PT1200132E - Sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos do vírus da anemia infecciosa do salmão e sua utilização como vacinas - Google Patents
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Description
ΡΕ1200132 ι DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS E DE AMINOÁCIDOS DO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA DO SALMÃO E SUA UTILIZAÇÃO COMO VACINAS" A presente a invenção refere-se a uma vacina para peixes. Mais especificamente a invenção refere-se a uma vacina para proteger o salmão contra o vírus da anemia infecciosa do salmão. 0 vírus da anemia infecciosa do salmão (ISAV) causa mortalidade nos viveiros de salmão do atlântico. Normalmente o rendimento da aquacultura é reduzido até 30%. Deste modo, existe uma necessidade de uma vacina eficaz contra o ISAV. É um dos objectivos da invenção fornecer uma vacina para proteger contra o ISAV.
De acordo com a presente invenção é fornecida uma composição contendo pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos e ou pelo menos uma sequência de aminoácidos, ou um análogo preparado sinteticamente daí resultante ou uma sequência substancialmente homóloga, em que a composição é derivada de ou baseada no vírus da anemia infecciosa do salmão e em que pelo menos uma das referidas sequências de 2 ΡΕ1200132 nucleótidos e/ou de aminoácidos não causa anemia no salmão e é passível de ser utilizada como ou para preparar uma vacina para o ISAV.
Uma sequência de ácidos nucleicos substancialmente homóloga é uma sequência que pode ser transcrita e/ou traduzida para fornecer uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga a pelo menos uma parte do antigénio de superfície presente em ISAV.
Preferencialmente os aminoácidos substancialmente homólogos são pelo menos 70% homólogos com uma parte de um antigénio de superfície de ISAV o qual é capaz de induzir uma resposta imune.
Mais preferencialmente a sequência de aminoácidos substancialmente homóloga é pelo menos 80% homóloga com uma parte de um antigénio de superfície de ISAV e pode induzir uma reposta imune.
Ainda mais preferencialmente a sequência de aminoácidos substancialmente homóloga é pelo menos 90% homóloga com uma parte de um antigénio de superfície de ISAV e pode induzir uma reposta imune.
Convenientemente a sequência de aminoácidos é escolhida a partir do grupo que compreende as Sequências ID números 2, 4, 6, 7, 8 ou 10 como descrito aqui. 3 ΡΕ1200132
Alternativamente a sequência de aminoácidos pode conter pelo menos um fragmento das Sequências ID números 2, 4, 6, 7, 8 ou 10.
Alternativamente a referida sequência de aminoácidos pode ser truncada a partir da sequência de aminoácidos das Sequências ID números 2, 4, 6, 7, 8 ou 10 como descrito aqui, o que pode induzir uma resposta imune.
Preferencialmente a sequência de nucleótidos substancialmente homóloga é pelo menos 60% homóloga com uma parte de uma sequência de ácidos nucleicos de um antigénio de superfície de ISAV e o produto da tradução daí resultante é capaz de induzir uma reposta imune.
Preferencialmente a sequência de nucleótidos substancialmente homóloga codifica pelo menos 70% de homo-logia com uma parte de uma sequência de ácidos nucleicos de um antigénio de superfície de ISAV, o produto da tradução da qual é capaz de induzir uma reposta imune.
Mais preferencialmente a sequência de nucleótidos substancialmente homóloga codifica pelo menos 80% de homologia com uma parte de uma sequência de ácidos nucleicos de um antigénio de superfície de ISAV, o produto da tradução da qual é capaz de induzir uma reposta imune.
Ainda mais preferencialmente a sequência de nucleótidos substancialmente homóloga é pelo menos 90% de homóloga a uma parte de uma sequência de ácidos nucleicos 4 ΡΕ1200132 de um antigénio de superfície de ISAV, o produto da tradução da qual é capaz de induzir uma reposta imune.
Convenientemente as sequências de nucleótidos são escolhidas a partir do grupo que compreende as Sequências ID números 1, 3, 5 ou 9 como descrito aqui.
Alternativamente, a invenção fornece fragmentos das sequências descritas nas Sequências ID números 1, 3, 5 ou 9 como descrito aqui e em que os produtos de tradução dos referidos fragmentos resultam na indução de uma resposta imune.
Adicionalmente, as sequências podem compreender uma forma truncada das sequências designadas como 1, 3, 5 ou 9. A sequência de nucleótidos pode ser incorporada num plasmideo. A sequência de nucleótidos pode ser incorporada num vector de expressão adequado.
Um aspecto adicional da presente invenção permite a utilização de uma sequência escolhida a partir do grupo constituído pelas sequências ID números 1 a 10, como descrito na presente invenção na preparação de uma vacina e/ou medicamente terapêutico para a protecção do peixe contra a infecção com o vírus da anemia infecciosa do salmão. 5 ΡΕ1200132
As sequências de ácidos nucleicos típicas são a ISA2cd (referida anteriormente como pl.38), ISAlmta (referida anteriormente como p8.17), ISA3mx (referida anteriormente como ρβ.28) e ISA4ha.
As sequências de peptídeos são preferencialmente transcritas e traduzidas a partir quer de uma, de duas ou de todas as sequências de ácidos nucleicos; ISA2cd, ISAlmta, ISA3mx ou ISA4ha e são incorporadas numa estratégia de vacinação com o objectivo de induzir uma resposta imune a um antigénio de superfície de ISAV e consequentemente ao próprio vírus da anemia infecciosa do salmão. A invenção permite a utilização de sequências de ácidos nucleicos ou de sequências de peptídeos como definidas aqui na preparação de uma vacina para a protecção do peixe contra ISAV. A invenção fornece também uma vacina para proteger o peixe contra o ISAV em que a vacina inclui sequências de ácidos nucleicos ou de peptídeos como definidas aqui.
Caracterização das Novas Sequências da Invenção
As figuras anexas descrevem a invenção em maior detalhe, sendo que; 6 ΡΕ1200132 A Figura 1 é a sequência de nucleótidos de ISA2cd, A Figura 2 é a sequência de aminoácidos que é obtida da tradução da sequência de nucleótidos de ISA2cd apresentada na Figura 1, A Figura 3 a sequência de nucleótidos de ISAlmta, A Figura 4 é a sequência de aminoácidos que é obtida seguindo a transcrição da sequência de ácido nucleico apresentada na Figura 3, A Figura 5 é a mesma sequência de nucleótidos da ISA3mx, A Figura 6a é a sequência de aminoácidos (Ml) que é traduzida a partir da sequência de ácido nucleico não processada de ISA3mx apresentada na Figura 5, A Figura 6b é a sequência de aminoácidos (M2) que é traduzida a partir da sequência de ácido nucleico processada de ISA3mx apresentada na Figura 5, e A Figura 6c é a sequência de aminoácidos (M3) que é traduzida a partir da sequência de ácido nucleico não processada de ISA3mx como apresentada na Figura 5.
Adicionalmente, a informação detalhada do peso 7 ΡΕ1200132 molecular específico, (PM) e dos pontos de focagem iso-eléctrica teóricos (pi) é apresentada com as respectivas listagens da sequência de aminoácidos.
As sequências de nucleótidos e de aminoácidos apresentadas nas figuras são depois representadas nas listagens anexas das sequências criadas na Patente em que; A Sequência ID número 1 é a sequência de nucleótidos de ISA2cd, como apresentada na Figura 1, A Sequência ID número 2 é a sequência de aminoácidos de ISA2cd, como apresentada na Figura 2, A Sequência ID número 3 é a sequência de nucleótidos de ISAlmta, como apresentada na Figura 3, A Sequência ID número 4 é a sequência de aminoácidos de ISAlmta, como apresentada na Figura 4, A Sequência ID número 5 é a sequência de nucleótidos de ISA3mx, como apresentada na Figura 5, A Sequência ID número 6 é a sequência de aminoácidos predita do produto não processado de ISA3mx, como apresentada na Figura 6a, A Sequência ID número 7 é a sequência de aminoácidos predita de ISA3mx processado, como apresentada na Figura 6b, ΡΕ1200132 A Sequência ID número 8 é a sequência de aminoácidos predita de ISA3mx processado, como apresentada na Figura 6c, A Sequência ID número 9 é a sequência de nucleótidos de ISA4ha, como previamente apresentada na Figura 7, e A Sequência ID número 10 é a sequência de aminoácidos de ISA4ha, como previamente apresentada na Figura 8.
As sequências genéticas apresentadas para ISAlmta e ISA2cd e as sequências genéticas processadas e não processadas para ISA3mx derivaram de cDNA clonado em que os clones de cDNA derivavam do material genómico do vírus da anemia infecciosa do salmão (ISAV). O material clonado foi sequenciado a partir das extremidades 5' e 3' dos sítios de inserção utilizando sobreposição de amplicões para produzir um contig. A veracidade do contig foi confirmada por amplificação pela reacção de polimerização em cadeia via transcriptase reversa (RT-PCR) de amplicões de tamanho apropriado a partir de tecido de salmão infectado com ISAV e de culturas de tecidos. Tais amplicões foram no entanto obtidos a partir de material de controlo não infectado, indicando que o material genético era de origem do ISAV.
As janelas de leitura aberta (ORFs) foram com- 9 ΡΕ1200132 pletas pela rápida amplificação das extremidades de cDNA (RACE) a partir da sequência incompleta da cultura de tecido infectada com o vírus.
Foram efectuadas correcções para o mRNA transcrito in vivo que não eram notórias nos cDNAs originalmente clonados. A ORF de ISA2cd não possui qualquer homologia significativa da sequência de nucleótidos ou de aminoácidos com submissões anteriores em bases de dados acessíveis por BLAST. No entanto, as proteínas com pesos moleculares similares (PM) e pontos isoeléctricos (pi) incluem 14 proteínas virais na base de dados da Swiss-Prot tal como a Hemaglutinina-Neuraminidase. A ORF de ISAlmta não possui também qualquer homologia significativa com proteínas previamente caracte-rizadas submetidas em bases de dados de pesquisa BLAST. No entanto, é interessante notar que as características de peso molecular e do ponto isoeléctrico (68-69 kDa e pi 8,2) são praticamente idênticas a uma das proteínas virais mais predominantes identificada por electroforese a duas dimensões. A proteína aparenta estar integralmente associada com as membranas das culturas de tecido infectadas com ISAV. Se a ORF contém tal proteína deve ser considerada importante em qualquer estratégia de vacinação para reduzir o nível da infecção de ISAV em qualquer das espécies de salmão. 10 ΡΕ1200132
Seguidamente, nas sequências apresentadas para ISA3mx, a ORF não processada (a base para a sequência de aminoácidos Ml predita) não possui qualquer homologia significativa ao nivel da sequência de nucleótidos ou de aminoácidos com a submissão anterior nas bases de dados acessíveis por BLAST. No entanto, as proteínas com pesos moleculares similares e pontos de focagem isoeléctrica incluem diversas proteínas de envelope e do invólucro virai listadas na base dados da Swiss-Prot. Ambas as proteínas preditas Ml e M2 (obtidas a partir de ORF's após o processamento da sequência de nucleótidos) são predizíveis por serem proteínas associadas à membrana e se as ORFs codificadas por ISA3mx produzirem tais proteínas devem ser consideradas importantes em qualquer estratégia de vacinação para reduzir o nível de infecção por ISAV em qualquer das espécies de salmão. A proteína de tradução predita de M3 (apresentada na figura 6c e a listagem da sequência anexa) demonstra homologia com uma proteína de fusão de um paramixovírus associada com a membrana celular e pensa-se estar envolvida na adesão celular. Devido a esta homologia exibida, a M3 é potencialmente importante em qualquer estratégia de vacinação destina a reduzir o nível de infecção por ISAV em qualquer das espécies de salmão. A sequência seguinte relativa à sequência de nucleótidos de ISA4ha foi obtida recorrendo ao seguinte procedimento. A proteína ISA4ha foi detectada por anti- 11 ΡΕ1200132 corpos policlonais seguidamente à hibridização. Descobriu-se que a proteína ocorre em duas formas alternativas. Estas duas formas alternativas são de tamanhos diferentes, e podem ser observadas onde as proteínas estão em cultura em diferentes linhas celulares, por exemplo shc e chse.
Como estas duas formas alternadas são ambas detectáveis por anticorpos e variam de tamanho dependendo de como são crescidas, a proteína é potencialmente uma boa candidata para a virulência. A proteína foi isolada e sequenciada, resultando na produção de um fragmento de 24 aminoácidos. Quando esta sequência foi submetida, em bases de dados de pesquisa BLAST, apresentou similaridades com sequências de estirpes de ISAV Britânicas e Norueguesas.
Subsequentemente, os iniciadores foram desenhados com base na sequência de aminoácidos obtida, juntamente com referência ás sequências conhecidas para as estirpes similares Britânicas e Norueguesas.
Os iniciadores foram então subsequentemente utilizados na reacção de polimerização em cadeia para amplificar o fragmento de DNA relevante, que foi subsequentemente sequenciado e traduzido num aminoácido codifi-cante.
As listagens das janelas de leitura abertas obti 12 ΡΕ1200132 das na presente invenção, possuem particular valor comercial pelas seguintes razões: 1. Existe razão suficiente para acreditar que os nucleótidos correspondentes ás sequências de aminoácidos são de origem ISAV. Assim, a sua incorporação em vacinas de ácido nucleico pode ter um impacto na redução da mortalidade nos viveiros de salmão do atlântico causada por ISAV o que foi anteriormente mencionado, podendo normalmente reduzir o rendimento da aquacultura até 30%. 2. A caracterização deste produto de gene irá levar à identificação dos elementos chave na patogénese da infecção e ao desenvolvimento de teste de diagnóstico mais precisos os quais irão ajudar também nos estudos epide-miológicos documentando a disseminação de diferentes estirpes da doença.
As sequências de nucleótidos ISAlmta, ISA2cd, ISA3mx, ISA4ha e de associações dai derivadas quando traduzidas em sequências de proteínas compostas por quaisquer aminoácidos idênticos ou equivalentes, devem induzir uma resposta pelo sistema imune dos hospedeiros. Este principio pode também ser alargado para utilizar estas proteínas em teste de diagnóstico e em procedimentos de vacinação. ΡΕ1200132 13
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Aqua Health (Europa) Limited Griffiths, Steven Ritchie, Rachael <120> Sequência
<13 0> P2 42 6 8-/GST/RMC <150> GB9918588,6 <151> 1999-07-08 <150> GB0005848,7 <151> 2000-03-11 <150> GB0006674,6 <151> 2000-03-21 <16 0> 10 <170> Patenteln versão 3,0
<210> 1 <211> 1821 <212> DNA <213> Vírus da Anemia do Salmão <40 0> 1 eaagatggat €0 tgetsctgaa .aqttdggstg cqtttctaag tgattfcgaga catçtataca tgcgtgttg 12 0 tttetgtg&t çaacacaaaa eoac-tggâgã cgãateaaga fctesecãácc tggaattas? t ISO· tgassàagat gasfjcactag ftgccôaaag g 24 0 ãctgasaaag gfcdãttgããfc fctacífcfctts aggtfeefctta ggsgasgttç ttgaccàtgà 14 ΡΕ1200132 £ tt.ctggsagc fefcgfc&tafcfcg çcgaacaaag aaagsg^aag acfc.caagcag asfccaataa fc
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<212> DNA <213> Vírus da Anemia do Salmão 19 ΡΕ1200132 <400> 3 gcaaagatyg çtçaaatcoc aasaataata gggasaacgt ata&gag&tg gccgatasa ST §0 gt&tg&etxa ttcttttgae gteagagaca acaccttggt tgtaaga&ga fecc-accgct â 120 ctaaaagtgg cattaagatc tcctacagag· aggatogagg aacateactt eeceaaaag g
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<212> PRT <213> Vírus da Anemia do Salmão <400> 6 Hâsfc Sè£ Gly Vai Va .i. Phe
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<210> PRT <210> Vírus da Anemia do Salmão 10 <40 0> 31 ΡΕ1200132
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Lisboa, 28 de Setembro de 2006
Claims (17)
- ΡΕ1200132 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos escolhida a partir do grupo constituído pelas Sequências ID números 2, 4, 6, 7, 8 e 10; sequências substancialmente homólogas sendo além disso pelo menos 70% homólogas, e fragmentos das sequências ID números 2, 4, 6, 7, 8 e 10 em que a referida sequência de amino ácidos é capaz de induzir uma resposta imune.
- 2. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma sequência de aminoácidos é uma forma truncada de uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo constituído pelas Sequências ID Números 2, 4, 6, 7, 8 e 10.
- 3. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma sequência de aminoácidos é a Sequência ID número 2, ou é uma sequência substancialmente homóloga sendo além disso pelo menos 70% homóloga, ou um fragmento da Sequência ID número 2.
- 4. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas sequências substancialmente homólogas são pelo menos 80% homólogas.
- 5. Uma composição de acordo com a reivindicação 2 ΡΕ1200132 4, em que as referidas sequências substancialmente homólogas são pelo menos 90% homólogas.
- 6. Uma composição de acordo com a reivindicação 5, em que a referida sequência de aminoácidos é a Sequência ID número 10 e as sequências substancialmente homólogas sendo além disso pelo menos 90% homólogas.
- 7. Uma composição compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico escolhida a partir do grupo constituído pelas Sequências ID números 1, 3, 5 e 9; sequências substancialmente homólogas sendo além disso pelo menos 70% homólogas, e fragmentos das sequências ID números 1, 3, 5 ou 9 em que o produto da tradução da referida sequência de ácido nucleico é capaz de induzir uma resposta imune.
- 8. Uma composição de acordo com a reivindicação 7, em que pelo menos uma sequência de ácido nucleico é uma forma truncada de qualquer das Sequências ID números 1, 3, 5 ou 9 .
- 9. Uma composição de acordo com a reivindicação 7 em que pelo menos uma sequência de ácido nucleico é a Sequência ID número 1, ou é uma sequência substancialmente homóloga sendo além disso pelo menos 70% homóloga, ou um fragmento da Sequência ID número 1. 3 ΡΕ1200132
- 10. Uma composição de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 9, em que as referidas sequências substancialmente homólogas são pelo menos 80% homólogas.
- 11. Uma composição de acordo com a reivindicação 10, em que as referidas sequências substancialmente homólogas são pelo menos 90% homólogas.
- 12. Uma composição de acordo com a reivindicação 11, em que a referida sequência de ácido nucleico é a Sequência ID número 9 e as sequências substancialmente homólogas sendo além disso pelo menos 90% homólogas.
- 13. Uma composição de acordo com qualquer das reivindicações de 7 a 12, em que a sequência de ácido nucleico é incorporada num plasmideo.
- 14. Uma composição de acordo com qualquer das reivindicações de 7 a 13, em que a sequência de ácido nucleico é incorporada num vector de expressão.
- 15. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 14 na preparação de uma vacina e/ou um medicamento terapêutico para a protecção do peixe contra a infecção com o Virus da Anemia Infecciosa do Salmão.
- 16. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 12 na preparação de um 4 ΡΕ1200132 teste de diagnóstico para a detecçao da presença no peixe da infecção com o Vírus da Anemia Infecciosa do Salmão.
- 17. Uma vacina compreendendo a composição de qualquer uma das reivindicações de 1 a 14. Lisboa, 28 de Setembro de 2006
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