ES2267553T3 - Secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos del virus de la anemia infecciosa del salmon y sus usos como vacunas. - Google Patents
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Abstract
Una composición que contiene al menos una secuencia de aminoácidos escogida del grupo que consiste de las Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 y 10; secuencias sustancialmente homólogas siendo al menos 70% homólogas a ellas, y fragmentos de las Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 y 10 en donde dicha secuencia de aminoácidos es capaz de inducir una respuesta inmune.
Description
Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos
del virus de la anemia infecciosa del salmón y sus usos como
vacunas.
La presente invención se relaciona con una
vacuna para peces. Más específicamente la invención se relaciona
con una vacuna para proteger al salmón contra el virus de la anemia
infecciosa del salmón.
El virus de la anemia infecciosa del salmón
(ISAV) causa la mortalidad del salmón atlántico de piscifactoría.
Típicamente la rentabilidad de la acuacultura se reduce en más de un
30%. Por lo tanto, existe la necesidad de una vacuna efectiva
contra el ISAV.
Un objetivo de la presente invención es la de
proveer una vacuna que sirva de protección contra la ISAV.
De acuerdo con la presente invención, se provee
una composición que contiene al menos una secuencia de ácido
nucleico y/o al menos una secuencia de aminoácidos, o un análogo del
mismo preparado en forma sintética o una secuencia sustancialmente
homóloga, en donde la composición se deriva de, o se basa en el
virus de la anemia infecciosa del salmón y en donde al menos una de
dichas secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos no causan
anemia al salmón puede ser utilizada como o para preparar una vacuna
para el ISAV.
Una secuencia sustancialmente homóloga de ácido
nucleico es una secuencia que se puede transcribir y/o traducir
para proveer una secuencia de aminoácidos que sea sustancialmente
homóloga al menos a una parte de un antígeno de superficie presente
sobre el ISAV.
Preferiblemente el aminoácido sustancialmente
homólogo es al menos 70% homólogo con una parte de un antígeno de
superficie del ISAV que es capaz de inducir una respuesta
inmune.
Más preferiblemente, la secuencia
sustancialmente homóloga de aminoácidos es al menos 80% homóloga con
una parte de un antígeno de superficie del ISAV y puede inducir una
respuesta inmune.
Lo más preferible, la secuencia sustancialmente
homóloga de aminoácidos es al menos 90% homóloga con una parte de
un antígeno de superficie del ISAV y puede inducir una respuesta
inmune.
Convenientemente, la secuencia de aminoácidos se
escoge del grupo que contiene las Secuencias Identificadas con los
números 2, 4, 6, 7, 8 ó 10 como se las describe aquí.
Alternativamente, la secuencia de aminoácidos
puede contener al menos un fragmento de las Secuencias Identificadas
con los números 2, 4, 6, 7, 8 ó 10.
Alternativamente, dicha secuencia de aminoácidos
se puede truncar de una secuencia de aminoácidos de las Secuencias
Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 ó 10 como se las
describe aquí, que pueden inducir una respuesta inmune.
Preferiblemente, la secuencia sustancialmente
homóloga de nucleótidos es al menos 60% homóloga con una parte de
una secuencia de ácidos nucleicos de un antígeno de superficie del
ISAV y el producto de la traducción del mismo es capaz de inducir
una respuesta inmune.
Preferiblemente, la secuencia sustancialmente
homóloga de nucleótidos codifica al menos 70% de los homólogos con
una parte de una secuencia de ácidos nucleicos de un antígeno de
superficie del ISAV, cuyo producto de traducción es capaz de
inducir una respuesta inmune.
Más preferiblemente, la secuencia
sustancialmente homóloga de nucleótidos codifica al menos 80% de los
homólogos con una parte de una secuencia de ácidos nucleicos de un
antígeno de superficie del ISAV, cuyo producto de traducción es
capaz de inducir una respuesta inmune.
Lo más preferible, la secuencia sustancialmente
homóloga de nucleótidos codifica al menos 90% de los homólogos con
una parte de una secuencia de ácidos nucleicos de un antígeno de
superficie del ISAV, cuyo producto de traducción es capaz de
inducir una respuesta inmune.
Convenientemente, las secuencias de nucleótidos
se escogen del grupo que contiene las Secuencias Identificadas con
los números 1, 3, 5 ó 9 como se las describe aquí.
Alternativamente, la invención provee fragmentos
de las secuencias descritas en las Secuencias Identificadas con los
números 1, 3, 5 ó 9 como se las describe aquí y en donde los
productos de traducción de dichos fragmentos resultan en la
inducción de una respuesta inmune.
Adicionalmente, las secuencias pueden contener
una forma truncada de las secuencias dadas como 1, 3, 5 y 9.
La secuencia de nucleótidos se puede incorporar
en un plásmido.
La secuencia de nucleótidos se puede incorporar
en un vector de expresión apropiado.
Un aspecto adicional de la presente invención
dispone el uso de una secuencia escogida del grupo que consiste de
las Secuencias Identificadas con los números 1 a 10, como se
describe en la presente invención en la preparación de una vacuna
y/o de un medicamento terapéutico para la protección de los peces de
la infección con el virus de la Anemia Infecciosa del Salmón.
Las secuencias típicas de ácido nucleico son
ISA2cd (previamente conocida como p1.38), ISA1mta (previamente
conocida como p8.17), ISA3mx (previamente conocida como p6.28) e
ISA4ha.
Preferiblemente, las secuencias de péptidos se
transcriben y se traducen ya sea a partir de uno, dos o todas las
secuencias de ácido nucleico; ISA2cd, ISA1mta, ISA3mx o ISA4ha y se
incorporan en una estrategia de vacunación dirigida a inducir una
respuesta inmune en un antígeno de superficie del ISAV y por lo
tanto en el virus de la anemia infecciosa del salmón en si
mismo.
La invención dispone el uso de secuencias de
ácido nucleico o de secuencias de péptidos como las definidas aquí
en la preparación de una vacuna para la protección del pez contra el
ISAV.
La invención dispone además de una vacuna para
proteger al pez contra el ISAV en donde la vacuna incluye secuencias
de ácido nucleico o de péptido como las definidas aquí.
Las figuras acompañantes describen la invención
con más detalle, en donde:
La Figura 1 es la secuencia de nucleótidos de
ISA2cd,
La Figura 2 es la secuencia de aminoácidos que
se obtiene a partir de la traducción de la secuencia de ácido
nucleico ISA2cd enlistada en la Figura 1,
La Figura 3 es la secuencia de nucleótidos de
ISA1mta,
La Figura 4 es la secuencia de aminoácidos que
se obtiene después de la trascripción de la secuencia de ácido
nucleico enlistada en la Figura 3,
La Figura 5 es la secuencia exacta de
nucleótidos de ISA3mx,
La Figura 6a es la secuencia de aminoácidos (M1)
que se traduce a partir de la secuencia no empalmada de ácido
nucleico de ISA3mx mostrada en la Figura 5,
La Figura 6b es la secuencia de aminoácidos (M2)
que se traduce a partir de la secuencia empalmada de ácido nucleico
de ISA3mx mostrada en la Figura 5, y
La Figura 6c es la secuencia de aminoácidos (M3)
que se traduce a partir de la secuencia no empalmada de ácido
nucleico de ISA3mx como se muestra en la Figura 5.
Además, la información que detalla el peso
molecular específico (MW) y los puntos teóricos de enfoque
isoeléctrico (pl) se da al pie del respectivo listado de secuencia
de aminoácidos.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
mostradas en las figuras se representan adicionalmente en el
listado acompañante de secuencia generado por
Patent-In, en donde:
El número de Identificación de Secuencia 1 es la
secuencia de nucleótidos de ISA2cd, como la mostrada en la figura
1,
El número de Identificación de Secuencia 2 es la
secuencia de aminoácidos de ISA2cd, como la mostrada en la figura
2,
El número de Identificación de Secuencia 3 es la
secuencia de nucleótidos de ISA1mta, como la mostrada en la figura
3,
El número de Identificación de Secuencia 4 es la
secuencia de aminoácidos de ISA1mta, como la mostrada en la figura
4,
El número de Identificación de Secuencia 5 es la
secuencia de nucleótidos de ISA3mx, como la mostrada en la figura
5,
La Secuencia Identificada con el número 6 es la
secuencia predicha de aminoácidos del producto no empalmado de
ISA3mx, como la mostrada en la figura 6a,
La Secuencia Identificada con el número 7 es la
secuencia predicha de aminoácidos de ISA3mx empalmada, como la
mostrada en la figura 6b,
La Secuencia Identificada con el número 8 es la
secuencia predicha de aminoácidos de ISA3mx empalmada, como la
mostrada en la figura 6c,
La Secuencia Identificada con el número 9 es la
secuencia de nucleótidos de ISA4ha, como la mostrada previamente en
la figura 7, y
La Secuencia Identificada con el número 10 es la
secuencia de aminoácidos de ISA4ha, como la mostrada previamente en
la figura 8.
Las secuencias genéticas mostradas para ISA1mta
e ISA2cd y las secuencias genéticas empalmadas y no empalmadas para
ISA3mx se han derivado a partir del ADNc clonado, en donde los
clones del ADNc se derivaron del material genómico del virus de la
anemia infecciosa del salmón (ISAV). El material clonado se
secuenció a partir de los sitios de inserción del extremo 5' y del
extremo 3' utilizando amplicones de superposición para producir una
secuencia contigua.
La veracidad de la secuencia contigua se
confirmó por medio de la amplificación por medio de la Reacción en
Cadena de la Polimerasa de la Transcriptasa Inversa
(RT-PCR) de los amplicones de tamaño apropiado de
tejido de salmón infectado con ISAV y de cultivos de tejido. Tales
amplicones se obtuvieron sin embargo a partir de material de
control no infectado, indicando que el material genético era
originario del ISAV.
Los marcos de lectura abierta (ORF) se
completaron por medio de una amplificación rápida de los extremos
del ADNc (RACE) a partir de la secuencia incompleta del cultivo de
tejido infectado con el virus. Las correcciones fueron hechas para
el ARNm trascrito in vivo que no fuera claro a partir de los
ADNc originalmente clonados.
El ORF de ISA2cd no tiene ninguna homología
significativa en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos con
sometimiento previo a bases de datos accesibles por medio de BLAST.
Sin embargo, las proteínas con pesos moleculares (Mw) y puntos
isoeléctricos (pI) similares incluyen 14 proteínas virales en la
base de datos Swiss-Prot tal como la
hemaglutinina-Neuraminidasa.
El ORF de ISA1mta no tiene tampoco ninguna
homología significativa con las proteínas previamente caracterizadas
sometidas a las bases de datos investigables por BLAST. Sin
embargo, es interesante que tenga características de peso molecular
y de punto isoeléctrico (68-69 kDa y pI 8,2) que son
casi idénticas a las de una de las proteínas virales más
predominantes identificadas por medio de electroforesis en dos
dimensiones. La proteína parece estar integralmente asociada con
las membranas de los cultivos de tejido infectados con el ISAV. Si
el ORF produce tal proteína se lo consideraría valioso en cualquier
estrategia de vacunación para reducir el nivel de infección del
ISAV en cualquier especie salmonoide.
Además, en las secuencias mostradas para ISA3mx,
el ORF no empalmado (la base para la secuencia predicha de
aminoácidos M1) no tiene ninguna homología significativa a nivel de
la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos con el sometimiento
previo a las bases de datos accesibles por medio de BLAST. Sin
embargo, las proteínas con pesos moleculares y puntos isoeléctricos
similares incluyen a varias proteínas de envoltura y recubrimiento
viral enlistadas en la base de datos Swiss-Prot.
Tanto las proteínas predichas M1 como M2 (obtenidas a partir de los
ORF después del empalme de la secuencia de nucleótidos) se predice
que son proteínas asociadas a la membrana y si los ORF codificados
por ISA3mx producen tales proteínas se consideraría valioso en
cualquier estrategia de vacunación para reducir el nivel de
infección del ISAV en cualquier especie salmonoide.
La traducción predicha de la proteína de M3
(mostrada en la figura 6c y el listado de secuencia acompañante)
muestra homología con una proteína de fusión del paromixovirus
asociada con la membrana celular y se piensa que está involucrada
en la adhesión celular. En vista de esta homología exhibida, M3 es
potencialmente valioso en cualquier estrategia de vacunación
dirigida a reducir el nivel de infección del ISAV en cualquier
especie salmonoide.
La secuencia adicional relacionada con la
secuencia de nucleótidos de ISA4ha se obtuvo por medio del siguiente
procedimiento. La proteína de ISA4ha se detectó por medio de
anticuerpos policlonales después de hibridación. Se encontró que la
proteína se presenta en dos formas alternativas. Estas dos formas
alternativas son de diferentes tamaños, y pueden ser vistas donde
las proteínas se cultivan sobre diferentes líneas celulares, por
ejemplo shc y chse.
Ya que estas dos formas alternas fueron
detectadas ambas por medio del anticuerpo y variaron en tamaño
dependiendo de la forma en que se cultivaron, la proteína es
potencialmente una buena candidata para virulencia.
Se aisló y se secuenció, resultando en la
producción de un fragmento de 24 aminoácidos. Cuando se sometió
esta secuencia a las bases de datos investigables por BLAST, mostró
similitudes con las secuencias de las cepas británica y noruega del
ISAV.
Posteriormente, se diseñaron los cebadores con
base en la secuencia de aminoácidos obtenida, junto con la
referencia a las secuencias conocidas para las cepas similares
británica y noruega.
Los cebadores fueron entonces posteriormente
utilizados en la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar
el fragmento relevante de ADN, que fue posteriormente secuenciado y
traducido en la codificación de aminoácidos.
Los listados del marco de lectura abierta
obtenidos en la presente invención, tienen valor comercial
particular por las siguientes razones:
- 1.
- Existen suficientes razones para creer que las secuencias de aminoácidos que corresponden a los nucleótidos tienen origen en el ISAV. Por lo tanto, su incorporación dentro de las vacunas de ácido nucleico puede tener impacto sobre la reducción de la mortalidad del salmón atlántico de piscifactoría causado por el ISAV que como se estableció anteriormente, puede reducir típicamente el rendimiento de la acuacultura por encima del 30%.
- 2.
- La caracterización del producto génico conducirá a la identificación de elementos clave en la patogénesis de la infección y al diseño de pruebas de diagnóstico más seguras que ayudarán también en estudios epidemiológicos que documenten la diseminación de diferentes cepas de la enfermedad.
Cuando las secuencias de nucleótidos de ISA1mta,
ISA2cd, ISA3mx, ISA4ha y los derivados asociados de las mismas se
traducen en secuencias de proteína que están compuestas ya sea de
aminoácidos idénticos o equivalentes, deben inducir una respuesta
por medio del sistema inmune del huésped. Este principio puede
extenderse adicionalmente para utilizar estas proteínas en pruebas
diagnósticas y en procedimientos de vacunación.
<110> Aqua Health (Europe) Limited
\hskip1cmGriffiths, Steven
\hskip1cmRitchie, Rachael
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<120> Secuencia
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<130> P24268-/GST/RMC
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Claims (17)
1. Una composición que contiene al menos una
secuencia de aminoácidos escogida del grupo que consiste de las
Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 y 10;
secuencias sustancialmente homólogas siendo al menos 70% homólogas a
ellas, y fragmentos de las Secuencias Identificadas con los números
2, 4, 6, 7, 8 y 10 en donde dicha secuencia de aminoácidos es capaz
de inducir una respuesta inmune.
2. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 1 en donde al menos una secuencia de aminoácidos es
una forma truncada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo que consiste de las Secuencias Identificadas con los números
2, 4, 6, 7, 8 y 10.
3. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 1 en donde al menos una secuencia de aminoácidos es
la Secuencia Identificada con el número 2, o una secuencia
sustancialmente homóloga siendo al menos 70% homóloga a ella, o un
fragmento de la Secuencia Identificada con el número 2.
4. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 1 en donde dichas secuencias sustancialmente
homólogas son al menos 80% homólogas.
5. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 1 en donde dichas secuencias sustancialmente
homólogas son al menos 90% homólogas.
6. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 5 en donde dicha secuencia de aminoácidos es la
Secuencia Identificada con el número 10 y las secuencias
sustancialmente homólogas siendo al menos 90% homólogas a ella.
7. Una composición que comprende al menos una
secuencia de ácido nucleico escogida del grupo que consiste de las
Secuencias Identificadas con los números 1, 3, 5 y 9; secuencias
sustancialmente homólogas siendo al menos 70% homólogas a ellas, y
fragmentos de las Secuencias Identificadas con los números 1, 3, 5 y
9 en donde el producto de la traducción de dicha secuencia de ácido
nucleico es capaz de inducir una respuesta inmune.
8. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 7 en donde al menos una secuencia de ácido nucleico
es una forma truncada de cualquiera de las Secuencias Identificadas
con los números 1, 3, 5 ó 9.
9. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 7 en donde al menos una secuencia de ácido nucleico
es la Secuencia Identificada con el número 1, o una secuencia
sustancialmente homóloga siendo al menos 70% homóloga a ella, o un
fragmento de la Secuencia Identificada con el número 1.
10. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 7 o a la reivindicación 9 en donde dichas secuencias
sustancialmente homólogas son al menos 80% homólogas.
11. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 10 en donde dichas secuencias sustancialmente
homólogas son al menos 90% homólogas.
12. Una composición de acuerdo a la
reivindicación 11 en donde dicha secuencia de ácido nucleico es la
Secuencia Identificada con el número 9 y las secuencias
sustancialmente homólogas siendo al menos 90% homólogas a ella.
13. Una composición de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 12 en donde la secuencia de ácido nucleico
se incorpora en un plásmido.
14. Una composición de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 13 en donde la secuencia de ácido nucleico
se incorpora en un vector de expresión.
15. El uso de una composición de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la preparación de una
vacuna y/o de un medicamento terapéutico para la protección de los
peces de la infección con el Virus de la Anemia Infecciosa del
Salmón.
16. El uso de una composición de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la preparación de una
prueba diagnóstica para detectar la presencia en los peces de la
infección con el Virus de la Anemia Infecciosa del Salmón.
17. Una vacuna que contiene la composición de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
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