JP5362167B2 - アルスロバクター由来のHsp70 - Google Patents
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Description
第1の側面において、本発明は、アルスロバクターhsp70遺伝子の配列、その断片の配列、又は関連配列を含む単離された核酸配列を提供する。この遺伝子は、ORF、5’UTR及び3’UTR、さらに、何らかの成分プロモーター、エンハンサー、調節因子、ターミネーター、及び局在化因子を含む。
本発明の単離されたhsp70遺伝子の新規配列及びそれにコードされる単離又は精製されたタンパク質を図1及び2にそれぞれ示す。本発明は、図1及び2に示された配列と実質的に相同な核酸配列及びアミノ酸配列を包含する。「実質的に相同」とは、ある配列を参照配列と比較した際に、その配列が参照配列に対して最低でも60%の相同性を有し、好ましくは最低でも70%の相同性を有し、さらに好ましくは最低でも80%、85%、90%、95%、98%又はそれを超える相同性を有することを意味する。
5mlのアルスロバクター培養液を、振盪しながら一晩、カナマイシン(30μg/ml)を含有するLB培地で30℃にて培養する。Puregene DNA isolation kit(Gentra)又はInstageneTM Resinを用いて、説明書に従い、DNA抽出を行う。
いくつかのミコバクテリアとストレプトマイセスとのhsp70(dnaK)配列間においてヌクレオチドレベルで最も相同性が高い領域を用いて、PCR及び配列決定用の縮重プライマーをデザインする。選択したプライマーは、dnak−1Fdeg(5’−gtcggnatcgacctvggnac−3’)及びdnak−4Rdeg(5’−gcggtsggctcgttgac−3’)である。アニーリング温度が50℃のPCR反応で、アルスロバクターDNAを増幅させるためにこれらのプライマーを使用する。増幅させたDNAの品質を、ゲル電気泳動で確認する。10μlの試料を0.8%アガロースゲルに添加し、1xTris−ホウ酸電気泳動バッファー(TBE)を用い、100Vでおよそ1時間、電気泳動を行う。次に650bpの産物をゲルから切り出し、Qiaquick purification kit(Qiagen)を用いて精製する。Qiagen PCR clean up kitを用いて説明書に従いPCR産物をクリーンアップし、BigDye primer chemistry(Applied Biosystems)及びPCRで用いた各プライマーをプライマーとして用いて説明書に従い配列決定を行う。ABI PRISM(8r)BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction mixを用いて伸長反応混合液(〜600ngのDNAテンプレート、3.2pmolの適切なプライマーに、ddH2Oを全量が20μlになるよう添加)を調製する。サイクルシークエンシング条件は以下のとおりである。すなわち、96℃を10秒、50℃を5秒、60℃を4分からなる反応を25サイクル繰り返すように、サーマルサイクラーを設定する。この配列決定により、この断片がdnaK遺伝子の最初のおよそ400bpを含有することが明らかとなる。
ゲノムウォーキング法を用いて、既に同定した配列の5’および3’配列を伸長させる。Genome Walkerマニュアル(Clontech)に記載されている配列からプライマーをデザインする。最初に、4種類のゲノムライブラリを作製(DraI、EcoRV、PvuII、StuI)し、次にさらに3種類のライブラリを作製する(AluI、ScaI及びSnaF1)。全てのライブラリ及びそれに続くPCR反応については、Genome Walkerマニュアルに記載されている。
3'RACEを使用して、さらなる3'配列を得る。一晩培養(上記のように培養)したアルスロバクターから、Purescript(Gentra)RNA単離キットを用いて、使用説明書に従い、RNAを単離する。Boehringer Mannheim、5'3'RACEキットを用いて、使用説明書に従い、3'RACEを行う。既知の配列の3'末端からRACE用プライマーをデザインする。10% DMSOを含有すること及びアニーリング温度が55℃であること以外は、記述したとおりにPCR反応を行う。〜1.0kbのバンドが増幅されるので、インビトロgenのTOPO sequencing kitを用いて、付属のプロトコールに従い、それをpCR4ベクターにクローニングする。ベクタープライマーを用いてコロニーをスクリーニングし、選択したクローンを一晩培養して、インビトロgenのSNAP miniprep kitを用いてDNA抽出を行い、上記のようにしてベクタープライマーを用いて配列決定を行う。
電気泳動およびウェスタンブロッティング
23℃にて48時間インキュベーションした後に、tryptic soy agar(TSA)プレートから直接、サブカルチャーした細菌を回収して、アルスロバクターATCC 55921細胞懸濁液を調製する。pH7.2の100mM Tris−HCl、1mM EDTA及び0.1% Triton−X 100(BioRad Laboratories,Hercules,CA)からなる10mlの「TET」バッファー中に、光学密度がおよそ50OD660単位(ここで、1 OD660は、1x109個の細胞を含むと推定される)になるように細菌を再懸濁し、6500gで遠心する。上清を捨て、細胞をさらに10mlのTETで懸濁し、再び遠心を行う。4mlのTETで細胞ペレットを再懸濁し、1.5mlのマイクロチューブにそれぞれ1mlずつ分注する。そのうち1本を、さらに200μlの5mg/ml ニワトリ卵白ライソザイムと混合し、振盪しながら一晩(18時間)、37℃にてインキュベーションを行う。卓上微量遠心機にて、最高速度で5分間、細胞懸濁液を遠心する。150μlの無細胞上清を、50μlのNuPage 4xLDSサンプルバッファー(インビトロgen Carlsbad,CA)と混合し、振盪しながら70℃で10分間インキュベーションを行う。得られた上清を10μlずつ分注し、8% Mini Protean II gel(BioRad)で電気泳動し、セミドライ転写装置(BioRad)を用いて30分間、20Vで、PVDF(Millipore,Bedford MA)上にウェスタンブロットする。ブロッティング後すぐに、0.1% ポンソーS(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)中で、膜を1分間洗浄し、ブロットしたタンパク質が見えるようになるまで、蒸留水で数回洗浄して脱色する。後の染色に備えて蒸留水で繰り返し洗浄を行い、前記膜を風乾させることでピンク色の発色が消える前に、免疫染色した後の基準点となるように、分子量マーカー及び特定のタンパク質に鉛筆で印を付ける。
滅菌したダルベッコ塩類溶液で前もって洗浄した4x108個の細胞を3部とフロイント不完全アジュバントを1部とからなる0.5mlの懸濁液をニュージーランドウサギにi.m.注射して、アルスロバクター抗原に対するポリクローナル抗血清を調製する。4週間後に、同量の注射用試料を上記ウサギに注射する。6週間後に耳の末梢静脈から5mlの血液を採取し、血餅を形成させた後に遠心を行って、血清を収集する。
ライソザイム処理したアルスロバクター懸濁液をSDS−PAGEで分析することにより、150−10kDaの範囲にわたりタンパク質バンドが存在することが分かる。これらのバンドのうち、およそ67、63及び59kDaの主要なタンパク質バンドが卓越している。アルスロバクター細胞壁のペプチドグリカンはライソザイム処理を行わないと放出されないので、67kDaのタンパク質が、アルスロバクター細胞壁のペプチドグリカンと架橋結合していることは明らかである。
アルスロバクターヒートショックタンパク質70の完全なコード配列を、非融合ペプチド及び融合ペプチドとして、pET30EKLICベクター(Novagen)にクローニングする。N融合タグは、その後の標的タンパク質の精製に利用する様々な機能を有する55個のアミノ酸(Hisタグ、S−タグ、エンテロキナーゼ切断部位を含む)からなる。ドメインIIとして知られている、HSP70タンパク質内に存在する200アミノ酸活性モチーフも、非融合ペプチド及び融合ペプチドとしてクローニングする。
清潔な水槽水で希釈したベンゾカインを用いて、流動する淡水で飼育したpre−smoltの大西洋サケ(Salmo salar)(35−40g)を麻酔する。ワクチン接種前に、致死量の麻酔剤で6匹の魚を安楽死させ、免疫前血清として尾静脈から採血する。
実験開始1週間前から通気した流水(10℃)が供給されている0.5mの貯蔵タンクに大西洋サケの幼魚を順応させ、実験期間全体を通して、毎日給餌する。各群55匹の魚を、25匹ずつ2つのタンクに分け、同型処理群を用意する。大西洋サケ幼魚に対してISAVで攻撃誘発を行うと、60−80%のへい死率を示す。
Claims (11)
- 下記の(a)または(b)からなる群から選択されるアルスロバクター(Arthrobacter)hsp70タンパク質をコードする単離された核酸分子と、異種抗原をコードする核酸分子とを含む魚類用ワクチンであって、該異種抗原に関連する感染性疾患を予防するための魚類用ワクチン。
(a) 配列番号1で表される核酸配列からなる核酸分子、
(b)(a)の断片であって、該断片は配列番号2の162位〜365位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは単離されたアルスロバクター(Arthrobacter)hsp70タンパク質に対する抗体に免疫反応性である断片。 - hsp70タンパク質をコードする核酸分子が、ATCC 55921の受託番号で寄託されているアルスロバクター(Arthrobacter)株から得られる、請求項1に記載の魚類用ワクチン。
- 異種抗原が細菌、ウイルス、真菌、原生動物、蠕虫類及び腫瘍の抗原から選択され、前記異種抗原をコードする核酸分子がhsp70タンパク質をコードする単離された核酸分子にイン・フレームになるように融合された請求項1又は2の魚類用ワクチン。
- 前記異種抗原をコードする核酸分子が動物病原体由来の抗原をコードする、請求項1〜3の何れか1項に記載の魚類用ワクチン。
- 前記異種抗原が感染性膵臓壊死ウイルス viral protein−2 (VP2)又はviral protein−3 (VP3)である、請求項1〜4の何れか1項に記載の魚類用ワクチン。
- hsp70タンパク質をコードする単離された核酸分子が転写調節配列に作動可能に結合している、請求項1〜5の何れか1項の魚類用ワクチン。
- 下記(a)または(b)からなる群から選択される単離されたアルスロバクター(Arthrobacter)hsp70タンパク質と、異種抗原とを含む魚類用ワクチンであって、該異種抗原に関連する感染性疾患を予防するための魚類用ワクチン。
(a) 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b) 配列番号2で表されるアミノ酸配列の162位〜365位のアミノ酸配列からなるタンパク質。 - hsp70タンパク質がATCC 55921の受託番号で寄託されている、アルスロバクター(Arthrobacter)株から得られる、請求項7に記載の魚類用ワクチン。
- 異種抗原が細菌、ウイルス、真菌、原生動物、蠕虫類及び腫瘍の抗原から選択され、hsp70タンパク質と前記異種抗原とが共有結合により連結されて融合タンパク質を形成する、請求項7又は8に記載の魚類用ワクチン。
- 前記異種抗原が、感染性サケ貧血ウイルス由来の、ヌクレオキャプシドタンパク質、ヘマグルチニン、ポリメラーゼ、及びセグメント7 P4及びP5タンパク質のうちいずれかのタンパク質である、請求項7〜9のいずれか1項に記載の魚類用ワクチン。
- hsp70タンパク質がアルスロバクター(Arthrobacter)細胞の細胞壁に局在し、N末端のアミノ酸配列が(M)SRAVG IDLGT TNSVV SVLEであり、SDS−PAGEによって測定した分子量が67kDaである請求項7に記載の魚類用ワクチン。
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