1% kasein tris-bufret saltoppløsning pH 7,4 (cTBS)

(BioRad) i 60 minutter, 2 vaskinger på 10 sekunder med TBS fulgt av inkubering med 1:2000 fortynning av geite anti-kanin immunoglobulinalkalisk fosfatase (Pierce, Rockford IL). Farvefremkallingen oppnås med 1-trinns NBT/BCIP (Pierce) i rundt 3 minutter og avsluttes ved vasking i destillert vann. Alle inkuberinger ble gjennomført i et sluttvolum på 10 ml på en rød rockerplattform (Hoefer, San Francisco, CA). Dokumenteringen oppnås med en Imagemaster og tilhørende program (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige). Estimering av molekylvektene oppnås ved sammenligning av migrering av antigener med Precision's bredområde forfarvede standarder (BioRad). Estimering av molekylvekt oppnås ved beregning av relativ mobilitet ved bruk av første ordens Lagrange.

Antiserumproduksj on

Polyklonal antiserum til Arthrobacter antigener fremstilles ved i.m. injeksjon av en New Zealand-kanin med 0,5 ml av en suspensjon bestående av 3 deler 4x10<8>celler, på forhånd vasket i steril Dulbecco's saltoppløsning og 1 del Freund's ufullstendige adjuvans. Etter 4 uker ble det samme volum av materialet injisert i kaninen. 5 ml blod ble hentet fra den perifere ørevene etter 6 uker og serum samlet ved å tillate blodet å klumpe seg fulgt av sentrifugering.

Resultater

SDS-PAGE-analyse av de lysozymbehandlede suspensjoner av Arthrobacter avdekker nærværet av et område av proteinbånd mellom 150 og 10 kDa. Preeminente blant disse er hovedproteiner på rundt 67, 63 hhv. 59 kDa. 67 kDa proteinet er tilsynelatende fornettet til peptidoglykan i Arthrobacter- ceWev eggen fordi det kun frigis etter behandling med lysozym.

Når SDS-PAGE-proteinprofilene Wester blottes og farves med et antiserum mot helceller av Arthrobacter identifiseres store immunoreaktive bånd ved 122 hhv. 67 kDa. N-terminus av 67 kDa proteinet sekvenseres og finnes å være SRAVGIDLGT TNSVV SVLE. Et homologisøk ved bruk av BLAST protein-proteinalgoritmen identifiseres at sekvensen har 100% homologi med hsp70-proteinet av Mycobacterium tuberculosis. Dette 67 kDa protein antas å være det samme som det hsp70 protein som identifiseres ved genomisk sekvensering og som er beskrevet her.

Eksempel 3: Rekombinant ekspresjon av hsp70

Den fullstendige, kodende sekvens av Arthrobacter varmesjokkprotein 70 klones inn i pET30EKLIC-vektoren (Novagen) som et ikke-fusjons- og som et fusjonspeptid. N-fusjonstaggen består av 55 aminosyrer som inkluderer forskjellige trekk for å tillate ytterligere rensing av målproteinet (inkludert er His-taggen, S-taggen, enterokinasespaltingssete). En 200 aminosyreaktiv del som er lastet inn i HSP70-proteinet, kjent som domene JJ, er også klonet som et ikke-fusjons- og fusjonspeptid.

Ekspresjon av rekombinant HSP70 og rekombinant domene JJ gjennomføres i E. coli DE3-celler. Når en egnet celledensitet er oppnådd, blir DE3-kulturene delt i to separate kolber. Proteinekspresjon induseres i en av kulturene med IPTG-substratet mens den andre tjener som kontroll. Både HSP70 og domene JJ, uttrykt som fusjon eller ikke-fusjon, finnes prinsipielt i en oppløselig form i cytoplasma eller assosiert med periplasma av E. coli. Således blir i E. coli det rekombinante HSP70 og domene JJ derav med hell bragt mot celleoverflaten akkurat som det native protein i Arthrobacter. Inklusjon av fusjonstaggen ved N-terminus av proteinene synes ikke å påvirke proteinets translokasjon. Basert på disse observasjoner er både fullengde HSP70 og domene II i stand til translokalisering av andre, antigene sekvenser til celleoverflaten.

Eksempel 4: Nukleinsyrevaksine mot IPNV basert på genfusjoner med hsp70

Atlantisk lakse ( Salmo salar) pre-smolt (35-40 g), holdt i gjennomstrømning av ferskvann (fresh water), anestetiseres med benzokain fortynnet i rent akvarievann. Før vaksinering eutaniseres 6 fisk ved letal overdose av anestetikum og tappes fra kaudalvenen for preimmunserum.

Nukleinsyrevaksinene og PBS-kontroll vaksineres intramuskulært inn i den venstre dorsale flanke, akkurat under dorsalfinnen, med 50 ul vaksine. 40 fisk vaksineres pr. replikat (80 pr. gruppe, delt mellom to tanker). Etter vaksinering tillates fisken å komme seg i ferskvann (fresh water) og allokeres til den riktige tank.

Nukleinsyrevaksinene som testes er: pUKrsxHSP70-ipnVP2 og pUKrsxHSP70-ipnVP3. Disse plasmider bærer, under kontroll av en CMV-promoter, en i-rammefusjon av de fullstendige, kodende sekvenser av Arthrobacter hsp70 og IPNV VP2 eller IPNV VP3. pUKrsxHSP70-ipnVP2 er testet alene, og begge plasmider er også testet sammen.

For sammenligning, fremstilles det også plasmider som omfatter IPN VP2-protein fusert 3' av en sekvens kjent fra tidligere studier til å gi en boost for immunoprotektiv effektivitet for VP2 komponenten på rundt 20% (dvs. en "gullstandard" VP2-basert IPNV nukleinsyrevaksine). 6 uker etter vaksinering overføres fisken til sjøvann. På dagen for utfordring tas det serumprøver fra 4 fisk pr. replikatgruppe. En muskelprøve fra injeksjonssetet tas også og formalinfikseres for å se på vaksinenærvær. På dag 21 etter utfordring, hentes serumprøver fra et maksimalt antall på 4 overlevende fisk pr. replikatgruppe. Etter utfordring, fjernes mortaliteter daglig ved første observasjon og nyreprøver tas og fryses for ELISA-analyse.

Utfordringen skjer 4-6 uker etter sjøvannsoverføring, ved kohabitering med merket avkomsfisk som er utfordret ved intraperitoneal injeksjon av virulent IPNV (IO<6>cfu). Prøven avsluttes etter 20 uker.

Resultatene antyder at alle nukleinsyrevaksiner basert på VP2-sekvensen av IPNV er beskyttende mot utfordring av virusen, inkludert hsp70-VP2-fusjonen.

Eksempel 5: Rekombinant hsp70 i en vaksine mot ISAV

Atlantisk unglaks akklimatiseres i 0,5 m oppholdstanker supplert med beluftet strømmende brønnvann (10°C) i en uke før oppstart av forsøk og mates daglig gjennom hele forsøket. Hver gruppe på 55 fisk splittes i 2 tanker på 25 for å gi replikatbehandlingsgrupper. Atlantisk unglaks erfarer mellom 60 og 80% mortalitet ved utfordring med ISAV.

Fisken anestetiseres og vaksineres deretter ved intraperitoneal injeksjon med 0,2 ml saltoppløsning, eller 0,2 ml saltoppløsning inneholdende de spesifikke, rekombinante proteiner. Den negative kontroll er en PBS-injeksjon (saltoppløsning). Behandlingsgruppene: (A) His-tagget, renset Arthrobacter hsp70-rekombinant protein, 12 ug; (B) ISAV-rekombinant, His-tagget nukleokapsidprotein (NC), 12 ug; (C) His-tagget, renset Arthrobacter hsp70-rekombinant protein, 12 ug, i blanding med His-tagget ISAV NC, 12 ug; (D) His-tagget, renset Arthrobacter hsp70-rekombinant protein, 12 ug, kryssforbundet til His-tagget ISAV NC, 12 ug; (E) His-tagget, renset Arthrobacter hsp70 domene II rekombinant protein, 12 ug, i blanding med His- tagget ISAV NC, 12 ug; (F) His-tagget, renset Arthrobacter hsp70 domene II rekombinant protein, 12 ug, kryssforbundet til His-tagget ISAV NC, 12 ug.

Behandlingsgruppene D og F mottar kovalent, kryssforbundne proteiner. EDC og sulfo-NHS benyttes som kryssforbindelsesmidler og benyttes i henhold til standardprotokoller.

Det benyttes en kohabiteringsutfordring, der et lite antall laks gis en i.p. injeksjon med 0,1 ml dyrket, virulent ISAV (~10<4>TCID50pr. fisk) og settes til hver tank av behandlet fisk. Mortalitetene i hver tank overvåkes daglig.

Den relative prosentandel overlevelse bedømmes ved sammenligning av mortaliteten mellom de forskjellige behandlingsgrupper og kontroller til spesifikke tidspunkter.

Claims (14)

1. Kimær nukleinsyresekvens,karakterisert vedat den omfatter den isolerte Arthrobacter Hsp70-sekvensen fra Arthrobacter stammen deponert under aksesjonsnr. ATCC 55921 fusert i ramme til en heterolog kodende sekvens.

2. Kimær nukleinsyresekvens ifølge krav 1,karakterisert vedat Arthrobacter Hsp70-sekvensen omfatter SEQ ID nr. 1 eller en åpen leseramme bestående av nukleotidene 291-2156.

3. Kimer nukleinsyresekvens ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den heterologe kodende sekvens er utvalgt fra gruppen bestående av: IPNV-VP2 eller IPVN-VP3 eller en IS AV-sekvens.

4. Nukleinsyre-ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter en nukleinsyresekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, operativt bundet til en transkripsjonen, regulatorisk sekvens.

5. Vertscelle,karakterisert vedat den er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 4.

6. Vaksinepreparat,karakterisert vedat det omfatter den kimære nukleinsyresekvensen ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, og en farmasøytisk akseptabel bærer for vaksinering av fisk.

7. Fusjonsprotein,karakterisert vedat det omfatter den isolerte aminosyresekvensen til Arthrobacter Hsp70 fra Arthrobacter stammen deponert under aksesjonsnr. ATCC 55921 bundet til et heterologt molekyl for å danne nevnte fusjonsprotein.

8. Fusjonsprotein,karakterisert vedat det omfatter en isolert Arthrobacter Hsp70 aminosyresekvens ifølge SEQ ID nr. 2, eller et Domene-U fragment av SEQ ID nr. 2 bestående av aminosyrene 162 til 365.

9. Fusjonsprotein ifølge krav 7 eller 8,karakterisert vedat det heterologe molekylet er valgt fra et IS AV-protein bestående av: nukleokapsidprotein; hemagglutinin; polymerase; og segment 7 P4- og -P5-proteiner.

10. Vaksinepreparat,karakterisert vedat det omfatter et fusjonsprotein ifølge krav 7-9, og en farmasøytisk akseptabel bærer for vaksinering av fisk.

11. Anvendelse av eo. Arthrobacter Hsp70- nukleinsyresekvens omfattende SEQ ID nr. 1, eller en åpen leseramme fra nukleotidene 291 til 2156 ifølge SEQ ID nr. 1, eller en aminosyresekvens omfattende SEQ ID nr. 2 eller et Domene II-fragmet fra aminosyrene 162 til 365 ifølge SEQ ID nr. 2, som en vaksineadjuvans for fremstilling av et vaksinepreparat for vaksinering av fisk.

12. Anvendelse av en Arthrobacter Hsp70 kimær nukleinsyresekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, eller et Arthrobacter Hsp70 fusjonsprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 9, for fremstilling av et medikament for forebyggelse eller behandling av infeksiøs sykdom hos fisk.

13. Anvendelse ifølge krav 11 eller 12, der sykdommen er infeksiøs pankreatisk nekrose-virus (IPNV) eller infeksiøs lakseanemivirus (ISAV).

14. Anvendelse ifølge krav 11 eller 12, der sykdommen er bakteriell nyresykdom (BKD) eller salmonid Rickettsial Septicaemia (SRS).