KR20030078807A

KR20030078807A - 양식 연어류 바이러스에 대한 복합 ｄｎａ 및 단백질백신의 개발과 백신 처리 방법의 최적화

Info

Publication number: KR20030078807A
Application number: KR1020030020242A
Authority: KR
Inventors: 정대균; 박정우; 김한근; 이정민; 문창훈; 김종수
Original assignee: 주식회사 알엔에이
Priority date: 2002-03-30
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2003-10-08
Also published as: KR20030078806A

Abstract

본 발명은 연어 및 무지개 송어에 질병을 일으키는 바이러스인 전염성 췌장괴저 바이러스 (Infectious Pancreatic Necrosis Virus; IPNV)와 전염성 조혈기 괴저 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)에 대한 효과적인 DNA 및 단백질 백신을 개발하고, 이를 어류에 처리함에 있어 보다 효과적인 백신처리방법을 소개함으로써 어류의 질병을 예방하는 것에 관한 것이다. 먼저 본 발명은, 진핵세포 이중발현 벡터에 IPNV의 VP2-VP3 융합 유전자(fusion gene)와 IHNV의 G-M1 융합 유전자를 서브-클로닝(sub-cloning)하여 하나의 plasmid DNA로 IPNV와 IHNV 모두를 예방할 수 있는 DNA 백신을 제공한다. 또한, 앞서 제조한 IPNV 및 IHNV의 융합 유전자를 pET28a(+)에 서브-클로닝하여 대장균에서 융합 단백질(fusion protein)을 만듦으로써 IPNV-VP2-VP3 및 IHNV-G-M1의 융합 단백질을 사용한 재조합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 상기에서 제작한 DNA 백신 및 단백질 백신을 어류에 처리함에 있어 처리시기 및 방법을 최적화함으로써 보다 효과적으로 바이러스로부터 어류를 보호할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

양식 연어류 바이러스에 대한 복합 ＤＮＡ 및 단백질 백신의 개발과 백신 처리 방법의 최적화 {Development of complex DNA and protein vaccines against infectious virus in aquaculture salmon, and optimizing of vaccine treatment}

연어류는 인간에게 단백질을 제공하여 주는 고급어종으로써 북미, 북유럽, 일본 등을 포함하는 세계 여러 지역에서 대량 양식되고 있는데, 특히 노르웨이의 경우 양식 관련 산업이 차지하는 비중이 GNP의 약 15 % 이상이 된다. 그런데 이들 양식 연어류에 전염성 췌장괴저 바이러스 (Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV)와 전염성 조혈괴저 바이러스 (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, IHNV)가 감염하여 대량폐사를 유발함으로써 막대한 피해를 주고 있다. 우리나라의 경우에도, 양식 연어류에 바이러스성 질병에 의한 대량 폐사가 발생하여 매년 수천만 마리의 치어가 죽어가고 있는 실정이다. 본 발명자들의 연구 결과 이들 치어에서 IPNV와 IHNV가 검출되어 우리나라의 경우 이들 두 종류 바이러스의 복합 감염이 대량폐사의 원인임이 확인되었다. 따라서 양식 연어류의 IPNV 및 IHNV 감염에 의한 피해를 줄이기 위한 대책 마련이 시급한 상황이다.

일반적으로 바이러스성 질병은 한번 발생하면 치료가 매우 어렵다. 따라서바이러스 질병을 막는 가장 좋은 방법은 효과적인 백신을 개발하여 바이러스 질병을 미연에 방지하는 것이다. 이러한 이유로 인하여 세계 여러 나라에서 IPNV 및 IHNV에 대한 백신을 개발하고자 많은 노력을 기울여 왔다. IPNV의 경우 VP1, VP2, VP3, 그리고 VP4 등의 4개의 구조 단백질 중 캡시드(capsid)의 가장 바깥쪽에 위치하는 VP2에 중화 에피토프(epitope)가 있다는 보고를 바탕으로 VP2를 사용한 재조합 백신(recombinant vaccine)을 개발하였다. 그리고 IHNV의 경우 L (polymerase), G (glycoprotein), N (nucleocapsid), M1 (matrix protein 1), M2 (matrix protein 2) 등의 5종류 구조 단백질 중 외피 단백질(envelope protein)인 G 단백질에 중화 에피토프가 있다는 보고를 바탕으로 G를 사용한 재조합 백신을 개발하였다. 최근에는 IHNV의 G를 타켓 유전자(target gene)로 하여 DNA 백신을 개발하고자 연구를 진행 중에 있는데, 재조합 백신보다 효과가 좋은 것으로 보고되고 있으며, 친어에 처리할 경우 치어의 발병을 어느 정도 줄일 수 있음이 보고되고 있다.

그러나 이들 개발된 백신들은 그 효과가 매우 약하여 실용화되지 못하고 있는 실정이다. 아직까지 이들 개발 중인 백신들의 효과가 낮은 이유를 정확하게 알지 못한다. 그러나 본 발명자들의 최근 연구 결과에 따르면 지금까지 외국의 연구자들이 선정한 IPNV 및 IHNV의 백신 타켓 유전자에 문제가 있을 가능성이 높다. 본 발명자들의 연구 결과 IPNV의 경우 VP2보다 VP3가 더 면역원성(immunogenicity)이 높음이 확인되었고, IHNV의 경우 G보다 M1이 더 면역원성이 높음이 확인되었다. 그리고 지금까지 백신으로 개발되어왔던 IPNV의 VP2, 그리고 IHNV의 G는 서로 다른 혈청형의 바이러스 사이에 변화가 많은 단백질들이다. 따라서 지금까지와 같은 타켓 유전자를 대상으로 개발 중에 있는 IPNV 및 IHNV 백신들은 다른 지역에서 발생하고 있는 양식 연어류의 바이러스 질병을 예방하기에는 적합하지 않은 것으로 판단된다. 반면에 본 발명자들에 의하여 면역원성이 높은 것으로 확인된 IPNV의 VP3와 IHNV의 M1은 바이러스 입자의 안쪽에 존재하는 구조단백질들로서 서로 다른 혈청형의 바이러스들 사이에서도 변이가 거의 없는 보존(conserved)된 단백질들이다. 따라서 기존에 외국에서 백신 대상으로 삼았던 것들과 본 발명자들이 밝혀낸 것들을 대상으로 백신을 개발하는 경우 기존에 개발되어 왔던 IPNV 및 IHNV 백신보다 훨씬 효과가 좋은 백신의 개발이 가능하리라 판단되며, 개발된 백신은 우리나라에 존재하는 바이러스뿐 아니라 외국에 존재하는 바이러스에도 적용 가능한 백신이 될 것으로 생각된다. 그리고 양식 연어류의 치어기에 IPNV와 IHNV가 동시에 복합 감염하여 대량폐사를 유발하기 때문에 이를 효율적으로 예방하기 위해서 이 두 종류의 바이러스를 동시에 퇴치 가능한 IPNV-IHNV 복합(combination) 백신의 개발이 필요한 상황이다.

대개의 경우 백신을 처리하는 방법으로는 주사, 침잠, 먹이 등의 3가지 방법을 사용하고 있다. 이러한 백신의 투여 방법은 백신의 종류, 어류의 나이 및 크기에 따라 달리한다. DNA 백신의 경우 친어에 주사를 함으로써 투여한다. 양식어를 0.04% 2-PE(phenoxyethanol) 용액으로 마취시킨 후 10-100ng의 DNA 백신을 근육 및 복강에 주사한다. 단백질 백신의 경우 부화 초기의 치어는 아직 먹이를 먹지 않기 때문에 침잠 법으로 백신을 처리한다. 바이러스 단백질을 풀어놓은 용기에 치어를 1-2분 정도 담가 놓음으로 백신 처리를 한다. 친어 및 성어의 경우 주사 방법을 사용하거나 사료에 단백질 백신을 섞은 후 양식어에 투여하여 먹게 함으로써 백신 처리를 한다. 주사 방법을 사용하는 경우 보조인자(adjavant)로써 라이트 오일(light oil), 베타-글루칸(β-glucan) 키토산(chitosan), 레바미솔(levamisol) 등을 보조인자로 사용하거나 GM-CSF, TGF-β, 호르몬(hormone) 등과 함께 처리한다. 경구 투여를 하는 경우 GM-CSF, TGF-β, 호르몬 등도 함께 투여하는 것이 통상적인 방법이다. 이처럼 백신을 처리하는 방법은 백신의 종류와 어류의 나이 및 크기와 밀접한 관련이 있다. 또한 위의 3가지 방법 중 가장 효과적인 방법은 주사 방법인데, 주사의 경우 성어 및 친어에는 적용이 가능하지만 나이가 어린 치어에는 처리하기가 힘들다. 또한 IPNV 감염에 의한 연어류의 폐사가 주로 부화 후 초기인 치어기에 발생함으로 이를 방지하기에 주사방법은 부적절하다. 그리고 친어에 백신을 처리하여 친어의 항체가 알을 통하여 치어에 전달된다는 개념의 백신은 난항이 사라지면 방어 효과가 사라지기 때문에 단 한번의 백신 처리로 효과적인 면역성을 기대하기 힘들다. 이에 본 발명자들은 위의 3가지 백신 처리 방법을 모두 이용하고, 어류의 성장 시기에 따라 백신을 처리하는 복합 백신 처리 방법을 고안해 냈다.

본 발명은 전염성 췌장괴저 바이러스의 VP2 유전자와 VP3 유전자의 전부 또는 일부가 융합된 유전자(VP2-VP3)를 포함하는 진핵세포 발현 벡터 및 이를 유효성분으로 하는 어류의 전염성 췌장괴사증의 치료 또는 예방을 위한 DNA 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 전염성 조혈괴저 바이러스의 G 유전자와 M1 유전자의 전부 또는 일부가 융합된 유전자(G-M1)를 포함하는 진핵세포 발현 벡터 및 이를 유효성분으로 하는 어류의 전염성 조혈괴사증의 치료 또는 예방을 위한 DNA 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 전염성 췌장괴저 바이러스의 VP2 유전자와 VP3 유전자의 전부 또는 일부가 융합된 유전자와 전염성 조열괴저 바이러스의 G 유전자와 M1 유전자의 전부 또는 일부가 융합된 유전자를 동시에 포함하는 진핵세포 발현 벡터 및 이를 유효성분으로 하는 어류의 전염성 췌장괴사증 및 전염성 조혈괴사증의 치료 또는 예방을 위한 DNA 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 IPNV의 VP2-VP3 재조합 결합 단백질과 IHNV의 G-M1 재조합 결합 단백질을 포함하는 단백질 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 VP2-VP3 유전자 또는 G-M1 유전자를 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, 생성된 형질전환체를 상기 유전자가 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 단백질 VP2-VP3 또는 G-M1을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 VP2-VP3 및 G-M1 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 IPNV의 VP2-VP3 결합 단백질을 인식함을 특징으로 하는 항체를 제공한다.

특정 양태로서, 본 발명은 IPNV의 VP2-VP3 및 IHNV의 G-M1을 단독으로 또는 혼합하여 산란계에 투여하여 면역화 시키고, 면역화된 산란계로부터 산란된 알을 회수하고, 회수된 알의 난황으로부터 분리된 난황항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 어류의 전염성 췌장괴사증 및 전염성 조혈괴사증을 치료 또는 예방하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 조성물을 어류의 성장단계에 따라 투여함으로써 전염성 췌장괴사증 및 전염성 조혈괴사증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

도 1은 IPNV 단편(segment) A로부터 VP2의 부분 단편과 VP3의 전체 유전자를 분리하여 VP2와 VP3가 융합된 발현 벡터의 작제도이다.

도 2는 IHNV에 대한 중화 에피토프(epitope)를 가지고 있는 G 단편과 M1의 전체 유전자를 분리하여 G와 M1 유전자가 융합된 발현 벡터의 작제도이다.

도 3은 IPNV-VP2-VP3 융합 유전자와 IHNV-G-M1 융합 유전자를 동시에 포함하는 이중 발현 벡터의 작제도이다.

도 4는 IPNV-VP2-VP3와 IHNV-G-M1 유전자가 클로닝되어 있는 DNA 백신을 무지개 송어 친어 근육에 주사한 다음, DNA 백신을 처리한 친어의 알에서 부화한 치어의 생존율을 조사한 결과를 나타낸 것이다(-□- 백신 처리하지 않음, -◆- 백신 처리함).

도 5는 연어 및 무지개 송어의 백신처리 일정과 백신 처리에 따른 항체의 생성 양을 나타낸 것이다. DNA 백신은 주로 친어에 처리하여 친어의 면역력을 높이는 한편 친어에서 만들어지는 항체가 치어에 전달되어 바이러스의 수직 감염을 막아치어기의 대량폐사를 예방할 목적으로 사용한다. 그리고 단백질 백신은 주로 치어 및 성어에 처리하여 치어기의 대량폐사를 막고 또한 치어 및 성어의 성장을 촉진시키도록 한다. 투여하는 방법으로서는 실제 개발되었을 때 실용 가능한 방법을 사용하는데, 주사, 경구투여, 침잠법 등의 세 가지 방법을 모두 사용한다.

본 발명은 전염성 췌장괴저 바이러스(Infectious Pancreatic Necrosis Virus; IPNV) 및 전염성 조혈괴저 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)로부터 분리된 구조 유전자로부터 중화항체를 유도하는 유전자 부위를 융합(fusion)하여 하나의 플라스미드로 클로닝시키고, 이로부터 발현되는 재조합 융합 단백질을 이용한 백신에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한국형 전염성 췌장괴사 바이러스로부터 분리한 VP2, VP3 및 전염성 조혈괴사 바이러스로부터 분리된 구조 유전자 G, M1 사이의 융합; 이로부터 발현되는 융합 단백질; 상기 단백질의 대량생산 방법; 상기 유전자를 이용한 어류 전염성 췌장괴저 바이러스 및 전염성 조혈괴저 바이러스에 대한 DNA 백신; 상기 단백질을 이용한 어류 전염성 췌장괴저 바이러스 및 전염성 조혈괴저 바이러스에 대한 단백질 백신; 상기 DNA 및 단백질 백신을 이용한 임상실험 절차에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 VP2-VP3 융합 단백질을 암호화하는 유전자는 한국형 분리주인 IPNV DRT 균주로부터 분리한 것이다. 상기 VP2 단백질은 약 23kDa 크기의 분자량을 갖는 부분적인 VP2 구조 유전자로부터 클로닝한 것이다. 클로닝된 부분적인 VP2 서열 내에는 아미노산 153-203 사이와 아미노산 204-330 사이를 포함하고 있고, 이 부위는 IPNV에 대한 중화항체 생성부위라고 보고된(Petter et al., Journal of General Virology, 76, 1165-1172, 1995; Marie B.L. et al., Fish & Shellfish Immunology, 11, 203-216, 2001) 서열이다. VP2의 부분 단편과의 융합 실험에 사용된 IPNV의 VP3 유전자는 675개의 염기쌍을 클로닝시켰으며 이들로부터 약 24.8kDa의 분자량을 갖는 단백질이 만들어진다.

또한, 본 발명에 따른 G-M1 융합 단백질을 암호화하는 유전자는 한국형 IHNV 혈청형인 IHNV-SCS에서 분리한 G 유전자의 단편과 M1 유전자의 전부를 이용하였다. G 유전자의 아미노산 서열 50부터 290번까지의 부분 단편 중에는 전염성 조혈괴저 바이러스에 대한 중화 에피토프가 존재하고 있고 이로부터 암호화되는 단백질은 약 26.4kDa 이다. 또한 M1 단백질은 G 단백질에 비해 더욱 강력한 중화 에피토프를 가지고 있는 것으로 본 발명자들의 결과 밝혀졌으며 이로부터 암호화되는 단백질은 약 25.9kDa이다.

본 발명에서는 상기 IPNV-VP2-VP3 융합 유전자를 작제함에 있어 IPNV의 A 단편(segment)으로부터 적합한 프라이머를 사용하여 VP2의 부분 단편을 증폭하고, 증폭된 DNA를 적합한 제한효소로 절단한 다음, 이를 발현 벡터의 적절한 제한효소자리에 도입하고, IPNV-VP3 유전자를 적합한 프라이머를 사용하여 증폭하고, 증폭된 DNA를 적합한 제한효소로 절단한 다음, 이를 상기 IPNV-VP2 유전자를 도입시킨 발현 벡터의 적절한 제한효소자리에 도입하여 IPNV-VP2 유전자와 IPNV-VP3 유전자를 함께 포함하는 벡터를 작제할 수 있다.

또한, IHNV로부터 적합한 프라이머를 사용하여 G와 M1 유전자를 증폭하고, 증폭된 DNA를 적합한 제한효소로 절단한 다음, 이를 동일한 발현벡터의 적절한 제한효소자리에 차례로 도입함으로써 G와 M1이 융합된 유전자를 포함하는 IHNV-G-M1 발현 벡터를 작제할 수 있다.

또한, IPNV-VP2-VP3 융합 유전자와 IHNV-G-M1 융합 유전자를 각각 적합한 프라이머를 사용하여 증폭하고, 증폭된 DNA를 적합한 제한효소로 절단한 다음 이를 동일한 포유류 이중 발현 벡터에 도입함으로써 DNA 백신을 제조할 수 있다.

본 발명의 DNA 백신 조성물은 상기에서 작제한 IPNV-VP2-VP3 발현벡터, IHNV-G-M1 발현벡터 및 IPNV-VP2-VP3 융합 유전자와 IHNV-G-M1 융합 유전자를 모두 포함하는 발현벡터 중에서 선택된 발현벡터와 상기 발현벡터가 생체 내에 주입되었을 때 그 발현 정도를 증강시킬 수 있는 싸이토카인(cytokine)유전자나 면역세포 활성화에 필요한 협력촉진 물질(costimulatory molecule) 유전자와 같은 보조인자(adjuvant)를 포함할 수 있다.

본 발명자들은 상기 DNA 백신을 IPNV 및 IHNV에 감염된 무지개 송어에 주사하고 백신을 처리한 것과 백신처리하지 않은 무지개송어로부터 난액을 채취하여 바이러스 증식 억제효과를 측정한 결과, 본 발명의 DNA 백신이 바이러스의 증식을 억제함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 IPNV의 VP2-VP3 재조합 융합 단백질 및 IHNV의 G-M1 재조합 융합 단백질을 포함하는 단백질 백신 조성물을 제공한다.

상기 VP2-VP3 재조합 단백질 및 G-M1 재조합 단백질은 VP2 유전자 또는 VP3 와 G 유전자 또는 M1유전자를 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, 생성된 형질전환체를 상기 유전자가 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 융합 단백질 VP2-VP3 와 G-M1을 회수함으로써 제조할 수 있다.

본 발명은 IPNV의 VP2-VP3 또는 IHNV의 G-M1 단백질을 인식함을 특징으로 하는 항체를 제공한다.

본 발명의 IPNV의 VP2-VP3 융합 단백질 및 IHNV의 G-M1 융합 단백질을 항원으로 하여 IPNV 및 IHNV에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 상기 단백질을 면역원으로서 사용하여 하이브리도마의 표준 제조 방법을 통해 항체를 제조한다. 생성된 항체는 샘플중의 IPNV 및 IHNV를 검출하는데 특히 유용하다. 폴리클로날 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물로부터 당해 분야의 통상적인 기술 중의 하나에 의해 용이하게 생성시킬 수 있다. 간단히, 목적하는 단백질 또는 펩타이드를 사용하여 전형적으로 복막내, 근육내, 안내 또는 피하 주사를 통해 동물을 면역시킨다. 관심대상의 단백질 또는 펩타이드의 면역성을 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전하거나 불완전한 보조제를 사용하여 증가시킬 수 있다. 여러 부스터(booster) 면역처리에 따른 다음, 혈청의 소형 샘플을 수집하고 목적하는 단백질 또는 펩타이드에 대한 반응성을 시험한다. 동물의 역가가 일단 단백질에 대한 이의 반응성의 관점으로 정체 상태에 도달하면, 다량의 폴리클로날 면역혈청을 1주마다의 출혈 또는 동물을 방혈시킴으로써 용이하게 수득할 수 있다.

모노클로날 항체도 익히 공지된 기술을 사용하여 용이하게 생성시킬 수 있다 (Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennettm McKearn, and Bechtol(eds.) (1980)).

특정 양태로서, 본 발명은 IPNV의 VP2-VP3 단백질 또는 IHNV의 G-M1 단백질을 단독으로 또는 혼합하여 산란계에 투여하여 면역화시키고, 면역화된 산란계로부터 산란된 알을 회수하고, 회수된 알의 난황으로부터 분리함을 특징으로 하는 난황 항체의 제조방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 난황 항체를 유효성분으로 포함하는 전염성 췌장괴사증을 예방하기 위한 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 어류의 전염성 췌장괴사증 및 전염성 조혈괴사증을 예방하기 위한 사료 조성물로 이용 될 수 있으며, 본 발명의 사료 조성물은 IPNV 및 IHNV에 대한 난황 항체를 통상의 사료와 혼합하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 백신 조성물, 단백질 백신 조성물 및 난황항체를 포함하는 약학 조성물은 주사법, 침잠법 및 경구투여법을 사용하여 동물에 투여할 수 있다. 백신 조성물을 투여하기 위한 방법으로는 가장 바람직하게는 친어에 DNA 또는 단백질 백신을 주사 방법으로서 처리하고, 채란을 한 후 계란면역항체를 처리한다. 알이 부화를 하면 침잠을 통하여 단백질 백신을 처리한다. 마지막으로 치어의 크기가 주사를 놓을 만큼 커지면 단백질 백신을 주사방법으로 처리하는 것이다. 이러한 방법을 사용하면, 최초 친어에 백신을 처리하면서 생성된 항체 즉 친어 항체는 두 번째 백신 처리 후 난황 항체로 이어지고, 세 번째 백신 처리를 함으로써 지속된다. 마지막으로 일정 크기의 치어에 단백질 백신을 처리함으로써 치어 항체가 생성, 지속적으로 항체를 보유하게 됨으로써 IPNV 및 IHNV의 감염에 대한 지속적인 방어 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 조성물은 어류, 더욱 바람직하게는 연어류에 매우 효과적이다.

이하, 아래의 실시예에 의하여 본 발명을 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다.

<실시예 1>

IPNV-VP2-VP3 유전자의 융합

서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용하여 IPNV-VP2 유전자의 부분 파편을 증폭하고, 서열번호 3과 4를 이용하여 IPNV-VP3의 유전자를 증폭하였다. 먼저 IPNV의A 단편(segment)을 포함하는 cDNA에 0.5U의 Tag-중합효소(대한메디칼시스템, 한국)와 10pmole의 센스(sense)와 안티-센스(anti-sense) 프라이머를 첨가하고, 고속 열순환기(Fast Thermal Cycler; 대한메디칼시스템, 한국)를 사용하여 92℃에서 40초, 55℃에서 40초, 72℃에서 50초의 순서로 35회 DNA 증폭을 반복 수행하여 624염기쌍의 VP2 유전자 단편 및 675염기쌍의 VP3 유전자를 증폭하였다. 증폭된 VP2 및 VP3 DNA를 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기 영동한 후 겔 정제 킷트(gel purification kit, Quiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 적절한 제한 효소로 소화 한 후 원핵세포 발현 벡터의 동일한 제한 효소 자리에 클로닝 하였으며, 그 개열 지도를 도 1에 나타내었다. 서열번호 5의 프라이머는 서열번호 25의 프라이머와 함께 사용하여 진핵세포 발현 벡터의 제작에 사용하였다.

서열번호 1 : GCTAGCATGAACCCACAGGACAAGGTCAACAAT

서열번호 2 : GCGGCCGCTTACACTTCTCCGTCATCGCCGGA

서열번호 3 : AGACCCATAACCCTAGTGATGGCCAGAGCAAAAGAAGTG

서열번호 4 : ACGCGTGCTTACACTTCTCCGTCATCGCCGGA

서열번호 5 : CACTAGGGTTATGGGTCT

<실시예 2>

IHNV-G-M1 유전자의 융합

서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 IHNV-G 유전자의 부분 파편을 증폭하고, 서열번호 8과 9를 이용하여 IHNV-M1 유전자를 증폭하였다. PCR 산물은 적절한 제한 효소로 소화 한 후 원핵세포 발현 벡터의 동일한 제한 효소 자리에 클로닝 하였으며, 그 개열 지도를 도 2에 나타내었다. 서열번호 10의 프라이머는 서열번호 11의 프라이머와 함께 사용하여 진핵세포 발현 벡터의 제작에 사용하였다.

서열번호 6 : AAAGTCGACATGGACAAACTCTCCA

서열번호 7 : TCTCCATCTGACATTAGATAGGCAAAGT

서열번호 8 : ACTTTGCCTATCTAATGTCAGATGGAGA

서열번호 9 : AAAGCGGCCGCCTATTGACCTTGCTTCA

서열번호 10 : AGCTAGCATGGACAAACTCTCCA

서열번호 11 : AAAGCTTCTATTGACCTTGCTTCA

<실시예 3>

IPNV-VP2-VP3 및 IHNV-G-M1 이중 발현 벡터의 제작

상기 실시예 1과 2에서 제작한 IPNV-VP2-VP3 융합 유전자와 IHNV-G-M1 융합 유전자를 진핵세포 발현 벡터(pRIES)의 MCS A site 와 MCS B site에 각각 도입함으로써 진핵세포 이중 발현 벡터(DNA 백신)를 제작하였으며, 도 3에 나타내었다.

<실시예 4>

DNA 백신을 이용한 임상실험

실시예 3에서 제작한 DNA 백신을 처리한 친어의 알에서 부화한 치어가 IPNV 및 IHNV에 대한 저항성을 지니는지를 확인하기 위하여 무지개 송어 치어의 생존율을 조사하였다. IPNV-VP-VP3와 IHNV-G-M1을 포함하는 DNA 백신을 처리한 친어에서 알을 채취한 다음, 알에서 부화한 치어 20000마리를 대상으로 생존율을 조사하였다. 대조구로는 백신처리를 하지 않은 무지개송어의 친어에서 나온 치어 20000마리를 사용하였다. 백신 처리한 친어의 치어와 대조구의 치어를 동일한 지하수를 사용하여 양식하였으며, 본 조사에 사용한 양식 수조는 IPNV 및 IHNV가 항상 존재하는 수조로써 무지개송어 치어에 IPNV 및 IHNV가 자연 감염되게 하였다. 백신 처리 그룹과 대조 그룹의 치어들을 부화 후부터 생존율을 조사하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 도시된 바와 같이, 백신 처리하지 않은 대조구의 치어는 부화 후 15일부터 죽기 시작하였으며, 30일 째에는 전체의 90%가 폐사되어 10% 정도만이 살아남았다. 이들 폐사된 치어를 대상으로 IPNV의 VP2에 대한 RT-PCR을 수행한 결과 모두 IPNV에 감염되었음을 확인할 수 있었다. 반면에 백신 처리한 친어에서 나온 치어의 경우 부화 후 30일 까지 전혀 폐사가 발생하지 않았으나 부화 후 30일 이후부터는 폐사가 발생하기 시작하여 부화 후 45일째에는 약 20%가 폐사되었으며, 70일 이후에는 약 50%가 폐사되었다. 이로부터 백신을 처리한 친어에서 나온 치어가 IPNV 및 IHNV의 감염에 대하여 높은 저항성을 보임을 확인할 수 있었다. 그러나 부화 후 시간이 지남에 따라 폐사율이 증가되는 것이 관찰되었는데, 이는 친어로부터 전달받은 항체가 쇠멸되어 감을 의미하는 것이다. 따라서 치어에서 계속적인 항체의 유지를 위해선 부화 후 치어에 대한 백신처리가 필수적이라 할 수 있다.

<실시예 5>

VP2-VP3 및 G-M1 단백질의 발현

IPNV의 VP2-VP3 유전자 또는 IHNV의 G-M1 유전자를 포함하고 있는 발현벡터로 형질 전환된 E. coli BL21(DE3) 세포를 카나마이신(kanamycine, 100㎍/ml) 또는 암피실린(ampicillin, 100㎍/ml)을 첨가한 100ml LB 브로쓰(broth)에서 유도(induction)하였다. OD600 0.4-0.5에서 0.3-0.4mM의 IPTG를 첨가한 후 37℃에서 진탕배양하였다. IPTG를 첨가하기 직전에 1ml의 세포를 샘플링(sampling)하고, 발현 유도(induction) 이후 매 2시간 간격으로 세포를 샘플링하여 SDS-PAGE 분석에 사용하였다. SDS-PAGE 분석 결과 VP2-VP3는 47.5 kDa의 분자량을 갖는 단백질이 그리고 G-M1은 53.1kDa의 분자량을 갖는 단백질이 발현되었다. 상기 단편들의 단백질은 0.4mM의 IPTG를 첨가한 후 37℃ 진탕 배양기(shaking incubator)에서 8시간 동안 유도(induction)시킬 경우 최상의 발현 조건을 갖는다.

<실시예 6>

백신 투여

백신 투여는 3가지 방법을 사용하여 수행하였다. 첫째, DNA 백신의 경우 친어에 주사 방법을 사용하여 투여하였다. 양식어를 0.04% 2-PE(phenoxyethanol) 용액으로 마취시킨 후 10-100ng의 DNA 백신을 근육에 주사하였으며, 이때, GM-CSF, TGF-β, 호르몬 등의 유전자들도 같이 주사하여 백신 효과를 증가시키려 했다. 주사방법은 백신 투여 방법 중 가장 효과가 좋은 것으로 알려졌는데, 친어에 면역을유도함은 물론 친어의 항체가 치어에도 들어가 부화 후 치어기에 바이러스에 대한 면역력을 제공하여 준다. DNA 백신을 처리한 친어로부터 부화한 초기의 치어에 침잠법으로 단백질 백신을 처리하였다. 단백질 백신을 풀어놓은 용기에 치어를 1-2분 정도 담가 놓음으로 백신 처리를 하였다. 마지막으로 부화 4개월 후 어느 정도 성장한 어류에 대하여 주사 방법을 사용하거나 사료에 단백질 백신을 섞은 후 양식어에 투여하여 먹게 함으로써 백신 처리를 하였다. 주사 방법을 사용하는 경우 보조인자(adjavant)로써 라이트 오일(light oil), 베타-글루칸(β-glucan), 키토산(chitosan), 레바미솔(levamisol) 등을 보조인자로 사용하거나 GM-CSF, TGF-β, 호르몬(hormone) 등을 함께 처리한다. 경구 투여를 하는 경우 GM-CSF, TGF-β, 호르몬 등도 함께 투여하여 백신 효과를 증대시킬 수 있다. 백신 처리 시기 및 그에 따른 면역항체의 생성에 관한 모식도를 도 5에 나타내었다.

본 발명자들이 개발한 IPNV의 VP2-VP3 융합 단백질 및 IHNV의 G-M1 융합 단백질 백신은 연어류의 집단 폐사를 일으키는 IPNV 및 IHNV 감염에 대한 복합 예방 백신으로 유용하게 이용될 수 있다. 아울러 상기 단백질들을 암호화하는 유전자를 직접 이용하여 DNA 백신으로 제조될 수도 있다. 이와 더불어 본 발명자들이 새롭게 시도한 백신 투여 방법으로써 상기의 모든 DNA 및 단백질 백신을 이용하여 어류의 성장시기에 따른 적절한 백신을 투여함으로써 면역반응 유도를 극대화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 배양 조건을 이용하여 상기 IPNV-VP2-VP3 및 IHNV-G-M1 단백질의 대량생산이 가능하므로, 효과적이면서도 경제적으로 연어류 바이러스 감염에 대한 백신을 제조할 수 있다.

Claims

서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 전염성 췌장괴저 바이러스의 VP2-VP3 융합 단백질(fusion protein).
제1항의 단백질 IPNV-VP2-VP3를 암호화하는 유전자.
제2항의 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 진핵세포 및 원핵세포 발현벡터.
제3항의 발현 벡터를 유효성분으로 하는 어류의 전염성 췌장괴사증의 치료 또는 예방을 위한 DNA 백신 조성물.
서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 전염성 조혈괴저 바이러스의 G-M1 융합 단백질.
제5항의 단백질 IHNV-G-M1을 암호화하는 유전자.
제6항의 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 진핵세포 및 원핵세포 발현벡터.
제7항의 발현 벡터를 유효성분으로 하는 어류의 전염성 조혈괴사증의 치료 또는 예방을 위한 DNA 백신 조성물.
IPNV-VP2-VP3 융합 유전자(fusion gene)와 IHNV-G-M1 융합 유전자를 함께 포함하는 진핵세포의 이중 발현벡터.
제9항의 발현 벡터를 유효성분으로 하는 어류의 전염성 췌장괴사증 및 전염성 조혈괴사증의 치료 또는 예방을 위한 DNA 백신 조성물.
IPNV-VP2-VP3 융합 단백질과 IHNV-G-M1 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 어류의 전염성 췌장괴사증 및 전염성 조혈괴사증의 치료 또는 예방을 위한 단백질 백신 조성물.
IPNV-VP2-VP3 융합 유전자 또는 IHNV-G-M1 융합 유전자를 작동 가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, 생성된 형질전환체를 상기 유전자가 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 단백질 VP2-VP3 융합 단백질 또는 G-M1 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.
제4항, 제8항, 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 어류의 성장단계에 따라 투여함으로써 어류의 전염성 췌장괴사증 또는 전염성 조혈괴사증을 치료 또는 예방하는 방법.
제13항에 있어서, 친어에 DNA 백신 또는 단백질 백신을 주사 방법으로 투여하고, 채란을 한 후 난황항체를 처리한 다음 알이 부화를 하면 침잠을 통하여 단백질 백신을 처리하며 치어의 크기가 주사를 놓을 만큼 커지면 단백질 백신을 주사 방법으로 처리함을 특징으로 하는 방법.