TWI332989B - Hsp70 from arthrobacter - Google Patents

Description

玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於來自棒狀桿菌屬（corynebacteria) 的熱休克蛋白（hsp)基因以及編碼的蛋自f。特別地，本 發明是有關於來自關節桿菌J (如物咖）的hsp70 之分離的DNA序列及胺基酸序列，以及與其同源性的序列 。此外，本發明也有關於關節桿菌屬hsp7〇的各種用途： 用於氣備疫苗，特別是魚類疫苗；作為佐冑·以及作為抗 原之載劑》 【先前技術】 一個成功對抗細胞内病原體的疫苗，不僅將經由主要 組織相容複合體（MHC)第n型途徑刺激體液免疫反應， 而且（更重要地）還將經由MHC第I型途徑的活化，而誘 發感染細胞的破壞。後者的反應是經由在感染細胞中的外 源丨生蛋白質之胞液降解而達成，使得外源性物質的片段穿 梭到細胞表面呈現給CD8 +細胞毒性T細胞（CTL )。無法活 化MHC第I型途徑，是以純化的重組抗原為基底的疫苗之 常見缺點。 熱休克蛋白（“ Hsps” ）是一種原核及真核細胞所製 造的分子伴護者蛋白質之家族，其在許多細胞内及細胞間 的過程中扮演必要的角色，特別是在抗原處理以及將抗原 片段呈現到細胞表面處的MHC第I型系統。特定的hsp蛋 白質與其他肽的融合蛋白質，已成功地在活體内誘發對該 等肽專，一性的CTL反應。 此外，hsps是目前已知對許多細菌、真菌、腸蟲及原 生動物疾病的抗-病原體免疫反應之標的。具有各種不同 病原性hsps (主要是微生物來源）的哺乳動物之免疫作用 ，可誘發強烈的免疫反應，並且提供對抗由這些病原體所 引起的疾病之保護。對於病原性hsps的哺乳動物免疫反應 之強度，推測部份是由於在這些蛋白質上的多種B細胞及 T細胞抗原決定部位之存在所致。 一種活的、非致命性的關節桿菌屬菌株（棒狀桿菌家 族之成員），是在用於保·護鮭魚及其他養殖魚類對抗細菌 性腎臟疾病（BKD)的疫苗中，以“Ren〇gen，、名稱銷售 。這個菌株的特徵是揭露於W〇 98/33884 特的，在於它是第一個被許可用於水產養 。這個疫苗是獨 殖的活體培養物 令人驚言牙地，目前顯示關節桿菌屬_7〇可有效地用 於對抗各種魚類病原體的疫苗中。 【發明内容】 發明概述 轄明㈣—形態係提供—種分離的㈣序列，直包 括關即桿菌屬h 7〇基因 A閃勺权0日 汁夕』其片段或相關的序列。 ==開_讀架構（，）、5，未轉譯區域（5，utr) 未轉譯區域以及任何構成的啟動子 、終結子及局部元素。 3強？調控子 1332989 本·發明的第二形態係提供一種分離的胺基酸序列， 包括關節刪hsP70蛋白質之序列、其免疫原 ： 關的蛋白質。 本發明的另-形態係提供—種疫苗組合物，其包括. 編碼關節桿菌屬hsP70蛋白質之核酸序列、或關節桿菌屬 hsP70蛋白質、或富含hsp70的關節桿菌細胞萃取物。氣 苗組合物可用於製備人類或獸醫用途（包括用於水產養殖 )之藥劑》 本發明的另-形態係提供—種核酸序列，其編碼且有 異源性多肽的關節桿菌屬hsp70蛋白質之全部或部份的融 合蛋白質。本發明也提供融合蛋白質本身。 本發明的又一形態係提供一種包括多肽的實體’該多 狀包括關節桿菌4 hsP70蛋白質的全部或部份，其為共價 或非共價地連接到異源性分子。 、貝 本發明的另一形態係提供關節桿菌屬乜邛”蛋白質或 核酸序列的用it，以作為疫苗抗原、作為佐劑、或作為異 源性分子的載劑，具有治療或預防動物疾病之目的。/ 本么明的另一形態係提供一種誘發或增強動物對免疫 原或=抗原（hapten)的免疫反應之方法，該方法包括將 -醫藥組合物投予該動物，該醫藥組合物包括本發明之 hsp70胺基酸序列’其共價或非共價地連接到異源性分子 ’其中異源性分子包括該免疫原或半抗原。 、本么月的另一形態係提供一種治療或預防性治療魚類 的感木1·生疾病之方法’其包括將一治療組合物投予該魚類 列该洽療組合物包括本發明< hsp7Q核酸序列或胺基酸序 本’X明的另一形態係提供關節桿菌屬〇 用途’以驅動異源性基因之表現。 ^發明的另—形態係提供分離的熱休克蛋白或編碼熱 原)·生、庄6^核s夂分子之用途，以製造用於免疫魚類對抗病 的病=之疫苗組合物；可選擇土也’ 一種預防或治療魚類 έ二、’疾病之方法’其包括將-組合物投予該魚類，該 2。物包括分離的熱休克蛋白或編碼熱休克蛋白的核酸分 。分離的熱休克蛋白較佳是來自細菌來源“例如，關節 捍菌屬）之hsp70。 發明詳述 本發明之分離的hsp7〇基因之新穎序列以及編碼的分 離或純化之蛋白質’是分別提供在第1圖及第2圖。本發 月。a核^序列及胺基酸序列，其實質上是同源於圖示中 斤提供的序列。I質上同源”是指當與參考序列比較時 ’序列與參考序列具有至少6G%的同源性，較佳至少7〇% 的同源性，更佳至少、8〇%、85%、9〇%、95%、98 大的同源性。 "" 為了決疋兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同源性百 分比，將序列以最適的比對目的而排列（例如，在第一胺 基酸或核酸序列的序列中導入缺口，以最適地與第二胺基 酸或核酸序列排列，以及為了比對之目的，可忽視在缺口 丄 中介於中間的非同源性序列）。 不需要兩個序列是相同的 長度。除非有不同的沪 曰 則橫跨要比對序列的序列長 又疋排列的完整内容。視需 ,^ , 祝要，用於比對目的而排列之參 長度’是至少30% ’較佳至少40%，更佳至少 50%，還要更佳至少 ου/〇以及還要更佳至少70%、80% 或9(U的參考序列之長度。可將同源性分析限制在參考序 列的任何特定部份，例如，I _7() #例子中，有人可能 希望將參考序列限制在基因或蛋白質的胺基端半部，或更 特別地限制在結構葉n ( Flahe吻等人⑴⑽）射㈣ 346 : 623-628，以及 Zhu 等人（1996 )如·⑽奶： 1606-1614)。 田第（參考）序列的位置被相同的胺酸殘基或核苷 酸佔據作為在序列中的對應位置時，在該位置處的分子是 同源性的（也就是，在該位置處有同一性）。在核酸序列 比對的例子中，於特定位置處也有同源性，其中包括核苷 酉义的逸碼子二聯體在要比對的兩個分子中編碼相同的胺基 酸，這是由遺傳密碼的簡併性所致。 在兩條序列間的同源性百分比，是同源位置數被序列 分攤的函數（也就是，％同源性=同源位置數/總位置數 )°視需要，序列的比對以及同源性百分比的決定，可利 用數學演算法而完成。適合的演算法是納入在A1 tschu 1等 人（1990 ) /.如厶万215 : 43〇_1〇 的 OBLAST 及 XBLAST程式中。 也包含在本發明的核酸序列範圍内的是在嚴格條件下 10 1332989 可與’參考序列編號1雜合的序列。在本發明的意思中， 嚴格的’’雜合條件是定義為如Sambr00k等人“分子選殖 貫驗室手冊”冷泉港實驗室出版（i989 ) 1. 1〇1_1 1〇4 所說明之條件，也就是，在以1χ ssc緩衝液及 在55°C，較佳是62eC，以及最佳是68〇c清洗】小時之後 ’特別是以〇.2x SSC缓衝液及〇 1%SDs在55°C，較佳是 62°C，以及最佳是68eC清洗1小時之後，還能觀察到陽性 的雜合訊號。 本發明之序列包括參考核酸序列或胺基酸序列之片段 。hsp70核酸參考序列的“片段”，是包括至少5〇個，視 需要至少75個或至少1〇〇個連續核苷酸的序列之任何部份 〇 hsp70蛋白質的“片段”，應理解為是指具有參考 hsp70胺基酸序列的至少25個，視需要至少35個或至少 45個連續胺基酸的任何肽分子。“免疫原性，，蛋白質片段 是可以誘發抗體的片段，該抗體可中和病原體感染力及/ 或調節抗體-補體或抗體依賴性的細胞毒性，以提供經免 疫的宿主之保護作用。一個關節桿菌屬hsp7〇的免疫原性 片段之實例是功能部位Π片段，類似於分枝桿菌屬的功能 部位 II 片段（Huang Q 等人（2000 ) 乂 191(2) :403-8 )。關節桿菌屬hsp70的功能部位π片段是來自 序列編號2的胺基酸；162至365之序列，或是其由至少 100個連續胺基酸’更佳是至少150個連續胺基酸，以及 最佳是至少200個連續胺基酸所組成的部份。 11 1332989 本發明之胺基酸序列也包括第2圖序列的衍生物或該 序列的同源物。胺基酸序列的“衍生物，，是在胺基酸序列 層次上（例如，同源性序列，其中特定天然存在的胺基酸 是以合成的胺基酸取代物而取代）或是在三維層次上（也 就疋’具有大約相同於參考胺基酸序列的形狀及構形之分 子）’與參考序列相關的序列。因此，衍生物包括突變物 、模擬物、模擬部位（mim〇t〇pes )、類似物、單體形式以 及功能等價物。胺基酸序列衍生物保留可誘發抗體產生之 能力，該抗體係可辨認及（交叉）反應來自魚類病原體（ 例如’链魚腎桿菌（y?·仰/卯刀“打⑽）及匹氏魚虱（ 衝·5·))之抗原，及/或保留可誘發 魚類免疫反應以避免這些病原體感染之能力。 本發明之hsp70核酸序列納入hsp70基因的開放譯讀 架構.（0RF)，而且還納入5,及3,未轉譯區域（UTR)。本 發明包括任何構成的啟動子、增強子、調控子、終結子及 局部元素，以及利用這些元素連結異源性基因。特別地， 本發明擴張至DNA表現载體，其包括連接到異源性基因的 關節桿菌屬hsP70啟動子序列（如序列編號！之描述）或 實質上同源性的序列，以驅動該基因的表現。 此處所提供的關節桿菌屬hsp7〇序列表（序列編號j )，是由存在於關節桿菌的基因體選殖所鑑定的基因之序 列’以及序列編號2從其中推論得到的胺基酸序列。原始 的關節桿菌屬菌株之培養物，是再1 996年12月2〇日，以 登錄編號ATCC 55921寄存於美國標準菌種中心（1〇8〇1， 12 1332989 大學大道，麻州，VA 201 1 0-2209 )。 相同屬的物種之hsp蛋白質’一般而言是非常高卢保 守性的，所以預期的是，其他關節桿菌屬所特有的 基因及蛋白質之序列，將不會分別大幅背離序列編號1及 序列編號2。因此’本發明也擴張至這些相關的分 子。從一個棒狀桿菌屬得到的hsP70基因之序列知識’可 促進相同基因從相關生物體中之分離。分離這些基因的方 法，是在此技藝中所熟知的。 “分離的” hsP70基因或核酸序列應理解為係指不同 於其在關節桿菌屬基因體的天然内涵之基因或序列。編碼 hsp70的DNA可來自表現hsp7〇的細胞物質所製備之a· 資料庫（hsp70是普遍存在的’並且大量表現）。編碼 _70的基因也可來自基因體資料庫，例如，藉由遵循實 鉍例所說明的步驟或藉由寡核苷酸合成所得的資料庫。 天然的hsP70蛋白質可藉由適當的純化方案，利用標 準的蛋白質純化技術’而從細菌細胞來源中分離。蛋白質 :::性可藉由例如西方墨潰法或免疫沈澱法，利用對關 j干菌ATCC 55921 hsp7G抗原的抗體而確認。純化的蛋白 ^之胺基端胺基酸的定序，可用於決定部份或完整的胺基 ^序列。這可設計探針以促進天㈣hsp7{)序列從c醜或 基因體資料庫中分離。 ;料庫可利用設計用於鐘定有興趣的基因或其編碼的 „ 對hsP?〇的抗體或至少約20-80個 驗基的寡核苷酸）餘 )而師選。例如’探針可設計成同源於此 13 1332989 處所揭’露的關節桿菌屬基因序列的—部份。 針可與其他細菌性—基因（例如，弧菌屬（：采 hsp基因序列）具有高度的同源性。以選 7 cDNA或基因體資料庫，可利用標準 進 '木針蒒選 你干々忐而進行，例 明於Sambrook等人“分子選殖：實 ° ,_ 观至于冊（紐約：冷 泉港貫驗室出版，1989 )之方法。 沾種刀雜編碼hsp70 的基因之方法疋利帛Ρα法（SambrQQk等人，上述文獻；

Dieffenbach等人“pCR引子：實驗 室出版，1 995 ))。 貫驗至手冊（冷泉港實驗 以這種資料庫篩選方法所鑑定的序列，可與序列編號 1所揭露的hsp70或其他已知紋寄存 人八瓜◦ *工竒存並可在公開資料庫（ 例如，GenBank)獲得的hsp7〇序列進行比對及排列。在分 子的定義區域内或橫跨全長序列之序列同—性（在胺基酸 或核苦酸層次），可經由序列排％，利用電腦軟體程式而 測定，例如’ BLAST、BLAST-2、AUGN、驗加及 INHERIT，其使用各種演算法以測量同源性。 可觀察到關節桿菌屬hsp?〇蛋白質帶有與其他物種（ 特別是細菌物種）的同源物之相似性。已知hsp基因在相 關物種之間是高度保守性的。然而，令人驚訝的是發現到 ，關節桿菌屬hsP70與結核分枝桿菌（办 tubercu 1 os 1 s')反氣氮令故释魯 ^ MyC〇bacteriUm 1 eprae )的hsp70s，在胺基端區域顯示接近的同一性（前2〇個 胺基酸事實上是相同的）。 在實施例2所說明的實驗中，明顯連接到細胞壁肽多 1332989 醋約67件道耳吞（kDa)之大量關節桿菌表面蛋白質，是 藉由胺基端的胺基酸定序而分析。頃發現2()個殘基的胺基 端胺基酸序列，是相同於公姑_ # s , 刀枝才干鹵屬hsp7〇的胺基酸序列 ，以及這個67仟道耳吞的蛋白質，咸信U㈣本發明之 hSP70蛋白質。本發明的—種形態係提供s])s_pAGE所測量 約67仟道耳吞之分離熱休克蛋白，其位於關節桿菌細胞的 細胞壁，並且具有胺基端的胺基酸序列：（m ) SRAVGIDLGTTNSVVSVLE。 我們貫驗的結果證明，魚類中的關節桿菌屬乜邛7〇之 免疫原性，是可與哺乳動物中的分枝桿菌屬hsp7〇相比較 。事後的認識’我們現在相信當用於接種疫苗的魚類時， 關節桿菌屬hsP70對於RenogenTM活體關節桿菌疫苗所提供 的疾病保護作出某程度的解釋。 本發明事實上提供第一證據，在於任何來源的分離或 純化之熱休克蛋白，是有效於作為魚類的疫苗。魚類的免 疫系統並不能與其他物種直接相比，特別是哺乳動物，並 且被貧乏地瞭解。因此’令人驚詩的是，熱休克蛋白可在 :員中誘發強力的免疫反應。本發明的一種形態是有關於 分離或純化的熱休克蛋白之用途，以製備投予魚類之疫苗 組合物。較佳地，熱休克蛋白是使用作為疫苗組合物的佐 劑，或是作為疫苗組合物中異源性分子的載劑。熱休克蛋 白較佳疋hsp70豕族的成員，但可選擇地，可以是任何其 他類型的已知熱休克蛋白’例如，hsp6〇、hsp9〇 ' 或任何小的熱休克蛋白（sHSPs) ^熱休克蛋白可來自任何 15 物種（·原核或真核物種），但較佳是來自細菌物種，例如 ，關節桿菌屬。 認識關節桿菌屬與分枝桿菌屬共享高度同源性的 hsp70基因，開啟了許多關節桿菌同源物之未預見到的應 用。分離的分枝桿菌屬hsp7()蛋白f已證實可表現為有效 的疫苗佐劑。關節桿菌g hsp7〇也可以純的或分離的形式 ，結合抗原而作為佐劑。此處所定義的“佐劑，，，是非專 -性地增強對抗原專_性免疫反應的物質，當結合抗原投 予時或當分別投予相同部位時。在本發明的一種形態中， ，離或純化的關節桿菌^ hsp7。蛋白質是使用作為動物疫 苗的佐劑，特別是魚類疫苗。在相關的應用中，hSp70基 因或其部份是提供力_載體上，以輔助核酸疫苗。在本 發明的料㈣提供疫苗組合物，其包括本發明之hsp?〇 胺基酸或核酸序列’並結合至少—種其他的抗原或編瑪抗 原的核酸序列，以及一種或多種醫藥上可接受的賦形劑。 其他的抗原可以是重組或分離的單一抗原，或可以是來自 病原體的抗原分子之混合物。 使用關節桿菌屬_70作為佐劑，可使醫師或獸醫師 遠離使用傳統減毒的活體分枝桿菌㈣，其可引起對動物 健康的風險’這是由於回復到致命性菌株的危險所致。對 於水產養殖有額外的利益在於，將關節桿菌屬hsp7G核酸 或分離的蛋白質注射到魚類’不會在注射部位引起難看的 隆起或節、结，這在傳統的佐劑是常見的，並且會降低电類 的商業價值。 1332989 關印#•菌屬hsP70蛋白質不僅有效於辅助包括其他抗 '、·疫田#且其本身也具有免疫原活性。關節桿菌屬 hsp70可提供疫苗的活性起源，以預防或治療各種人類及 獸醫疾病’包括由魚類病原體引起的疾病，特別是，但並 不㈣1KD及SRS (‘鞋類立克次體敗血症）。在本發明的 另形也'中，疫田組合物包括分離或純化的蛋白質 作為單獨的抗原或免疫原成份，並且伴隨—種❹種醫藥 上可接受的賦形劑。 本發明也提供一種包括表現載體的核酸疫苗組合物， =表現載體包括本發明< hsp7G核酸序列，其編碼成為疫 田組合物的單獨抗原或免疫原成份之抗原，並且伴隨一種 或多種醫藥上可接受的賦形劑。 從分枝桿菌屬及其他hsp7〇s的同源物推導出高度免疫 原/曰力的關節桿菌屬hsp7〇，也顯示可製備蛋白質 與異源性（非hsp70)分子，通常但並不限於非hsp7〇蛋 白質（例如’半抗原）的基因或肽共價結合物（例如，嵌 合體或融合體）。以此方式，關節桿菌屬hsp7〇蛋白質扮 廣無佐劑載劑的角色，以刺激對於伴隨的異源性分子之體 液及細胞免疫反應。此處所使用的名詞“載劑，，是指包含 T細胞抗原決定部位的分子，當共價連接到第二分子時， 其可幫助誘發及增強對抗第二分子的免疫反應（第二分子 可以是蛋白質、肽、寡核苷酸或寡糖）。 這個疫苗開發的方法是特別有利的，當所涉及到的抗 原性肽不是非常大並且是差的免疫原性，但卻是疫苗的適 17 1332989 合標的時。由關節桿菌屬hsp70攜帶的異源性分子，有利 地是蛋白質半抗原或非蛋白質分子，例如，碳水化合物的 分子部份。 此處所使用的hsp70 “融合蛋白質，，，係包括hsp7() 多肽，其可操作地連接到不同多肽（“異源性多肽” ）^ “異源性多肽’，或“非hsp70多肽，，是指具有對應到實質 上非同源性於hsp70蛋白質的蛋白質胺基酸序列之多肽。 在hsP70融合蛋白質的範疇内，hsp7〇多肽可對應到所有 或部份的hsp70蛋白質（例如’功能部位〗〗蛋白質）。在 融合蛋白質的範疇内，名詞“可操作地連接，，是指hsp7〇 多肽及非hsp70多肽是在架構内彼此融合。非hsp7〇多肽 可融合到hsp70多肽的胺基端或羧基端，或可包埋在 hsp70多肽之内。 ,藉由共價或非共價連結而非藉由產生融合蛋白質，可 將hsP70多肽及異源性分子連接。“異源性分子”是不同 於hsp70蛋白質的任何蛋白質、肽、募核苷酸或寡糖分子 。例如’可將化學間隔基團插入到多肽之間，例如，以產 生一般式hsp70-X-異源性多肽的分子，其中χ是間隔基團 ’例如’ 一個或多個胺基酸的短序列。可選擇地，不同於 在直鏈胺基酸中經由醯胺連結，hsp7〇多肽也可例如藉由 化予結合或化學的、光（例如，紫外光）或放射線_誘發 的交聯，而共價連接到非hsp分子。戊二醛及酼基結合交 聯劑是適合的化學交聯劑之實例。特定的物質是EDC+NHS 或硫-NHS、硫-SMCC、硫_SBED以及SAED，其可以套組的形 18 1332989 式購得。 在本發明的較佳具體實例中，hsp7〇多5太是結合到半 抗原二半抗原是一種可結合抗體的低分子量物質（例如， 肽或寡糖）自，、有當共價連接到大的載劑分子時才 發免疫反應。 ° 可藉由活體外複合細胞溶胞產物、流份、萃取物、病 毒顆粒以及類似物，而冑hsp7Q結合到來自抗原性細胞或 顆粒之完整族群的蛋白質β 異源性分子或多肽可來自任何來源，但最可能是病原 性生物體之成份。特別地’它們可以是來自動物（特別是 水生動物）的病毒、細菌、原生動物、腸蟲或真菌病原體 之多肽。 分離的hsP70基因可以傳統的方式開發，藉由將基因 選殖到表現載體’以產生大量純化或分離的重組hsp7〇蛋 白質（或hSp7〇融合蛋白質）。純化的hsp7()抗原也可藉 由非重組的技術而獲得。這個蛋白質是大量的並可從關 節桿菌細胞中，藉由傳統的純化方法而萃#。可選擇地， —蛋白質或多B太，也可利用標準的肽合成技術而化學 合成。包括這個純化或分離的重組或非重組蛋白質之疫苗 ，可稱作以抗原為基礎的疫苗。 “分離”丨“純化”的蛋白質是定義為實質上不含細 胞物質或衍生hsp7〇蛋白質的其他來自細胞或組織來源的 污染蛋白質，或當化學合成時，實質上不含化學前驅物或 其他化學物質。“實質上不含細胞物質”《表達方式係包 19 1332989 括hsp70蛋白質的製備物，其中蛋白質是分離自它所分離 或重組製造的細胞之細胞成份。在一具體實例中，“實質 上不含細胞物質”之表達方式係包括hsp70蛋白質的製備 物，其具有少於約30% (乾重）的非hsp70蛋白質（此處 也稱為“污染的蛋白質”），更佳是少於約20 %的非 hsp70蛋白質’還要更佳是少於約10%的非hsp7〇蛋白質 ’以及最佳是少於約5%的非hsp70蛋白質。當重組製造 hsp70蛋白質或其生物活性部份時，也較佳是實質上不含 培養液’也就是，培養液代表少於約20%，更佳是少於約 1 0%，以及最佳是少於約5%的蛋白質製備物之體積。 虽含 h s p 7 0的關卽桿邊細胞卒取物，也可用於實 行本發明作為選擇分離或純化的hsp70。藉由去活化或殺 死整個關節桿菌細胞、將細胞溶解、藉由傳統方法將所得 的細胞溶胞產物分層以及鑑定hsp70蛋白質是比其他流份 更大量的流份（例如藉由西方墨潰法），而可獲得“富含 ’’的細胞萃取物。富含hsp70的細胞萃取物，也可藉由在 可導致增加表現熱休克蛋白的條件下（也就是，在熱或其 他細胞壓力的條件下）培養關節桿菌細胞，以及去活化或 殺死，並且將細胞溶解而製備。視需要，將所得的細胞萃 取物（溶胞產物）分層，並且鑑定富含hsp7〇的流份。 較佳地’本發明之嵌合或融合蛋白質是藉由標準的重 組DNA技術而製造。例如，編碼不同多肽序列的dna片段 ’疋根據傳統技術而在架構内一起接合，例如，藉由使用 平端或交錯端接合 '限制酶消化以提供適合端、如果適合 20 1332989 的活黏端的填入、鹼性磷酸酶的處理以避免不想要的連結 以及酵素接合。在另一具體實例中，融合基因可藉由傳統 技術而合成，《包括自動化的DNA合成儀。可選擇地，基 片·^的PCR放大可利用錨狀引子而進行，其可引起連續 兩個基因片段間的互補突出’接著可煉回並且再次放大， ，以產生嵌合基因序列（例如，參見“現代分子生物學方法 ，Ausubel 等人編輯，j〇hn wiely & Sons ; 1 992 )。 本發明的另一形態是有關於載體，較佳是表現載體， 其包括編碼hsP70 (或其一部份）的核酸序列。此處所使 用的名詞“載體” {指核酸分子，其可運送與它們連接的 另外核酸。一種載體的類型是“質體，，，是指環狀的雙股 驗環圈m卜#難片段可接合於其巾。另一種載體 的類型是病毒載體，其中另外的DNA片段可接合到病毒基 因體中。特定的載體可引導與它們操作性連接的基因之表 現。這樣的載體在此處稱為“表現載體”。一般而言，將 表現載體應用於重組DNA技術，通常是以質體的形式。然 而，本發明希望包括其他形式的表現載體，例如，病毒載 體（例如，複製缺失性反轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病 毒）’其提供相等的功能。 本發明之重組表現載體包括本發明以適合於在宿主細 胞中使核酸表現的形式之核酸，係指重組表現載體包括一 種或多種以用於表現的宿主細胞為基礎而選擇的調控序列 ，可操作地連接到要表現的核酸序列。本發明之表現載體 可用於在所要的hsp70抗原接受者内表現（作為DNA疫苗 21 1332989 )，或用於在不同於最終接受者的宿 製造重組抗原疫苗）β 主生物體内表現 以 在表現載體内，可择竹+山Α 細作地連接，，希望是指將有興趣 核苷酸序列’以容許該核苷酸 久斤列表現的方式連接到調控 序列（例如，在活體外的轅转/ 们轉錄/轉譯系統或在宿主細胞中 ’當載體被導入至宿主細胞眸、 ^ „ 肥日寻）。名詞調控序列，，是希 望包括啟動子、增料及其他表現控制元素（例如，聚腺 苷酸化作用訊息）。這樣的調控序列是說明於，例如， G— “基因表現技術，，酵素學方法185，大學出版，聖 地牙哥’加州調控序列包括可在許多類型的宿 主細胞中引導核苷酸序列本質性表現之序列，以及僅可在 特定宿主細胞中引導核㈣序列表現之序％ (例如，組織 專一性的調控序列）。熟悉於此技藝者應可理解，表現載 體的設計可取決於許多因素，例如，要轉形的宿主細胞之 選擇、所要的蛋白質表現量等等。可將本發明之表現載體 導入宿主細胞，藉以產生蛋白質或肽，包括由此處說明的 核酸所編碼之融合蛋白質或肽（例如，hsp7〇蛋白質' hsp70的突變形式、hsp70與異源性肽之融合蛋白質等等） 本發明的另一形態是有關於宿主細胞，其中本發明的 重組表現載體已藉由轉形作用而導入宿主細胞。宿主細胞 可以是任何的原核或真核細胞（包括多細胞真核生物體内 的真核細胞）。例如’ hsp70蛋白質可在細菌細胞（例如 ’大腸桿菌）、昆蟲細胞（利用桿狀病毒表現載體）、酵 22 1332989 母囷細胞或哺乳動物細胞中表現。其他適合的宿主細胞是 在此技藝中之人士所熟知的（例如，G〇eddei，上述文獻） 。可將重組表現載體設計成在宿主魚類細胞中表現（在 謝疫苗接種後）。可選擇地，例如，利用π啟動子調控 序列及Τ7聚合酶，可在活體外轉錄及轉譯重組表現載體。 蛋白質在原核生物中的表現，最常在大腸桿菌中進行 ’其具有包含引導融合或非融合蛋白表現的連續或可誘發 啟動子之載體。融合㈣將許多胺基酸加到在其中編碼的 蛋白質’通常是加到重組蛋白質的胺基端。通常，在融合 表現載體中，f白水解切割位置是導入到融合分子與重組 蛋白質的接合處，以便在後續融合蛋白的純化中，可從融 合分子中分離重組蛋白f。這樣的酵素以及它們同族的辨 認序列’包括13子Xa、凝血酶以及腸激酶。典型的融合表 現載體包括pGEX (法瑪亞生技公司；Smith D· B.及 Johnson K. S· ( 1988 )心此 67 : 31_4〇 )、pMAL (新英格 蘭生物實驗室，貝芙麗，麻州）以及pRIT5 (法瑪亞，

Plscataway，紐澤西），其分別將縠胱甘肽S-移轉酶（ GST)、麥芽糖E結合蛋白質或蛋白f A融合到標的重組蛋 白質。 可將hsp70基因納入到核酸疫苗中（NAV)，藉此nav 可被活體動物的宿主細胞化去，以及hsp7〇基因的表現是 在細胞質中發生》由於細胞間hsp7〇抗原的短肽被運送到 它們可與MHC I系統接觸的細胞表面，因此，源自NAV的 hsp70抗原理想地是置於誘發細胞免疫反應的位置。 23 1332989 插到DNA載體中的hsp70基因，可直接接種到魚類（ 例如’口服、肌肉内或腹膜内），以在魚類細胞的活體内 表現。DNA疫苗接種也可在其他的動物物種中進行。因此 ’本發明的一種形態係提供核酸疫苗，其包括醫藥上可接 受的載劑以及DNA質體，其中編碼關節桿菌屬hsp7〇的核 酸序列可操作地連接到轉錄調控序列。轉錄調控序列包括 啟動子、聚腺苷酸化作用序列以及它核苷酸序列，例如， 具有未甲基化CpG二核穿酸的免疫刺激寡核脊酸，或是可 編碼其他抗原性蛋白質或輔助細胞激素的核苷酸序列。真 核或病毋性轉錄調控序列的存在，可使hsp7〇基因在魚類 細胞中表現。DNA質體本身可在細菌細胞中複製，以製備 疫苗組合物，但一般係缺少可使hsp7〇基因在原核細胞内 表現的轉錄調控序列。為了適於在活體内表現，較佳可選 擇與要接種疫苗的魚類係内源性的轉錄調控序列。例如， 可考慮内源性的細胞激素或肌動蛋白基因啟動子。DNA可 以裸露的形式存在，或它可與促進細胞攝取的作用劑（例 如，微脂體或陽離子性脂質）一起投藥。魚類的疫苗 接種之技術，是更詳細地解釋在美國專利第5,78〇,448號 ’其以引用方式納入本文中。 本發明也有關於一種產生對抗分子的單株或多株抗體 之方法’係使用結合到該分子的hsp70蛋白質之結合體。 在這個具體實例中，將有效量的結合冑（也就是，可在宿 主中引起免疫反應的量），導入到動物宿主中，其可引起 對杬俏主中的物貝之抗體產生。抗體是利用已知的技術（ 24 1332989 例如，色層分析法）從宿主中移除並且純化，藉此引起多 株抗體的產生。可選擇地，利用本發明之方法所產生的抗 體，可用於產生融合瘤細胞，其可利用已知的技術造單株 抗體。 在本發明的具體實例中，關節桿菌屬hsp7〇基因的啟 動子序列，是用於驅動異源性基因（也就是，不同於編碼 關節桿菌屬hsP70的基因）之表現。啟動子可插入生物體 的染色體DMA中之異源性基因的上游’或插人到染色體外 =體或其他表現載體。例如，在想要大量表現内源性關 菌基因的事件中’或想要將外源性基因插人到關節桿 菌的内源性質體的事件中’上游的hsp7〇啟動子可驅動對 刺激（例如’熱休克）反應的該異源性基因之表現。 根據本發明方法所製造的疫苗，是適合投藥給具有體 液及/或細胞免癌系M y μ，，'先的任何動物物種。人類是包括在本 發明内文中的“動物，，月“去，* 關節桿菌>1㈣0辅^ ”之意義内。可使用 或备類（有 $何用於哺孔動物、鳥類'爬蟲類 一〇也： 類）的疫苗。同樣地，關節桿菌屬 nsp70也可用於疫苗 興 ,, ，作為共價連接的抗原之載劑，視 而晋徘除任何傳統的 關節彳曰g）佐劑（所謂的“無佐劑疫苗”）。 關即才干函屬hsp70也 A ^ A 用於疫苗中作為免疫原（視需要作 马早獨的免疫原）， 、仍而女朴 Β 知向對特定疾病的免疫反庠，尤豆 疋動、鮭類立克次 心又夂應、尤其 性疾病。 症（SRS)以及其他魚類的感染 名詞“疫苗，，是 田 取廣的意義而使用，並且不僅包 25 Y5Jzy〇y 括用於對病原體免疫作用的組合物 .^ lL 初還包括抗腫瘤疫苗、 自體性抗原為基礎的疫苗（ ^ ^ m ^ 用於化學去勢）等等》 在獸诀疫苗接種的範圍内，任何 # u并人類的動物都可接種疫 田，匕括主要的農場動物物種，亦即牛、馬、綿羊、豬及 禽：。對於水產養殖、本發明之疫苗可用於貝類或有鰭魚 ，寺別是用於治療硬骨魚類’例如，鮭魚、鱒魚、鯉魚、 累驢、頁尾魚、餘魚、大比目房、、黑線繪，或視需 要用於治療其他水生物種’例如，？殼綱動物（例如，小 蝦、對锻、龍瑕、蟹）以及軟體動物（例如，牡螺、珠坪 )。對於適合與疫苗中之關節桿菌屬hsp7Q序列結合的候 選抗原’並無限制。病原性抗原可衍生自細菌、病毒 '原 生動物、線蟲及真®。-種特別的焦點是在魚類病原性生 物體的抗原上，特別是表面抗原。 士 _ Hsp7〇胺基酸或核酸序列可用於疫苗組合物中，並且 ‘、。CT或連接到會侵襲貝類或有鰭魚的疾病之細菌、原生動 物病毒或真菌抗原，包括衍生自下列之抗原（或它們的 編碼序列）：感染性鮭魚貧血症病毒（15^)、感染性胰 壞=病毒（IPNV)、感染性造血壞死病毒（IHNV)、虹彩 病母、神經壞死病毒（關v )、鮭魚胰病病毒（spDV)、鯉 魚春季毒血症病毒（svcv)、病毒性出血敗血症病毒（ VHSv)、黃頭病毒（YHV)、桃拉症候群病毒（TSV )、白 斑症候群病毒（WSSV )、鮭魚腎桿菌（細菌性腎臟疾病的 致病原）及匹氏魚虱（鮭類立克次體敗血症的致病原）、 f菌屬 '水中產氣單胞菌屬（5仍^.)、魯克氏 26 1332989 耶爾♦森氏菌（krshya ri/c々er// )、假單胞菌屬（

Pseudomonas spp·)、侮龜發先菌（ph〇t〇bacterjum 等等。大量以及漸多數量的來自這些及其他病 原性生物體之多肽，已被純化及/或選殖並表現，並且可 在疫舀組合物中用於連接或結合關節桿菌屬hsp7〇或其編 碼序列。較佳的實例包括IPNV蛋白質νρι、vp2、vp3及 NS及其編碼的核苷酸序列；揭露於w〇 〇1/1〇469的^^蛋 白質，其包括血球凝集素、核蛋白殼、聚合酶及片段7 p4 及P5蛋白質及其編碼的核苷酸序列；揭露於01/68865 的經魚腎㈣蛋白質，纟包括GspA及lGmE編碼的核槪 序列；野田病毒蛋白質’例如，核蛋白殼；以及來自兕叭 的結構多肽及其編碼的核苷酸序列（揭露於w〇 99/58639 )。本發明較佳的疫苗組合物包括DNA表現載體，其攜帶 在架構内與IPNV VP2序列或IPNV vp3序列融合的hsp7〇 核¥ St序列。視需要’疫苗包括攜帶hsp7()_vp2融合體的 第一質體，以及攜帶hsp70-VP3融合體的第二質體。

Hsp70序列也可用於結合或連接到來自其他動物病原 體或寄生蟲的抗原（或它們的編碼序列），包括：牛病毒 性腹瀉病毒（BVDV)、牛疱疹病毒（BHV)、足口症病毒、 牛呼吸道融合病毒（BRSV)、牛副流行性感冒第3型病毒 (PI3)、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBR)、豬呼吸與繁殖 症候群病毒（PRRSV )、分枝桿菌屬、利什曼原蟲（ Ze/s如如/a)、埃里希氏體屬（必r//c/?/a)、愛美球蟲屬 (h射、梭菌屬、巴斯德桿菌2 27 1332989 /^>^〜尸己_/73)、黴漿菌屬（例如，牛黴漿菌（#.办<^/5) 、緒肺炎黴漿菌（#.力/叩刀仙历⑽/北））、鉤端螺旋體屬 { Leptospira)、分也螺、敬魯 Mt i Brachyspira)、沙？' 氏 释蛰Mi Q Salmonel la)、布魯氏菌屬（及r"ce//a )、新包 匕 Mt i Neospora)、穩抱 + A Μ i Cryptosporidium)、梭 桿菌屬（/'t/SOAacier/w^?)、大腸桿菌、輪狀病毒、冠狀病 鮝 '溶缸曼氏菌（Mannhei’/nia hae/nojytica)、睡眠今缸 桿菌（7 ί/s 50/2//7:/5 )、胸膜肺炎放線桿菌（ Actinobacillus pleuropneumoniae ) 、錐蟲屬 ( Trypanosoma)、紅血球胞子蟲屬廳）、密螺旋 體屬（7yepo/?e/»a)等等。 本發明包含hsp70序列結合任何上述的抗原或它們的 編碼序列之用途，以製造醫藥組合物，用於治療或預防由 抗原衍生的致病劑所感染而引起的疾病。 所提供結合hsp70基因或蛋白質的疫苗抗原，可化學 地連結.到hsp70 (以嵌合體或融合蛋白質之形式），或它 們可提供為分離的分子，一起在單一的疫苗組合物中。另 一種選擇，hsp70基因或蛋白質可在套組中提供抗原或編 碼抗原的核酸序列，以用於分開、連續或同步的投藥。所 提供與hsp7〇基因或蛋白質連結的疫苗抗原，可以是菌苗 (bacterin)、細胞萃取物、重組蛋白質、質體攜帶的基 因或活體/減毒的病原體菌株。 可藉由本發明融合蛋白質或分離的hsp70蛋白質之中 性或鹽形式，經單獨投藥或與醫藥上可接受的載劑或賦形 28 丄:9 劑混合而免疫個體。通常， ^ , 吊疚田疋製備成液體溶液或縣浮 液，也可製備固體形式，在浐鏟二4人 心子 八在蚁樂刖適合於液體載 液或懸浮液。可將製劑乳化， 、办 # 1 次將活性成份包膜在微脂體 載劑中。本發明之醫藥組合物 髖 延長釋放而投藥。 迅速釋放的形式或藉由 •醫藥上可接受的載劑是例如水、鹽溶液、葡萄糖、甘 油、輔助物質（例如，座潤劑或乳化劑）、膨服劑、黏社 劑、崩散劑'稀釋劑、潤滑劑、pH緩衝劑或傳統的佐劑 例如，胞壁醯二肽、愛立定（avridine) '氫氧化紹、油 脂、植物專素、成塊共聚物及其他在此技藝中所已知的物 質）。 '為了免疫個體，hsp70抗原或hsp70基因載體可非腸 月道投藥，通常是藉由在適合的載劑中肌肉内注射，但視 需要可藉由皮下途徑、藉由靜脈注射或皮内或鼻内傳遞。 在免疫魚類的例子中，通常的投藥途徑是藉由注射到腹腔 、在食物中口服、或藉由浸泡。本發明較佳的抗原性疫苗 組合物’疋適合於藉由注射或浸泡而投藥的形式。Dna疫 苗接種一般是藉由肌肉内注射。 有效劑量可根據個體的大小及物種，以及根據投藥的 模式而改變。最適劑量可由醫師或獸醫師經由反覆試驗而 決定。通常，單一劑量的hsp70抗原將會在約〇. 〇1至 1000微克/公斤體重的範圍内，較佳是0.5至500微克/公 斤體重，更佳是0· 1至100微克/公斤體重。對於DNA疫苗 ，1 0微微克（pg )的最小劑量至1 000微克的質體/動物之 29 χ^2989 劑量’應足夠抗原在活體内的適當表現。 本發明部份所揭露的新穎抗原，也有效於篩選對抗病 原體蛋白質之抗體。本發明另外包括這些抗原的診斷用途 ，例如，用於製備診斷套組，以有效於測試動物是否存在 致病的生物體。 以此處所揭露之純化的hsp7〇抗原及/或hsp7〇融合蛋 白質所引起的抗體，也包括在本發明的範疇内。其包含這 樣的抗體可具有診斷以及治療的應用於疾病處理及魚類健 康。多株抗體以及單株抗體都可有效於此一觀點。以蛋白 質免疫動物（例如，老 抗體的的融合瘤之篩選 鼠），以及產生免疫原專一性單株 ’是在此技藝中所熟知的（例如， 參見 Kohler 及 Milstein ( 1975 )256 : 495_497) 。三明治分析法以及酵素連結免疫吸附分析法（elisa )可 視為診斷分析的特定貪例。 本發明之hsP70核酸序列具有診斷之應用，例如，引 子的設計，以用於聚合酶鏈鎖反應（pcR)放大分析。 【實施方式】 實施例 實施例1 :來自關節桿菌ATCC 55921基因體的hsp7〇 基因之分離及定序 使5毫升的關節桿菌培養物在包含康那徽素（3〇微克 /毫升）# LB培養液中，於搖晃生長隔夜。然後利用 PUregene MA 分離套組（Gentra)或 InstageneTM樹脂，根 據製造商的操作指南而進行DNA萃取。 30 1332989 簡併PCR : 在核苷酸的層次上，數個分枝桿菌屬及鏈黴菌屬 hsP70 (dnaK)序列之間的最大相似性區域，是用於設計 PCR及定序的簡併引子。所選擇的引子是dnak_1Fdeg ( 5，_ gtcggnatcgacctvggnac-35 )以及 dnak-4Rdeg ( 5，_ gcggtsggctcgttgac-3，）。這些引子是在5(rc煉回溫度的 PCR反應中，用於關節桿菌dNa的放大。放大的DNA之品 質，疋藉由膠體電泳而評估。將1〇微升的分裝物在〇.8% ϊ复知糖膠體上，於1X Tr i s-硼酸鹽電泳緩衝液（tbe )中 ，以100伏特進行電泳約！小時。然後將65〇鹼基對（bp )的產物從膠體中割下，並且利用Qiaquick純化套組（ Qiagen)而純化。PCR產物是利用Qiagen pCR清理套組’ 根據製造商的操作指南而弄乾淨，並且利用BigDye引子化 學（應用生物系統公司），根據製造商的操作指南而定序 ，並將每個引子都用於PCR。延伸反應混合物是利用ABI PRISM ( 8r) BigDye終結子循環定序快速反應混合物，約 600奈克的DNA模板、3.2微微莫耳的適合引子以及ddH2〇 至20微升而製備。循環定序的條件如下：熱循環儀是設定 25個循裱，其包含96°c 1〇秒' 5〇〇c 5秒以及6〇。匸4分 鐘。序列顯示這個片段包含第一個約4〇〇鹼基對的仳#基 因。 為了得到另外的hsp70/dnaK基因序列，使用簡併引子 以放大關節桿菌屬hsp7〇基因的下游部份。這些引子是選 擇龟 Ga\\ey 専 κ q i奶2、Bi〇chemica et Bj〇phySjca 1332989

Zcia 1 130 . 203-208。[正向引子 hsp70 通用-Fl ( 5，-CAR GCN CAN AAR GAY GCN GG-3’），反向引子 hsp7〇 通用 _R1 ( 5’-GCN CAN GCY TCR TCN GGR TT-3’）]。引子是設計成在 hsp70基因内煉回兩個高度保守性的區域，以產生65〇鹼 基對的產物。 PCR反應物包含（50微升總體積）：5微升ι〇χ pcR 緩衝液、5微升25 11^氣化鎂、2.5微升1〇„111{各個（11^、 2 微升 HsP70 通用-F1 ( 200 "M) 、2 微升 Hsp7〇 通用 _Ri ( 200 /z Μ) 、〇· 5微升Amplitaq DNA聚合酶（5單位/微升） 、10微升Instagene萃取的DNA、23微升ddH2〇。pcR反應 是以下列條件而循環：94°C 2分鐘，然後40個包含94。(：

1·〇分鐘、50〇C或58°C 0·5分鐘以及72°C 1.0分鐘的PCR 循環。PCR循環是在7rc 3 〇分鐘的延長步驟而結束。將 PCR產物如上所述的進行電泳、清潔以及定序。發現這個 片段的序列是與第一定序嘗試所鑑定的約4〇〇鹼基對序列 之3 ’重疊並延伸。 基因體步移 基因體步移是用於延伸已鑑定序列的5，及3，序列。引 子疋從基因體步移者手冊（cl〇nteck )所說明的序列中設 汁。一開始’製作四個基因體資料庫（DraI、Ec〇rv、 II StuI ) ’接著製作三個基因體資料庫（Aiui、scai 及SnaFI)。所有的資料庫以及後續的pcR反應，都如基 因體步移者手冊之說明。 5’基因體步移產生一段約500鹼基對的片段，其與先 32 1332989 前所得到的序列重疊。5,延伸包》hsp7〇 &因的起始密碼 子以及5’未轉譯區域。3’步移無法延伸基因。 RACE ： 3’RACE是用於獲得另外的3’序列。利用purescript (Gentra ) rna分離套組，根據製造商的操作指南，而將 RNA從關節桿菌的隔夜培養物中分離（如上述之培養）。 3 RACE 是利用 B〇ehringer Mannheim 5,3’ RACE 套組，根 據製造商的操作指南而進行。RACE的引子是從已知序列的 3 ’端而設計。PCR反應是如上述說明而進行，除了反應物 包含ίο%二曱基亞碾（DMS〇)並且具有55〇c煉回溫度之外 。一 ^又約丨.〇仟鹼基對的條帶被放大’並利用Invitrogen 的topo定序套组，根據所附的方法而選殖到pCR4載體中 。利用載體引子篩選選殖株，並使篩選的選殖株隔夜生長 ’然後利用Invitrogen的SNAP小量套組進行DNA萃取， 以及利用上述的載體引子而定序。 相連圖s普（contigs)是利用Genecode的定序者軟體 而組合。利用相連圖譜序列所進行的Genbank檢索，證實 它是hsp70。 hsp70的其餘部份以及3,未轉譯區域是利用上述之基 因體步移而獲得。再者，相連圖譜是利用Genec〇de的定序 者軟體而鑑定。利用相連圖譜序列所進行的Genbank檢索 ’證實它包括hsP7〇基因，其包括3,未轉譯區域及5,未轉 譯區域。 33 1332989 實施例2 :關節桿菌細胞壁蛋白質之特性播述 電泳及西方墨潰法： 關節桿菌ATCC 55921細胞懸浮液是藉由直接從胰蛋白 大豆瓊脂（TSA )培養盤中移除繼代培養的細菌，然後在 23 C培養48小時而製備。將細菌再懸浮於i 〇毫升的‘‘ tet ”緩衝液，其包含100 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7 2)、夏 mM EDTA 以及 0. 1% Triton-X 100 ( BioRad 實驗室，海克力 斯，加州），至光學密度約5.0個OD66〇單位（1個〇D66〇 單位已估計是1 X 109個細胞），並以65〇〇 g離心。將上 清液丟棄，並將細胞懸浮於另外1〇毫升的TET，並重複離 心步驟。將細脃沈澱物再懸浮於4毫升的TET，並且分成i 毫升的分裝物裝到1. 5毫升的小試管。將一個分裝物進一 步與200微升的5毫克/毫升雞蛋蛋白溶菌酶混合，並在 37°C搖晃培養隔夜（18小時）^將細胞懸浮液在桌上型微 離心機中，以最大速度離心5分鐘。將丨5〇微升無細胞之 上清液與50微升NuPage 4X LDS樣本缓衝液（Invitrogen ，卡爾斯巴，加州）混合，並在γ 〇 «C培養1 〇分鐘同時搖 晃。將所得上清液的10微升分裝物，在8%Mini Protean II膠體（BioRad)上分析，並以半乾的轉移單元（Bi〇Rad )’以20伏特西方墨潰30分鐘到PVDf ( Miinpore，貝福 德’麻州）。在墨潰後迅速將膜以〇.丨％ p〇nceau s (

Amersham Pharmacia 生技公司，UppSaia，瑞典）清洗 1 分 鐘’並以數次蒸館水清洗而去染色，直到墨潰的蛋白質顯 現為止。分子量標準品以及特定蛋白質是在免疫染色後以 34 1332989 鉛筆標記參考點，然後藉由重複在蒸餾 主 紅色，並將膜風乾，以製備進—步的染色。’月’而移除粉 對於考馬斯藍鑑定胺基酸定序的蛋白質條帶，將 =膜在包含5〇%甲醇、醋酸及〇.⑽-250的溶液作 養10分鐘，錢利用不含考馬斯藍的上述溶液，而將背旦。 去染色。之後將墨潰在蒸潑的去離子水中潤洗1G分鐘並風 乾’以錯自Ed纖降解法’利用自動蛋白質定序儀（應用 生物系統公司）而進行胺基端的胺基酸定序。 免疫反應性抗原的顯露，是藉由將乾燥的墨潰與1: 200倍稀釋於1%路胺酸三經甲基胺基甲烧緩衝溶液邱 7.4 (cTBS) (BiRad)的抗體（多株兔子抗關節桿菌）培 養60分鐘，以TBS清洗1〇秒兩次，然後與1 : 2〇〇〇倍稀 釋的山羊抗兔子免疫球蛋白鹼性磷酸酶培養（pierce，洛 克福德，伊利諾州）而達成。呈色是以一步驟的NBT/Bcip (Pierce)約3分鐘而達成，並且藉由在蒸餾水中清洗而 終止。所有的培養都是以最終體積1 〇毫升，在紅搖動平台 上進行（Hoef er，舊金山，加州）。文件是以影像管理者 以及相關的軟體而完成（Amersham Pharmacia生技公司， Uppsa 1 a ’瑞典）。分子量的估計是經由將抗原的移動與精 破的廣祐圍預染標準品（Bi oRad )做比較而得到。分子量 的估叶是藉由計异相對遷移率’利用一階Lagrange而完成 抗血清的產生： 對4几關郎ί干囷抗原的多株抗血清，是將〇. 5毫升包含 35 1332989 3份先以無菌Dulbecco氏鹽溶液清洗的4 χ l〇8個細胞及 1份Freund氏不完全佐劑所組成的懸浮液，藉由肌肉内注 射紐西蘭兔而產生。四週之後，將相同體積的材料注射到 兔子。在第六週時從周圍耳靜脈回升5毫升血液，並藉由 使血液滅集然後離心而收集血清。 結果 · 經溶菌酶處理的關節桿菌懸浮液之SDS_PAGE分析，顯 不有150至1〇仟道耳吞（kDa)範圍間的蛋白質條帶之存 在。這些中顯著的是約67、63及59仟道耳吞的主要蛋白 質。67仟道耳吞的蛋白質明顯地交聯至關節桿菌細胞壁之 肽多醣，因為只有它在以溶菌酶處理後被釋放出來。 田SDS PAGE蛋白質圖像被西方墨潰並以對抗關節桿菌 全細胞的抗血清染色時，主要的免疫反應條帶是在122及 67仟道耳吞處被鑑定。將67仟道耳吞蛋白f的胺基端定 序，並且發現是SRAVG IDLGT TNSVV snE。利用blast蛋 白質-蛋白質演算法之同源性檢索’鑑定出序列與結核分 枝桿菌的hsp70蛋白質，具有1〇〇%的同源性。這個”仟 道耳吞蛋白質咸信是與基因體定序所鑑定以及此處所揭露 的hsp70蛋白質相同。 實施例3 : hsp70之重組表現 將關節桿菌熱休克蛋白70的完整編碼序列，選殖到 PET30EKLIC載體（NGvagen)，作為非融合以及作為融合狀 。胺基端融合的標籤是由55個包括各種特質的胺基酸所挺 成，以提供標的蛋白質之進一步純化（包括有組胺酸標錢 36 丄 ^籤、腸激酶切割位置）。位於HSP70蛋白質内的 2 0 0個胺基酸活性主體址 ^ ^ 體，、·。構已知為功能部位π，也選殖 作為非融合以及融合肽。 曰重組的HSP70及重組的功能部位π之表現，是在大腸 样菌DE3細胞中進行一旦得到適合的細胞密度，則將 廳培養物區分成兩個單獨的錐形瓶。蛋白質的表現是在 一個培養物中以娜基質而誘發，第二個培養物則扮演對 照組1融合或非融合表現的HSP7Q以及功能部位π，主 要是以溶解的形式在細胞質中被發現，或是與大腸桿菌的 胞質周緣區（periplasm)結合。因此，在大腸桿菌中，重 組的HSP7G及其功能部位π是成功地標定至細胞表面，就 像是關節桿菌中的天然蛋白質般。將融合標鐵納入到蛋白 質的胺基端，似乎並不會影響蛋白質的移位。根據這些觀 察’全長的贈7〇以及功能部位丨丨可將其他抗原性序列移 位到細胞表面。 實施例4:與hsp7〇的基因融合體為基礎之對抗謂 的核酸疫苗 ,將維持在流動清水中之大西洋鮭魚（&的 珂期銀色幼鮭（35-40幻’以稀釋於乾淨水族箱水中之 苯並卡因（benzocaine)麻醉。在接種疫苗之前，將六隻 魚藉由致死劑量的麻醉劑而安樂死，並從尾靜脈放血: 集免疫前血清。 將核酸疫苗及磷酸鹽緩衝溶液（pBS)對照組，以5〇 37 1332989 微升的疫苗肌肉内接種到左背側，就在背鰭下方。將每重 複40隻魚接種疫苗（每組8〇隻，在兩箱之間區分）。接 種疫田之後，使魚回復到乾淨的水中，並分配到它們適合 的箱子。 經過測試的核酸疫苗是：pUKrsxHSp7〇 ipnVp2以及 pUKrsxHSP70-ipnVP3。在細胞巨大病毒（CMV)啟動子的控 制下，這些質體分別攜帶關節桿菌屬hsp7〇與Ιρ· vp2或 IPNV VP3的完整編碼序列之架構内融合體。將 pUKrSXHSP70-iPnVP2單獨測試，並將兩個質體也一併測試 〇 為了進行比較，也製備包括先前研究已知序列的3，融 合之IPN VP2蛋白質的質體，以將VP2成份的免疫保護功 效推增約20% (也就是，“黃金標準”砰2_為基礎的〗pNv 核酸疫苗）。 在疫苗接種後六週，將魚轉移到海水。在激發之前的 當天，從每個二重複組的四隻魚中取樣血清。也採樣注射 部位的肌肉樣本，並以福馬林固定以尋找疫苗的存在。在 激發之後的第21天，從每個二重複組的最大量四隻存活的 魚中取樣血清。在激發之後，於每天第一次觀察時移開死 亡的魚’並將腎臟樣本冷凍以藉由Elisa分析。 激發是在轉移到海水後4_6週，藉由與標記的姊妹種 魚同居而舉行，姊妹種魚已藉由腹膜内注射致命的IPNV ( 1 〇群洛形成單位（cf u ))而激發。此項試驗是在2〇週之 後終止。 38 結果顯示，所有以IPNV的VP2序列為基礎之核酸疫苗 户可保°蒦對抗病毒的激發，包括hsp70-VP2融合體。 貫施例5 :在對抗ISAV的疫苗中之重組Hsp70 古在開始實驗之前，使大西洋鮭魚的幼魚在補充通氣及 L動良好的水（1〇c)之〇.5毫升保存槽中適應-週，並 且在整個實驗期間每日餵食。每組55隻魚分成2槽託隻 ，以提供二重複的處理組。當以ISAV激發時，大西洋鮭魚 的幼魚經歷50至80%之間的死亡率。 將魚麻醉，然後以腹膜内注射〇. 2毫升鹽溶液或〇. 2 毫升包含特定重組蛋白質的鹽溶液而接種疫苗。陰性對照 組是磷酸鹽緩衝溶液注射液（鹽溶液）。處理組是：（A )組胺酸標藏的純化之關節桿菌屬hsp7〇重組蛋白質，i2 微克；（B ) ISAV重組的組胺酸標籤之核蛋白殼蛋白質（ NC) ，12微克；（C)組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬 hsP70重組蛋白質，12微克，混合組胺酸標籤的isav此 ，12微克；（D )組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬乜邛” 重組蛋白質，12微克’交聯到組胺酸標籤的iSAV Nc，12 微克；（E)組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬hsp7〇功能部 位2重組蛋白質’ 12微克，混合組胺酸標籤的iSAV Nc， 12微克；（F)組胺酸標籤的純化之關節桿菌屬hsp7〇功 能部位2重組蛋白質’ 12微克，交聯到組胺酸標藏的I sav NC，12微克。 處理組D及F接受共彳貝父聯的蛋白質。使用edc及石穿_ 39 1332989 NHS作為交聯劑，並且根據標準方法而使用。 使用同居激發，其中少量的鮭魚是給予〇. i 的致命ISAV之腹膜内注射（約1〇4 TCIDw/·备） 到每個處理的魚的槽中。每天監測每槽的死亡率 存活的相對百分比是藉由在特定的時間點， 不同處理組以及對照組間的死亡率而評估。 【圖式簡單說明】 第1圖說明序列編號1，也就是，八私 刀離自 ATCC 55921 的 hsp70 基因之 DNA 序列（5, $ 工3’） 及3 ’未轉譯區域序列。 第2圖顯示序列編號2，也就是，預測^ hsp70基因序列所编碼之胺基酸序列。 亳升培養 ’並且加 〇 藉由比較 關節捍菌 ，包括5, $ 1圖的 1332989 2/6 agaagtacac cgcgcaggaa atctccgccc gcaccctgat gaagctcaag aacgacgccg 600 agtcctactt gggcgaaaag gtcaccgacg cggtgatcac ggttcctgcc tacttcaacg 660 acgccgagcg ccaggccacc aaagaagccg gtgagatcgc cggcctgaac gtgctgcgca 720 tcgtcaacga gcccactgcg gcggcgctgg cctatggctt ggacaaaggc aaagaagacg 780 aactcatcct ggtcttcgac ctcggtggcg gcaccttcga cgtctcgctg ctggaagtcg 840 gcaaagacga cgacggcttc tccacgatcc aggtccgcgc cacctccggc gacaaccgcc 900 tgggcggcga cgactgggat cagcggatcg tcgactactt gctgaaccag ctcaaggtca 960 agggcatcga cctctccaag gacaagatcg cgctgcagcg tctgcgcgaa gcttccgagc 1020 aggccaagaa ggaactctcc tcggccacca gcaccaacat ctcgctgcag tacctctcgg 1080 tcacccctga cggtccggtg cacttggacg agcagctgac ccgggcgaag ttccaggaac 1140 tgaccgctga tctgctcgag cgcaccaaga agccgttcca ggacgtgatc gccgaggccg 1200 ggatcaaggt ttccgacatc gaccacatcg tgctggtcgg cggttccacc cggatgcccg 1260 cagtgaccga attggtcaag cagctggccg gtggcaagga gccgaacaag ggcgtcaacc 1320 cggacgaggt ggtcgccgtc ggcgccgcgc tgcaagccgg cgtgctcaag ggcgaacgca 1380 aagacgtgct gctcatcgac gtcaccccgc tttccctcgg catcgaaacc aagggcggcg 1440 tgatgaccaa gctgatcgag cggaacaccg cgattccgac caagcggtcc gagaccttca 1500 ccacagcgga cgacaaccag ccttcgatga ccatcceggt gttccaaggc gagcgcgagt 1560 tcacccggga caacaagccg ttgggcacct tcgaactgac cggcatcgca ccggctccgc 1620 gcggcgtgcc gcaggtcgaa gtcaccttcg acatcgacgc caacggcatc gtgcacgtgt 1680 cggccaaaga caagggcacc ggcaaggagc agtcgatgac catcaccggc ggttcctcgc 1740 ^332989 3/6 * tgtccaagga agacatcgag cgcatggtcg ccgacgccga ggcacacgct gcagaggaca 1800 aggcccggcg cgagcaggcc gaggcccgca acagcgccga gcagctggcg tactcggtgg 1860 acaagatcct caccgacaat gacgacaagc tgccggaaga ggtcaagacg gaggtcaagg 1920 ccgacgtcgg ggcgctcaag accgcgctgg ccggcaccga tgaggacgcg gtcgaggcgg 1980 cctcggagaa gctgcaggct tcgcagacca aactcggcgg agcgatttac gcttcggccc 2040 aggccgaggg tgccgccgct gccggtgacg ccccgagcga aggtgccaag cccgacgaag 2100 acatcgtcga cgccgagatc gtggacgaag aagaaccgaa gaacgagaag aagtagtcat 2160 gtccgaccag agccaatctg atcagggccg caaccccgaa aaagacgaaa ccgacgtgga 2220 cccggcaacg ggtcccgccg gggacgttcc ggaggagcag gatcctttgg cgcaagtcga 2280 agacatcctg aacaatgccg aggtgcccgc cgacgagtcg gtggcccagg gcgccgggca 2340 ggtggatgcc gcagaactca agaacgatct gctgcgcttg caggccgaat acgtgaacta 2400 ccgcaaacgc gtcgagcggg acaccagccc gggccgtcga ccacgcgtgc cctatagtaa 2460 gggc 2464 <210> 2 <211> 621 <212> PRT <213>關節桿菌屬 1 <400> 2

Met Ser Arg Ala Val Gly lie Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val 15 10 15

Ser Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Val Val He Ala Asn Ala Glu Gly 20 25 30

Gly Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Ser Lys Ser Gly Glu Val ^332989 4/6 35 40 45

Leu Val Gly Glu lie Ala Lys Arg Gin Ala Val Asn Asn lie Asp Arg 50 55 60

Thr lie Ala Ser Val Lys Arg His Met Gly Thr Asp Trp Thr Val Gly 65 70 75 80 lie Asp Asp Lys Lys Tyr Thr Ala Gin Glu lie Ser Ala Arg Thr Leu 85 90 95

Met Lys Leu Lys Asn Asp Ala Glu Ser Tyr Leu Gly Glu Lys Val Thr 100 105 110

Asp Ala Val lie Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Glu Arg Gin 115 120 125

Ala Thr Lys Glu Ala Gly Glu lie Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg lie 130 135 140

Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly 145 150 155 160

Lys Glu Asp Glu Leu lie Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe 165 170 175

Asp Val Ser Leu Leu Glu Val Gly Lys Asp Asp Asp Gly Phe Ser Thr 180 185 190 lie Gin Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn Arg Leu Gly Gly Asp Asp 195 200 205

Trp Asp Gin Arg lie Val Asp Tyr Leu Leu Asn Gin Leu Lys Val Lys 210 215 220

Gly lie Asp Leu Ser Lys Asp Lys lie Ala Leu Gin Arg Leu Arg Glu 225 230 235 240

Ala Ser Glu Gin Ala Lys Lys Glu Leu Ser Ser Ala Thr Ser Thr Asn 245 250 255 『1332989 5/6 lie Ser Leu Gin Tyr Leu Ser Val Thr Pro Asp Gly Pro Val His Leu 260 265 270

Asp Glu Gin Leu Thr Arg Ala Lys Phe Gin Glu Leu Thr Ala Asp Leu 275 280 285

Leu Glu Arg Thr Lys Lys Pro Phe Gin Asp Val lie Ala Glu Ala Gly 290 295 300 lie Lys Val Ser Asp lie Asp His lie Val Leu Val Gly Gly Ser Thr 305 310 315 320

Arg Met Pro Ala Val Thr Glu Leu Val Lys Gin Leu Ala Gly Gly Lys 325 330 335

Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala 340 345 350

Ala Leu Gin Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Arg Lys Asp Val Leu Leu 355 360 365 lie Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly He Glu Thr Lys Gly Gly Val 370 375 380

Met Thr Lys Leu lie Glu Arg Asn Thr Ala lie Pro Thr Lys Arg Ser 385 390 395 400

Glu Thr Phe Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gin Pro Ser Val Ala lie Gin 405 410 415

Val Phe Gin Gly Glu Arg Glu Phe Thr Arg Asp Asn Lys Pro Leu Gly 420 425 430

Thr Phe Glu Leu Thr Gly lie Ala Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gin 435 440 445

Val Glu Val Thr Phe Asp lie Asp Ala Asn Gly lie Val His Val Ser 450 455 460

Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Lys Glu Gin Ser Met Thr lie Thr Gly 465 470 475 480 1332989 6/6

Gly Ser Ser Leu Ser Lys Glu Asp lie Glu Arg Met Val Ala Asp Ala 485 490 495

Glu Ala His Ala Ala Glu Asp Lys Ala Arg Arg Glu Gin Ala Glu Ala 500 505 510

Arg Asn Ser Ala Glu Gin Leu Ala Tyr Ser Val Asp Lys lie Leu Thr 515 520 525

Asp Asn Asp Asp Lys Leu Pro Glu Glu Val Lys Thr Glu Val Lys Ala 530 535 540

Asp Val Gly Ala Leu Lys Thr Ala Leu Ala Gly Thr Asp Glu Asp Ala 545 550 555 560

Val Glu Ala Ala Ser Glu Lys Leu Gin Ala Ser Gin Thr Lys Leu Gly 565 570 575

Gly Ala lie Tyr Ala Ser Ala Gin Ala Glu Gly Ala Ala Ala Ala Gly 580 585 590

Asp Ala Pro Ser Glu Gly Ala Lys Pro Asp Glu Asp lie Val Asp Ala 595 600 605

Glu lie Val Asp Glu Glu Glu Pro Lys Asn Glu Lys Lys 610 615 620

Claims (1)

1. 丨公告本

   ^9. ^ I 念_ •年月曰修(·史丨正本 1. 一種核酸序列，其特徵在於包含序列編號丨、序列 編號1的核苷酸291-21 56的ORF、或編碼序列編號2或編 碼序列編號2的胺基酸1 62-365的序列。 2. 一種嵌合體核酸序列，其包括如申請專利範圍第1 項之分離的核酸序列，在架構内融合到異源性編碼序列。 3. 如申请專利範圍第2項之嵌合體核酸序列，其中 該異源性編碼序列編碼來自動物病原體之抗原。 4. 如申请專利範圍第3項之嵌合體核酸序列，其中 該抗原是IPNV VP2或VP3。 5. —種DNA表現載體’其包括如申請專利範圍第1 至4項中任一項之核酸序列，其中該核酸序列可操作地連 接到轉錄調控序列。 6. —種宿主細胞，其以如申請專利範圍第5項之DNA 表現載體轉形。 7. —種分離的胺基酸序列，其包含序列編號2的胺 基酸序列或其胺基酸162-365的序列，其具有增強疫苗的 免疫保護功效的功能。 8. 如申請專利範圍第7項之胺基酸序列，其係共價 或非共價地連接到異源性分子，以形成一結合分子。 9. 如申請專利範圍第8項之胺基酸序列，其中該結 合分子是一融合蛋白質。 10. 如申請專利範圍第8或9項之胺基酸序列’其中 該異源性分子是選自細菌、病毒、真菌、原生動物、線蟲 1332989 以及腫瘤抗原。 11. 如申請專利範圍第8或9項之胺基酸序列，其中 該異源性分子是來自ISAV的以下蛋白質之任—者：核蛋 白殼蛋白質、血球凝集素、聚合酶、以及片段7 p4及%5 蛋白質。 12. —種分離的胺基酸序列，係由如申請專利範圍第 1至4項中任一項之核酸序列所編瑪。 13. —種分離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第 7至11項中任一項之分離的胺基酸序列。 14. 一種疫苗組合物，其包括如申請專利範圍第丨至 4項中任一項之核酸序列以及醫藥上可接受的載劑。 如申請專利範圍第14項之疫苗組合物，更包括 至y種異源性抗原、或編碼異源性抗原的核酸序列。 16. —種疫苗組合物，其包括如申請專利範圍第5項 之DNA表現載體以及醫藥上可接受的載劑。 17. 如申請專利範圍第16項之疫苗組合物，更包括 至少一種異源性抗原、或編碼異源性抗原的核酸序列。 18. —種疫苗組合物，其包括如申請專利範圍第7至 11項中任一項之胺基酸序列以及醫藥上可接受的載劑。 19. 如申請專利範圍第18項之疫苗組合物，更包括 至少一種異源性抗原、或编碼異源性抗原的核酸序列。 2〇· 一種輔助疫苗之方法，其包括將疫苗抗原與申請 專利範圍第7項之胺基酸序列混合。 21. 一種如申請專利範圍第1至4項中任一項之核酸 1332989 序列之用途，以製造用於預防或治療魚類感染性疾病之疫 苗組合物。 22. —種如申請專利範圍第7至11項中任—項之胺 基酸序列之用途，以製造用於預防或治療魚類感染性疾病 之疫苗組合物》 23. —種如申請專利範圍第1至4項中任一項之核酸 序列之用途’以製備用於免疫魚類以對抗感染性疾病之藥 劑。 2 4.如申s青專利範圍第2 3項之用途，其中該魚類是 馨 硬骨魚。 25.如申請專利範圍第24項之用途，其中該疾病是 細菌性腎臟疾病（BKD)或鮭類立克次體敗血症（srs)。 26· 種如申請專利範圍第5項之DNA表現載體之用 途，以製備用於免疫魚類以對抗感染性疾病之藥劑。 Μ.如申請專利範圍第26項之用途，其中該魚類 硬骨魚。 /8.如申請專利範圍帛27項之用途，其中該疾病是# 細菌性腎臟疾病（BKD)或鮭類立克次體敗血症（SRS)。 29. —種如申請專利範圍第7至u項中任一項之胺 基酸序列之料，以製制於免疫·#'類以對抗感染 之藥劑。 m 30. 如申請專利範圍帛29項之用途，其中該魚 硬骨魚。 〜 31. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該疾病是 3 1332989 細菌性腎臟疾病（BKD )或娃類立克次體敗金症（SRS )。 拾壹、圖式： 如次頁

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