BRPI0613362A2 - polipeptìdeo quimérico, polinucleotìdeo, vetor viral, uso de um vetor viral, anticorpos, vetor, composição imunogênica e método de prevenção e/ou de tratamento de uma infecção e usos - Google Patents

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Erika Navarro-Sanchez
Marie-Pascale Frenkiel
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Chantal Combredet
Philippe Despres
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Abstract

POLIPEPTìDEO QUIMéRICO, POLINUCLEOTìDEO, VETOR VIRAL, USO DE UM VETOR VIRAL, ANTICORPOS, VETOR, COMPOSIçãO IMUNOGêNICA E MéTODO DE PREVENçãO E/OU DE TRATAMENTO DE UMA INFECçãO E USOS. A presente invenção trata da construção de um polipeptídeo quimérico útil na prevenção ou no tratamento de uma infecção por Flaviviridae. A presente invenção trata também do uso do polipeptideo quimérico na elabomçáo de vetores virais recombinantes, tal como o vetor viral vivo do sarampo.

Description

"POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR VIRAL, USODE UM VETOR VIRAL, ANTICORPOS, VETOR, COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA E MÉTODO DE PREVENÇÃO E/OU DE TRATAMENTO DEUMA INFECÇÃO E USOS"
Campo da Invenção
A presente invenção trata da construção de um polipeptídeoquimérico útil na prevenção ou no tratamento de uma infecção por Flavivirídae.
A presente invenção trata também do uso do polipeptídeo quimérico naelaboração de vetores virais recombinantes, tais como um vetor viral vivo dosarampo para agir como vacina.
Antecedentes da Invenção
Os flavivírus (família dos Flavivirídae) são vírus com envelope cujogenoma é uma molécula de RNA de polaridade positiva. O flavivirion é composto detrês proteínas estruturais designadas C (proteína do núcleo), M (proteína demembrana) e E (proteína de envelope). A proteína E que está exposta na superfíciedo vírus é responsável pelas funções biológicas principais do vírion que incluem aligação do vírus e a fusão membranar específica. A tradução do RNA genômicoproduz uma poliproteína precursora que é clivada simultaneamente por proteasescelulares e virais para gerar as proteínas virais individuais: três proteínas estruturaisC1 prM (o precursor glicosilado da proteína Μ), E, e sete proteínas não estruturaisNS1 a NS5. A replicação dos flavivírus é realizada no citoplasma das célulasinfectadas. Os flavivírus possuem ciclos de transmissão naturais complexos queenvolvem diversos hospedeiros naturais (em sua maior parte mamíferos e pássaros)e vetores, e estes últimos são artrópodes hematófagos, tais como carrapatos emosquitos. Esses vírus são a causa principal de doenças humanas severas taiscomo manifestações hemorrágicas ou sintomas meningoencefalíticos. O vírus dadengue (DEN) é um dos dois principais flavírus r econhecidos como causa dedoenças hemorrágicas severas no mundo inteiro.A dengue é uma doença emergente e uma preocupação de saúdepública. Há mais de 50 anos, vêm sendo desenvolvidos candidatos a vacinas vivos-atenuados contra os quatro serotipos do vírus da dengue. A busca de uma vacina édificultada pela ausência de um modelo animal que reproduza a doença causadapelo vírus da dengue, ou seja a febre hemorrágica da dengue e a síndrome dechoque associada a ela. A eficácia das vacinas pode ser avaliada no camundongopor meio de uma cepa neurovirulenta do vírun DEN adaptada ao camundongo, quemata os animais adultos após uma inoculação intracerebral. Entretanto, os estudosbaseados nesse tipo de modelos murídeo não refletem a atividade dos vírus dadengue no homem. No macaco, a proteção só pode ser demonstrada pela medidada redução de viremia após uma prova infecciosa experimental. Assim, o teste finalpara uma vacina contra a dengue deve se basear em ensaios clínicos realizadosno homem. A maior parte dos candidatos a vacinas atenuados que foramdesenvolvidos nesses últimos 50 anos foram excessivamente reatogênicas ouinsuficientemente imunogênicas nos ensaios clínicos. Diversos candidatostetravalentes atenuados estão sendo hoje objeto de ensaios clínicos de fase I ou II.
A dificuldade no desenvolvimento desse tipo de vacina vivos-atenuadostetravalente parece ser à obtenção uma mistura equilibrada das quatro valências afim de gerar uma imunidade protetora contra os quatro sorotipos.
Diversos candidatos a vacinas quiméricas vivas estão tambémem fase de desenvolvimento. Eles se baseiam na troca de genes estruturaishomólogos entre diferentes flavivírus. Diversos tipos de vírus quiméricosintertípicos foram construídos e testados no camundongo ou no macaco. Vírusquiméricos foram construídos com a tecnologia Chimerivax® baseada no vírusvacinai da febre amarela (YF-17D). Misturas tetravalentes dessas quimerasYF-17D/DEN foram testadas no macaco rhesus. Nesse caso também, oequilíbrio entre os quatro vírus quiméricos é difícil de obter para umaimunização uniforme. Um ensaio clínico de fase l/ll está atualmente empreparação para testar uma vacina Chimerivax-dengue 2. Outras abordagensincluem candidatos a vacinas subunitários produzidos a partir de um vetor deexpressão, e candidatos de tipo DNA nu que estão em desenvolvimento pré-clínico. Assim, o desenvolvimento de uma vacina tetravalente contra o vírus dadengue continua a ser um problema não resolvido, um dos mais importantesna lista da Organização Mundial de Saúde.
Existe, portanto, a necessidade de desenvolver novos candidatosa vacina eficazes, fáceis de produzir e de formular para a prevenção ou otratamento de uma infecção por um vírus da família dos Flaviviridae como ovírus da Dengue.
Descrição Resumida da Invenção
A presente invenção trata de um polipeptídeo quimérico e suasaplicações na prevenção ou no tratamento de uma infecção por Flaviviridae.
Mais particularmente, a presente invenção tem por objeto umpolipeptídeo quimérico que compreende um peptídeo de subdomínio daproteína E de Flaviviridae ligado ao peptídeo do subdomínio da proteína demembrana M de Flaviviridae.
A presente invenção tem também por objeto um polinucleotídeoisolado ou purificado que codifica para um polipeptídeo quimérico de acordocom a presente invenção.
A presente invenção tem também por objeto um vetor viralrecombinante do sarampo em cujo genoma está inserido um polinucleotídeode acordo com a presente invenção.
A presente invenção tem também por objeto anticorposmonoclonais ou policlonais purificados que reconhecem especificamente pelomenos o polinucleotídeo definido anteriormente e/ou o polipeptídeo quiméricoda presente invenção.
A presente invenção trata também do uso de um vetor viral deacordo com a presente invenção para a preparação de uma composiçãoimunogênica destinada à prevenção ou ao tratamento de uma infecção porFlaviviridae em uma espécie sensível.
A presente invenção visa também vetores de clonagem ouexpressão que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção.
De acordo com outro objeto, a presente invenção propõe umacomposição imunogênica destinada à prevenção e/ou ao tratamento de umainfecção por Flaviviridae em uma espécie sensível, caracterizada pelo fato decompreender pelo menos um dos seguintes elementos:
- um polipeptídeo quimérico tal como definido anteriormente;
- um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção;
- um vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção;
- um anticorpo de acordo com a presente invenção; e
- um vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com apresente invenção.
A presente invenção propõe também um método de prevençãoe/ou de tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensívelque compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamenteeficaz de pelo menos um dos seguintes elementos:
- um polipeptídeo quimérico tal como definido anteriormente;
- um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção;
- um vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção;
- um anticorpo de acordo com a presente invenção; e
- um vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com apresente invenção.
Breve Descrição das Figuras
A Figura ;1 mostra uma descrição de 384 nucleotídeos (nt) quecodificam o domínio (EDIII)Dvi da cepa viral FGA/89 fundida com o dipeptídeoArg-Ser com o peptídeo sinal de calreticulina (ssCRT) intercalada entre doissítios BsiWI (em 5') e BssHII (em 3') necessários à inserção no vetor MWShew-
A Figura 2 mostra a seqüência de 516 nucleotídeos (nt) quecodificam a proteína de fusão [EDIII + M1^0] da cepa viral FGA/89 fundida com odipeptídeo Arg-Ser com o peptídeo sinal de calreticulina (ssCRT) intercalada entredois sítios BsiWI (em 5') e BssHII (em 3') necessários à inserção no vetor MWSchw-
A Figura 3 mostra células Vero infectadas com vetores viraisrecombinantes do sarampo. Multiciplicidade de infecção de 10 TCIP50 / célula para30 h. Imunofluorescênciâ realizadas com um anticorpo específico anti-DVI HMAF.
A Figura 4 mostra a expressão e a secreção dos domíniosantigênicos [EDIM]Dv-i e [EDIII+M^dv-i nos Iisados citoplásmicos (C) e ossobrenadantes (S) de células Vero infectadas pelos vírus recombinadosMVSchw-DV-1
A Figura 5 mostra a expressão e a secreção dos domíniosantigênicos [EDII1]Dv-i e [EDIII+M^dv-i nos sobrenadantes filtrados econcentrados de células de drosófila S2 que expressam de modo indutívelesses antígenos.
A Figura 6 mostra uma seqüência nucleotídica que codifica para umpeptídeo quimérico de acordo com um modo preferido da presente invenção.
A Figura 7 mostra uma seqüência de aminoácidos de umpolipeptídeo quimérico de acordo com um modo preferido da presenteinvenção, bem como a seqüência nucleotídica que o codifica.
A Figura è mostra uma seqüência de aminoácidos de um dímerodo ectodomínio Ill (EDIII) de acordo com um modo preferido da presenteinvenção, bem como a seqüência nucleotídica que o codifica.
A Figura 9 mostra uma seqüência de aminoácidos de um dímerodo ectodomínio Ill (EDIII) de acordo com um modo preferido da presenteinvenção, bem como a seqüência nucleotídica que o codifica.A Figura 10 mostra uma seqüência de aminoácidos de umpolipeptídeo quimérico de acordo com um modo preferido da presenteinvenção, bem como a seqüência nucleotídica que o codifica.
A Figura 11 mostra uma seqüência de aminoácidos doectodomínio Ill (EDIII) de acordo com um modo preferido da presenteinvenção, bem como a seqüência nucleotídica que o codifica.
A Figura 12 mostra uma seqüência de aminoácidos de um dímerodo ectodomínio Ill (EDIII) de acordo com um modo preferido da presenteinvenção, bem como a seqüência nucleotídica que o codifica.
A Figura 13 mostra uma seqüência de ácidos nucléico quecodificam para um peptídeo do ectodomínio Ill (EDIII) de acordo com um modopreferido da presente invenção.
A Figura 14 mostra uma seqüência nucleotídica que codifica para umpeptídeo quimérico de acordo com um modo preferido da presente invenção.
As Figuras 15 a 19 mostram uma seqüência de aminoácidos depeptídeos quiméricos de acordo com um modo preferido da presente invenção.
As Figuras 20 a 24 mostram uma seqüência nucleotídica quecodifica respectivamente para os polipeptídeos quiméricos ilustrados nasfiguras 15 a 19.
As Figuras 25 a 29 mostram respectivamente um esquemarepresentativo dos polipeptídeos quiméricos ilustrados nas figuras 15 a 19.
A Figura 30 mostra a seqüência peptídica da seqüência apoptoMde quatro sorotipos do vírus da Dengue utilizados na construção de umpolipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção.
Descrição Detalhada da Invenção
A originalidade da presente invenção consiste na construção deum polipeptídeo quimérico e suas aplicações na prevenção ou no tratamentode uma infecção por Flaviviridae. Por "Flavivirídae", entende-se um vírusselecionado no grupo constituído pelo vírus do Nilo Ocidental, da dengue, daencefalite japonesa e da febre amarela.
1. POLIPEPTÍDEO E POLINUCLEOTÍDEO
De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção tratade um polipeptídeo de subdomínio da proteína E Flaviviridae ligado a umpeptídeo de subdomínio da proteína de membrana M de Flaviviridae. Apresente invenção tem também por objeto um polipeptídeo que consiste nosreferidos peptídeos.
Por "polipeptídeo", entende-se, de acordo com a presenteinvenção, designar indiferentemente proteínas ou peptídeos. Por "peptídeoquimérico", entende-se qualquer proteína ou peptídeo que compreendesubpartes de diferentes origens, por exemplo um polipeptídeo A provenientede uma primeira espécie e um polipeptídeo (proteína ou peptídeo) provenientede uma segunda espécie. Uma proteína ou um peptídeo é tambémconsiderado um polipeptídeo quimérico se compreender subpartesprovenientes de diferentes proteínas ou peptídeos de uma mesma espécie, ouentão de uma mesma proteína ou peptídeo de diferentes espécies.
De preferência, o peptídeo do subdomínio da proteína E consisteno ectodomínio Ill que compreende uma seqüência de aminoácidos tal comodefinida em qualquer uma das seguintes seqüências:
- aminoácidos 19 a 120 da SEQ ID NO : 1;
- aminoácidos 19 a 119 da SEQ ID NO : 3;
- aminoácidos 21 a 123 da SEQ ID NO : 6;
- aminoácidos 21 a 121 da SEQ ID NO : 12; e
- aminoácidos 21 a 123 da SEQ ID NO : 14.
Mais particularmente, o peptídeo de subdomínio da proteína Econsiste em um dímero do ectodomínio Ill dos vírus da Dengue 1, 2, 3 ou 4que compreende uma seqüência de aminoácidos tal como definida emqualquer uma das seguintes seqüências:
- aminoácidos 21 a 262 da SEQ ID NO : 8; e
- aminoácidos 21 a 262 da SEQ ID NO : 10;
ou um tetrâmero do ectodomínio Ill dos vírus da Dengue I1 2, 3 e4 que compreendem uma seqüência que vai do aminoácido 21 a 494 da SEQID NO : 16 ou que vai do aminoácido 18 a 429 da SEQ ID NO : 24.
No que diz respeito ao peptídeo do subdomínio da proteína M,ele consiste em particular no ectodomínio 1-40 que compreende umaseqüência de aminoácidos que vai da posição 123 a 170 da SEQ ID NO : 3 ouna seqüência apoptoM que compreende uma seqüência de aminoácidos quevai da posição 154 à 170 da SEQ ID NO : 3 ou que vai da posição 122 a 132da SEQ ID NO 12.
De acordo com um modo preferido, o polipeptídeo quimérico dapresente invenção compreende ainda um segmento de ligação que liga opeptídeo de subdomínio da proteína E ao peptídeo de subdomínio da proteínaΜ. O referido segmento de ligação é de preferência um pentapeptídeo que tempor seqüência: RRDKR ou RREKR.
De modo particularmente preferido, o polipeptídeo quimérico deacordo com a presente invenção compreende uma seqüência de aminoácidostal como definida em qualquer uma das seguintes seqüências:
a) - aminoácidos 19 a 172 da SEQ ID NO : 3;
b) - aminoácidos 21 a 168 da SEQ ID NO : 6;
c) - aminoácidos 21 a 132 da SEQ ID NO : 12;
d) - aminoácidos 18 a 624 da SEQ ID NO : 20;
e) - aminoácidos 18 a 609 da SEQ ID NO : 21
f) - aminoácidos 18 a 624 da SEQ ID NO : 22;
g) - aminoácidos 18 a 489 da SEQ ID NO : 23; e
h) - aminoácidos 21 a 474 da SEQ ID NO : 24.A presente invenção trata também dos polipeptídeo (e osfragmentos desses polipeptídeos) que são codificados pelas seqüênciasnucleotídicas mencionadas a seguir.
De modo particularmente preferido, o polipeptídeo de acordo coma presente invenção apresenta uma porcentagem de identidade de pelo menos80% depois do alinhamento ótico com uma seqüência tal como definida emqualquer uma das seqüências de ácidos aminados a) a h) definidas acima, depreferência, de pelo menos 90% , mais preferencialmente de pelo menos 98%e mais preferencialmente ainda de pelo menos 100%.
De acordo com um aspecto conexo, a presente invenção trata deum polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica para um polipeptídeoquimérico tal como definido anteriormente.
Por "isolado ou purificado", entendem as moléculas cujo estado naturalfoi modificado pelo homem, ou seja, se essas moléculas existem na natureza, elasforam mudadas e/ou retiradas de seu ambiente inicial. Por exemplo, umpolinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente e que se encontra noambiente biológico do organismo vivo q ue o expressa não é, nesse contexto,"isolado". Todavia, o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo quando separado deseu ambiente natural e/ou obtido por clonagem, amplificação e/ou síntese química éconsiderado de acordo com a presente invenção como "isolado". Por outro lado, umpolinucleotídeo ou polipeptídeo que é introduzido em um organismo portransformação, manipulação genética ou por qualquer outro método derecombinação é "isolado" mesmo que esteja presente no referido organismo.
Por seqüência nucleotídica, ácido nucléico, seqüência nucléicaou de ácido nucléico, polinucleotídeo, oligonucleotídeo, seqüência depolinucleotídeo, termos que serão utilizados indiferentemente na presenteinvenção descrição, designa-se um encadeamento preciso de nucleotídeos,modificados ou não, que permite definir um fragmento ou uma região de umácido nucléico, que comporta ou não nucleotídeos não naturais, e que podecorresponder tanto a um DNA de filamento duplo, um DNA de filamentosimples como produtos de transcrição dos referidos DNAs. Assim, asseqüências nucléicas de acordo com a presente invenção englobamigualmente os PNA (Peptid Nucleic Acid), ou análogos. Os fragmentos dospolinucleotídeos da presente invenção compreendem pelo menos 15nucleotídeos consecutivos. De preferência, eles compreendem pelo menos 20nucleotídeos consecutivos e mais preferencialmente ainda, eles compreendempelo menos 30 nucleotídeos consecutivos.
A presente invenção tem também por objeto fragmentos depolinucleotídeos que consistem em fragmentos de 15, 20 ou 30 nucleotídeossucessivos.
Todo polinucleotídeo que foi modificado química, enzima oumetabolicamente, mas que conservou as propriedades bioquímicas dopolipeptídeo qüimérico de origem pertence ao âmbito da presente invenção.
De acordo com um modo de realização preferencial, o polinucleotídeoda presente invenção, quando codifica para um polipeptídeo qüimérico de acordocom a presente invenção, compreende vantajosamente uma seqüência nucleotídicatal como definida em qualquer uma das seguintes seqüências:
a) nucleotídeos 7 a 492 da SEQ ID NO : 4;
b) SEQ ID NO : 5;
c) nucleotídeos 7 a 504 da SEQ ID NO : 7;
d) nucleotídeos 7 a 504 da SEQ ID NO : 13; e
e) SEQ ID NOS : 25 a 29.
De modo particularmente preferido, o polinucleotídeo de acordocom a presente invenção apresenta uma porcentagem de identidade de pelomenos 80% depois do alinhamento ótimo com uma seqüência tal comodefinida em qualquer das seqüências nucleotídicas a) a e) definidas acima, depreferência de pelo menos 90%, mais particularmente de pelo menos 98% ede modo mais particularmente preferido ainda de pelo menos 100%.
Por porcentagem de identidade entre duas seqüências de ácidosnucléicos ou de ácidos aminados de acordo com a presente invenção,designa-se uma porcentagem de nucleotídeos ou de resíduos de ácidosaminados idênticos entre as duas seqüências que vão ser comparadas, obtidaapós o melhor alinhamento, porcentagem essa que é puramente estatística eas diferenças entre as duas seqüências está distribuída ao acaso e em todoseu comprimento. Designa-se por "melhor alinhamento" ou "alinhamentoótimo", o alinhamento para o qual a porcentagem de identidade determinadado modo indicado a seguir é mais elevada. As comparações de seqüênciasentre duas seqüências de ácidos nucléicos ou de aminoácidos sãotradicionalmente realizadas pela comparação dessas seqüências depois dealinhá-las de modo ótimo, comparação essa que é realizada por segmento oupor janela de comparação para identificar e comparar as regiões locais desimilaridade de seqüência. O alinhamento ótimo das seqüências para acomparação pode ser realizado manualmente e também por meio do algoritmode homologia local de Smith e Waterman (1981), por meio do algoritmo dehomologia local de Neddleman e Wunsch (1970), por meio do método depesquisa de similaridade de Pearson e Lipman (1988), por meio de programasinformáticos que utilizam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLASP P, BLASTN, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetica Software Package, GeneticsComputer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl). A fim de obter o alinhamentoótimo, utiliza-se de preferência o programa BLAST, com a matriz BLOSUM 62.Pode-se também usar as matrizes PAM ou PAM250.
A porcentagem de identidade entre duas seqüências de ácidosnucléicos ou de aminoácidos é determinada pela comparação entre essasduas seqüências alinhadas de modo ótimo, e a seqüência de ácidos nucléicosou de aminoácidos que vai ser comparada pode compreender adições oudeleções em relação à seqüência de referência para um alinhamento ótimoentre essas duas seqüências. A porcentagem de identidade é calculadadeterminando-se o número de posições idênticas para as quais o nucleotídeoou o resíduo de aminoácido é idêntico entre as duas seqüências, dividindoesse número de posições idênticas pelo número total de posições comparadase multiplicando o resultado obtido por 100 para obter a porcentagem deidentidade entre essas duas seqüências.
Por seqüências nucléicas que apresentam uma porcentagem deidêntico de pelo menos 80%, de preferência de pelo menos 90%, maispreferencialmente ainda de pelo menos 98% após alinhamento ótimo com umaseqüência de referência, designam-se as seqüências nucléicas queapresentam, em relação à seqüência nucléica de referência, certasmodificações como em particular uma deleção, uma truncação, umalongamento, uma fusão quimérica, e/ou uma substituição, em particularpontual, e cuja seqüência nucléica apresenta pelo menos 80%, de preferência90%, e mais preferencialmente ainda pelo menos 98%, de identidade depoisdo alinhamento ótimo dom a seqüência nucléica de referência. De preferência,as condições de hibridação específicas ou de alta estringência serão tais queasseguram pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, e maispreferencialmente ainda pelo menos 98% de identidade depois do alinhamentoótimo entre uma das duas seqüências e a seqüência complementar da outra.
Uma hibridação em condições de alta estringência significa queas condições de temperatura e de força tônica são escolhidas de modo apermitir a manutenção da hibridação entre dois fragmentos de ácidos nucléicoscomplementares. A título ilustrativo, condições de alta estringência da etapa dehibridação, para fins de definir as seqüências nucleotídicas descritas acima,são vantajosamente as seguintes.A hibridação DNA-DNA ou DNA-RNA é realizada em duasetapas: (1) pré-hibridação a 42°C durante 3 horas em tampão fosfato (20 mM,pH 7, 5) que contém 5 χ SSC (1 χ SSC corresponde a uma solução 0,15 MNaCI + 0,015 M citrato de sódio), 50% de formamida, 7 % de sódio dodecilsulfato (SDS), 10 χ Denhardfs, 5% de dextrano sulfato e 1% de DNA deesperma de salmão; (2) hibridação propriamente dita durante 20 horas a umatemperatura que depende do tamanho da sonda (ou seja: 42°C, para umasonda de tamanho > 100 nucleotídeos), seguida de 2 lavagens de 20 minutosa 20°C em 0,1 χ SSC χ 0,1% SDS. A última lavagem é realizada em 0,1 χ SSC+ 0,1% SDS durante 30 minutos a 60°C para uma sonda de tamanho > 100nucleotídeos. As condições de hibridação de alta estringência descritas acimapara um polinucleotídeo de tamanho definido podem ser adaptadas pelotécnico no assunto para oligonucleotídeos de maior ou menor tamanho, deacordo com os ensinamentos de Sambrook et al. 1989.
Os polipeptídeos e polinucleotídeos de acordo com a presenteinvenção podem ser preparados por qualquer processo apropriado. Elespodem em particular ser obtidos por síntese química, mas é também possívelobtê-los por via biológica utilizando em particular diferentes vetores nasculturas celulares apropriadas. Os peptídeos de acordo com a presenteinvenção podem se apresentar em forma desglicosilada, ou glicosilada, se issofor necessário. Uma pessoa versada no campo da presente invenção saberáobter diferentes polinucleotídeos/polipeptídeos e saberá determinar quais são,entre os polinucleotídeos/polipeptídeos obtidos, aqueles que possuem umaatividade biológica adequada.
2. Vetores Virais Recombinantes
De acordo com outro aspecto, a presente invenção trata de umvetor viral recombinante do sarampo em cujo genoma está inserido umpolinucleotídeo de acordo com a presente invenção. Esses vetores sãopreparados pelos métodos habitualmente utilizados pelo técnico no assunto, eos clones que deles resultam podem ser introduzidos em um hospedeiroapropriado por métodos padrão conhecidos do técnico no assunto.
De acordo com um modo privilegiado, o vetor viral recombinantede acordo com a presente invenção é vantajosamente um vetor viral vivo dosarampo cepa Schwarz, como os selecionados no grupo de vetores viraisconstituído pelos que foram depositados na "Collection Nationale de Culture deMicroorganismes" - CNCM (Acervo Nacional de Cultura de Microorganismos)sob os números I-3440, I-3442, I-3452, I-3453, I-3454, I-3455, 1-3619, I-3620, I-3621, I-3622 e I-3623. A seqüência do antigenoma completo do vírus dosarampo cepa Schwarz pode ser obtido por exemplo a partir dos plasmídeospTM das cepas depositadas sob os números CNCM I-3440 e I-3442.
O vetor pTM-MVSchm2-[ED111+M1 "40JWN V(IS-98-ST!) foi depositadona CMCM (Paris, Françâ) em 26 de maio de 2005 sob o número I-3440.
Esse vetor é um plasmídeo PTM que contém o antigenomacompleto do vírus do sarampo, cepa Schwarz, e uma unidade adicional deexpressão situada entre os genes PeM que contêm a seqüência do domínioIll da proteína de envelope do Nilo ocidental (WNV IS-98-ST1) fundida com aseqüência 1-40 da proteína de membrana.
O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml apósinoculação por pequenas colônias.
Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.
O vetor PTM-MVSchw2-[EDIIl]+ApoptoM]DV1 (FGA89) foi depositadona CNCN (Paris, França) em 26 de maio de 2005 sob o número I-3442.
Esse vetor é um plasmídeo pTM que contém o antigenomacompleto do vírus do sarampo, cepa Schwarz, e uma unidade adicional deexpressão modificada situada entre os genes PeM que contém a seqüênciado domínio Ill da proteína de envelope do vírus da dengue 1, cepa FGA89,fundida com a seqüência apoptótica da proteína da membrana M.
O vetor pode ser cultivado em meio LB amp 100 μ/ml depois dainoculação por pequenas colônias.
Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.
O vetor pTRE2-ssCRT-ApoptoMden1/DIII-Ha1-2 foi depositado naCNCN (Paris, França) em 16 de junho de 2006 sob o número I-3452.
Esse vetor é um plasmídeo pTRE2 que contém a seqüência dopeptídeo sinal da calbreticulina humana fundida com as seqüênciasproapoptóticas da proteína M e com os ectodomínios Ill da proteína E com asseqüências hélice α dos vírus da dengue 1 e 2.
A seqüência do inserto contido no plasmídeo e que constitui umpolinucleotídeo da presente invenção, é a SEQ ID NO: 9 representada na figura 8.
O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml.
Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.
O vetor pTRE2-ssCRT-ApoptoMden1/DIII-Ha3-4 foi depositado naCNCN (Paris, França) em 16 de junho de 2005 sob o número I-3453.
Esse vetor é um plasmídeo pTRE2 que contém a seqüência dopeptídeo sinal da calbreticulina humana fundida com as seqüênciasproapoptóticas da proteína M do vírus da dengue 1 e com as seqüências dosectodomínios Ill da proteína E e Ha dos vírus da dengue 3 e 4.
A seqüência do inserto contido no plasmídeo e que constitui umpolinucleotídeo da presente invenção, é a SEQ ID NO: 11 representada na figura 9.
O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml.
Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.
O vetor pTRE2-ssCRT-ApoptoMden1/DIII-Ha1-2-3-4 foi depositadona CNCN (Paris, França) em 16 de junho de 2005 sob o número I-3454.
Esse vetor é um plasmídeo pTRE2 que contém a seqüência dopeptídeo sinal da calbreticulina humana fundida com as seqüências proapoptóticasda proteína M do vírus da dengue 1 e com as seqüências dos ectodomínios Ill comhélices α(Ηα) das proteínas E dos vírus da dengue 1, 2, 3 e 4.
A seqüência do inserto contido no plasmídeo e que constitui umpolinucleotídeo da presente invenção, é a SEQ ID NO: 4 representada na figura 2.
O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml.
Ele é conservado a longo prazo por congelamento a -80°C.
O vetor pTRE2-ssCRT-EctoM40den1/DlII-Hal-2-3-4 foi depositadona CNCN (Paris, França) em 16 de junho de 2005 sob o número I-3455.
Esse vetor é um plasmídeo pTRE2 que contém a seqüência dopeptídeo sinal da calbreticulina humana fundida com as seqüências doectodomínio 1-40 da proteína M do vírus da dengue 1 e com as seqüênciasdos ectodomínio 1-40 da proteína M do vírus e das seqüências dosectodomínios Ill com hélices α(Ηα) das proteínas E da dengue 1, 2, 3 e 4.
A seqüência do inserto contido no plasmídeo e que constitui umpolinucleotídeo da presente invenção, é a SEQ ID NO: 17 representada nafigura 12.
O vetor pode ser cultivado em meio LB ampi 100 μ/ml.
Ele é conservado à longo prazo por congelamento a -80°C.
O vetor pUC57-TetraDVA (introduzido na cepa E. coli) foi depositadona CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número 1-3619.
Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma seqüêncianucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de umaconstrução tetramérica dos ectodomínios Ill da proteína de envelope E dos 4sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio daproteína de membrana M.
O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 25.
A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi 100 μ/ml.O vetor pUC57-TetraDVB (introduzido na cepa E. coli) foidepositado na CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número I-3620.
Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma seqüêncianucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de umaconstrução tetramérica dos ectodomínios Ill da proteína de envelope E dos 4sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio daproteína de membrana M.
O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 26.
A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi 100 μ/ml.
O vetor pUC57-TetraDVC (introduzido na cepa E. coli) foidepositado na CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob onúmero 1-3621.
Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma seqüêncianucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de umaconstrução tetramérica'dos ectodomínios Ill da proteína de envelope E dos 4sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio daproteína de membrana M.
O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 27.
A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi 100 μ/ml.
O vetor pUC57-TetraDVD (introduzido na cepa E. coli) foi depositadona CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número I-3622.
Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma seqüêncianucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de umaconstrução tetramérica dos ectodomínios Ill da proteína de envelope E dos 4sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio daproteína de membrana M.
O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 28.
A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi100 μ/ml.
O vetor pUC57-TetraDVE (introduzido na cepa E. coli) foi depositadona CNCM (Paris-França) em 14 de julho de 2006 sob o número I-3623.
Esse vetor é um plasmídeo pUC que contém uma seqüêncianucleotídica otimizada para a expressão em células mamíferas de umaconstrução tetramérica dos ectodomínios Ill da proteína de envelope E dos 4sorotipos (1, 2, 3, 4) do vírus da dengue, fundida com o ectodomínio daproteína de membrana M.
O inserto contido no plasmídeo vetor está representado na figura 29.
A cepa que contém o vetor pode ser cultivada em meio LB ampi100 μ/ml.
3. Vetores de Clonagem e/ou de Expressão ε Anticorpos
De acordo com outro aspecto, a presente invenção trata dequalquer vetor de clonagem e/ou de expressão e de qualquer hospedeiro celular(procarionte ou eucarionte) transformado por esse vetor, e que compreende oselementos de regulação que permitem a expressão da seqüência de nucleotídeosque codificam para um polipeptídeo quimérico de acordo com a presenteinvenção. Esses vetores são preparados pelos métodos habitualmente utilizadospelo técnico no assunto, e os clones que deles resultam podem ser introduzidosem um hospedeiro apropriado por métodos padrão, tais como, por exemplo, alipofecção, a eletropóração, o choque térmico, a transformação apóspermeabilização química da membrana, a fusão celular.
A presente invenção compreende ainda as células hospedeiras,em particular as células eucariotes e procariotes, transformadas pelos vetoresde acordo com a presente invenção bem como os animais transgênicos, depreferência os mamíferos, com exceção do homem, que compreendem asreferidas células transformadas de acordo com a presente invenção. Essesanimais podem ser utilizados como modelos, para o estudo da etiologia dedoenças inflamatórias e/ou imunes, e em particular das doenças inflamatóriasdo tubo digestivo, ou para o estudo de cânceres.
Entre as células que podem ser utilizadas de acordo com apresente invenção, pode-se citar as células bacterianas (Olins et Lee (1993),Curr. Op. Biotechnology 4; 520), e também as células de levedura (Buckholz,(1993), Curr. Op. Biotechnology 4,538, bem como as células animais, emparticular as culturas de células de mamíferos (Edwards et Aruffo (1993), Curr.Op. Biotechnology, 4,558).
De acordo com a presente invenção, o termo "vetor de clonageme/ou de expressão" se refere a uma construção polinucleotídica concebida para sertransfectada em diferentes tipos celulares. Por isso, esses vetores visam os vetoresde expressão concebidos para a expressão de uma seqüência nucleotídica nacélula hospedeira: os vetores de clonagem concebidos para o isolamento, apropagação e a replicação de nucleotídeos inseridos ou dos vetores ponte quecompreendem atributos de mais de um vetor.
4. Anticorpos Policlonais ou Monoclonais
Os polipeptídeos e polinucleotídeos da presente invenção podemtambém ser utilizados para preparar anticorpos policlonais ou monoclonaiscapazes de se fixar (de preferência de modo específico) em pelo menos umpolipeptídeo quimérico/polinucleotídeo objeto da presente invenção. Apresente invenção visa, portanto, igualmente esses anticorpos purificados quepodem ser obtidos por técnicas bem conhecidas como, por exemplo, a técnicadescrita por Kolher et Milstein (Contínuos cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity. Nature (1975), 263:495-497). De acordo comum modo de realização preferido da presente invenção, os anticorpos são dotipo "humanizado". Uma pessoa versada na área por seus conhecimentosgerais saberá preparar esses tipos de anticorpos.
5. Métodos ε Processo de Uso
De acordo com outro aspecto, a presente invenção trata daprevenção e/ou do tratamento de uma infecção por Flaviviridae em umaespécie sensível. Mais particularmente, a presente invenção trata do uso deum vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção para apreparação de uma composição imunogênica destinada à prevenção ou aotratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível. Por"espécie sensível", entende-se qualquer animal suscetível a uma infecção porFlaviviridae, como por exemplo um ser humano.
A presente invenção trata também de um método de prevençãoe/ou de tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível,que compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamenteeficaz de pelo menos um dos seguintes elementos:
- um polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção;
- um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção;
- um vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção;
- um anticorpo de acordo com a presente invenção; e
- um vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com apresente invenção.
Por "infecção por Flaviviridae", entende-se por exemploflaviviroses tais como a dengue, a febre amarela, a encefalite japonesa e dafibra do Nilo Ocidental. Os meios de preparação e de administração doselementos da presente invenção não serão descritos com mais detalhes poisjá são conhecidos do técnico no assunto.
6. Composições
A presente invenção trata também das composiçõesimunogênicas úteis na prevenção e/ou no tratamento e/ou no tratamento deuma infecção por Flavivirídae. Por "composição imunogênica", entende-se umacomposição que contém elementos que possuem a capacidade de induzir invivo ou in vitro, uma resposta imune de tipo celular e/ou humoral.
Em um modo de realização preferido, a composição da presenteinvenção contém ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, e umelemento escolhido no grupo constituído por:
- um polipeptídeo de acordo com a presente invenção;
- um polinucleotídeo quimérico de acordo com a presente invenção;invenção;
- um vetor viral recombinante de acordo com a presente
- um anticorpo de acordo com a presente invenção; e
- um vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com apresente invenção.
As composições de acordo com a presente invenção podem seapresentar em uma forma sólida ou líquida qualquer habitual para aadministração farmacêutica, ou seja, por exemplo formas de administraçãolíquida, em gel, ou qualquer outro suporte que permita por exemplo umaliberação controlada. Entre as composições utilizáveis, pode-se citar emparticular as composições injetáveis no ser humano.
As composições da presente invenção podem comportar aindacomponentes que aumentam ou podem aumentar a imunogenicidade dospolipeptídeos quiméricos da presente invenção, em particular de outrospeptídeos imunogênicos, adjuvantes de imunidade específicos ou não, taiscomo o alun, o QS21, o adjuvante de Freund, o adjuvante SBA, a montanida,polissacarídeos ou compostos equivalentes.
Uma pessoa versada na área saberá preparar composiçõesfarmaceuticamente aceitáveis e determinar, em função de vários fatores, o modode administração privilegiado e a quantidade que deve ser administrada. Entre osfatores que podem influir nessas escolhas pode-se citar: a composição; o estágioda doença; a condição; a idade e o peso do paciente, etc.
Exemplos
Os exemplos a seguir permitirão ressaltar outras características evantagens da presente invenção, e servem para ilustrar a extensão do uso dapresente invenção e não a limitar seu alcance. Pode-se introduzir modificações evariações nela sem fugir ao âmbito desta invenção. Embora possam ser utilizadosoutros métodos ou produtos equivalentes aos encontrados a seguir para testar ourealizar a presente invenção, o material e os métodos preferidos estão descritos.
Exemplo 1
O Vírus do Sarampo Recombinado MVsr»w-rEDlll + M^WiCQMO Protótipode uma Candidato a Vacina contra a Dengue (PTR156)
Descritas nas Figuras 1 e 2, duas construções imunogênicasbaseadas, de um lado, na capacidade do domínio Il da glicoproteína de invólucro Edo vírus da dengue a induzir anticorpos neutralizantes e, de outro lado, na implicaçãodo ectodomínio da proteína de membrana M (M1^0) na patogenicidade viral(apoptose) foram inseridas no genoma da cepa viral atenuada Schwarz do vírus dosarampo (MVSchw). As seqüências virais estão na dependência do peptídeo sinal dacalreticulina para permitir seu endereçamento na via de secreção. A expressão dasseqüências [EDIII]dv-i, e [EDIII-M1J%v-i pelos vírus recombinados MVSchw foiverificada nas células Vero infectadas por imunofluorescência indireta por meio deum soro policlonal da cepa HMAF dirigido contra o DV-1 (Fig. 3). A secreção dosdomínios antigênicos EDII e EDII fundidos na seqüência M1"40 (com o pentapeptídeointercalante RRDKR) do vírus dengue, tipo-1 (DV-1) da cepa FGA/89 (Holmes E.C.et al, Mol. Biol. Evol. 16(3): 405^09, 1999 e Desprès P. et al„ Virology 196:209-219)foi observada por análise em Westem blot nos sobrenadantes de células infectadaspelos vírus MVSchw-[EDIII]Dv-i e MVs^w- [EDIII+M1^°]dv-i· respectivamente (Fig. 4). Damesma forma, a produção e a secreção nos sobrenadantes de cultura de uma cepade células de drosófila S2[EDIII+M1^°]Dv.1 induzidas para a expressão dessasproteínas foram demonstradas (Fig. 5).
Dois grupos de 4 camundongos CD46/IFNAR adultos foramimunizados com 104 TCID50 de cada um dos vírus MVSchw recombinados(Tabelas 1 e 2). O vírus vazio MVSchw foi utilizado como um controle negativo.Determinamos a produção de anticorpos dirigidos contra o vírus MVSchw (MVAg) e o vírus DV-1(DV-1 Ag) inclusive os que são específicos de EDIII(Thullier, P. et al. 2001, J. Gen. Virol. 82 : 1885-1892) e neutralizantes (Anti-DV1 FRNT75) nos camundongos imunizados (Tabelas 1 e 2). Observamosque o vírus MVSchw-[EDIII]Dv-i é pouco eficaz para produzir anticorposespecíficos do DV-1 ou do EDIII sozinho após duas inoculações com umintervalo de um mês (Tabela 1). De acordo com o mesmo protocolo deimunização, observamos que o vírus MVschw-IEDIlIJ+M1"40] Dv-1 induz títulossignificativos de anticorpos dirigidos contra o DV-1 e contra o EDIII sozinho(Tabela 2). Anticorpos anti-DV1 entre os quais os que são neutralizantes sãoainda detectados quatro meses após o fim da imunização.
Quando os camundongos imunizados por mais de 6 meses comM Vschw-[ED111]+M1 "40J dv-ι são submetidos a um reforço com uma dose única de5 μg de proteínas totais de um concentrado de sobrenadante de células dedrosófila S2.[EDIII]+M1"40] Dv-i induzidas para a expressão da proteína de fusão[EDIIIJ+M1"40] dv-ι e em presença de Alugel como adjuvante, são observadastaxas elevadas de anticorpos anti DV-1, anti-EDIll e neutralizantes do DV-1,que traduzem uma resposta humoral memória bem estabelecida nessesanimais vacinados (Tabela 2). Os anticorpos anti DV-1 estão ainda presentesdiversos meses após o reforço antigênico (Tabela 2).
Três meses depois do reforço com r[EDIII]+M1~40]Dv-i, oscamundongos imunizados com MVschw-[EDIII]+M1"40] Dv-i foram inoculadoscom 107 UFF do DV-1 camundongo FGA/NA d1d por via intraperitoneal (oDV-1 é responsável por uma infecção assintomática no camundongoIFNAR). Títulos importantes de anticorpos anti-DV-1 (dirigidos sobretudocontra o EDIII) entre os quais os que neutralizam o DV-1 cepa Havaí (títuloneutralizante 4000) são observados após 3 semanas de prova viral (Quadro2). Deve-se notar que os camundongos imunizados por 9 meses com ovírus com MVSchw-[EDIII]+M1"40] Dv-i (essa construção não induz anticorposanti-EDIll ou neutralizantes do DV1) e testados com 107 UFF do DV-1 cepaFGA/NA d1d pela via intraperitoneal, produzem títulos de anticorpos DV1-,anti-EDIll e neutralizàntes de 20000, 5000 e 80, respectivamente; sãovalores equivalentes aos observados nos camundongos BALB/c ou IFNARtestados nas mesmas condições experimentais.
Concluindo, a seqüência de fusão .[EDIIIJ+M1"40] dv-i secretadapelo vírus MVschw-IEDMIl+M1"40] Dv-i é capaz de gerar anticorpos neutralizantesanti-DV-1 e de induzir uma resposta humoral memória a longo prazo que éestimulada eficazmente, de um lado, pelo antígeno solúvel r[EDIII]+M1"40]Dv-i e,de outro lado, em resposta a uma infecção viral. Inversamente, apenas odomínio antigênico EDIII secretado pelo vírus MVschw-[EDIII]Dv-i é poucoimunogênico no camundongo CD46+-IFNAR. Nossos trabalhoscomplementares demonstram que o peptídeo pro-apoptótico ApoptoM (M32"40)na extremidade C-terminal da M é determinante no poder imunogênico daseqüência de fusão .[EDIIII+M1"40] Dv-1, uma vez que o vírus MVSchw-[EDIII+M1"30] dv-1 ι sem ApoptoM induz uma produção de anticorpos DV-1 equivalente àque é obtida após imunização com o vírus MVschw-[EDIII]Dv-i·
Como metodologia geral de vacinação pediátrica contra adengue, propomos imunizar indivíduos jovens com o vírus MVschw-fEDIll+M1"40]dv-i, por uma inoculação dupla com um intervalo de um mês, e depois detornar a estimulá-los tardiamente com o antígeno solúvel r[EDIII]+M1_40]Dv-icom uma finalidade de reforço vacinai ou de profilaxia contra o risco de umainfecção pelo vírus da dengue. Essa estratégia de imunização está em fase devalidação para os quatro serotipos da dengue com base em um antígenocomposto pelo tetrâmero dos 4 domínios EDIII dos DV-1, -2, -3 e 4 fundidocom a seqüência citotóxica ApoptoM.
Nossos primeiros resultados experimentais assinalam aimportância de um ímunógeno de tamanho reduzido derivado da proteínade envelope do vírus DV1 em combinação com as capacidadesimunoestimuladoras do vetor sarampo vivo, uma estratégia que permite aindução de uma resposta humoral neutralizante que é eficaz contra ovírus da dengue. Eles definem uma prova de conceito para o design dasconstruções tetraméricas dos domínios antigênicos do DV que permitirãoimunizar simultaneamente e a longo prazo contra os quatro sorotipos dadengue.
Exemplo 2
Construção de Polipeptídeos Quiméricos Otimizados para uma Expressãoem Mamífero
No presénte exemplo, os inventores desenvolveram novasconstruções antigênicas úteis contra uma infecção por Flaviviridae.
Esses novos polipeptídeos quiméricos se baseiam em umantígeno composto de um tetrâmero dos quatro domínios EDIII dos quatrosorotipos do vírus da Dengue, fundidos entre si e com uma ou outra dasseqüências citotóxicas apoptoM mostradas na Figura 30.
A seguir, esses polipeptídeo quiméricos otimizados para umaexpressão em mamífero foram inseridos no genoma da cepa viral atenuadaSchwarz do vírus do sarampo (MVSchw). As figuras 15 a 29 mostram asseqüências de aminoácidos de cinco polipeptídeos quiméricos preferidos e ospolinucleotídeos que os codificam.
Esses polipeptídeos quiméricos foram construídos de acordo comas seguintes condições de otimização:
Informações de otimização dessas seqüências:
- (No Cai=0,806, %GC médio = 53,46, distribuição em GC:homogêneo aproximadamente 50%);
- eliminação das seqüências "TATA box" interna, porção ricaem AT ou GC, os elementos de seqüências ARE, INS e CRS, seqüênciasrepetidas, seqüências de estrutura de RNA secundária, seqüência desplicing críptico:
- eliminação dos sítios de restrição indicados a seguir: Nhel,BamHI, Xhol, EcoRI, KPnl, Sall, BspEI, Bglll, Notl, BssHII e BsiWI, comexceção para BsiWI em primeira posição e BssHII em última posição;
- eliminação dos motivos TTTT, TTTAA, AAAGGG, AAAAGG,GGGAAA, GGGGAA e seus complementares TTCCCC, TTTCCC, CCTTTT,CCCTTT.
Tabela I
Resposta de Anticorpos Dirigida contra o Vírus MVSchw noscamundongos CD46*/IFNAR INOCULADOS I.P. POR MVsrMw-rEpiHlDvi
<table>table see original document page 27</column></row><table>
a. 104 TCIP50 de MV-DVIIEDIII+M1"40] foram dados i.p. aquatro camundongos adultos
b. Os indivíduos receberam uma injeção de reforço com 104TCIP5O de MV-DVIfEDIll+M1"40]c. Determinado por ELISA (Trinity Biotech) em sorosagrupados (pooled) e inativados pelo calor.
d. Determinado por ELISA em soros agrupados (pooled) einativados pelo calor. Placas de microtitulação foram recobertas de 5 χ 105FFU de sucrose purificada, FGA/NA d1d como antígeno viral.
e. Determinado por ELISA em soros agrupados (pooled) einativados pelo calor. Placas de microtitulação foram recobertas de 50 ng deEDIII recombinante altamente purificado do DV1 como antígeno viral.
f. Os anticorpos de neutralização anti-DV1 foram detectadospelo uso do teste dè soroneutralização por redução das placas (ou "FocusReduction Neutralization Test" (FRNT). Soros agrupados (pooled) e inativadospelo calor foram incubados com a cepa HAvai DV1 e a titulação de vírus foirealizada sobre células Vero pelo teste de imunodetecção das placas.FRNT75, a diluição do soro mais elevado testada que reduziu o número deFFU em pelo menos 75%.
Tabela II
<table>table see original document page 28</column></row><table>a. 104 TCIP50 de MV-DVIIEDIII+M1"40] foram dados i.p. aquatro camundongos adultos
b. Os indivíduos receberam uma injeção de reforço com 104TCIP50 de MV-DVIIEDIII+M1"40]
c. Os camundongos imunizados receberam uma injeção dereforço de 5 μg de proteínas secretadas totais provenientes do sobrenadante decélulas S2 que expressam rDVItEDIll+M1"40] em presença do adjuvante Alugel.
d. Os camundongos imunizados foram inoculados i.p. com107 FFU de FGA/NA d1d da cepa DV1 por três semanas.
e. Determinado por ELISA (Trinity Biotech) em sorosagrupados (pooled) e'inativados pelo calor.
f. Determinado por ELISA em soros agrupados (pooled) einativados pelo calor. Placas de microtitulação foram recobertas de 5 χ 105FFU de sucrose purificada, FGA/NA d1d como antígeno viral.
g. Determinado por ELISA em soros agrupados (pooled) einativados pelo calor. Placas de microtitulação foram recobertas de 50 ng deEDIII recombinante altamente purificado do DV1 como antígeno viral.
h. Os anticorpos de neutralização anti-DV1 foram detectadospelo uso do FNRT. Soros agrupados (pooled) e inativados pelo calor foramincubados com a cepa Havaí DV1 e a titulação de vírus foi realizada sobrecélulas Vero pelo teste de imunodetecção das placas. FRNT75, a diluição dosoro mais elevado testada que reduziu o número de FFU em pelo menos 75%.Listagem de seqüência
<110> INSTITUT PASTEUR
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
<120> POLIPEPTÍDEOS QUIMÉRICOS E SUAS APLICAÇÕES TERAPÊUTICASCONTRA UMA INFECÇÃO POR FLAVIVIRIDAE
<130> B6802A
<150> CA 2508266<151> 20-06-2005
<160> 33
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
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<212> PRT
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<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae<400> 1
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val15 10 15
Ala Arg Ser Lys Gly Met ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys20 25 30
Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln35 40 45
vai Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr50 - 55 60
Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn65 70 75 80
Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro vai Asn Ile Glu Thr Glu Pro85 . 90 95
Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu100 105 110
Lys Leu Ser Trp Phe Lys Arg
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<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae
<400> 2cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60
tctaaaggga tgtcatatgt gatgtgcaca ggctcattta agctagagaa ggaagtggct 120
gagacccagc atgggactgt cctagtgcag gttaaatacg aaggaacaga tgcgccatgc 180
aagatcccct tttcgaccca agatgagaaa ggagtgaccc agaatgggag attgataaca 240
gccaatccca tagttactga caaagaaaaa ccagtcaaca ttgagacaga accacctttt 300
ggtgagagct acatcatagt aggggcaggt gaaaaagctt tgaaactaag ctggttcaag 360
cgatagcggc cgctataagc gcgc 384
<210> 3
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<212> PRT
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<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae
<400> 3
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Arg Ser Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys20 25 30
Leu Glu Lys Glu vai Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln35 40 45
Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr50 55 60
Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn65 70 75 80
Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr Glu Pro85 90 95
Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu100 105 110
Lys Leu ser Trp Phe Arg Arg Asp Lys Arg ser Val Ala Leu Ala Pro115 120 125
His vai Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met ser ser130 135 140
Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg145 150 155 160
His Pro<210> 4
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cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60tctaaaggga tgtcatatgt gatgtgcaca ggctcattta agctagagaa ggaagtggct 120gagacccagc atgggactgt cctagtgcag gttaaatacg aaggaacaga tgcgccatgc 180aagatcccct tttcgaccca agatgagaaa ggagtgaccc agaatgggag attgataaca 240gccaatccca tagttactga caaagaaaaa ccagtcaaca ttgagacaga accacctttt 300ggtgagagct acatcatagt aggggcaggt gaaaaagctt tgaaactaag ctggttccga 360cgagacaaac gttccgtggc actggcccca cacgtgggac ttggtctaga aacaagaacc 420gaaacatgga tgtcctctga aggcgcctgg aaacaaatac aaaaagtgga gacttgggct 480ttgagacacc catgatagcg gccgctataa gcgcgc 516
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cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60tctaaaggga tgtcatatgt gatgtgcaca ggctcattta agctagagaa ggaagtggct 120gagacccagc atgggactgt cctagtgcag gttaaatacg aaggaacaga tgcgccatgc 180aagatcccct tttcgaccca agatgagaaa ggagtgaccc agaatgggag attgataaca 240gccaatccca tagttactga caaagaaaaa ccagtcaaca ttgagacaga accacctttt 300ggtgagagct acatcatagt aggggcaggt gaaaaagctt tgaaactaag ctggttccga 360cgagacaaac gttccgtggc actggcccca cacgtgggac ttggtctaga aacaagaacc 420gaaacatgga tgtcctctga aggcgcctgg aaacaaatac aaaaagtgga gacttgggct 480ttgagacacc catgatagcg gccgctataa gcgcgc 516
<210> 6
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Arg Thr Met Leu Leu ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu15 10 15Ala Val Ala Arg Ser Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys20 25 30
Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val35 40 45
Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly pro Cys Lys Ile Pro Ile50 55 60
Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val65 70 75 80
Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr ser ser Ala Asn ser Lys Val Leu85 90 95
Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg100 105 110
Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Lys Arg Ser Arg Arg115 120 125
Ser Val ser Val Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys130 135 140
Glu Ala Trp Leu Asp ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr145 150 155 160
Glu Asn Trp Ile Val Arg Asn Pro Arg Pro Leu Ala Arg165 170
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cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60tctaaaggca caacctatgg catgtgcaca gaaaaattct cgttcgcgaa aaatccggcg 120gacactggtc acggaacagt tgtcattgaa ctttcctact ctgggagtga tggcccttgc 180aaaattccga ttgtctccgt tgcgagcctc aatgacatga cccccgtcgg gcggctggtg 240acagtgaacc ccttcgtcgc gacttccagc gccaactcaa aggtgctagt cgagatggaa 300ccccccttcg gagactccta catcgtagtt ggaaggggag acaagcagat caaccaccat 360tggcacaaaa agcgaagcag gagatccgtg tcggtccaaa cacatgggga gagttcacta 420gtgaataaaa aagaggcttg gctggattca acgaaagcca cacgatacct catgaaaact 480gagaactgga tcgtaaggaa tccttgatag cggccgctat aagcgcgc
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<212> PRT
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<400> 8
Arg Thr Met Leu Leu ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu1 5 1° 15
Ala Val Ala Arg Ser Lys Gly Met ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser20 25 30
Phe Lvs Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr vai Leu35 40 45
Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe50 55 60
ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu lie Thr65 70 75 ou
Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr85 90 95
Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu Lys100 105 HO
Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser ser Ile Gly Lys Met115 120 125
Phe Glu Ala Thr Ala Gly Gly ser Gly Gly Lys Gly Met Ser Tyr ser130 135 140
Met cys Thr Gly Lys Phe Lys lie Val Lys Glu He Ala Glu Thr Gln145 150 155 Ί-ϋυ
His Gly Thr He vai Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro165 170 I75
Cvs Lvs He Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His vai Leu180 185 190
Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro195 200 205
vai Asn He Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile He210 215 220Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly ser225 230 235 240
ser lie Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met ser Gly Arg Val Glu Thr245 250 255
Trp Ala Leu Arg His Pro Ala Arg260
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cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60tctaaaggga tgtcatatgt gatgtgcaca ggctcattta agctagagaa ggaagtggct 120gagacccagc atgggactgt cctagtgcag gttaaatacg aaggaacaga tgcgccatgc 180aagatcccct tttcgaccca agatgagaaa ggagtgaccc agaatgggag attgataaca 240gccaatccca tagttactga caaagaaaaa ccagtcaaca ttgagacaga accacctttt 300ggtgagagct acatcatagt aggggcaggt gaaaaagctt tgaaactaag ctggttcaag 360aaaggaagca gcãtagggaa aatgttcgaa gcaaccgccg gaggatcagg agggaaagga 420atgtcatact ctatgtgtac aggaaagttt aaaattgtga aggaaat.agc agaaacacaa 480catggaacaa tagttatcag agtacaatat gaaggggacg gctctccatg taagatccct 540tttgagataa tggatttgga aaaaagacac gtcttaggtc gcctgattac agttaacccg 600atcgtaacag aaaaagatag cccagtcaac atagaagcag aacctccatt cggagacagc 660tacatcatca taggagtaga gccgggacaa ttgaaactca actggtttaa gaaaggaagt 720tccatcggcc aaatgtttga gacaacaatg agcggccgcg tggagacttg ggctttgaga 780cacccatagt aagcgcgc 798
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Arg Thr Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu1 5 10 15
Ala Val Ala Arg ser Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr20 25 30Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu35 40 45
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Phe Glu Ala Thr Ala Gly Gly ser Gly Gly Lys Gly Met ser Tyr Thr130 135 140
Met Cys ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln145 150. 155 J-ou
His Gly Thr Thr vai vai Lys vai Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro165 170 175
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Gly vai Gly Asp ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser225 230 235 Z40
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Trp Ala Leu Arg His Pro Ala Arg260
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Arg Thr Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu15 10 15
Ala Val Ala Arg Ser Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser20 25 30
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Leu Arg His Pro Ala Arg130
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<220>
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae
<400> 13 cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60tctaaaggga tgtcatatgt gatgtgcaca ggctcattta agctagagaa ggaagtggct 120gagacccagc atgggactgt cctagtgcag gttaaatacg aaggaacaga tgcgccatgc 180aagatcccct tttcgaccca agatgagaaa ggagtgaccc agaatgggag attgataaca 240gccaatccca tagttactga caaagaaaaa ccagtcaaca ttgagacaga accacctttt 300ggtgagagct acatcatagt aggggcaggt gaaaaagctt tgaaactaag ctggttcaag 360cgcggccgca ttgaaacctg gatcttgaga catccatagt aagcgcgc .408
<210> 14
<211> 128
<212> PRT
<213> Flavivirus sp.
<400> 14
Arg Thr Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu1 5 1Q 15
Ala Val Ala Arg ser Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys20 25 30
Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val vai35 40 45
Ile Glu Leu ser Tyr ser Gly ser Asp Gly Pro Cys Lys lie Pro Ile50 55 60
vai ser vai Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val65 70 75 80
Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu85 90 95
vai Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg100 105 110Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys Arg Pro Leu Ala Arg115 120 125
<210> 15 <211> 390 <212> DNA <213> Flavivirus sp.
<400> 15 cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60tctaaaggca caacctatgg catgtgcaca gaaaaattct cgttcgcgaa aaatccggcg 120gacactggtc acggaacagt tgtcattgaa ctttcctact ctgggagtga tggcccttgc 180aaaattccga ttgtctccgt tgcgagcctc aatgacatga cccccgtcgg gcggctggtg 240acagtgaacc ccttcgtcgc gacttccagc gccaactcaa aggtgctagt cgagatggaa 300ccccccttcg gagactccta catcgtagtt ggaaggggag acaagcagat caaccaccat 360tggcacaaat agcggccgct ataagcgcgc 390
<210> 16
<211> 496
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae
<400> 16
Arg Thr Met Leu Leu ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu1 5 10 15
Ala Val Ala Arg ser Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly ser20 25 30
Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu35 40 45
Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe50 55 60
Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr65 70 75 80
Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr85 90 95
Glu pro Pro Phe Gly Glu ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu Lys100 105 110
Ala Leu Lys Leu ser Trp Phe Lys Lys Gly ser Ser Ile Gly Lys Met115 120 125
Phe Glu Ala Thr Ala Gly Gly Ser Gly Gly Lys Gly Met ser Tyr Ser130 135 140Met cys Thr Gly Lys Phe Lys He Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln145 150 155 160
His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly ser Pro165 170 175
Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu180 185 190
Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp ser Pro195 200 205
Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp ser Tyr Ile Ile Ile210 215 220
Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser225 230 235 240
ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Gly Gly ser Lys Gly Met245 250 255
Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val ser260 265 270
Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu275 280 285
Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys290 295 300
Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys305 310 315 320
Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn325 330 335
Ile vai Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Lvs340 345 350
Lys Gly Ser Ser Ilg Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Gly Gly Ser355 360 365
Gly Gly Lys Gly Met ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe ser Ile370 375 380
Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys vai385 390 395 400
Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg405 410 415Asp Val Asn Lys420
Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile ser425
Ser Thr Pro430
Phe Ala Glu Asn Thr Asn435
Ser Val Thr Asn440
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Phe Gly Asp450
Ser Tyr Ile vai Ile Gly vai455
Gly Asp Ser Ala Leu Thr460
Leu His Trp Phe465
Arg Lys Gly ser Ser470
Ile Gly Lys Met475
Phe Glu Ser480
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Ala490
Leu Arg His Pro Ala Arg495
<210> 17<211> 1494<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae<400> 17
cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60
tctaaaggga tgtcatatgt gatgtgcaca ggctcattta agctagagaa ggaagtggct 120
gagacccagc atgggactgt cctagtgcag gttaaatacg aaggaacaga tgcgccatgc 180
aagatcccct tttcgaccca agatgagaaa ggagtgaccc agaatgggag attgataaca 240
gccaatccca tagttactga caaagaaaaa ccagtcaaca ttgagacaga accacctttt 300
ggtgagagct acatcatagt aggggcaggt gaaaaagctt tgaaactaag ctggttcaag 360
aaaggaagca gcatagggaa aatgttcgaa gcaaccgccg gaggatcagg agggaaagga 420
atgtcatact ctatgtgtac aggaaagttt aaaattgtga aggaaatagc agaaacacaa 480
catggaacaa tagttatcag agtacaatat gaaggggacg gctctccatg taagatccct 540
tttgagataa tggatttg^a aaaaagacac gtcttaggtc gcctgattac agttaacccg 600
atcgtaacag aaaaagatág cccagtcaac atagaagcag aacctccatt cggagacagc 660
tacatcatca taggagtaga gccgggacaa ttgaaactca actggtttaa gaaaggaagt 720
tccatcggcc aaatgtttga gacaacaatg ggaggatcta aggggatgag ctatgcaatg 780
tgcttgaata cctttgtgtt gaagaaagaa gtctccgaaa cgcagcatgg gacaatactc 840
attaaggttg agtacaaagg ggaagatgca ccttgcaaga ttcctttctc cacagaggat 900
ggacaaggga aagctcacaa tggtagactg atcacagcca acccagtggt gaccaagaag 960
gaggagcctg tcaacattga ggctgaacct ccttttgggg aaagtaacat agtgattgga 1020
attggagaca aagccttgaa aattaactgg tacaagaagg gaagctcgat tgggaagatg 1080ttcgaggcca ctgccggtgç ttctggtggt aagggaatgt catacacgat gtgctcagga 1140aagttctcaa ttgataaaga gatggcagaa acacagcatg ggacaacagt ggtgaaagtc 1200aagtatgagg gtgctggagc tccatgtaaa gttcccatag agataagaga tgtgaacaag 1260gaaaaagtgg ttgggcgtat catctcatct accccttttg ctgagaatac caacagtgtg 1320accaatatag aattggaacc cccttttggg gatagctaca tagtaatagg tgtaggagac 1380agtgcattaa cactccattg gttcaggaaa gggagctcca ttggcaagat gtttgagtcc 1440acatacagcg gccgcgtgga gacttgggct ttgagacacc catagtaagc gcgc 1494
<210> 18
<211> Β90
<212> DNA
<21Β> Flavivirus sp.'
<400> 18
cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60tctaagggaa caacctatgg cgtctgttca aaggctttca agtttcttgg gactcccgca 120gacacaggtc acggcactgt ggtgttggaa ttgcagtaca ctggcacgga tggaccttgc 180aaagttccta tctcgtcagt ggcttcattg aacgacctaa cgccagtggg cagattggtc 240actgtcaacc cttttgtttc agtggccacg gccaacgcta aggtcctgat tgaattggaa 300ccaccctttg gagactcata catagtggtg ggcagaggag aacaacagat taatcaccat 360tggcacaagt agcggccgct ataagcgcgc 390
<210> 19
<211> 528
<212> DNA
<21Β> Flavivirus sp.
<400> 19
cgtacgatgc tgctatccgt gccgttgctg ctcggcctcc tcggcctggc cgtcgccaga 60tctaagggaa caacctatgg cgtctgttca aaggctttca agtttcttgg gactcccgca 120gacacaggtc acggcactgt ggtgttggaa ttgcagtaca ctggcacgga tggaccttgc 180aaagttccta tctcgtcagt ggcttcattg aacgacctaa cgccagtggg cagattggtc 240actgtcaacc cttttgtttc agtggccacg gccaacgcta aggtcctgat tgaattggaa 300ccaccctttg gagactcata catagtggtg ggcagaggag aacaacagat taatcaccat 360tggcacaaga gacgcagtcg gaggtcactg acagtgcaga cacacggaga aagcactcta 420gcgaacaaga agggggcttg gatggacagc accaaggcca caaggtattt ggtaaaaaca 480gaatcatgga tcttgaggaa cccttgatag cggccgctat aagcgcgc 528
<210> 20
<211> 624
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae
<400> 20Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val1 5 10 15
Ala Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly20 25 30
Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val35 40 45
Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro50 55 60
Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile65 70 75 80
Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu85 90 95
Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu100 105 110
Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala115 120 125
Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp130 135 140
Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp145 150 155 160
Ala Leu Arg His Pro Arg Arg Asp Lys Arg Asp Lys Leu Gln Leu Lys165 170 175
Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu180 185 190
Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu195 ; 200 205
Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Thr Asp Leu Glu210 215 220
Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr vai Asn Pro Ile Val Thr225 . 230 235 240
Glu Lys Asp ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp245 250 255
Ser Tyr Ile Ile Val Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp260 265 270Phe Arg Arg Asp Lys Arg ser Val Ala Leu Ala Pro His Val Gly Leu275 280 285
Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp290 295 300
Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg His Pro Arg Arg305 310 315 320
Asp Lys Arg Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met ser Tyr Ala Met Cys325 330 335
Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val ser Glu Thr Gln His Gly340 345 350
Thr Ile Leu Ile Lys vai Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys355 360 365
Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg370 375 380
Leu Ile Thr Ala Asn Pro vai Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro vai Asn385 390 395 400
Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn lie Val Ile Gly Ile405 410 415
Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Arg Asp Lys Arg Ser420 425 430
vai Ala Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu435 440 445
Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu450 455 460
Thr Trp Ala Leu Arg His Pro Arg Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Arg465 470 475 480
Ile Lys Gly Met Sçr Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp485 490 495
Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys500 505 510
Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp515 520 525
Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu530 535 540Ala Glu Asn Thr Asn ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe545 550 555 560
Gly Asp ser Tyr lie Val Ile Gly Val Gly Asn ser Ala Leu Thr Leu565 570 575
His Trp Phe Arg Arg Asp Lys Arg ser Val Ala Leu Ala Pro His Val580 585 590
Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly595 600 605
Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg His Pro610 615 620
<210> 21<211> 609<212> PRT<213> Arti fi ci al
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae<400> 21
ι
Met Leu Leu ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val15 10 15
Ala Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met ser Tyr vai Met Cys Thr Gly20 25 30
Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val35 40 45
Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro50 55 60
Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile65 70 75 80
Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu85 90 95
Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu ser Tyr Ile lie vai Gly Ala Gly Glu100 105 110
Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Ser vai Ala Leu Ala Pro His Val115 120 125
Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser ser Glu Gly130 135 140Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg His Pro145 150 155 160
Arg Arg Asp Lys Arg Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met ser Tyr ser165 170 175
Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln180 185 190
His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly ser Pro195 200 205
Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Thr Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu210 215 220
Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro225 230 235 240
Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp ser Tyr Ile Ile vai245 250 255
Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Ser Val Ala Leu260 265 270
Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met275 280 285
Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys vai Glu Thr Trp Ala290 295 300
Leu Arg His Pro Arg Arg Asp Lys Arg Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly305 310 315 320
Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu vai325 330 335
Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys vai Glu Tyr Lys Gly340 345 350
Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly355 360 365
Lys Ala His Asn Gly Arg Leu lie Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys370 375 380
Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser385 390 395 400
Asn lie Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr405 410 415ser Val Ala Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr420 425 430
Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys vai435 440 445
Glu Thr Trp Ala Leu Arg His Pro Arg Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu450 455 460
Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys ser Gly Lys Phe ser Ile465 470 475 480
Asd Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys vai485 490 495
Lvs Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys vai Pro Ile Glu Ile Arg500 505 510
Asp vai Asn Lys Glu Lys Val vai Gly Arg Ile Ile ser ser Thr Pro515 520 525
Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser vai Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro530 535 540
Phe Gly Asp ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn ser Ala Leu Thr545 550 555 560
Leu His Trp Phe Arg Arg Asp Lys Arg ser Val Ala Leu Ala Pro His565 570 575
Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu580 585 590
Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg His595 600 605
Pro
<210> 22<211> 624<212> PRT<213> Artificial
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae<400> 22
Met Leu Leu ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala vai1 5 10 15
Ala Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met ser Tyr Val Met Cys Thr Gly20 25 30ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val35 40 45
Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro50 55 60
Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile65 70 75 80
Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu85 90 95
Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu100 105 110
Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Arg Arg Asp Lys Arg ser Val Ala115 120 125
Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp130 135 140
Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys vai Glu Thr Trp145 150 155 160
Ala Leu Arg His Pro Arg Arg Asp Lys Arg Asp Lys Leu Gln Leu Lys165 170 175
Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu180 185 190
Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg vai Gln Tyr Glu195 200 205
Gly Asp Gly ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Thr Asp Leu Glu210 215 220
Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr225 230 235 240
Glu Lys Asp ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp245 250 255
Ser Tyr Ile Ile Val Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp260 265 270
Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His vai Gly Met275 280 285
Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp290 295 300Lys His Val Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Arg Arg305 310 315 320
Asp Lys Arg Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys325 330 335
Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val ser Glu Thr Gln His Gly340 345 350
Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys355 360 365
Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg370 375 380
Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn385 390 395 400
Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile405 410 415
Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Arg Asp Lys Arg ser420 425 430
vai Ala Leu Ala Pro His Val Gly Met Gly Leu Asp Thr Arg Thr Gln435 440 445
Thr Trp Met Ser Ala Glu Gly Ala Trp Arg Gln Val Glu Lys Val Glu450 : 455 460
Thr Trp Ala Leu Arg His Pro Arg Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Arg465 470 475 480
Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp485 490 495
Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys500 505 510
Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp515 . 520 525
Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu530 535 540
Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe545 550 555 560
Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn ser Ala Leu Thr Leu565 570 575His Trp Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Thr Pro His Ser580 585 590
Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Trp Met ser Ser Glu Gly595 600 605
Ala Trp Lys His Ala Gln Arg vai Glu Ser Trp lie Leu Arg Asn Pro610 615 620
<210> 23
<211> 489
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae<400> 23
Met Leu Leu ser vai Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala vai15 10 15
Ala Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly20 25 30
ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr vai35 40 45
Leu vai Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro50 55 60
Phe ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly vai Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile65 70 75 80
Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu85 90 95
Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu100 105 HO
Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Arg Arg Asp Lys Arg Asp Lys Leu115 ' 120 125
Gln Leu Lys Gly Met ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile130 135 140
Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val He Arg Val145 150 155 160
Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Thr165 170 175Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu lie Thr Val Asn Pro180 185 190
Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro195 200 205
Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly vai Glu Pro Gly Gln Leu Lys210 215 220
Leu Asn Trp Phe Arg Arg Asp Lys Arg Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly225 230 235 240
Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val245 250 255
ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly260 265 270
Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly275 280 285
Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys290 295 . 300
Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu ser305 310 315 320
Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr325 330 335
Arg Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr340 345 350
Met cys ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln355 360 365
His Gly Thr Thr vai vai Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro370 375 380
Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys vai vai385 390 395 400
Gly Arg Ile Ile Ser ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn ser Val405 410 415
Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile vai Ile420 425 430
Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Arg Asp Lys435 440 445Arg ser vai Ala Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg450 455 460
Thr Glu Thr Trp Met Ser ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys465 470 475 480
Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg His Pro485
<210> 24<211> 474<212> PRT<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae<400> 24
Met Leu Leu ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala vai1 5 10 15
Ala Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly20 25 30
Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val35 40 45
Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro50 ' 55 60
Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile65 70 75 80
Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu85 90 95
Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu100 105 110
Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met115 . 120 125
Ser Tyr ser Met cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala130 135 140
Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg vai Gln Tyr Glu Gly Asp145 150 155 160
Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Thr Asp Leu Glu Lys Arg165 170 175
His vai Leu Gly Arg Leu Ile Thr vai Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys180 185 190Asp ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp ser Tyr195 200 205
Ile Ile vai Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Asp210 .215 220
Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe225 230 235 240
Val Leu Lys Lys Glu Val ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile245 250 255
Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe ser260 265 270
Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala275 280 285
Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu290 295 300
Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn lie Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala305 310 315 320
Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr325 330 335
Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr340 345 350
Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala355 360 365
Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val370 375 380
Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser385 390 395 400
Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val405 410 415
Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Arg Asp420 425 430
Lys Arg Ser Val Ala Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr435 440 445
Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln450 455 460Lys Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg His Pro
465 470
<210> 25
<211> 1890
<212> DNA
<213> Arti fici al
<220>
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae
<400> 25
cgtacgatgc tcctttccgt cccgttgcta ttaggactac tcgggttggc tgtcgccgat 60aagctgactc tgaagggaat gtcatacgtt atgtgcacag ggagcttcaa gttggagaag 120gaggtggcag agacccagca cggaacagtc ttggtgcagg tcaagtacga gggcacggac 180gctccttgta agatcccatt ctcaacccag gatgagaagg gcgtgaccca gaatggacgg 240ctgatcacgg ctaatcccat cgtgactgat aaggagaagc cagtcaacat cgagacagag 300ccacccttcg gtgagtctta cataatagtc ggggccggag agaaggctct caagctgagt 360tggttcaggc gggataagcg aagcgtcgca cttgccccac acgttggcct cggactcgag 420acaagaacag agacctggat gagcagcgag ggagcctgga agcagattca gaaggttgag 480acctgggctc tccggcaccc tcgccgtgat aagagagaca agctgcagct taaggggatg 540agttattcca tgtgcacagg caagttcaag attgtcaagg agatagcaga gactcagcac 600ggaaccatag tgatcagagt tcagtacgag ggagacggat ccccatgcaa gattccgttt 660gagattaccg acctggagaa gcgccacgtg ctggggagac tcattactgt gaacccaatc 720gtgactgaga aggattctcc cgtcaatatc gaggctgagc caccattcgg agattcttat 780ataatcgttg gtgtagagcc tggccagttg aagttgaatt ggtttaggcg ggataagagg 840agcgtggctc tcgctccaca tgttggcctg ggcctggaga cccgaacaga gacgtggatg 900agctccgaag gtgcctggaa gcagattcag aaggttgaga cctgggccct gcgacaccct 960agacgggata agcgcgataa gctgaagctt aagggtatgt cctacgcaat gtgcctgaac 1020acgttcgtgc tgaagaagga ggtttcagag acccagcacg ggacaattct cattaaggtg 1080gagtacaagg gcgaggacgc gccctgcaag atcccgttca gtactgaaga tggacagggc 1140aaggctcaca atgggcgact cattactgct aatccagtgg tgaccaagaa ggaagagcca 1200gtgaatatag aggcagagcc accatttgga gagagcaaca tcgtgatagg tatcggcgat 1260aaggcactga agatcaactg gtatcgccgc gacaagcgat ccgtggcatt ggcgcctcat 1320gtgggcctgg gtctagagac ccgcacagag acgtggatga gtagcgaagg cgcgtggaag 1380cagatccaga aggtcgagac ttgggcactg cggcaccctc gacgtgacaa gcgagagaag 1440ctccgaatca agggaatgag ttacacaatg tgcagcggca agttctcaat tgataaggag 1500atggccgaga cccagcacgg cacaaccgtg gtcaaggtca agtacgaagg tgcgggcgct 1560ccttgcaagg tcccaatcga gattagggat gtgaacaagg agaaggtcgt gggaagaatc 1620attagttcca cgcctcttgc tgagaacact aatagtgtca ccaatatcga gctagagcca 1680cccttcggag attcttacat tgtcattgga gttggcaatt ccgctcttac tctgcattgg 1740tttaggagag ataagagaag cgtggccctg gcaccacacg tgggattagg gctggagaca 1800cgaaccgaga cctggatgag cagcgaagga gcctggaagc agattcagaa ggtcgagact 1860tgggccctca gacacccttg atgagcgcgc 1890
<210> 26
<211> 1842
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de fiisão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae
<400> 26
cgtacgatgc tgttgagcgt gccattattg ctggggctgc tgggtctggc tgtggccgac 60aagcttaccc tgaagggtat gagctacgtg atgtgcactg gttcgttcaa gctagagaag 120gaggtggcag agacccagca tggaactgtg ttagtacaag ttaagtatga ggggaccgac 180gcaccctgta agattccaft ctctacccaa gacgagaagg gcgtcacgca gaatggtcgc 240ttgattacgg ctaatccaat agtgacggac aaggagaagc cagtgaatat cgagacagaa 300cctccatttg gagaatccta cataatagtc ggggccggcg agaaggccct gaagttgtcc 360tggttcagcg tggccctggc tccacacgtg ggcctgggcc tggagacccg aactgagact 420tggatgtcgt ccgagggcgc ctggaagcag atccagaagg tagagacttg ggccctgcgc 480catcctagga gagataagag ggacaagttg cagctcaagg gcatgtccta ctccatgtgt 540acaggtaagt tcaagattgt gaaggagatt gctgagaccc agcacggcac catcgtaata 600cgggtgcagt acgagggcga tggcagtcca tgtaagatac ctttcgagat cactgacctt 660gagaagcgcc acgtgcttgg gcggctcatt accgtcaatc caatcgtgac tgagaaggat 720agtccggtga atattgagg^ tgagccgccg tttggggata gttatataat cgttggcgtg 780gagcccggac aactcaagtt gaattggttc tctgtggcct tggcaccaca cgtggggctg 840ggcctggaga cacggaccga gacttggatg tcaagtgaag gagcctggaa gcagattcag 900aaggtggaga cttgggctct tcggcaccct agacgtgata agcgcgacaa gctgaagctc 960aagggaatgt cttacgccát gtgtctgaat actttcgtcc tgaagaagga ggtgtccgag 1020actcagcatg ggactatcct gatcaaggtg gagtacaagg gtgaagacgc accatgtaag 1080ataccattca gcacagagga cggtcagggc aaggctcata acgggcgcct tataactgcc 1140aatccggttg tgaccaagaa ggaggagccc gtgaacatcg aggcagagcc accattcggc 1200gagtccaaca tcgtgatagg aatcggtgat aaggccctca agattaattg gtattcagtg 1260gccctggccc ctcacgtcgg actgggactc gagaccagga cagagacatg gatgtcttct 1320gagggtgcat ggaagcagat acagaaggtt gagacctggg ccctcaggca cccacgtagg 1380gacaagcggg agaagttgag gattaagggg atgtcgtaca ccatgtgcag cggcaagttc 1440tccattgaca aggagatggc agagacgcag cacggaacaa cggtcgttaa ggtcaagtac 1500gaaggagcgg gcgccccatg caaggtccca atcgagatta gggacgtgaa caaggagaag 1560gttgtaggac ggattattag tagcacccca ctggcggaga atacgaatag tgtcacgaat 1620atcgaactgg aaccaccttt cggcgatagc tacatcgtga ttggtgttgg caattccgca 1680cttacactgc actggtttcg gagagacaag cgaagcgtgg ccctggcccc tcacgtggga 1740cttggcctgg agacccgcac agagacttgg atgtcctctg aaggagcatg gaagcagatt 1800cagaaggtgg agacttgggc attacgccac ccatgagcgc gc 1842
<210> 27<211> 1890<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae<400> 27
cgtacgatgc tgctatctgt gccactgctc ctgggactgc tggggctggc cgtggctgac 60
aagttgacgc ttaaggggat gtcctacgta atgtgcacag gatcattcaa gctagagaag 120
gaagttgcag agacgcagca cggcaccgtg ctggttcagg tgaagtacga gggcactgat 180
gcaccctgca agatcccatt cagtactcag gacgagaagg gagtcacgca gaatgggagg 240
ctcatcacgg ccaacccaat tgttaccgac aaggagaagc ccgttaatat agagactgaa 300
ccgcccttcg gggagtcata cattattgtg ggcgcagggg agaaggctct gaagctttcc 360
tggttccgta gggataagcg cagcgtggcg ctagcccctc atgtgggtct cgggctggag 420
actcgcaccg agacatggat gtcatccgag ggtgcgtgga agcagatcca gaaggttgag 480
acatgggcac ttcgccaccc acggcgcgac aagcgtgaca agcttcagct gaaggggatg 540
tcttatagca tgtgcacagg caagttcaag atcgtcaagg agatagcaga gacacagcat 600
ggcacaatag tcatacgggt gcaatatgag ggagatggct ctccgtgtaa gatacctttc 660
gagatcaccg atctggagaa gcggcacgtc ctcgggagac taattacggt gaacccaatt 720
gtgacagaga aggatagccc agttaatatt gaggccgaac cacccttcgg agacagctac 780
attatcgtag gagtcgagcc agggcagctg aagctgaact ggttccgcag ggagaagcgt 840
tccgtcgctc ttgttccaca tgtgggaatg ggcctggaga cccgcaccga gacatggatg 900
agcagcgagg gtgcctggaa gcacgtacag agaattgaga cttggatctt aaggcatcct 960
cggcgggata agcgcgacaa gttgaagctg aagggaatgt cttacgcaat gtgtttgaac 1020
actttcgtcc tgaagaagga ggtgtcagag acccagcacg gaactatact tattaaggtt 1080
gagtacaagg gagaagacgc tccttgcaag atcccattct caactgaaga tgggcagggc 1140
aaggcacaca acggaaggct catcacagct aacccagtgg ttaccaagaa ggaggagccc 1200
gtgaacatcg aagccgagcc gcccttcgga gagagcaaca tagtgatcgg tattggggat 1260aaggctctga agatcaattg gtatcgccgg gacaagagaa gtgtggccct
gtcggcatgg gcttggacac acggacacag acatggatgt ccgctgaagg
caggtggaga aggtcgagac ctgggcgctg cgccacccgc gtcgagacaa
ttaagaatca agggtatgtc ctacacgatg tgttccggta agttctccat
atggctgaga cccagcacgg cactacggtg gtcaaggtga agtatgaggg
ccttgcaagg tgccgatcga gatccgcgac gtcaacaagg agaaggtggt
atttccagta ccccattagc tgagaatact aatagcgtga ctaatattga
cccttcggag actcttacat; cgttatcggg gtgggcaact cagctcttac
ttccgcaggg agaagagatc agtggcccta acccctcact caggcatggg
cgggccgaga cctggatgag cagcgagggt gcctggaagc acgcccagcg
tggattctta ggaatccatg atgagcgcgc
<210> 28<211> 1482<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae<400> 28
cgtacgatgc tgttatctgt acctctcctg ctcggcctcc ttggactggc agttgcagat 60aagcttacac tcaagggaat gtcctatgtg atgtgtaccg ggtccttcaa gttggagaag 120gaggtagctg agacgcagca tggcacagtg ctggtgcagg ttaagtatga aggaactgat 180gctccgtgta agatcccgtt cagtactcag gatgagaagg gtgtgaccca gaatggccgc 240ttaattacag ccaaccctat cgtaactgac aaggagaagc ctgtgaacat cgagactgaa 300ccacccttcg gtgagagtta tataatagtt ggcgccggag agaaggccct caagcttagc 360tggtttcggc gcgacaagcg agataagctc caacttaagg gaatgtcata ctcaatgtgc 420acaggtaagt tcaagatagt gaaggagata gccgagaccc agcatggcac catcgtgatc 480agagtccaat atgaaggaga cgggtctcct tgtaagatcc cattcgagat aacagacttg 540gagaagaggc acgtgctggg acgtctgata acagttaatc ccatagttac cgagaaggat 600agccctgtta acattgaggc tgaacctccc ttcggagatt cctacattat tgtcggcgtg 660gagccaggtc agctgaagct taactggttc agacgggaca agcgcgacaa gctgaagttg 720aagggcatgt cctatgcaat gtgtctcaat actttcgttc tcaagaagga agtgagcgag 780acacagcatg gcaccatatt aattaaggtt gagtacaagg gtgaggatgc tccttgcaag 840attcctttca gcaccgagga tggacagggc aaggcccaca atggtcggct gatcaccgcc 900aaccctgtgg taaccaagaa ggaagagccc gtcaacatag aagccgagcc gccgtttggc 960gagtccaata tagtaatcgg catcggagat aaggccttga agattaattg gtacaggcgg 1020gataagcgcg agaagttacg gattaagggt atgtcttaca ctatgtgtag cggtaagttt 1080
ggccccacat 1320
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agtggaatcg 18601890agcatcgaca aggagatggc agagacccag catggcacta ccgtggtcaa ggtgaagtac 1140gaaggagctg gagcaccatg taaggtccct atcgagatcc gcgacgtgaa caaggagaag 1200gtggtgggaa gaatcatctc ttccacacct ctggcagaga acacgaatag cgtgactaat 1260atcgaacttg agcctccttt cggcgattcc tacatcgtta ttggcgtggg caactccgcc 1320ctgacactgc attggtttag acgtgacaag cgtagcgtgg cccttgcacc acacgtgggc 1380ctaggcctgg agacgcgtac agagacatgg atgagcagtg aaggagcctg gaagcagatt 1440cagaaggtcg agacctgggc tctcagacat ccttgagcgc gc 1482
<210> 29
<211> 1440
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de fusão que compreende domínio(s) de linhagens de Flaviviridae
<400> 29
cgtacgatgc tcctaagcgt tccactgctt ctgggactgc tgggtttggc cgttgccgac 60aagctcacgc tcaaggggat gagctacgtc atgtgcacag gctcattcaa gttggagaag 120gaagtcgccg agacgcagca cggaacagta ctcgtgcagg tcaagtatga gggcaccgac 180gctccatgca agatcccgtt ctccacacag gacgagaagg gcgttactca gaacggaaga 240ttaattactg ccaatcctat agtaacagac aaggagaagc ctgtgaatat tgagactgag 300cctcccttcg gtgaatccta catcattgta ggggctggcg agaaggcttt gaagctctcc 360tggtttgata agctgcagct caagggaatg tcgtattcaa tgtgcactgg gaagttcaag 420attgtgaagg agattgcaga gactcaacac ggcaccattg tgataagggt ccagtacgag 480ggtgatgggt caccctgcaa gattcccttt gagatcacag accttgagaa gaggcacgta 540cttgggcgat taattaccgt gaatcctatt gtgactgaga aggatagtcc cgtgaacatt 600gaagctgagc ctcctttcgg agatagctac attatcgtgg gagtcgagcc tggccagttg 660aagctcaact ggtttgataa gctgaagctc aagggcatgt cctacgctat gtgcttgaat 720acatttgtgc tgaagaagga ggtgagtgag acccaacacg gaaccatcct gatcaaggtg 780gagtacaagg gtgaagatgc accttgcaag atccctttct ccactgaaga cgggcagggc 840aaggcccata atgggagact cataacagct aatccagtgg tcaccaagaa ggaagaacca 900gtcaacatcg aggcggagcc accatttggg gagagtaaca tcgtgatcgg tattggcgat 960aaggccctga agattaactg gtatgagaag ttgagaatta aggggatgag ctataccatg 1020tgctcaggta agttcagcat cgataaggag atggccgaga cacagcacgg gaccacagtt 1080gtgaaggtga agtacgaggg cgctggggcc ccatgcaagg tgcctatcga gattcgcgac 1140gtgaacaagg agaaggtcgt ggggcgaatc atctcatcca cccctctcgc agagaacacg 1200aactctgtga ccaatattga gctggaacca cctttcggag actcatatat cgtcataggc 1260gtcggcaatt cagctttgac attgcactgg ttcagacggg acaagcggtc cgttgccctg 1320gctccacacg tcggcctggg ccttgagact aggacggaga cctggatgtc ctccgagggc 138Cgcctggaagc agatccagaa ggtggagacc tgggccctgc gccacccctg ataggcgcgc 144C
<210> 30<211> 40<212> PRT
<213> Flavi virus sp.<400> 30
Ser Val Ala Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr1 5 10 15
Glu Thr Trp Met ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val20 25 30
Glu Thr Trp Ala Leu Arg His Pro35 40
<210> 31<211> 40<212> PRT
<213> Flavivirus sp.<400> 31
Ser vai Ala Leu Ala Pro His Val Gly Met Gly Leu Asp Thr Arg Thr15 10 15
Gln Thr Trp Met Ser Ala Glu Gly Ala Trp Arg Gln Val Glu Lys Val20 25 30
Glu Thr Trp Ala Leu Arg His Pro35 40
<210> 32<211> 40<212> PRT
<213> Flavivirus sp.<400> 32
Ser Val Ala Leu Thr Pro His Ser Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Ala15 10 15
Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Val20 25 30
Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro35 40
<210> 33
<211> 40
<212> PRT
<213> Flavivirus sp.
<400> 33ser Val Ala Leu vai Pro His vai Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr15 10 15
Glu Thr Trp Met ser ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile
20 25 30
Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro35 40

Claims (31)

1. POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO, caracterizado pelo fato de quecompreende um peptídeo de subdomínio da proteína E de Flaviviridae ligado a umpeptídeo do subdomínio da proteína de membrana M de Flaviviridae.
2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o peptídeo de subdomínio da proteína Econsiste no ectodomínio Ill que compreende uma seqüência de aminoácidostal como definida em uma das seqüências indicadas a seguir:- aminoácidos 19 a 120 da SEQ ID NO : 1;- aminoácidos 19 a 119 da SEQ ID NO : 3;- aminoácidos 21 a 123 da SEQ ID NO : 6;- aminoácidos 21 a 121 da SEQ ID NO : 12; e- aminoácidos 21 a 123 da SEQ ID NO : 14.
3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o peptídeo de subdomínio da proteína Econsiste em um dímero do ectodomínio Ill dos vírus da Dengue 1, 2, 3 ou 4que compreende uma seqüência de aminoácidos tal como definida em umadas seguintes seqüências:- aminoácidos 21 a 262 da SEQ ID NO : 8; e- aminoácidos 21 a 262 da SEQ ID NO : 10.
4. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o peptídeo de subdomínio da proteína Econsiste em um tetrâmèro do ectodomínio Ill dos vírus da Dengue 1, 2, 3 ou 4que compreende uma seqüência que varia do aminoácido 21 a 494 da SEQ IDNO: 16 ou que varia do aminoácido 18 a 429 da SEQ ID NO: 24.
5. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações 1a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de subdomínio da proteína Mconsiste no ectodomínio 1-40 que compreende uma seqüência de aminoácidosque varia da posição 123 a 170 na SEQ ID NO: 3.
6. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações 1a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de subdomínio da proteína Mconsiste na seqüência apoptoM que compreende uma seqüência deaminoácidos que varia da posição 154 a 170 na SEQ ID NO: 3 ou que varia daposição 122 a 132 da SEQ ID NO: 12.
7. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações 1a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segmento de ligaçãoque liga o peptídeo de subdomínio da proteína E ao peptídeo de subdomínioda proteína M.
8. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o segmento de ligação é um pentapeptídeo quetem por seqüência: RRDKR ou RREKR.
9. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações 1a 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência deaminoácidos tal como definida em uma das seguintes seqüências:- aminoácidos 19 a 172 da SEQ ID NO : 3;- aminoácidos 21 a 168 da SEQ ID NO : 6;- aminoácidos 21 a 132 da SEQ ID NO : 12;- aminoácidos 18 a 624 da SEQ ID NO : 20;- aminoácidos 18 a 609 da SEQ ID NO : 21- aminoácidos 18 a 624 da SEQ ID NO : 22;- aminoácidos 18 a 489 da SEQ ID NO : 23; e- aminoácidos 21 a 474 da SEQ ID NO : 24.
10. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações 1a 9, caracterizado pelo fato de que o Flaviviridae é escolhido no grupoconstituído pelos vírus do Nilo Ocidental, da Dengue, da encefalite japonesa eda febre amarela.
11. POLINUCLEOTÍDEO, isolado ou purificado, caracterizadopelo fato de que codifica para um polipeptídeo quimérico conforme descrito emuma das reivindicações 1 a 10.
12. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência nucleotídica talcomo definida em uma das seqüências indicadas a seguir:- nucleotídeos 7 a 492 da SEQ ID NO : 4;- SEQ ID NO : 5;- nucleotídeos 7 a 504 da SEQ ID NO : 7;- nucleotídeos 7 a 504 da SEQ ID NO : 13; e- SEQ ID NOS : 25 a 29.
13. VETOR VIRAL recombinante do sarampo, caracterizadopelo fato de que em seu genoma é inserido um polinucleotídeo conformedescrito em uma reivindicação 11 ou 12.
14. VETOR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que é um vetor viral vivo do sarampo cepa Schwarz.
15. VETOR, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que é escolhido no grupo de vetores virais constituídos poraqueles que foram depositados na CNCM sob os números I-3440, I-3442, I--3452, I-3453, I-3454, I-3455, 1-3619, I-3620, 1-3621, I-3622 e I-3623.
16. USO DE UM VETOR VIRAL, conforme descrito em umadas reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de ser para a preparaçãode uma composição imunogênica destinada à prevenção ou ao tratamento deuma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível.
17. USO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o Flaviviridae é selecionado no grupo constituído pelo vírus dadengue, o vírus da febre amarela, o vírus da encefalite japonesa e o vírus dafebre do Nilo Ocidental.
18. ANTICORPOS monoclonais ou policlonais purificados,caracterizados pelo fato de que reconhecem especificamente pelo menos opolinucleotídeo conforme descrito na reivindicação 11 e/ou o polipeptídeoquimérico conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 10.
19. VETOR de clonagem ou de expressão, caracterizado pelofato de que compreende um polinucleotídeo conforme descrito nareivindicação 11.
20. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA destinada à prevençãoe/ou ao tratamento de uma infecção por Flaviviridae em uma espécie sensível,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguinteselementos:- um polipeptídeo quimérico conforme descrito em uma dasreivindicações 1 a 10;- um polinucleotídeo conforme descrito na reivindicação 11;- um vetor viral recombinante conforme descrito na reivindicação 13;- um anticorpo conforme descrito na reivindicação 18; e- um vetor de clonagem e/ou de expressão conforme descrito nareivindicação 19.
21. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamenteaceitável.
22. MÉTODO DE PREVENÇÃO E/OU DE TRATAMENTO DEUMA INFECÇÃO, por Flaviviridae em uma espécie sensível, caracterizadopelo fato de que compreende a administração de uma quantidadefarmaceuticamente eficaz de pelo menos um dos seguintes elementos:- um polipeptídeo quimérico conforme descrito em uma dasreivindicações 1 a 10;- um polinucleotídeo conforme descrito na reivindicação 11;- um vetor viral recombinante conforme descrito na reivindicação 13;- um anticorpo conforme descrito na reivindicação 18; e- um vetor de clonagem e/ou de expressão conforme descrito nareivindicação 19.
23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de imunização dereforço que compreende a administração adicional de um polipeptídeoquimérico conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 10 em presençade um adjuvante.
24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o Flaviviridae é selecionado no grupoconstituído pelo vírus da dengue, o vírus da febre amarela, o vírus daencefalite japonesa e o vírus da febre do Nilo Ocidental.
25. USO DE UM POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO, conformedescrito em uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser napreparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção porFlaviviridae.
26. USO DE UM POLINUCLEOTÍDEO, conforme descrito nareivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser na preparação de ummedicamento para o tratamento de uma infecção por Flaviviridae.
27. USO DE UM VETOR VIRAL RECOMBINANTE, conformedescrito na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ser na preparação deum medicamento para o tratamento de uma infecção por Flaviviridae.
28. USO DE UM ANTICORPO, conforme descrito nareivindicação 18, carácterizado pelo fato de ser na preparação de ummedicamento para o tratamento de uma infecção por Flaviviridae.
29. USO DE UM VETOR DE CLONAGEM E/OU DEEXPRESSÃO, conforme descrito na reivindicação 19, caracterizado pelo fatode ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecçãopor Flavivirídae.
30. USO, de acordo com uma das reivindicações 25 a 29,caracterizado pelo fato de que compreende ainda o uso de um polipeptídeoquimérico conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 10 em presençade um adjuvante.
31. USO, de acordo uma das reivindicações 25 a 29,caracterizado pelo fato de que o Flavivirídae é selecionado no grupoconstituído pelo vírus da dengue, o vírus da febre amarela, o vírus daencefalite japonesa e o vírus da febre do Nilo Ocidental.
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