NO311648B1

NO311648B1 - DNA-sekvenser som kan benyttes til vaksine, forebyggende helsearbeid på fisk og akvatiske organismer og ellers innenbiomedisin, vektor, vaksine mot ILA-virus samt diagnostisk sett

Info

Publication number: NO311648B1
Application number: NO19992608A
Authority: NO
Inventors: Espen Rimstad
Original assignee: Genomar Asa
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2001-12-27
Also published as: NO992608D0; AU4957800A; DK1180041T3; EP1180041A1; NO992608L; EP1180041B2; IS2797B; WO2000072878A1; DK1180041T4; US7183404B1; EP1180041B1; CA2375800C; CA2375800A1; IS6184A

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår DNA-sekvenser som kan benyttes til vaksine, forebyggende helsearbeid på fisk og akvatiske organismer, herunder diagnostiske systemer, og ellers innen biomedisin, herunder spesielt innen human medisin og generelt innen forskning, som for eksempel modellorganisme for influensalignende virus, vektor, vaksine mot infeksiøs lakseanemi (ILA) samt diagnostisk sett.

O ppfinnelsens bakgrunn

Infeksiøs lakseanemi(ILA) er en virussykdom funnet utelukkende i Atlantisk laks (Salmo salar) i oppdrett. Sykdommen ble diagnostisert første gang i 1985 på parr (Bremnes utbruddet). Sykdommen er bare påvist på atlantisk laks som har gått i sjø eller sjøtilblandet ferskvann. Forvaltningsmessige tiltak fra myndighetenes side, som nedslakting av smittede anlegg etterfulgt av desinfeksjon og restriksjoner på salg/flytting av fisk i området, har redusert antall utbrudd fra toppårene rundt 1990, men i de senere år har sykdommen tiltatt i omfang. I utgangspunktet har ILA vært et særnorsk problem for lakseoppdrett og i 1998 hadde vi i Norge ca. 15 utbrudd. I løpet av 1997-1998 ble ILA påvist og verifisert i både Canada (97) og Skottland (98).

Sykdommen er forårsaket av en generalisert infeksjon som blant annet forårsaker alvorlig anemi og blødnings-lesjoner. Sykdommen sprer seg langsomt i et infisert oppdrettsanlegg, og dødeligheten kan variere fra 15-100%. Det finnes ingen medikamentell behandling for ILA i dag. Kontrolltiltak som iverksettes har som mål å minimalisere risikoen for at laksen utsettes for ILA-virus smitte. Påvisning av smitte innebærer slakting av all fisk i et rammet anlegg og desinfisering av lokalitetene. Det finnes i dag ingen tilgjengelig vaksine.

På grunn av de store økonomiske belastninger sykdommen innebærer både samfunnsmessig og for den enkelte oppdretter er det viktig å ha en god og sikker diagnostikk av sykdommen. Diagnostikk av ILA er i dag fremdeles basert på en kombinasjon av makroskopiske og mikroskopiske observasjoner av død/døende fisk (patologisk/histologiske undersøkelser). I den senere tid er det også lykkes å dyrke ILA-virus i cellekultur (1), noe som er meget tid- og ressurskrevende. Det er også utvikelet en indirekte immunfluorescenstest for påvisning av agens, som kan benyttes på vevssnitt og vevsavtrykk (2). Det er også utviklet en hurtigtest -en RT-PCR(revers transkriptase polymerasekjedereaksjon)-test til å påvise ILA-virus i laks. Den kan også benyttes i ILA-virus infisert fisk uten sykdomstegn (3). Denne testen er klar til bruk i både diagnostisk og masseundersøkelses sammenheng.

Det mest aktuelle for forebyggende behandling mot ILA, er utvikling av vaksine og bearbeiding av laksens naturlige forsvarssystem.

ILA-virus har et enkeltrådet RNA genom med negativ polaritet, som består av 8 segmenter. Total størrelse på segmentene er 14,5 Kb (l,5x!0<3>basepar). Viruset replikerer i kjernen. Det er et 100-120 nm stort kappevirus med 10nm peplomerer, og det avsnøres fra cellemembranen ved knoppskyting. Opptak av ILA-virus i celler er pH-avhengig. ILA virus har både hemagglutinerende og hemadsorberende egenskaper (3). Alle disse egenskapene peker i retning av at viruset hører inn under familien Orthomyxoviridae og dermed er et influensalignende virus.

Immunsystemet hos laks har mange likhetstegn med immunsystemet hos pattedyr. Det er derfor mulig å trekke mange paralleller. Fisk har immunkompetente celler som bl.a. B- og T-lymfocytter, samt lymfokiner, komplement og produksjon av immunglobuliner. Oppdrettslaks vaksineres i dag effektivt mot de mest aktuelle bakterieinfeksjoner som kan gi sykdom hos laks. På det norske markedet eksisterer det også vaksiner mot infeksiøs pankreasnekrose, som er en virusinfeksjon, men disse gir ikke god nok beskyttelse mot sykdommen. Behovet for nye og mer effektive vaksiner mot virussykdommer hos oppdrettsfisk er stort. DNA-vaksine fremstår idag som en av de mest aktuelle kandidatene, og har vært beskrevet i flere sammenhenger (4). Ved DNA-immunisering mot bl.a. influensavirus er det observert en beskyttende effekt ikke bare mot den antigene varianten av influensavirus som var opphav til DNA-vaksinen, men også mot andre antigent ulike influensavirus (5). Den brede immunresponsen kan muligens forklares med en god cellulær respons. Det er naturlig å anta at en god cellulær immunrespons vil gi en langt bedre beskyttelse mot ILA enn bare humoral immunrespons. Dette fordi den cellulære immunresponsen er rettet mot et bredere spekter av antigener, og i tillegg er en cellulær respons mer langvarig.

Interferonsystemet er også en interessant del av fiskens immunforsvar mot influensa-lignende virus og dermed ILA. Interferonene induserer hemming av formering av mange ulike virus og er av særlig viktighet i fasen før den spesifikke immunresponsen er etablert. Interferon-induserte proteiner, kalt Mx-proteiner, er spesielt effektive hemmere av influensavirus. Mus som mangler et funksjonelt Mx-gen vil for eksempel ikke overleve en influensavirusinfeksjon (6). Hos laksen er det også påvist Mx-gener (7), men disse synes ikke å hemme ILA-virus tilstrekkelig til å hindre sykdom. Muligens har ILA-virus tilpasset seg laks så godt, at den kan formere seg til tross for laksens Mx-respons. Mx-proteiner fra både menneske og mus ser ut til å hemme formering av ILA-virus i cellekutur (8).

Det er relativt stor likhet mellom Mx-gener hos pattedyr, fugler og fisk, noe som indikerer at infeksjoner med influensalignende virus har vært en alvorlig trussel for artene og som har forårsaket et seleksjonspress til fordel for individer med Mx-gener. Det er derfor grunn til å anta at influensa-lignende virus har eksistert i det marine miljø i lang tid. Oppdrett av laksefisk i sjøvann har tilrettelagt forholdene for effektiv spredning og oppformering av virus, og utbrudd av ILA er derfor en påminnelse om eksistensen av influensalignende virus i det marine miljø. Et sikkert ILA-virus reservoar i det marine miljø er ennå ikke påvist, noe som vanskeliggjør det forebyggende arbeid.

Det er vist ved elektromikroskopi (9) at ILA-virus avsnøres fra endotelceller i blodkar i flere ulike organer. Etter eksperimentelle smitteforsøk er det påvist viruspartikler i de fleste organer, noe som er forskjellig fra en infeksjon med influensavirus hos menneske, hvor virusinfeksjonen vanligvis er begrenset til respirasjonssystemet. Orthomyxsovirus har 3-4 ulike overflateproteiner, hemagglutinin anses som særlig viktig og er ansvarlig for blant annet valg av vertscelle, dette på grunn av reseptorgjenkjenning og dermed bindingen til vertscellen. Det er sannsynlig at hemagglutinin har samme rolle hos ILA-virus. Proteinspaltende enzymer (proteaser), som finnes på overflaten av vertsceller, er nødvendige for å aktivere hemagglutininet og dermed muliggjøre transport av virus inn i cellen. Tilgjengelighet og vevsfordeling av egnede proteaser samt tilgjengelighet av cellulære overflatemolekyler som kan fungere som reseptorer for ILA-virus, er viktige faktorer i denne sammenheng. Den utbredte vevsdistirbuering av ILA-virus ved infeksjon indikerer at dersom infektiviteten er avhengig av proteolytisk aktivering av virusproteiner, utføres denne aktivering av vanlig forekommende proteaser. Dette kan også delvis forklare ILA-virusets patogenitet som viser seg ved at mortaliteten kan være så høy som 100 % i enkelte utbrudd. Mange vaksiner som induserer immunrespons er utviklet mot fiskepatogener. Kunnskap i forbindelse med utvikling av DNA-vaksiner mot fiskepatogener skiller seg ikke fra kunnskap fra DNA-vaksiner på andre dyrearter. Publiserte data innen disse områdene er nyttig basalkunnskap, men ikke nødvendige for spesifikke funn i forbindelse med utvikling av nye DNA-vaksiner.

ILA virus og deler av dets genomiske sekvenser er tidligere beskrevet, men det er ingen sekvenshomologi mellom disse og nukleotidsekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse. Det har heller ikke vært mulilg på grunnlag av disse publikasjonene å identifisere nukleotidsekvensene beskrevet i foreliggende oppfinnelse. Det er heller ikke funnet homologi for nukleotidsekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse til andre nukleotidsekvenser fra andre orthomyxovirus som f.eks. influensavirusene. Både nukleotidsekvensene og sykdomsforløp er så forskjellige at det ikke har vært mulig å overføre kunnskap fra data innen humanmedisin.

Det er tidligere beskrevet fremgangsmåter for immunisering av aquakulturarter ved introdusering av DNA-ekspresjonssystemer inn i aquakulturindividene. Se Europeisk Patentsøknad nr. 839913/964713 (NO). Her beskrives fremgangsmåten for immunisering ved hjelp av DNA-vaksiner mot ulike aquakulturvirus, ILA-virus er ikke beskrevet, men nevnt i den norske søknaden i krav 11 side 39. Det er ikke nevnt noe spesifikt vedrørende ILA-virus, verken med tanke på hvilke gensekvenser som kan være aktuelle, eller metoder til å sekvensere slike.

Forskjellen er liten mellom human vaksine og fiskevaksine. Foreløpig er det ingen kommersielt tilgjengelige DNA vaksiner. Prinsippet er det samme, men applikasjonen vil være forskjellig, og selvfølgelig agens. Få vaksiner mot virussykdommer er i bruk i fiskeoppdrett. DNA-vaksiner representerer en ny og lovende metode i vaksinesammenheng. DNA-vaksinering innebærer administrasjon av antigen-ekspresjonsvektorer som gir proteinsyntese in situ i vev til det vaksinerte dyr. DNA-vaksiner har eksperimentelt vist å kunne gi beskyttelse mot influensavirus hos mus (nær slektning av ILA-virus) (10,11,12,13). I motsetning til rekombinante eller subenhetsvaksiner vil DNA-vaksiner ligne mer på attenuerte eller levende rekombinante vaksiner på grunn av deres mulighet til å initiere dannelsen av cytotoksiske T-celleresponser og antistoffresponser som gjenkjenner autentiske konformasjonsavhengige epitoper. Matriksproteinene hos ortomyxsovirus er det mest tallrike protein i viruspartikkelen og har vist seg å være viktig for å gi kryssbeskyttelse (dvs. beskyttelse mot forskjellige stammer av influensavirus som ellers ville gi redusert beskyttelse på grunn av antigen/genetisk drift) hos mus (14). Matriksproteinet bør derfor utgjøre en del av en DNA-vaksine som skal beskytte mot ILA-virus (5,10).

De tradisjonelle fiskevaksinene injiseres intraperitonalt og det brukes tilsetning av adjuvans for å øke effekten. I hovedsak brukes vegetabilske/animalske oljeblandinger som kan gi betydelige bivirkninger i form av lokale betennelses-reaksjoner i bukhulen som kan føre til sammenvoksninger og redusert apetitt. DNA-vaksine krever ikke adjuvans av denne type for å være effektiv. I noen tilfeller kan bruk av liposomer øke effekten, men det forventes god effekt av både intramuskulær og intracutan injeksjon uten tilsetninger. Det tas også sikte på å undersøke om det kan gi tilstrekkelig effekt etter dypp- eller badevaksinering.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår DNA-sekvenser som kan benyttes til vaksine, forebyggende helsearbeid på fisk og akvatiske organismer, herunder diagnostiske systemer, og ellers innen biomedisin, herunder spesielt innen human medisin og generelt innen forskning, som for eksempel modellorganisme for influensalignende virus, kjennetegnet ved at de koder for minst ett protein fra ILA-virus, representert ved nukleotidsekvensen angitt i SEKV. ID. NR. :1 eller sekvenser med minst 80 % homologi til denne.

Oppfinnelsen angår videre vektor, kjennetegnet ved at den inneholder DNA-sekvenser som angitt ovenfor.

Oppfinnelsen angår også vaksine mot ILA-virus, kjennetegnet ved at den omfatter DNA-sekvenser som angitt ovenfor, som koder for minst ett protein fra viruset i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens i individet som tilføres vaksinen.

Også omfattet av oppfinnelsen er diagnostisk sett, kjennetegnet ved at det omfatter primere som reagerer med ILA-virussekvenser som angitt ovenfor, for påvisning av ILA-spesifikke nukleinsyrer eller proteiner.

Vaksinen mot ILA-virus omfatter således cDNA-sekvenser som er komplementære til ILA-virusets RNA-genom og som koder for immunogene proteiner fra viruset, DNA-sekvenser som koder for minst ett matriksprotein fra viruset og/eller DNA-sekvenser som koder for matriksprotein og/eller protein integrert i virusmembranen. DNA-sekvensene er kjennetegnet ved at de koder for immunogene proteiner fra ILA-virus, minst ett matriksprotein fra ILA-virus, matriksprotein og/eller et annet protein integrert i IL A-virusmembranen og/eller en DNA-sekvens, kjennetegnet ved at den er representert ved nukleotidsekvenser vist i SEKV. ID NR.:1, sekvenser med relativt stor likhet til denne samt deler av denne. En DNA-vaksine er fremstilt eksperimentelt og enkelte vaksineforsøk er utført. Resultatene viste at prototypen er lovende og har en viss beskyttende effekt.

Oppfinnelsen omfatter således også en vektor som inneholder nevnte DNA-sekvens, fremgangsmåte for fremstilling av dette DNA, fremgangsmåte for fremstilling av dette DNA, bruken av denne DNA sekvens til diagnostisk påvisning av ILA-virus spesifikke proteiner/nukleinsyrer, samt påvisning av antistoff rettet mot immunogene ILA-virusproteiner - kodet av den nevnte DNA-sekvens.

Fisk har et immunsystem som er relativt analogt til det man kjenner fra pattedyr. I laks som har overlevd ILA-infeksjon kan en derfor påvise ILA-virus spesifikke antistoffer. Søkeren har klonet og sekvensert ulike deler av arvematerialet til ILA-virus som koder for de virusproteiner som er viktige for å stimulere laksens immunapparat til å gi en eventuell beskyttende respons mot ILA. På dette grunnlag er det fremstilt en vaksine ifølge oppfinnelsen. Vaksinen inneholder DNA (optimalt og bestemt konstruksjon) som appliserert til laks gir en beskyttelse mot ILA-sykdom. Ved for eksempel injeksjon vil celler ta opp DNA inneholdt i vaksinen og uttrykke virusproteiner. Dette induserer en immunrespons som ligner det man finner etter en vanlig infeksjon og gir dermed en bedre beskyttelse enn den responsen som kun er basert på inaktivert/drept virus eller rekombinante proteiner. Årsaken til dette er at de proteiner som uttrykkes av en DNA vaksine vil prosesseres som cellulære proteiner og representeres på celleoverflaten i antigenpresenterende groper, analogt til hva proteiner fra intracellulære parasitter som for eksempel virus vil.

I tillegg har en RT-PCR-test blitt utviklet for anvendelse ved ILA-viruspåvisning i organmaterialet fra laks. I denne test ble primere som reagerte med ILA-virussekvenser ifølge oppfinnelsen anvendt. Resultatene fra alt organmateriale som er testet tyder på overensstemmelse med andre lignende tester. En slik test er ment for anvendelse i massescreening i forbindelse med overvåkning, flytting av fisk fra en lokasjon til en annen og sykdomsutbrudd.

DNA-sekvensen som vist i SEKV. ID NR.:1 koder for et polypeptid på 391 aminosyrer. Molekylvekt av dette proteinet og det gen-segmentet som det kodes av er analogt til hva som er tilfellet for matriksproteinet hos influensavirus. Hos influensavirus er matriksproteinet det mest tallrike protein i viruspartikkelen og foreligger som et ikke-integrert membranprotein som ligger under virusmembranen og gir rigiditet og stabilitet til denne.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1. Grafene illustrerer resultatet av vaksinasjonsforsøket ved anvendelse av ILA-klon 1-pEGFP-Nl-plasmid som en vaksine fra Eksempel 10. To parallelle tanker ble anvendt, 50 laks på omtrent 25 gram, 25 laks i hver tank ble injisert to ganger med ILA-klon 1-pEGFP-Nl-plasmid mens 25 laks ble injisert to ganger med et kontrollplasmid, pEGFP-Nl. Den horisontale akse viser antallet dager etter challenge med virulent ILA-virus. Den vertikale akse viser antallet akkumulert døde laks. I tank A ble ingen forskjell mellom kontrollgruppen og de oksiderte grupper observert, mens i tank B ble det funnet en statistisk signifikant forskjell mellom kontrollgruppen og den vaksinerte gruppe. Figur 2. Grafene viser resultatet av vaksineforsøk ved anvendelse av ILA-klon 1-pEGFP-Nl-plasmid som vaksine fra Eksempel 10. Grafen er samme som i Figur 1, men denne viser bare resultatene observert i tank B. En statistisk signifikant forskjell ble funnet mellom kontrollgruppen og den vaksinerte gruppe. Sammenlignet med tank A var det en forsinkelse i tank B før den kontrollinjiserte fisk begynte å dø. Dette kan tyde på at en forlenget tidsperiode mellom vaksinasjon og eksponering er bedre.

Eksempel 1. Isolering av gensegmentene

Fra en 175 cm^ cellekulturflaske med SHK-1 celler som hadde vært infisert med ILA virus (Glesvær stammen) i 5 dager, ble cellene skrapet av og pelletert. Cellekuturmediet ble fjernet og cellene ble vasket 2 ganger med PBS. Deretter ble mRNA ekstrahert med oligo-dT cellulose i henhold til forhandlerens rettningslinjer (mRNA purification kit, Pharmacia, Uppsala Sweden). mRNA ble felt med etanol og løst i diethyl pyrocarbonate (DEPC) behandlet vann og konsentrasjonen av mRNA ble bestemt ved hjelp av måling av OD260- Totalt 1.0 fig mRNA ble så brukt i første tråd syntese i revers transkribering i henhold til rettningslinjer fra forhandler (TimeSaver cDNA Synthesis Kit, Pharmacia). Primeren som ble brukt i denne reaksjonen var oligo-dT primer med et Not / kutte sete i 5'-ende. Etter annen tråd syntesen ble en EcoR I adapter ligert til cDNA ved bruk av T4 DNA ligase ved 16°C i 2 timer. Dette cDNA ble deretter kuttet med Not I og ligert inn i et EcoR I/ Not I-kuttet pCRII-plasmid. Det nye plasmidet med innskudd ble brukt i transfeksjon av E. coli. Plasmider fra transformerte bakterier ble renset ved hjelp av mini-preper og kuttet med EcoR I/ Not I og separert ved agarose gel elektroforese. Plasmidinnskudd ble skåret ut av gelen og renset (Geneclean, Bio 101, Vista, CA) og oppbevart ved - 20°C før de ble brukt i hybridiseringsreaksjoner.

I hybridiseringsreaksj onene ble total-RNA ekstrahert fra IL A-virusinfiserte og ikke-infiserte SHK-1 -celler. RNA ble ekstrahert ved bruk av 8,5 ml TRIzol reagens (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) per 175 cm^ cellekulturflaske etter at medium var fjernet og cellene vasket med PBS. Denne suspensjonen ble deretter fjernet fra celledyrkningskolben og overført til et sentrifugerar, 8,5 ml kloroform ble tilsatt og sentrifugert i 50 min ved 3,600 x g. Vannfasen ble fjernet og RNA ble pelletert ved å tilsette 0,7 volumenheter isopropanol. RNA pelleten ble vasket i DEPC-behandlet 70% etanol og løst i 0,5 ml DEPC-H2O. RNA ble deretter denaturert med 1 M glyoxal, 10 mM NaP04 at 50°C i 1 time, og 10 ug denaturert RNA ble brukt i en 1 % agarose gel med 10 mM NaP04 som buffer. Deretter ble RNA blottet til en nylon membran (Hybond N+, Amersham, Buckinghamshire, UK) og fiksert i 2 timer ved

32

80°C. Hybridisering ble utført med innmerking av probene med P-merking (Rediprime DNA labelling system, Amersham). cDNA fra ILA virus infiserte cellekulturere ble brukt som prober. Hybridiseringene ble utført ved 50°C overnatt og vasket med 2 x SSC, 0.1 % SDS ved rom temperatur i 2 x 5 min etterfulgt av 0.1 x SSC, 0.1 % SDS ved 68°C i 2 x 15 min. Prober som ga positive signaler fra ISAV-infiserte SHK-1-celler og ingen signaler fra ikke-infiserte celler ble videre testet for ILA-virusspesifisitet med Southern Blot hybridisering hvor mål var total-DNA fra ikke-infiserte SHK-1-celler kuttet, med henholdsvis EcoR I, Barn HI eller Hind III.

Disse probene ble også testet i hybridiseringsreaksjoner, hvor RNA var ekstrahert fra pelletert ILA-virus fra celleculturmedium og fra ILA-virusinfiserte SHK-1-celler. Før pelletering av virus fra cellekultursupernatant ble mediet sentrifugert ved 3,000 x g i 30 min og deretter ble ILA virus pelletert 100,000 x g i 3 timer. RNA ekstrahert fra denne pelleten ble delt i 3 fraksjoner hvor en fraksjon ble behandlet med RNaseA, en annen fraksjon ble behandlet med Rnase-fri Dnase og en tredje fraksjon ble ikke behandlet.

En klon ga positive signaler i hybridiserings reaksjoner med total RNA fra ILA-virusinfiserte SHK-1-celler, og ingen signaler fra hverken RNA eller DNA fra ikke-infiserte SHK-1-celler. Når pelletert ILA-virus ble brukt som målprodukt fikk man positivt signal mot et gensegment på ca 1,3 kb. Dette signalet ble opphevet ved behandling av ILA-virus pellet med RNaseA, mens behandling med Rnase-fri DNase ikke hadde noen effekt.

Den foreliggende ILA virus spesifikke gensekvensen ble nukelotidsekvensert i en automatisk DNA-sekvenseirngsmeskin, DNA-sequencer (ABI Prism 377, Perkin Eimer Applied Biosystems, Foster City, CA). Selve nukleotidsekvensen er vist i

SEKV ID. NR.:1.

ILA-virusspesifikke gensegmenter ble deretter ytterligere verifisert som ILA-virusspesifikke ved at de terminale 5' og 3'-ende sekvensene ble bestemt ved hjelp av RACE (rapid amplification og cDNAends). Hos influensavirus er disse 5' og 3' terminale endene konstante mellom de forskjellige segmentene og også delvis komplementære seg imellom. Med hensyn til sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse ble disse konserverte 5' og 3'-endesekvensene funnet, dette som en ytterligere verifisering av ILA-virusspesifisiteten.

Eksempel 2. Fremstilling av DNA-konstruksjon for ekspresjon i eukaryote celler

Ut fra den foreliggende sekvens for gensegment 7 finner man en stor åpen leseramme på 1173 nukleotider. Denne leserammen vil teoretisk kode for et protein på 391 aminosyrer med total molekyl vekt på ca. 42,8 kD.

For å uttrykke den store åpne leserammen (antatt matriks-protein gen) i eukaryot celler ble denne gensekvensen klonet inn i pEGFP-Nl-vektoren (Clontech. GenBank aksesjonsnummer U55762). I denne vektoren er ekspresjonen av det klonede gen under kontroll av cytomegalovirus promotoren, som i flere sammenhenger er vist å være effektiv i fisk. Proteinet som uttrykkes produseres som et fusjonsprotein med GFP (green fluorescent protein), dette ligger i N-enden av proteinet og uttrykkes derfor kun hvis det foranliggende proteinet også uttrykkes. I korthet ble dette gjort på følgende måte: To PCR-primere ble konstruert slik at de var komplementære til hver sin ende av den åpne leserammen, og i tillegg hadde de hver sitt restriksjonsenzym sete i 5'-enden ( Nhel og Kpnl). Restriksjonsenzymene ble valgt ut fra kriteriene: a) ingen kuttesteder i aktuell gensekvens, b) kuttesetet finnes i ekspresj ons vektor.

PCR primere som ble brukt for amplifisering av den nevnte åpne leserammen for etterfølgende kloning inn i pEGFP-Nl er vist nedenfor: PRIMER: 5 * - GG- GCT- AGC-ATG-GCA-CGA-TTC-ATA-ATT-TTA -3' NAVN: KLON 1 -EGFP-F1

POSISJON: 7-28, KLON 1.

DIVERSE: Startkodon i fet skrift. Nhel sete er understreket.

PRIMER: 5'-G-G GG- TAC- CGT-AGC-AAC-AGA-CAG-GCT-CGA-TGG-3' NAVN: KLON 1 -EGFP-R1

POSISJON: 1179-1159, KLONl.

DIVERSE: Siste kodon (dvs invers av dette kodon) før stopp kodon er i fet skrift. Kpnl sete er understreket. To nt (GT) ble lagt inn mellom siste kodon og Kpnl for å få riktig leseramme for GFP protein i pEGFP-Nl.

Følgende PCR ble kjørt:

26 uH20

5 ul 10X Taq polymerase buffer uten MgC12

8ull.25mMdNTP

1.5 ul MgC12

1 ul W-l

1.5 ul KLONl EGFP-F1 (15 pmol/ul)

1.5 ul KLONl EGFP-R1(15 pmol/ul)

0. 5 fil Taq- polvmerase

45 ul totalt

Deretter ble 5 ul cDNA fremstilt fra RNA som var ekstrahert fra organmateriale fra laks eksperimentelt infisert med ILA virus, Glesvær stammen.

Følgende PCR profil ble benyttet:

Først 5 min ved 94°C.

Deretter 35 sykluser med:

30 sek 94 °C

1 min 55 °C

30 sek 72 °C

Deretter 7 min ved 72 °C, og 4 <0> uendelig.

10 ul av PCR-løsningen ble brukt ved elektroforese i 2 % agarose gel og deretter farget med etidium bromid. DNA-bånd med korrekt størrelse i forhold til størrelsen av den åpne leserammen ble skåret ut av gelen og renset med Geneclean.

DNA fra gelbiten ble løst i 10 ul H20.

Dette DNA ble deretter kuttet med Nhel/ Kpnl

10 ul DNA fra KLON 1-EGFP-Nl/KLON 1-EGFP-Rl PCR

2 ul React 3 (GIBCO buffer for restriksjonsenzymer)

5 ul H20

1 (il Nhel

1 ul Kpn I

20ul

Inkubert ved 37° C i 2 t.

1 (il pEGFP-Nl

2 (il React 3 (GIBCO buffer for restriksjonsenzymer)

15 ulH20

1 ul Nhel

1 ul Kpn I

20ul

Inkubert ved 37° C i 2 t.

Alt ble kjørt med elektroforese i 2 % agarose gel, og farget med etidium bromid. DNA båndene ble skåret ut og DNA ble ekstrahert (Geneclean). DNA fra hver av gelbitene ble tilslutt løst i 5 ul H20. 1 ul av dette ble brukt til å måle mengden DNA(OD26o). Relativt mengdeforhold mellom NhellKpn /-kuttet pEGFP-Nl og det PCR-amplifiserte NhellKpn /-kuttede DNA-segmentet ble utregnet.

Ligeringsreaksjon: mengdeforholdet mellom Nhel/ Kpn 1I kuttet pEGFP-Nl og det PCR amplifiserte, NhellKpn / kuttede DNA segmentet var i området 1:1, 1:3.

2 ul NhellKpn 11 kuttet pEGFP-Nl

2 (il NhellKpn / kuttede DNA segmentet

1 (il 10 x ligase buffer

4 ul H20

1 ul T4 DNA- ligase.

10 ( il

Inkubert ved 16°C i 41.

Ferske, kompetente E. coli- ceWer ble transfektert i følge prosedyre slik den er beskrevet i Maniatis(15). 50 ul og 200 (il fra hvert rør ble sådd ut på skåler med Kanamycin og inkubert overnatt i 37°C. 5 kolonier fra disse skålene ble brukt til minipreparering av plasmider(Qiagen miniprep). Plasmidpelleten ble løst i 20 (il H20, og brukt i en restriksjonkutting NhellKpn I slik denne er beskrevet ovenfor.

En bakterieklon som inneholdt plasmid med riktig fragment (ILA-klon 1-pEGFP-Nl) (utfra størrelse ved gelelektroforese) ble brukt videre til ekspresjon. Men som backup ble 100 ul bakteriløsning fra miniprepareringen spredt på skåler med kanamycin, dyrket overnatt, og bakterienekoloniene løst opp i lml LB medium med 15% glycerol og frosset på -70°C.

Det er også noen korte potensielle leserammer, (se figur over sekvens)

(influensavirus er det eneste viruset hvor RNA-spleising forekommer og man kan derfor ikke utelukke at en tilsvarende egenskap også foreligger for ILA-virus).

Eksempel 3. Oppformering av DNA-sekvensene

Den oppgitte DNA-sekvensen som er komplementær til RNA fra gensegment 7 hos ILA-virus ble oppformert på følgende måter. 1) PCR med bruk av primere som er komplementære til 5' og 3' ender av den oppgitte sekvens. PCR-oppformering ble brukt før kloning inn i vektor slik som beskrevet i eksempel 1 og 2, mål-RNA var da totalt RNA fra et organ fra eksperimentelt ILA-virusinfisert fisk slik at muligheter for eventuell artifisiell mutasjon skulle være så liten som mulig. De PCR-betingelsene som ble brukt er beskrevet i eksempel 2. 2) Oppformering av DNA fra ILA-virus gensegment 7-sekvens i pCRII vektoren. Denne sekvensen manglet de ekstreme 5' og 3'-endene som ble funnet med RACE-metoden (beskrevet i eksempel 1). 25 ng av dette plasmidet (ILA-virus gensegment 7-pCRII) ble transfektert inn i kompetente E. coli- celler (TOP10'). E. coli som hadde tatt opp plasmidet ble selektert på grunnlag av resistens mot Kanamycin, som er en egenskap som kodes av pCRII. Bakteriekolonier ble testet for innhold av plasmid ved hjelp av miniprep (Qiagen miniprep). En koloni som hadde riktig innskudd ble dyrket i 5 ml LB medium med Kanamycin, og plasmidet ble renset (Qiagen mini prep). Dette plasmidet ble brukt som DNA-kilde til nukleotidsekvensering, som ble gjort med automatisk DNA-sekvensator(beskrevet i eksempel 1). 3) Oppformering av DNA som består av åpent leseramme-innskudd i pEGFP-Nl (ILA-klonl-pEGFP-Nl). 25 ng av (ILA-klon 1-pEGFP-Nl) ble transfektert inn i E. coli. Kolonier ble selektert på grunnlag av Kanamycin resistens. Deretter ble det testet for innhold av korrekt innskudd med miniprep (Qiagen miniprep) og restriksjonsenzym-analyse ( Nhel/ Kpnlkutting slik den er beskrevet under eksempel 2). En E. coli koloni med plasmid med riktig insert ble benyttet til oppformering av ILA-klon 1-pEGFP-Nl. Her ble Quiagen Maxiprep og Gigaprep benyttet til rensing av plasmidet i henhold til forhandlerens instruksjoner.

Eksempel 4 Ekspresjon i en cellelinje

ILA-klon 1-pEGFP-Nl plasmidet ble transfektert inn i BF-2-celler. BF-2 celler er en standard fiskecellelinje. Disse ble dyrket i 96- brønners plater etter standard prosedyrer. Som transfeksjonsreagens ble Fugene (Boehringer-Mannheim) brukt. Prosedyre beskrevet av forhandler ble benyttet. 1,4 ug DNA ble funnet å være nok til 25 brønner. Totalt 4 ul av FuGene/DNA-løsning ble tilsatt per brønn. Brønnene inneholdt medium og cellene ble ikke vasket eller lignende i forbindelse med transfeksjonen. Vellykketheten av transfeksjonen kunne måles ved å mikroskopere de transfekterte cellene under UV lys. Forekomst av fluorescens vil indikere at GFP (green fluorescent protein) produseres, leseramme for dette proteinet ligger nedstrøms for den klonede åpne leserammen til ILA-virus-gensegment 7 og vil kun uttrykkes dersom det sistnevnte proteinet også uttrykkes. Forventet molekyvekt på dette fusjonsproteinet er 69,7 kD:

ILA-Klonl protein: Molekylvekt = 42,8 kD

GFP Molekylvekt = 26,9 kD

Fusjonsprotein: Molekylvekt = 69,7 kD

BF-2-cellene ble daglig sjekket for eventuell tilstedeværelse av fluorescens. I mange av BF-2 cellene kunne man tydelig se fluorescens, som hovedsakelig var lokalisert til cytoplasma.

Eksempel 5 Ekspresjon i laks

Vi vil sjekke for ekspresjon av det åpne-leseramme-proteinet i laks på samme måte som vi har beskrevet dette i BF-2 celler under eksempel 4. Delvis kan det brukes materiale fra de immuniserte fiskene i eksempel 6, men andre applikasjonsmetoder vil også bli benyttet. Etter injeksjon tas prøve fra injeksjonsstedet, og etter bruk av for eksempel genkanon (Gene-gun, BioRad) vil det være tistrekkelig å skrape av skinn med mer. Andre muligheter vil bli overveiet fortløpende. Testene som gjøres er enten Western Blot eller fluorescense målinger som detekterer forekomst av GFP.

Eksempel 6. Immunisering av laks

15 fig av ILA-klon 1-pEGFP-Nl plasmidet løst i 25(il H20 ble injisert intramuskulært i 40-60 g stor laks. Insulinsprøyter ble benyttet til injeksjonen. Totalt ble 150 laks immunisert. Fisken ble gitt injeksjon kun en gang, det vil si ingen booster ble gitt.

Eksempel 7. Vaksineforsøk etterfulgt av eksponering av levende ILA-virus

(Challenge)

I challengeforsøk ble laks å 40-60 gram immunisert med ILA-klon 1-pEGFP-Nl-plasmidet slik det er beskrevet i eksempel 6. Kontroll laks ble immunisert med pEGFP-Nl -plasmidet uten innnskudd i samme mengde og volum som de laksene som fikk ILA-klon 1-pEGFP-Nl-plasmidet.

Etter denne immuniseringen gikk det 4 uker før laksen ble eksponert for ILA-virus.

Eksponering av ILA-virus skjedde ved at de immuniserte laksene ble kohabitant smittet av eksperimentelt ILA virus infiserte laks.

Eksperimentell ILA-virussmitte ble utført ved at laks med en vekt på 40-60 gram (som ikke var blitt immunisert) ble injisert intraperitonealt med ILA-virus fra cellekultursupernatant fortynnet 1:10 i cellekulturmedium. Virusstammen var Glesvær. Virustiter var 10<4>/ml. Podedose: 0,3 ml intraperitonealt.

Deretter ble laks med ulik immunisering/infisering fordelt etter følgende mønster:

Kar A: 25 fisk vaksinert med Klonl-pEGFP-Nl,

25 fisk vaksinert med pEGFP-Nl

5 eksperimentelt ILA virus infiserte fisk tilsatt etter 4 uker

Kar B: 25 fisk vaksinert med Klonl-pEGFP-Nl,

25 fisk vaksinert med pEGFP

5 eksperimentelt ILA virus infiserte fisk tilsatt etter 4 uker

Kar C: 100 fisk vaksinert med Klonl-pEGFP-Nl,

5 eksperimentelt ILA virus infiserte fisk tilsatt etter 4 uker

Kar D: 100 fisk vaksinert med pEGFP

5 eksperimentelt ILA virus infiserte fisk tilsatt etter 4 uker

Deretter venter man i 4-6-8-uker for å gjøre opp status mellom levende og død fisk i karene.

Eksempel 8. Effekt av vaksinen i Challenge forsøk

Det forventes å måle grader av beskyttelse av fisken mot sykdom forårsaket av ILA-virus. All type beskyttelse vil bli betraktet som et positivt resultat. I forsøket blir fisken utsatt for meget stort smittepress, sannsynligvis betydelig større enn naturlig smitte. Over tid kan en derfor forvente at fisken ikke vil kunne være beskyttet. Derfor vil det også være et positivt resultat om fisken blir "forsinket" syk i forhold til kontrollfisken. Resultatene av challenge-testene ga ingen signifikant forskjell mellom vaksinerte grupper og kontrollgrupper.

Eksempel 9. Vaksineforsøk med bl.a. forandret smittepress

I etterkant av eksempel 6-8 vil det bli utført flere vaksineforsøk. Forsøkene vil bli utført etter samme mønster, men her vil det optimaliseres enten/både applikasjons metoder eller/og type og mengde smittepress.

På applikasjonssiden vil intracutan injeksjon med genkanon (BioRad) vurderes samt bading/dypping. På smittesiden vil det i første omgang bli snakk om å redusere smittepresset på forskjellige måter for eksempel færre smittede fisk, kortere opphold sammen med smittet fisk.

Eksempel 10. Vaksineforsøk gjentatt som i Eksemplene 6-9 med enkelte modifikasjoner.

Fisken var noe mindre enn 25 gram og fikk injisert 25 ug av ILA-klon 1-pEGFP-Nl-plasmid fortynnet i 100 ul TE med 2 % polyvinylpyrrolidon-40. Fisken ble immunisert to ganger med 25 dagers intervall. Kun forsøkene i tank A og B fra Eksempel 7 ble utført. I tank A døde fisken raskt og det ble ikke påvist noen forskjell mellom gruppene. Til motsetning var mortaliteten forsinket i tank B. Dette kan indikere en forsinket infeksjonsinnvirkning sammenlignet med de forventede 40 dager. Forsøket ble avsluttet etter ca. 20 uker. I tank B ble det registrert en signifikant forskjell mellom gruppene, dette tyder på at det var flere overlevende innen den vaksinerte gruppe. Ved anvendelse av % -testen ble en verdi på 5,36 estimert som var signifikant ved p < 0,025. Verdiene anvendt i estimatene stammet fra avslutningen av forsøket var henholdsvis 24 og 18 individer i gruppene på 25 døde, hvorved 18 stammet fra grupper med vaksinert fisk.

Disse resultater kan tyde på at en forlenget tidsperiode mellom vaksinasjon og eksponering ville ha vært bedre rent forsøksmessig fordi beskyttelse mot infeksjon var noe mer forsinket enn antatt. Med andre ord trenger immunsystemet hos fisken noe lenger tid etter DNA-vaksinasjon for å oppnå en god beskyttende respons.

Eksempel 11

Identifisering av ILA-virus

Organmaterialer fra ILA-infisert og ikke- infisert laks ble homogenisert, og en RNA-ekstraksjon ble utført i overensstemmelse med kjente bioteknologiske fremgangsmåter. Deretter ble Raedy-To og RT-PCR-kule (Pharmacia) i RT-PCR-prosedyren anvendt. Revers transkripsjon og PCR-reaksjonene ble utført som beskrevet av produsenten. PCR-syklus ved anvendelse av ILA-primere er som følger: 95 °C i 30 sek, 55 °C i 15 sek og 72 °C i 30 sek, 35 sykluser totalt. Primere som reagerte med ILA-virussekvenser i overensstemmelse med krav 1-6 (merket IA og IB) ble anvendt og sammenlignet med primerne (merket ILA1 og ILA2) som reagerer med ILA-virussekvenser og som i dag anvendes til diagnostiske formål. For å visualisere reaksjonen ble en 3% NuSieve agarose i lxTAE-buffer anvendt for elektroforese ved 80 volt i 75 minutter, en sige på 123 basepar ble anvendt som størrelsesstandard. Gelen ble satt på et UV-bord og foto ble tatt.

35 prøver fra den Norske Veterinærhøgskole (NSVS) og 54 prøver fra Skottland ble testet. Alle prøver fra NSVS ga positive tester med hensyn til tilstedeværelse av ILA-virus og prøvene fra Skottland ga negative tester. Resultatene viste at sekvensene nevnt i krav 1-6 med passende primere er godt egnet for diagnostiske formål.

Referanser

1. Dannevig, B.H., Falk, K., and Namork, E. Isolation of the causal virus of infectious salmon anaemia (ISA) in a long-term cell line from Atlantic salmon head kidney. J. Gen. Virol. 76(Pt 6):1353-1359, 1995. 2. Falk, K. and Dannevig, B.H. Demonstration of infectious salmon anaemia (ISA) viral antigens in cell cultures and tissue sections. Vet. Res. 26(5-6):499-504, 1995. 3. Mjaaland, S., Rimstad, E., Falk, K., and Dannevig, B.H. Genomic characterization of the virus causing infectious salmon anemia in Atlantic salmon (Salmo salar L.): an orthomyxo-like virus in a teleost. J. Virol. 71(10):7681-7686, 1997. 4. Leong, J.C., Anderson, E., Bootland, L.M., Chiou, P.W., Johnson, M., Kim, C, Mourich, D., and Trobridge, G. Fish vaccine antigens produced or delivered by recombinant DNA technologies. Dev. Biol. Stand. 90:267-77:267-277, 1997. 5 . Donnelly, J.J., Friedman, A., Ulmer, J.B., and Liu, M.A. Further protection against antigenic drift of influenza virus in a ferret model by DNA vaccination. Vaccine 15(8):865-868, 1997. 6 . Arnheiter, H., Skuntz, S., Noteborn, M., Chang, S., and Meier, E. Transgenic mice with intracellular immunity to influenza virus. Cell 62(1):51-61, 1990. 7 . Robertsen, B., Trobridge, G., and Leong, J.A. Molecular cloning of double-stranded RNA inducible Mx genes from Atlantic salmon (Salmo salar L.) [In Process Citation]. Dev. Comp. Immunol. 21(5):397-412, 1997.

8. Rimstad, E. Teig, A. : Personlig meddelse.1998

9. HOVLAND, T., Nylund, A., WATANABE, K., and ENDRESEN, C. Observation of infectious salmon anemia virus in Atlantic salmon, Salmo- salar L. JOURNAL OF FISHDISEASES 17(3):291-296, 1994. 10 . Ulmer, J.B., Donnelly, J.J., Parker, S.E., Rhodes, G.H., Felgner, P.L., Dwarki, V.J., Gromkowski, S.H., Deck, R.R., DeWitt, C.M., and Friedman, A. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein [see comments]. Science 259(5102): 1745-1749, 1993. 11. Fynan, E.F., Robinson, H.L., and Webster, R.G. Use of DNA encoding influenza hemagglutinin as an avian influenza vaccine. DNA Cell Biol. 12(9):785-789, 1993. 12. Raz, E., Carson, D.A., Parker, S.E., Parr, T.B., Abai, A.M., Aichinger, G., Gromkowski, S.H., Singh, M., Lew, D., and Yankauckas, M.A. Intradermal gene immunization: the possible role of DNA uptake in the induction of cellular immunity to vimses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91(20):9519-9523, 1994. 13. Donnelly, J.J., Ulmer, J.B., and Liu, M.A. Protective efficacy of intramuscular immunization with naked DNA. Ann. N. Y. Acad. Sci. 772:40-6:40-46, 1995. 14. Webster, R.G. og Hinshaw, V.S. Matrix protein from influenza A virus and its role in cross-protection in mice. Infect.Immun. 17(3):561-566, 1977. 15. Sambrok, J., Fritsch,E.F., og Maniatis, T. Molecular cloning. A laboratory manual, New York: Cold spring harbor laboratory press, 1989.

Claims

1. DNA-sekvenser som kan benyttes til vaksine, forebyggende helsearbeid på fisk og akvatiske organismer, herunder diagnostiske systemer, og ellers innen biomedisin, herunder spesielt innen human medisin og generelt innen forskning, som for eksempel modellorganisme for influensalignende virus, karakterisert ved at de koder for minst ett protein fra ILA-virus, representert ved nukleotidsekvensen angitt i SEKV. ID. NR. :1 eller sekvenser med minst 80 % homologi til denne.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter deler av nukelotidsekvensen vist i SEKV. ID.NR.:1.

3. Vektor, karakterisert ved at den inneholder DNA-sekvenser ifølge krav 1-2.

4. Vaksine mot ILA-virus, karakterisert ved at den omfatter DNA-sekvenser ifølge krav 1 eller 2, som koder for minst ett protein fra viruset i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens i individet som tilføres vaksinen.

5. Vaksine mot ILA-virus ifølge krav 4, karakterisert ved at den inneholder nevnte DNA-sekvens omfattende nukleotidsekvensen vist i SEKV. ID. NR.: 1, eller sekvenser med minst 80 % homologi til denne.

6. Vaksine mot ILA-virus ifølge krav 4-5, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 2.

7. Diagnostisk sett, karakterisert ved at det omfatter primere som reagerer med ILA-virussekvenser ifølge krav 1-2, for påvisning av ILA-spesifikke nukleinsyrer eller proteiner.