ES2326703T3 - Vacuna para el virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UNA PREPARACION PURIFICADA QUE CONTIENE, POR EJEMPLO, UN ACIDO POLINUCLEICO QUE CODIFICA AL MENOS UN POLIPEPTIDO SELECCIONADO DEL GRUPO CONSISTENTE EN PROTEINAS CODIFICADAS POR UNO O MAS MARCOS ABIERTOS DE LECTURA (ORFS) DE UNA CEPA IOWA DEL VIRUS DEL SINDROME RESPIRATORIO Y REPRODUCTOR PORCINO (PRRSV), REGIONES ANTIGENICAS DE DICHAS PROTEINAS QUE TIENEN AL MENOS 5 AMINOACIDOS DE LONGITUD Y QUE PROTEGEN DE FORMA EFECTIVA UN HUESPED PORCINO CONTRA UN RETO SUBSIGUIENTE CON UN AISLADO DE PRRSV, Y COMBINACIONES DE LAS MISMAS EN LAS QUE LOS AMINOACIDOS NO ESENCIALES PARA LA ANTIGENICIDAD PUEDEN SER SUSTITUIDOS DE FORMA CONSERVADORA. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A UN POLIPEPTIDO CODIFICADO POR DICHO ACIDO POLINUCLEICO; A UNA VACUNA QUE COMPRENDE UNA CANTIDAD EFECTIVA DE DICHO ACIDO POLINUCLEICO O PROTEINA; ANTICUERPOS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A DICHO ACIDO POLINUCLEICO O PROTEINA; METODOS PARA PRODUCIRLOS; Y METODOS PARA PROTEGER UN CERDO CONTRA EL PRRSV, TRATAR UN CERDO INFECTADO POR PRRSV Y DETECTAR PRRSV UTILIZANDOLOS.
Description
Vacuna para el virus del síndrome reproductivo y
respiratorio porcino.
La presente invención se refiere a ácidos
polinucleicos aislados a partir del virus del síndrome reproductivo
y respiratorio porcino (PRRSV), a una proteína y/o un polipéptido
codificado por los ácidos polinucleicos, a una vacuna que protege a
los cerdos del PRRSV basada en la proteína o en los ácidos
polinucleicos, a métodos para fabricar las proteínas, polipéptidos
y ácidos polinucleicos, a un anticuerpo contra los polipéptidos, al
uso del anticuerpo en la preparación de un medicamento para tratar a
un cerdo con PRRS, a un método para producir la vacuna y a un
método para detectar el PRRSV.
El síndrome reproductivo y respiratorio porcino
(PRRS), una enfermedad nueva y grave en el ganado porcino, se
presentó por primera vez en los Estados Unidos en 1987 y se
reconoció rápidamente en muchos países de Europa occidental
(revisado por Goyal, J. Vet. Diagn. Invest., 1993, 5:
656-664; y en las Solicitudes de Patente de Estados
Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435). La enfermedad
se caracteriza por fallo reproductivo en cerdas de vientre y cerdas
primerizas, neumonía en cerdos jóvenes en crecimiento y un aumento
en la mortalidad antes del destete (Wensvoort et al., Vet.
Q., 13: 121-130, 1991; Christianson et al.,
1992, Am. J. Vet. Res. 53: 485-488, Solicitudes de
Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y
08/301.405).
El agente causante del PRRS, el virus del
síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), se identificó
por primera vez en Europa y después en los Estados Unidos (Collins
et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:
117-126). La cepa europea de PRRSV, que se conoce
como virus Lelystad (LV), se ha clonado y secuenciado (Meulenberg
et al., 1993, Virology, 192: 62-72 y J. Gen.
Virol., 74: 1697-1701; Conzelmann et al.,
1993, Virology, 193: 329-339).
El PRRSV se clasificó provisionalmente en la
nueva familia de virus propuesta Arteriviridae, que incluye
el virus de la arteritis equina (EAV), el virus de elevación de la
lactato deshidrogenasa (LDV) y el virus de la fiebre hemorrágica
del simio (SHFV) (Plagemann y Moennig, 1992, Adv. Virus. Res., 41:
99-192; Godeny et al., 1993, Virology, 194:
585-596; Solicitudes de Patente de Estados Unidos
con los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435). Este grupo de virus
de ARN con una sola cadena positiva comparte muchas características,
tales como la organización del genoma, la estrategia de
replicación, la morfología y el tropismo de macrófagos (Meulenberg
et al., 1993; Solicitudes de Patente de Estados Unidos con
los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435). También son propiedades
histopatológicas características de los arterivirus infecciones
subclínicas y una viremia persistente con la producción concurrente
de anticuerpos.
Se han notificado variaciones antigénicas,
genéticas y patogénicas entre los aislados de PRRVS (Wensvoort
et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4:
134-138; Mardassi et al., 1994, J. Gen.
Virol., 75: 681-685; Solicitudes de Patente de
Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435). Además,
los PRRSV estadounidenses y europeos representan dos genotipos
distintos (Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los Nº de
Serie 08/131.625 y 08/301.435). También existe variabilidad
antigénica entre diferentes aislados norteamericanos (Wensvoort
et al., 1992). Se han demostrado notables diferencias en la
patogenicidad no sólo entre los aislados estadounidenses y
europeos, sino también entre diferentes aislados estadounidenses
(Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie
08/131.625 y 08/301.435).
La organización genómica de los arterivirus se
parece a la de los coronavirus y torovirus ya que su replicación
implica la formación de una serie anidada
3'-coterminal de ARNm subgenómicos (ARNm sg) (Chen
et al., 1993, J. Gen. Virol, 74: 643-660;
Den Boon et al., 1990, J. Virol., 65:
2910-2920; De Vries et al., 1990, Nucleic
Acids Res., 18: 3241-3247; Kuo et al., 1991,
J. Virol., 65: 5118-5123; Kuo et al., 1992;
Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie
08/131.625 y 08/301.435). También se han determinado secuencias
parciales de varios aislados norteamericanos (Solicitudes de
Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y
08/301.435; Mardassi et al., 1994, J. Gen. Virol., 75:
681-685).
El genoma del PRRSV está poliadenilado, tiene
una longitud de aproximadamente 15 kb y contiene ocho fases de
lectura abierta (ORF; Meulenberg et al., 1993; Solicitudes de
Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y
08/301.435). Las ORF 1a y 1b probablemente codifican la ARN
polimerasa viral (Meulenberg et al., 1993). Se descubrió que
las ORF 5, 6 y 7 codificaban una proteína de membrana glicosilada
(E), una proteína de membrana no glicosilada (M) y una proteína de
la nucleocápsida (N), respectivamente (Meulenberg et al.,
1995). Las ORF 2 a 4 parecen tener las características de proteínas
asociadas a la membrana (Meulenberg et al., 1993; Solicitud
de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/301.435). Sin
embargo, los productos de traducción de las ORF 2 a 4 no se
detectaron en lisados de células infectadas con virus ni en viriones
(Meulenberg et al., 1995).
La glicoproteína principal de la envuelta de EAV
codificada por la ORF 5 puede ser la proteína de unión al virus, y
se dirigen anticuerpos monoclonales (MAb) neutralizadores contra
esta proteína (de Vries, J. Virol. 1992; 66:
6294-6303; Faaberg, J. Virol. 1995; 69:
613-617). La glicoproteína primaria de la envuelta
de LDV, un miembro estrechamente relacionado de PRRSV, también se
codifica por la ORF 5, y se descubrió que varios MAb
neutralizadores diferentes inmunoprecipitaban específicamente la
proteína de la ORF 5 (Cafruny et al., Vir. Res.,
1986; 5: 357-375). Por lo tanto, es probable que la
proteína principal de la envuelta de PRRSV codificada por la ORF 5
pueda inducir anticuerpos neutralizadores contra PRRSV.
Se ha propuesto que la variación antigénica de
los virus es el resultado de la selección directa de variantes por
las respuestas inmunes del hospedador (revisado por Domingo et
al., J. Gen. Virol. 1993, 74: 2039-2045).
De esta manera, estas regiones hipervariables probablemente se
deben a la presión de selección inmune del hospedador y pueden
explicar la diversidad antigénica observada entre los aislados de
PRRSV.
Las proteínas M y N de los aislados de PRRSV de
Estados Unidos, incluyendo ISU 3927, están muy conservadas
(Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/301.435). Las proteínas M y N son integrales para conservar la
estructura de los viriones de PRRSV, y la proteína N puede estar
bajo limitaciones funcionales estrictas. Por lo tanto, es poco
probable que (a) las proteínas M y N estén sometidas a una presión
de selección de anticuerpos importante o que (b) las ORF 6 y 7, que
probablemente codifican las proteínas M y N, sean responsables o
estén correlacionadas con la virulencia viral. Sin embargo, de
manera interesante, se observó una mayor variación de secuencia de
la proteína M de LDV entre aislados de LDV con diferente
neurovirulencia (Kuo et al., 1992, Vir. Res. 23:
55-72).
Se predice que las ORF 1a y 1b se traducen en
una sola proteína (polimerasa viral) por desplazamiento de fase.
Las ORF 2 a 6 pueden codificar las proteínas asociadas con la
membrana viral.
Además del ARN genómico, muchos virus animales
producen una o más especies de ARNm sg para permitir la expresión
de genes virales de una forma regulada. En células infectadas con
PRRSV, se sintetizan siete especies de ARNm con especificidad de
virus que representan una serie anidada
3'-coterminal (ARNm 1 a 7, en orden decreciente de
tamaño). El ARNm 1 representa el ARNm genómico. Cada uno de los ARNm
sg contiene una secuencia líder procedente del extremo 5' del
genoma viral.
Los números de los ARNm sg difieren entre los
arterivirus e incluso entre diferentes aislados del mismo virus. Se
detectó una serie anidada de 6 ARNm sg en células infectadas con EAV
y en células infectadas con PRRSV europeo. Sin embargo, en células
infectadas con el LDV está presente una serie anidada de seis
(LDV-C) o siete (LDV-P) ARNm sg. El
ARNm sg adicional 1-1 de LDV-P
contiene el extremo 3' de la ORF 1b y puede traducirse en una
proteína que representa el extremo C de la polimerasa viral. El
análisis de la secuencia de los ARNm sg de LDV y EAV indica que se
conserva el motivo de unión líder-ARNm.
Recientemente, también se demostró que las secuencias de unión
líder-ARNm del LV europeo también contenían un
motivo común, UCAACC, o una secuencia muy similar.
Se ha demostrado que los ARNm sg se empaquetan
en los viriones en algunos coronavirus, tales como el coronavirus
bovino (BCV) y el virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV).
Sin embargo, sólo se detectaron pequeñas cantidades de los ARNm sg
en viriones purificados del virus de la hepatitis de ratón (MHV),
otro coronavirus. Los ARNm sg de LDV, un miembro muy relacionado de
PRRVS, tampoco se empaquetan en los viriones, y sólo se detectó el
ARN genómico en viriones de LDV purificado.
Los ARNm sg de LDV y EAV se han caracterizado
con detalle. Sin embargo, la información en relación con los ARNm
sg de las cepas de PRRSV, especialmente el PRRSV estadounidense,
está muy limitada. De esta manera, se siente la necesidad de una
caracterización molecular más minuciosa de los ARNm sg del PRRSV
estadounidense.
La señal de empaquetamiento del MHV se localiza
en el extremo 3' de la ORF 1b, de esta manera sólo se empaqueta el
ARN genómico de MHV. Los ARNm sg de BCV y TGEV, sin embargo, se
encuentran en viriones purificados. La señal de empaquetamiento de
BCV y TGEV no se ha determinado. El ARNm sg del alfavirus Aura se
empaqueta eficazmente en los viriones, supuestamente porque la
señal de empaquetamiento está presente en el ARNm sg. El ARNm sg
26S del virus sindbis no se empaqueta en viriones porque la señal de
empaquetamiento está localizada en el segmento del genoma (no
presente en el ARNm sg). Los ARNm sg de LDV, un miembro muy
relacionado de PRSSV, tampoco se empaquetan en los viriones.
En la generación de los ARNm sg están implicados
muchos mecanismos. Se ha propuesto que los coronavirus utilizan un
único mecanismo de transcripción cebado por ARN líder en el que un
ARN líder se transcribe desde el extremo 3' del ARN de plantilla de
cadena negativa de tamaño de genoma, se disocia de la plantilla y
después se vuelve unir al ARN de plantilla en regiones intergénicas
cadena abajo para cebar la transcripción de los ARNm sg. El modelo
predice que el líder 5' contiene una secuencia específica en su
extremo 3' que se repite adicionalmente cadena abajo en el genoma,
que precede a cada una de las ORF 2 a 7. El líder se une al cuerpo
de cada uno de los ARNm sg a través del segmento de unión
líder-ARNm.
El PRRSV es una causa importante de neumonía en
cerdos lactantes y destetados. El PRRSV produce pérdidas económicas
significativas por neumonía en cerdos lactantes (el grado exacto no
se conoce completamente). La enfermedad reproductiva fue el
resultado clínico predominante de las infecciones por PRRSV durante
los últimos años, debido a la precoz prevalencia de cepas de PRRSV
con una virulencia relativamente baja. La enfermedad respiratoria
ahora se ha convertido en el problema principal asociado con el
PRRSV, debido a la prevalencia creciente de cepas de PRRSV de
virulencia relativamente elevada. Se siente la necesidad de una
vacuna para proteger contra la enfermedad producida por las
diversas cepas de PRRSV.
Sorprendentemente, el mercado para las vacunas
animales en los Estados Unidos y en todo el mundo es mayor que el
mercado para las vacunas humanas. De esta manera, existe un
incentivo económico para desarrollar nuevas vacunas veterinarias,
además de los beneficios sustanciales para la salud pública
derivados de la protección de los animales de granja de la
enfermedad.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención es proporcionar un ácido polinucleico aislado a partir
del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV),
aislado VR 2430, que codifica una proteína de PRRSV.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una proteína de PRRSV, aislada a partir de PRRSV o
codificada por un ácido polinucleico de PRRSV.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una vacuna basada en ácido polinucleico o en proteína
que proteja a un cerdo frente al PRRS.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para detectar el PRRSV.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un anticuerpo que se une inmunológicamente a una
proteína de PRRSV o a una región antigénica de dicha proteína.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar el uso del anticuerpo en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un cerdo con PRRS.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un kit de diagnóstico para ensayar o detectar un
PRRSV.
Estos y otros objetos, que se harán evidentes
durante la siguiente descripción de las realizaciones preferidas,
se han proporcionado por una preparación purificada de acuerdo con
la reivindicación 1 mostrada más adelante.
La presente invención también proporciona un
polipéptido purificado de acuerdo con la reivindicación 8, vacunas
de acuerdo con las reivindicaciones 9 y 10, un anticuerpo de acuerdo
con la reivindicación 11, el uso de un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 13, un kit de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 14, un método para producir un polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 15 y un vector de expresión que
contiene el ácido polinucleico bajo el control operativo de un
promotor de acuerdo con la reivindicación 16.
A continuación se proporciona una descripción a
modo de ejemplo únicamente haciendo referencia a los dibujos
adjuntos de realizaciones de la presente invención. En los
dibujos:
la Figura 1 muestra una comparación de
secuencias de nucleótidos de las ORF 2 a 5 de los aislados
estadounidenses VR 2474 (ISU 79), VR 2475 (ISU 1894), VR 2431 (ISU
3927), VR 2429 (ISU 22) y VR 2430 (ISU 55) con otros aislados de
PRRSV conocidos;
las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D respectivamente
muestran el alineamiento de las secuencias de aminoácidos deducidas
de las ORF 2, ORF 3, ORF 4 y ORF 5 de los aislados estadounidenses
VR 2474 (ISU 79), VR 2475 (ISU 1894), VR 2429 (ISU 22), VR 2430
(ISU 55) y VR 2431 (ISU 3927) con otros aislados de PRRSV
conocidos;
la Figura 3 muestra un árbol filogenético basado
en las secuencias de nucleótidos de las ORF 2 a 7 de siete aislados
de PRRSV estadounidenses con diferente virulencia;
la Figura 4 muestra un análisis de transferencia
de Northern de ARN aislados a partir de células CRL 11171
infectadas con VR 2431 (ISU 3927) (calle 1) y aislados a partir de
viriones purificados de VR 2431 (ISU 3927) (calle 2);
la Figura 5 muestra un análisis de transferencia
de Northern de ARN intracelulares totales aislados a partir de
células CRL 11171 infectadas con VR 2429 (ISU 22) (calle 1), VR 2430
(ISU 55) (calle 2), VR 2474 (ISU 79) (calle 3), VR 2475 (ISU 1894)
(calle 4) y VR 2431 (ISU 3927) (calle 5), respectivamente;
las Figuras 6A y 6B muestran una hibridación de
Northern de ARN totales aislados a partir de células CRL 11171
infectadas con VR 2474 (ISU 79) a diferentes multiplicidades de
infección (m.d.i.) (A) y ARN poliadenilado procedente de células
infectadas con aislados de PRRSV VR 2430 (ISU 55) y VR 2474 (ISU 79)
(B);
las Figuras 7A y 7B muestran un análisis de
transferencia de Northern de ARNm intracelulares totales aislados a
partir de células CRL 11171 infectadas con VR 2475 (ISU 1894) (A) y
VR 2474 (ISU 79) (B);
las Figuras 8A y 8B muestran la amplificación
por RT-PCR de las secuencias
5'-terminales de los ARNm sg y 4 de ISU 1894 (calle
1) y los ARNm sg 3, 4 y 4-1 de VR 2474 (ISU 79)
(calle 2) (A) donde la calle L es un marcador de 1 kb; y las
secuencias de unión líder-ARNm de los ARNm sg 3 y 4
de VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894) y del ARNm sg
4-1 de VR 2474 (ISU 79) (B), donde las
localizaciones de las secuencias de unión
líder-ARNm en los genomas con respecto al codón de
iniciación de cada ORF se indicaron por números negativos (-) de
nucleótidos cadena arriba de las ORF; y
la Figura 9 muestra el alineamiento de
secuencias de las ORF 2 a 7 de VR 2475 (ISU 1894) y VR 2474 (ISU
79), donde el codón de iniciación de cada ORF está indicado por
+>, el codón de terminación de cada ORF está indicado por
asteriscos (*), las secuencias de unión líder-ARNm
determinadas o previstas están subrayadas y las localizaciones de
las secuencias de unión líder-ARNm con respecto al
codón de iniciación de cada ORF están indicadas por números
negativos (-) de nucleótidos cadena arriba de cada ORF.
En la presente solicitud, se han determinado las
secuencias de nucleótidos de las ORF 2 a 5 de un aislado de baja
virulencia y cuatro aislados distintos de PRSSV de la cepa Iowa con
una virulencia "moderada" y elevada. Basándose en
comparaciones de las ORF 2 a 7 de diversos aislados de PRRSV, el
aislado estadounidense menos virulento conocido VR 2431 (ISU 3927)
tiene variaciones de secuencia relativamente altas en las ORF 2 a 4,
en comparación con las variaciones en otros aislados
estadounidenses. Además, basándose en el análisis de las secuencias
de las ORF, existen al menos tres genotipos minoritarios dentro del
genotipo principal del PRRSV estadounidense.
El análisis de la secuencia de la proteína de la
ORF 5 de diferentes aislados de PRRSV revela tres regiones
hipervariables que contenían sustituciones de aminoácidos no
conservadas. Estas regiones son hidrófilas y también son
antigénicas según se predice por análisis informático.
En la presente invención, un "virus del
síndrome reproductivo y respiratorio porcino" o "PRRSV" se
refiere a un virus que produce las enfermedades PRRS, PEARS, SIRS,
MSD y/o PIP (el término "PIP" ahora parece estar en desuso),
incluyendo la cepa Iowa de PRRSV, otras cepas de PRRSV encontradas
en los Estados Unidos (por ejemplo, VR 2332), cepas de PRRSV
encontradas en Canadá (por ejemplo, IAF-exp91),
cepas de PRRSV encontradas en Europa (por ejemplo, virus Lelystad,
PRRSV-10) y variantes muy relacionadas de estos
virus que pueden haber surgido y que surgirán en el futuro.
La "cepa Iowa" de PRRSV incluye (a)
aislados de PRRSV depositados en la Colección Americana de Cultivo
Tipo por los presentes inventores y/o descritos en esta solicitud
y/o en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los Nº de
Serie 08/131.625 y 08/301.435, (b) virus de PRRS que producen más de
seis ARNm sg cuando se cultivan o se someten a pases en células CRL
11171, (c) PRRSV que producen al menos 40% de lesiones pulmonares
macroscópicas o consolidación pulmonar en lechones privados de
calostro, nacidos por cesárea, de 5 semanas de edad, 10 días
después de la infección, (d) un aislado de PRRSV que tiene un genoma
que codifica una proteína que tiene la homología mínima con una ORF
de PRRSV descrita en la Tabla 2 presentada más adelante, y/o (d)
cualquier aislado de PRRSV que tenga las características de
identificación de dicho virus.
La vacuna de la presente invención es eficaz si
protege a un cerdo frente a una infección por el virus del síndrome
reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Una vacuna protege a un
cerdo frente a una infección por un PRRSV si, después de la
administración de la vacuna a uno o más cerdos no afectados, una
exposición posterior a un aislado de virus biológicamente puro (por
ejemplo, VR 2385, VR 2386 u otro aislado de virus descrito más
adelante) produce menos gravedad de cualquier cambio macroscópico o
histopatológico (por ejemplo, lesiones en el pulmón) y/o de los
síntomas de la enfermedad, en comparación con los cambios o síntomas
producidos típicamente por el aislado en cerdos similares que no
están protegidos (es decir, con respecto a un control apropiado).
Más particularmente, la eficacia de la vacuna de la presente
invención puede demostrarse administrando la vacuna a uno o más
cerdos adecuados que la necesitan, y después de un periodo de tiempo
apropiado (por ejemplo, 1-4 semanas), exponiendo a
los cerdos a una muestra grande (10^{3-7}
TCID_{50}) de un aislado de PRRSV biológicamente puro.
Posteriormente, se extrae una muestra de sangre del cerdo expuesto
después de aproximadamente una semana, y se intenta aislar el virus
de la muestra de sangre (por ejemplo, véase el procedimiento de
aislamiento de virus ejemplificado en el Experimento VIII mostrado
más adelante). El aislamiento del virus es una indicación de que es
posible que la vacuna no sea eficaz y la incapacidad de aislar el
virus es una indicación de que la vacuna puede ser eficaz.
De esta manera, la eficacia de la vacuna de la
presente invención puede evaluarse cuantitativamente (es decir, una
reducción en el porcentaje de tejido pulmonar consolidado en
comparación con un grupo de control apropiado) o cualitativamente
(por ejemplo, el aislamiento de PRRSV de la sangre, la detección del
antígeno de PRRSV en una muestra de tejido de pulmón, amígdala o
ganglio linfático por medio de un método de ensayo de
inmunoperoxidasa [descrito más adelante], etc.). Los síntomas de la
enfermedad reproductiva y respiratoria porcina pueden evaluarse
cuantitativamente (por ejemplo, temperatura/fiebre),
semicuantitativamente (por ejemplo, gravedad de la insuficiencia
respiratoria [explicado con detalle más adelante] o cualitativamente
(por ejemplo, la presencia o ausencia de uno o más síntomas o una
reducción en la gravedad de uno o más síntomas, tal como cianosis,
neumonía, lesiones cardiacas y/o cerebrales, etc.).
Un cerdo no afectado es un cerdo que no se ha
expuesto a un agente infeccioso de la enfermedad reproductiva y
respiratoria porcina, o que se ha expuesto a un agente infeccioso de
la enfermedad reproductiva y respiratoria porcina pero no muestra
síntomas de la enfermedad. Un cerdo afectado es uno que muestra
síntomas de PRRS o a partir del cual se puede aislar PRRSV.
Los signos clínicos o síntomas de PRRS pueden
incluir letargo, insuficiencia respiratoria, palpitaciones
("thumping") (espiración forzada), fiebre, pelo áspero,
estornudos, tos, edema ocular y ocasionalmente conjuntivitis. Las
lesiones pueden incluir lesiones pulmonares macroscópicas y/o
microscópicas, miocarditis, linfadenitis, encefalitis y rinitis.
Además, se han encontrado formas menos virulentas y no virulentas de
PRRSV y de la cepa Iowa, que pueden producir una subserie de los
síntomas anteriores o no producir ningún síntoma. Sin embargo, las
formas menos virulentas y no virulentas de PRRSV pueden usarse de
acuerdo con la presente invención para proporcionar protección
frente a las enfermedades reproductivas y respiratorias
porcinas.
La frase "ácido polinucleico" se refiere a
ARN o ADN, así como al ARNm y ADNc correspondiente o complementario
al ARN o ADN aislado a partir del virus o el agente infeccioso. Una
"ORF" se refiere a una fase de lectura abierta, un segmento
que codifica un polipéptido, aislada a partir de un genoma viral,
incluyendo el genoma de PRRSV. En el ácido polinucleico de la
presente invención puede estar incluida una ORF en parte (como un
fragmento) o en su totalidad, y puede solapar con la secuencia 5' o
3' de una ORF adyacente (véase, por ejemplo, la Fig. 1 y el
Experimento 1 mostrado más adelante). Un "polinucleótido" es
equivalente a un ácido polinucleico, pero puede definir una
molécula o grupo de moléculas distinto (por ejemplo, como una
subserie de un grupo de ácidos polinucleicos).
En los Experimentos descritos más adelante se
determinaron el aislamiento, clonación y secuenciación de las ORF 2
a 5 de (a) un aislado de PRRSV estadounidense de baja virulencia y
(b) dos aislados de PRRSV estadounidense distintos de virulencia
variable. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos
deducida de estos tres aislados estadounidenses se compararon con
las secuencias correspondientes de otros aislados de PRRSV
conocidos (véase, por ejemplo, la Solicitud de Estados Unidos con el
Nº de serie 08/301.435). Los resultados indican que existen
variaciones genéticas considerables no sólo entre el PRRSV
estadounidense y el PRRSV europeo, sino también entre los aislados
estadounidenses.
La identidad de las secuencias de aminoácidos
entre los siete aislados de PRRSV estadounidenses estudiados fue de
91-99% en la ORF 2, 86-98% en la ORF
3, 92-99% en la ORF 4 y 88-97% en la
ORF 5. El aislado estadounidense menos virulento conocido VR 2431
(ISU 3927) tiene mayores variaciones de secuencia en las ORF 2 a 4
que en las ORF 5 a 7, en comparación con otros aislados
estadounidenses. En la glicoproteína de la envuelta principal
codificada por la ORF 5 se han identificado tres regiones
hipervariables que podrían ser antigénicas.
La comparación por parejas de las secuencias de
las ORF 2 a 7 y el análisis de árbol filogenético implicaba la
existencia de al menos tres grupos de variantes de PRRSV (o
genotipos minoritarios) dentro del genotipo principal de PRRSV
estadounidense. El aislado estadounidense menos virulento conocido
forma una rama distinta de otros aislados estadounidenses con
diferente virulencia. Los resultados de ese estudio tienen
implicaciones para la taxonomía del PRRSV y el desarrollo de
vacunas.
En un experimento adicional, se caracterizaron
los ARNm sg en células infectadas con PRRSV. Los datos demostraron
que en células infectadas con diferentes aislados de PRRSV se forma
una serie anidada 3'-coterminal de seis o siete
ARNm sg. Sin embargo, a diferencia de algunos de los coronavirus y
alfavirus, los ARNm sg de PRRSV no se empaquetan en el virión, y
sólo se detectaba el ARNm genómico de PRRSV en viriones purificados.
También se observaron variaciones en los números de ARNm sg entre
diferentes aislados de PRRSV con diferente virulencia. Un análisis
adicional de la secuencia de las ORF 2 a 7 de dos aislados
estadounidenses y su comparación con el LV europeo revelan la
naturaleza heterogénea de las secuencias de unión
líder-ARNm de PRRSV.
Como se demuestra en el Experimento 2 mostrado
más adelante, se forma una serie anidada
3'-coterminal de seis o más ARNm sg en células
infectadas con diferentes aislados de PRRSV. La presencia de una
serie anidada de ARNm sg también indica que el PRRSV
estadounidense, a diferencia del aislado europeo conocido como virus
Lelystad (LV), pertenece a la familia Arteriviridae
propuesta recientemente que incluye LDV, EAV y SHFV. El análisis de
transferencia de Northern con sondas con especificidad de ORF indica
que la estructura del ARNm sg de PRRSV es policistrónico, y cada
uno de los ARNm sg con la excepción del ARNm sg 7 contiene múltiples
ORF. Por lo tanto, la secuencia de cada ARNm sg está contenida
dentro de la parte 3' del siguiente ARNm sg más grande, y no todos
los extremos 5' de los ARNm sg solapan con las secuencias de los
ARNm sg más pequeños.
Sin embargo, no hay una correlación aparente
entre los números de ARNm sg y la neumovirulencia viral. Se
descubrió que una especie adicional, ARNm sg 4-1,
contenía una ORF pequeña (ORF 4-1) con una capacidad
de codificación de 45 aminoácidos en su extremo 5'.
En el Experimento 2 mostrado más adelante se
demuestra que los ARNm sg de PRRSV no se empaquetan en los viriones.
El hecho de que los ARNm sg se empaqueten en viriones puede
depender de si los ARNm sg contienen una señal de empaquetamiento.
Como los ARNm sg de PRRSV no se empaquetan en viriones,
probablemente la señal de encapsidación de PRRSV se localiza en la
región de la ORF 1 que es única para el genoma viral, pero que no
está presente en los ARNm sg.
En el Experimento 2 mostrado más adelante se
determinan los segmentos de unión (las secuencias de unión
líder-ARNm) de los ARNm sg 3 y 4 de dos aislados
estadounidenses de PRRSV, VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894). El
conocimiento de las identidades de las secuencias de unión
líder-ARNm proporciona medios para producir
eficazmente (a) virus quiméricos a usar como un clon infeccioso y/o
como una vacuna, y (b) vectores para insertar o "lanzar" uno o
más genes en un hospedador infectable adecuado. Se conocen métodos
para diseñar y producir estos virus quiméricos, clones infecciosos
y vectores (véase, por ejemplo, Sambrook et al, "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York).
La secuencia de unión líder-ARNm
de los ARNm sg 3 y 4 de los dos aislados son diferentes
(TTGACC para el ARNm 4-1 de ISU 79,
GTAACC para el ARNm 3 y TTCACC para el ARNm 4). La
mayoría de las diferencias de nucleótidos en las uniones están
presentes en los 3 primeros nucleótidos. Los últimos 3 nucleótidos
son invariables, lo que sugiere que la unión de la secuencia líder
a los cuerpos de los ARNm sg se produce dentro del extremo 5' de la
secuencia de unión líder-ARNm. Se han notificado
observaciones similares para LV, EAV y LDV.
La adquisición del ARNm sg 4-1
adicional en el aislado VR 2474 (ISU 49) se debe a una sola
sustitución de nucleótidos que genera una nueva secuencia de unión
líder-ARNm. Esta sustitución se produce en el último
nucleótido del segmento de unión, lo que sugiere que el último
nucleótido del motivo de unión líder-ARNm es crítico
para la unión del líder y para el inicio de la transcripción.
Aunque la homología de secuencia entre el líder
y las regiones intergénicas de los coronavirus condujo a la
hipótesis de que la formación de pares de bases podría ser esencial
en la transcripción cebada por el líder, no se ha documentado
ninguna prueba experimental de la necesidad de formación de pares de
bases en la transcripción de los ARNm sg. Por ejemplo, aún no se
conoce la secuencia en el extremo 3' del líder de los coronavirus y
arterivirus que está implicada en el proceso de fusión.
Varias líneas de evidencia confirman el
mecanismo de transcripción cebado por líder para los coronavirus,
pero la presencia de ARNm sg de cadena negativa e intermedios
replicativos sg (IR sg) en células infectadas con coronavirus
sugiere que el mecanismo implicado en la síntesis del ARNm sg es más
complejo que la simple formación de pares de bases de la secuencia
líder con una secuencia de unión. Sin embargo, no se han detectado
ARNm sg de cadena negativa en arterivirus, excepto en LDV, y sólo se
han detectado IR sg en células infectadas con EAV. Por lo tanto, la
síntesis de ARNm sg en arterivirus, y particularmente en PRRSV,
puede ser menos complicada que en coronavirus.
El análisis de la secuencia de las ORF 2 a 7 de
dos aislados de PRRSV estadounidenses y la comparación de la
secuencia con LV revela la heterogeneidad de las secuencias de unión
líder-ARNm. La presencia de los motivos de unión
líder-ARNm en las posiciones que no corresponden a
un ARNm sg suscita la cuestión de si el tramo corto de sólo seis
nucleótidos que está conservado en la secuencia líder y de unión en
los genomas de PRRSV y otros arterivirus es suficiente para
conseguir una unión eficaz del líder a estos sitios de unión
específica cadena arriba de las ORF. Esta discrepancia aparente,
sin embargo, puede explicarse por las dos siguientes
posibilidades.
En primer lugar, es de esperar que otros
elementos estructurales, tales como estructuras secundarias o las
secuencias que rodean al segmento de unión
líder-ARNm, estén implicados en la fusión (unión)
del líder a los sitios específicos. Se ha demostrado que, en MHV,
la secuencia que flanquea la secuencia consenso (secuencia de unión
líder-ARNm) de UCUAAAC afecta a la eficacia de la
transcripción de ARN de DI sg, y que la secuencia consenso era
necesaria pero no suficiente en y por sí misma por la síntesis del
ARNm de DI.
En segundo lugar, la distancia entre dos
regiones de unión líder-ARNm puede afectar a la
transcripción de los ARNm sg. Se ha demostrado que la región de
unión líder-ARNm cadena abajo era supresora de la
síntesis de ARN de DI sg de MHV a partir de la región de unión
líder-ARNm cadena arriba. La supresión era
significativa cuando la separación de las dos secuencias de unión
líder-ARNm era menor de 35 nucleótidos. Sin embargo,
no se observaba una inhibición significativa de la síntesis de ARN
de DI sg más grande (a partir de la secuencia de unión
líder-ARNm cadena arriba) cuando las dos regiones de
unión líder-ARNm estaban separadas por más de 100
nucleó-
tidos.
tidos.
Los resultados experimentales presentados
previamente son coherentes con las observaciones notificadas en el
Experimento 2 presentado más adelante, donde se observa una especie
adicional de ARNm sg 4-1, además del ARNm sg 4, en
algunos de los aislados de PRRSV. Las secuencias de unión
líder-ARNm de los ARNm sg 4 y 4-1
en la cepa Iowa de PRRSV están separadas por aproximadamente 226
nucleótidos. Por lo tanto, la síntesis del ARNm sg
4-1 de mayor tamaño a partir de la secuencia de
unión líder-ARNm cadena arriba no se reprime por la
presencia de la secuencia de unión líder-ARNm 4
cadena abajo.
Por el contrario, se encontraron múltiples
posibles secuencias de unión líder-ARNm en
diferentes posiciones cadena arriba de las ORF 3, 5, 6 y 7, pero no
había ningún ARNm sg correspondiente a estos motivos de unión
líder-ARNm en el análisis de transferencia de
Northern. La mayoría de estas secuencias de unión
líder-ARNm están separadas por menos de 50
nucleótidos desde la región de unión líder-ARNm
cadena abajo, con la excepción de la ORF 7 (en la que las dos
posibles secuencias de unión líder-ARNm están
separadas por 114 nucleótidos). Sin embargo, el ARNm sg 7 en el
análisis de transferencia de Northern mostró una banda muy difusa.
Por lo tanto, la transcripción del ARNm sg 7 de mayor tamaño a
partir de la secuencia de unión líder-ARNm cadena
arriba puede no reprimirse de forma significativa por la secuencia
de unión cadena abajo, pero no se puede distinguir fácilmente del
ARNm sg 7 abundante por análisis de transferencia de Northern.
En la Solicitud de Patente de Estados Unidos con
el Nº de serie 08/301.435 se describen con detalle las ORF
2-7 del aislado del PRRSV purificado en placa
ISU-12 (depositado el 30 de octubre de 1992 en la
Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, con los números de
acceso VR 2385 [purificación en placa 3 veces] y VR 2386 [no
purificado en placa] y las ORF 6-7 de los aislados
de PRRSV ISU-22, ISU-55,
ISU-3927 (depositados el 29 de septiembre de 1993 en
la Colección Americana de Cultivos Tipo con los números de acceso
VR 2429, VR 2430 y VR 2431, respectivamente), ISU-79
e ISU-1894 (depositados el 31 de agosto de 1994 en
la Colección Americana de Cultivos Tipo con los números de acceso
VR 2474 y VR 2475, respectivamente). Sin embargo, las técnicas
usadas para aislar, clonar y secuenciar estos genes también pueden
aplicarse al aislamiento, clonación y secuenciación de los ácidos
polinucleicos genómicos de cualquier
PRRSV.
PRRSV.
\newpage
Por ejemplo, pueden diseñarse cebadores para
obtener cantidades relativamente grandes de ADN por la reacción en
cadena de la polimerasa (y si se desea, para obtener ARN por
transcripción y/o proteínas por traducción de acuerdo con métodos
in vivo o in vitro conocidos) basándose en la
información de secuencia cuando se ha determinado más de una
secuencia obtenida a partir de un genoma de PRRSV (por ejemplo, las
ORF 2-7 de VR 2385, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR
2474, VR 2475 (ISU 1894), VR 2332 y virus Lelystad). A partir de las
secuencias determinadas se selecciona una región con una longitud
de aproximadamente 15 a 50 nucleótidos que tenga una identidad de
al menos 80% y preferiblemente de al menos 90%. Como base para
preparar un cebador selectivo para una amplificación selectiva del
ácido polinucleico de una cepa o tipo de PRRSV con respecto a otro
(por ejemplo, para el diagnóstico diferencial de las cepas de PRRSV
norteamericanas y europeas) puede usarse una región en la que se
produce una deleción en una de las secuencias (por ejemplo, de al
menos 5 nucleótidos).
Una vez que el ácido polinucleico genómico se ha
amplificado y clonado en un hospedador adecuado por métodos
conocidos, los clones pueden seleccionarse con una sonda diseñada
basándose en la información de secuencia descrita en la presente
memoria. Por ejemplo, se selecciona una región de aproximadamente 50
a aproximadamente 500 nucleótidos de longitud basándose en un alto
grado de identidad (por ejemplo, de al menos 90%) entre dos o más
secuencias (por ejemplo, en las ORF 6-7 de las cepas
Iowa de PRRSV descritas en el Experimento III mostrado más
adelante) y se prepara un polinucleótido de longitud e identidad de
secuencia adecuada por métodos conocidos (tales como síntesis
automática o restricción de un fragmento adecuado a partir de un
ácido polinucleico que contiene la región seleccionada,
amplificación por PCR usando cebadores que hibridan específicamente
con el polinucleótido y aislamiento por electroforesis). El
polinucleótido puede marcarse, por ejemplo con ^{32}P (para la
identificación radiométrica) o con biotina (para detección por
fluorometría). La sonda después se hibrida con los ácidos
polinucleicos de los clones y se detecta de acuerdo con métodos
conocidos.
Los presentes inventores han descubierto que una
o más de las ORF 2-4 pueden estar relacionadas con
la virulencia de PRRSV. Por ejemplo, al menos un aislado de PRRSV
que muestra una virulencia relativamente baja también parece tener
una deleción en la ORF 4 (véanse, por ejemplo, los Experimentos
VIII-XI en la Solicitud de Patente de Estados
Unidos con el Nº de Serie 08/301.435). Además, el aislado menos
virulento conocido (VR 2431) muestra un grado relativamente alto de
varianza en la información tanto de las secuencias de nucleótidos
como de la secuencia de aminoácidos en las ORF 2-4,
en comparación con otros aislados de PRRSV estadounidenses.
En una realización, la presente invención se
refiere a un ácido polinucleico obtenido a partir de un aislado de
PRRSV que confiere protección inmunogénica directa o indirectamente
contra una exposición posterior a un PRRSV, pero en el que el ácido
polinucleico se ha delecionado o mutado en un grado que haría a un
PRRSV que contiene el ácido polinucleico menos virulento (es decir,
un fenotipo de "baja virulencia" (Iv); véase la explicación
correspondiente en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el
Nº de Serie 08/301.435) o sin virulencia (un denominado "mutante
de deleción"). Preferiblemente, una o más de las ORF
2-4 se delecionan o mutan en tal medida que un
virus de PRRS se vuelve no virulento. Sin embargo, en el ácido
polinucleico de la presente invención puede ser deseable conservar
regiones de una o más de las ORF 2-4 que (i)
codifiquen un fragmento peptídico antigénico y/o inmunoprotector y
que (ii) no confieran virulencia a un virus de PRRS que contiene el
ácido polinucleico.
La presente invención también incluye un PRRSV
per se en el que una o más de las ORF 2-4 se
han delecionado o mutado en tal medida que se vuelve poco virulento
o no virulento. Dicho virus es útil como una vacuna o como un
vector para transformar un hospedador adecuado (por ejemplo,
MA-104, PSP 36, CRL 11171, MARC-145
o células de macrófagos alveolares porcinos) con un gen heterólogo.
Los genes heterólogos preferidos que pueden expresarse usando el
mutante de deleción de la presente invención pueden incluir los que
codifican una proteína o un antígeno distinto del antígeno del
virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (por ejemplo,
proteínas y/o antígenos que contienen polipéptidos del virus de la
seudorrabia y/o del virus de la gripe porcina, una hormona de
crecimiento porcina, etc.) o un adyuvante basado en polipéptidos
(tal como los descritos en la Solicitud de Patente de Estados
Unidos con el Nº de Serie 08/301.435 para una composición de
vacuna).
En ciertas realizaciones también puede ser
deseable que el ácido polinucleico de la presente invención
contenga, por ejemplo, la región 3' terminal de una ORF de PRRSV
(por ejemplo, con una longitud de 200 a 700 nucleótidos), de la que
al menos parte puede solapar con la región 5' de la ORF
inmediatamente cadena abajo. De forma similar, cuando la región 3'
terminal de una ORF puede solapar con la región 5' terminal de ORF
cadena abajo inmediata, puede ser deseable conservar la región 5'
de la ORF que solapa con la ORF inmediatamente cadena
abajo.
abajo.
Los presentes Inventores también han descubierto
que la ORF 5 en el genoma de PRRSV parece estar relacionada con la
replicación del virus en células hospedadoras de mamífero capaces de
mantener un cultivo mientras están infectadas con PRRSV. Por
consiguiente, la presente invención también se refiere a ácidos
polinucleicos obtenidos a partir de un genoma de PRRSV en el que la
ORF 5 puede estar presente en múltiples copias (un denominado
"mutante de superproducción"). Por ejemplo, el ácido
polinucleico de la presente invención puede contener al menos dos y
más preferiblemente de 2 a 10 copias de la ORF 5 de un aislado de
PRRSV de fenotipo de alta replicación
(hr).
(hr).
De manera interesante, el aislado de PRRSV VR
2385 (ISU-12) tiene un número sorprendentemente
grande de posibles codones de iniciación (secuencias ATG/AUG) cerca
del extremo 5' de la ORF 5, posiblemente indicando sitios de inicio
alternos de este gen. De esta manera, pueden existir formas alternas
de la proteína codificada por la ORF 5 de un aislado de PRRSV,
particularmente cuando las ORF alternas codifican una proteína que
tiene un peso molecular similar al determinado experimentalmente
(por ejemplo, con una longitud de aproximadamente 150 a
aproximadamente 250 aminoácidos). La región codificante más probable
para la ORF 5 de VR 2385 (ISU-12) se indica en la
Figura 1.
Se pueden preparar mutantes de deleción y
superproducción de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, se
puede preparar un ácido polinucleico mutante que contiene un cambio
"silencioso" o degenerado en la secuencia de una región que
codifica un polipéptido. Por medio de la selección y obtención de
una mutación degenerada apropiada, se puede sustituir una secuencia
de ácido polinucleico reconocida por una enzima de restricción
conocida (véase, por ejemplo, el Experimento 2 mostrado más
adelante). De esta manera, si se realiza una mutación silenciosa,
degenerada en uno o dos de los extremos 3' de una ORF y el extremo
5' de una ORF cadena abajo, se puede insertar un ácido polinucleico
sintético (un denominado "casete") que puede contener un ácido
polinucleico que codifica una o múltiples copias de un producto
proteico de la ORF 5 hr de un PRRSV u otra proteína de la envuelta
viral y/o un fragmento antigénico de una proteína de PRRSV. El
"casete" puede ir precedido por un codón de iniciación
adecuado (ATG) y puede terminarse convenientemente con un codón de
terminación en el extremo 3' (TAA, TAG o TGA). Por supuesto, puede
insertarse una secuencia oligonucleotídica que no codifica un
polipéptido o, como alternativa, es posible no insertar ningún
casete. Al hacer esto, se puede proporcionar un denominado mutante
de
deleción.
deleción.
El presente polipéptido aislado y/o purificado
puede ser uno o más codificados por una "mutación de baja
virulencia" de una o más de las ORF 2, 3 y 4 de VR 2430
(ISU-55) (o un fragmento de baja virulencia del
mismo con una longitud de al menos 5 aminoácidos) donde una o más
de las posiciones 12-14 del polipéptido codificado
por la ORF 2 son RGV (donde "R", "G" y "V" son las
abreviaturas de una letra para los aminoácidos correspondientes),
las posiciones 44-46 son LPA, la posición 88 es A,
la posición 92 es R, la posición 141 es G, la posición es 183 es H,
la posición 218 es S, la posición 240 es S y las posiciones
252-256 son PSSSW, o cualquier combinación de las
mismas. Otras identidades de restos aminoacídicos que pueden
combinarse adicionalmente con una o más de las identidades de
posiciones de aminoácidos anteriores incluyen las de la posición 174
(I) y la posición
235 (M).
235 (M).
El polipéptido aislado y/o purificado de la
presente invención también puede ser uno codificado por una ORF 3
de VR 2430 (ISU-55) en el que una o más de las
identidades de aminoácidos especificadas puede seleccionarse entre
las de las posiciones 11 (L), 23 (V), 26-28 (TDA),
65-66 (QI), 70 (N), 79 (N), 93 (T),
100-102 (KEV), 134 (K), 140 (N),
223-227 (RQRIS), 234 (A) y 235 (M), o cualquier
combinación de las mismas, que pueden combinarse adicionalmente con
una o más de las posiciones 32 (F), 38 (M), 96 (P), 143 (L),
213-217 (FQTS), 231 (R) y 252 (A).
El polipéptido aislado y/o purificado de la
presente invención también puede ser uno codificado por la ORF 4 de
VR 2430 (ISU-55) en el que una o más de las
identidades de aminoácidos especificadas pueden seleccionarse entre
las de las posiciones 13 (E), 43 (N), 56 (G), 58-59
(TT), 134 (T), 139 (I) y cualquier combinación de las mismas, que
pueden combinarse adicionalmente con una o más de las posiciones
2-3 (AA), 51 (G) y 63 (P).
Preferiblemente el ácido nucleico de la presente
invención codifica al menos una región antigénica de una proteína
de la membrana (de la envuelta) de PRRSV. Más preferiblemente, el
ácido nucleido de la presente invención codifica una región
hipervariable de un producto proteico de la ORF 5 de PRRSV (véase la
descripción presentada más adelante) o (b) contiene al menos una
copia del gen de la ORF 5 de un aislado de fenotipo de alta
virulencia (hv) de PRRSV (véase la descripción de "fenotipo de
hv" en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de
Serie 08/301.435) y un fragmento, región o secuencia suficientemente
larga de al menos una de las ORF-2,
ORF-3, ORF-4, ORF-5
y/u ORF-6 del genoma de un aislado de PRRSV para
codificar una región antigénica de la proteína o proteínas
correspondientes y estimular de forma eficaz la protección contra
una exposición posterior, por ejemplo, a un aislado de PRRSV de
fenotipo de hv.
En el ácido polinucleico de la presente
invención puede estar contenida al menos una proteína de la envuelta
entera codificada por la ORF-2,
ORF-3 u ORF-5 de un PRRSV, y el
ácido polinucleico de la presente invención excluye o modifica una
parte suficientemente larga de una de las ORF 2-4
procedente de un PRRSV para proporcionar un PRRSV que la contenga
con baja virulencia o sin virulencia.
\newpage
Otra realización preferida de la presente
invención incluye un polinucleótido que codifica una secuencia de
aminoácidos de una región hipervariable de la ORF 5 de PRRSV. De
esta manera, estos polinucleótidos codifican una (o más) de las
siguientes secuencias de aminoácidos:
En esta realización, el polinucleótido puede
codificar secuencias de aminoácidos adicionales de una ORF 5 de
PRRSV (como se describe en la Figura 3 o en las Solicitudes de
Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 o
08/301.435), siempre que se incluyan una o más de las regiones
hipervariables en las posiciones 32-38,
57-66 y/o 120-128. (La presente
invención excluye específicamente las proteínas y polinucleótidos de
la ORF 5 de LV y VR 2332).
La presente invención también puede referirse a
una preparación purificada que puede comprender, consistir
esencialmente en o consistir en un ácido polinucleico, un vector de
expresión o un plásmido que tiene una secuencia de la fórmula
(V)
5'-
\varepsilon - \zeta - \iota - \kappa - \xi
-3'
donde \varepsilon, que está
presente opcionalmente, es una secuencia polinucleotídica 5'
terminal que proporciona un medio para expresar operativamente los
polinucleótidos \alpha, \beta, \gamma y \delta; \zeta es
un polinucleótido de la fórmula KTVACC, donde K es T, G o U, y V es
A, G o C; \iota es un polinucleótido que tiene como máximo
aproximadamente 130 (preferiblemente como máximo 100) nucleótidos
de longitud; \kappa es un polinucleótido que comprende uno o más
genes seleccionados entre el grupo consistente en un marcador o gen
indicador convencional, \alpha, \beta, \gamma y las
combinaciones de los mismos unidas operativamente, donde \alpha
codifica dicho al menos un polipéptido y \beta es al menos una
copia de una ORF 5 de una cepa Iowa de PRRSV o un fragmento
antigénico de la misma (por ejemplo, una o más regiones
hipervariables), preferiblemente una copia de longitud completa
procedente de un fenotipo de alta replicación (hr); y \gamma
codifica al menos un polipéptido o fragmento antigénico del mismo
codificado por un polinucleótido seleccionado entre el grupo
consistente en la ORF 6 y ORF 7 de una cepa Iowa de PRRSV y regiones
de las mismas que codifican el fragmento antigénico; y \xi, que
está presente opcionalmente, es una secuencia polinucleotídica 3'
terminal que no reprime la expresión operativa de los
polinucleótidos \alpha, \beta, \gamma y \delta, y que puede
estar unida operativamente a \varepsilon (por ejemplo, en un
plásmido), donde el ácido polinucleico no consiste en la secuencia
mostrada en la SEC ID Nº: 13 del documento WO
96/06619.
Los genes marcadores o indicadores adecuados,
incluyen, por ejemplo, los que proporcionan resistencia a un
antibiótico tal como neomicina, eritromicina o cloranfenicol; los
que codifican una enzima detectable conocida tal como la
\beta-lactamasa, DHFR, peroxidasa de rábano
picante,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa,
fosfatasa alcalina y enzimas descritas en la Patente de Estados
Unidos 4.190.496, col. 32, línea 33 hasta col. 38, línea 44
(incorporada en la presente memoria como referencia), etc.; y los
que codifican un anticuerpo conocido (por ejemplo, IgG de ratón,
IgG de conejo, IgG de rata, etc.) o una proteína antigénica conocida
tal como la Proteína A, Proteína C, albúmina de suero bovino (BSA),
hemocianina de lapa californiana (KLH), gammaglobulina bovina
(BGG), lactalbúmina, polilisina, poliglutamato, lectina, etc.
El polinucleótido preferiblemente es una
secuencia polinucleotídica con una homología de al menos 80% con
una secuencia polinucleotídica procedente de un genoma de PRRSV
localizado entre una secuencia de unión líder-ARNm
y el codón de iniciación de la ORF inmediatamente cadena abajo.
"Aproximadamente 130" nucleótidos de longitud se refiere a una
longitud del polinucleótido que no afecta adversamente a la
expresión operativa de \kappa. Por ejemplo, en ISU 79, puede
encontrarse una secuencia de unión líder-ARNm que no
reprime la expresión de la ORF 7 129 bases cadena arriba del codón
de iniciación de la ORF 7 (véase el Experimento 2 mostrado más
adelante). Pueden deducirse secuencias ilustrativas adecuadas para
el polinucleótido L a partir de la secuencia mostrada en las
Figs. 1 y 9.
El ácido polinucleico de la presente invención
también puede comprender, consistir esencialmente o consistir en
combinaciones de las secuencias anteriores, como una mezcla de
polinucleótidos o unidas covalentemente en una configuración de
cabeza a cola (con sentido-antisentido) o de cabeza
a cabeza. En la presente invención también se incluyen ácidos
polinucleicos complementarios a las secuencias anteriores y
combinaciones de los mismos (ácido polinucleico antisentido). De
esta manera, además de poseer copias múltiples o variantes de la
ORF 5, el ácido polinucleico de la presente invención también puede
contener copias múltiples o variantes de una o más de las ORF
1-7, incluyendo regiones antigénicas o
hipervariables de la ORF 5 de la cepa Iowa de PRRSV.
De forma similar a los métodos descritos
anteriormente y en los Experimentos descritos más adelante y en la
Solicitud de Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie
08/131.625 y 08/301.435, se puede preparar una biblioteca de clones
recombinantes (por ejemplo, usando E. coli como hospedador)
que contenga fragmentos de restricción preparados de forma adecuada
de un genoma de PRRSV (por ejemplo, insertados en un plásmido
apropiado expresable en el hospedador). Los clones después se
exploran con una sonda adecuada (por ejemplo, basada en una
secuencia conservada de las ORF 2-3; véase, por
ejemplo, la Figura 22 de la Solicitud de Patente de Estados Unidos
con el Nº de Serie 08/301.435). Después, los clones positivos pueden
seleccionarse y desarrollarse hasta un nivel apropiado. Los ácidos
polinucleicos después pueden aislarse a partir de los clones
positivos de acuerdo con métodos conocidos. Después, puede
diseñarse un cebador adecuado para la PCR y prepararse como se ha
descrito anteriormente para amplificar la región deseada del ácido
polinucleico. El ácido polinucleico amplificado después puede
aislarse y secuenciarse por métodos conocidos.
En el contexto de la presente solicitud,
"homología" se refiere al porcentaje de restos nucleotídicos o
aminoacídicos idénticos en las secuencias de dos o más virus,
alineadas de acuerdo con un método convencional para determinar la
homología (por ejemplo, los programas informáticos MACVECTOR o
GENEWORKS, alineados con el procedimiento descrito en el
Experimento III en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el
Nº de Serie 08/301.435).
Preferiblemente, el ácido polinucleico aislado
de la presente invención codifica una proteína, polipéptido o
fragmento antigénico del mismo que tiene una longitud de al menos 10
aminoácidos y en el que ciertos aminoácidos no homólogos que no son
esenciales para la antigenicidad pueden estar sustituidos de forma
conservativa. Un resto aminoacídico en una proteína, polipéptido o
fragmento antigénico del mismo está sustituido de forma
conservativa si se reemplaza por un miembro de su grupo de polaridad
como se define a continuación:
Aminoácidos Básicos:
- lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His)
Aminoácidos Ácidos:
- ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), asparagina (Asn), glutamina (Gln)
Aminoácidos hidrófilos, no iónicos:
- serina (Ser), treonina (Thr), cisteína (Cys), asparagina (Asn) y glutamina (Gln)
Aminoácidos que contienen azufre:
- cisteína (Cys), metionina (Met)
Aminoácidos hidrófobos aromáticos:
- fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), triptófano (Trp)
Aminoácidos no aromáticos,
hidrófobos:
- glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile) y prolina (Pro)
\vskip1.000000\baselineskip
Más particularmente, el ácido polinucleico de la
presente invención codifica una o más de las proteínas codificadas
por la segunda, tercera, cuarta o quinta fases de lectura abierta
(ORF 2-5) del aislado de PRRSV.
Las ORF 6 y 7 no son candidatos probables para
controlar los fenotipos de virulencia y replicación de PRRSV, ya
que las secuencias de nucleótidos de estos genes están muy
conservadas entre los aislados de alta virulencia (hv) y de baja
virulencia (lv) (véase el Experimento III de la Solicitud de Patente
de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/301.435). Sin embargo, la
ORF 5 en los aislados de PRRSV parece estar menos conservada entre
los aislados de alta replicación (hr) y de baja replicación (lr).
Por lo tanto, se cree que la presencia de una ORF 5 procedente de
un aislado de PRRSV hr en el ácido polinucleico de la presente
invención mejorará la producción y expresión de una vacuna
recombinante producida a partir del ácido polinucleico.
Además, la ORF 5 de PRRSV contiene tres regiones
hipervariables hidrófilas asociadas típicamente con la antigenicidad
en un polipéptido.
Se prefiere que el ácido polinucleico de la
presente invención, cuando se usa con fines inmunoprotectores (por
ejemplo, en la preparación de una vacuna) contenga al menos una
copia de la ORF 5 de VR 2430 (ISU-55) (es decir, un
aislado que se desarrolla hasta un título de
10^{6}-10^{7} TCID_{50} en, por ejemplo,
células CRL 11171; véanse también las descripciones de los
Experimentos VIII-XI de la Solicitud de Patente de
Estados Unidos con el Nº de Serie 08/301.435).
Por otra parte, el aislado de lv VR 2431 parece
ser un mutante de deleción, en relación a los aislados de hv
(véanse los Experimentos III y VIII-XI de la
Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/301.435). La deleción parece estar en la ORF 4, basándose en el
análisis de transferencia de Northern. Por consiguiente, cuando se
usa con fines inmunoprotectores, el ácido polinucleico de la
presente invención preferiblemente no contiene una región de ORF 4
de un aislado de hv responsable de alta virulencia; y, más
preferiblemente, excluye la región de la ORF 4 que no solapa con las
ORF 3 y 5 adyacentes.
También se sabe (al menos en el caso de PRRSV)
que ni la proteína de la nucleocápsida ni los anticuerpos contra la
misma confieren protección inmunológica contra PRRSV a los cerdos.
Por consiguiente, el ácido polinucleico de la presente invención,
cuando se usa con fines inmunoprotectores, puede contener una o más
copias de una o más regiones de las ORF 2, 3, 4, 5 y 6 de un
aislado de PRRSV que codifica una región antigénica de la proteína
de envuelta viral, pero que no produce los síntomas o cambios
histopatológicos asociados con PRRS cuando se administra a un
cerdo. Preferiblemente, esta región presenta reacción inmunológica
cruzada con anticuerpos contra la proteína de la envuelta de otros
aislados de PRRSV.
De forma similar, la proteína codificada por el
ácido polinucleico de la presente invención confiere protección
frente a PRRS a un cerdo al que se le ha administrado una
composición que comprende la proteína, y los anticuerpos contra
esta proteína presentan reacción inmunológica cruzada con las
proteínas de la envuelta de otros aislados de PRRSV.
Pueden usarse segmentos relativamente cortos de
ácido polinucleico (de aproximadamente 20 pb o de mayor longitud)
en el genoma de un virus para seleccionar o identificar muestras de
tejidos y/o fluidos biológicos a partir de animales infectados, y/o
identificar virus relacionados, por métodos descritos en este
documento y conocidos por los especialistas habituales en los
campos del diagnóstico veterinario y viral y la medicina
veterinaria.
Otra realización de la presente invención se
refiere a una o más proteínas o fragmentos antigénicos de las
mismas procedentes de VR 2430 (ISU-55).
Como se ha descrito anteriormente, un fragmento
antigénico de una proteína procedente de un virus de PRRS tiene una
longitud de al menos 5 aminoácidos, de una forma particularmente
preferible de al menos 10 aminoácidos, y proporciona o estimula una
respuesta inmunológicamente protectora en un cerdo al que se le ha
administrado una composición que contiene el fragmento
antigénico.
Los especialistas habituales en la técnica
conocen métodos para determinar la parte antigénica de una proteína
(véase la descripción anterior). Además, también se puede determinar
un fragmento antigénico esencial de una proteína demostrando
primero que la proteína de longitud completa es antigénica en un
animal hospedador (por ejemplo, un cerdo). Si la proteína aún es
antigénica en presencia de un anticuerpo que se une específicamente
a una región o secuencia particular de la proteína, entonces esa
región o secuencia puede no ser esencial para la inmunoprotección.
Por otra parte, si la proteína ya no es antigénica en presencia de
un anticuerpo que se une específicamente a una región o secuencia
particular de la proteína, entonces esa región o secuencia se
considera esencial para la antigenicidad.
Se han identificado tres regiones hipervariables
en la ORF 5 del PRRSV comparando las secuencias de aminoácidos del
producto de la ORF 5 de todos los aislados de PRRSV disponibles
(véase, por ejemplo, la Fig. 2D). Las variaciones de aminoácidos en
estas tres regiones son significativas y no se conservan
estructuralmente (Fig. 2D). Las tres regiones hipervariables son
hidrófilas y antigénicas. De esta manera, estas regiones
probablemente se expondrán a la membrana viral y de esta forma
estarán bajo presión de selección inmune del hospedador. Las
regiones hipervariables se consideran determinantes antigénicos en
la proteína de la envuelta de ORF 5.
La presente invención también se refiere a una
proteína o fragmento antigénico de la misma codificado por uno o
más de los ácidos polinucleicos definidos anteriormente. Las
proteínas y fragmentos antigénicos de la presente invención son
útiles para inmunizar cerdos contra PRRSV, en ensayos serológicos
para seleccionar cerdos para la exposición o infección por PRRSV
(particularmente la cepa Iowa de PRRSV), etc.
La proteína de la presente invención puede
seleccionarse entre el grupo consistente en las proteínas
codificadas por las ORF 2-5, ISU-55
(VR 2430); y regiones antigénicas de al menos una de estas proteínas
que tienen una longitud de 5 aminoácidos a menos de la longitud
completa de la proteína. Preferiblemente, la proteína de la
presente invención tiene una secuencia codificada por una ORF
seleccionada entre el grupo consistente en las ORF
2-5 de VR 2430 (véase, por ejemplo, la Fig.
2A-D); variantes de la misma que proporcionan
protección inmunológica eficaz a un cerdo al que se le ha
administrado y donde existen de 1 a 100 (preferiblemente de 1 a 50
y más preferiblemente de 1 a 25) deleciones en la secuencia de
aminoácidos; y fragmentos antigénicos de la misma con una longitud
de al menos y preferiblemente al menos 10 aminoácidos que
proporcionan protección inmunológica eficaz a un cerdo al que se le
ha administrado.
Más preferiblemente, la variante de proteína o
fragmento de proteína de la presente invención tiene una afinidad
de unión (o constante de asociación) de al menos 1% y
preferiblemente al menos 10% de la afinidad de unión de la proteína
natural de longitud completa correspondiente a un anticuerpo
monoclonal que se une específicamente a la proteína natural de
longitud completa (es decir, la proteína codificada por una ORF de
PRRSV).
La presente invención también se refiere a un
método para producir un polipéptido que comprende expresar el ácido
polinucleico de la presente invención en un sistema de expresión
operativo, y purificar el polipéptido expresado a partir del
sistema de expresión. Los sistemas de expresión adecuados incluyen
los usados convencionalmente para la expresión in vivo o
in vitro de proteínas y polipéptidos, tales como el sistema
de reticulocitos de conejo para la expresión in vitro, y
para la expresión in vivo, un PRRSV quimérico o modificado
(usado para infectar una línea de células hospedadoras infectable,
tal como MA-104, CRL 11171, PSP-36,
PSP-36-SAH,
MARC-145 y macrófagos alveolares porcinos), o un
vector de expresión convencional que contiene el ácido nucleico de
la presente invención, bajo el control operativo de un promotor
conocido (por ejemplo, el promotor de timidina quinasa, SV40, etc.)
para uso en sistemas de expresión convencionales (por ejemplo,
plásmidos bacterianos y bacterias hospedadoras correspondientes,
sistemas de expresión de levadura y levaduras hospedadoras
correspondientes, etc.). El polipéptido o proteína expresada
después se purifica o se aísla a partir del sistema de expresión
por métodos de purificación y/o aislamiento convencionales.
Otras características de la invención serán
evidentes en el transcurso de las siguientes descripciones de
realizaciones ilustrativas, que se proporcionan para ilustrar la
invención y no pretenden ser limitantes de la misma.
Experimento
I
Se han determinado y analizado las secuencias de
las ORF 2 a 5 de un aislado de PRRSV estadounidense de baja
virulencia, un aislado de PRRSV estadounidense de virulencia
"moderada" y un aislado de PRRSV estadounidense de alta
virulencia. Las comparaciones con secuencias conocidas de otros
aislados de PRRSV demuestran que existen considerables variaciones
de secuencia tanto a nivel de los nucleótidos como a nivel de los
aminoácidos en las ORF 2 a 5 de siete aislados estadounidenses con
diferente virulencia. Sin embargo, las ORF 6 y 7 de estos siete
aislados estadounidenses están muy conservadas (Solicitud de Patente
de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/301.435). También se
encontraron variaciones de secuencia extensivas en las ORF 2 a 7
entre el LV europeo y los aislados estadounidenses. El aislado de
PRRSV estadounidense menos virulento conocido VR 2431
(ISU-3927) presentó la mayor variación de secuencia,
en comparación con otros aislados estadounidenses.
También se analizó la relación filogenética de
los aislados estadounidenses. El análisis filogenético de las ORF 2
a 7 de los aislados estadounidenses indicó que hay al menos tres
grupos de variantes de PRRSV (o genotipos minoritarios) dentro del
genotipo de PRRSV estadounidense principal. Por consiguiente, es muy
probable que se examinen varios genotipos mayoritarios o
minoritarios adicionales identificados como más aislados de virus
de diferentes regiones geográficas.
De forma interesante, el aislado estadounidense
menos virulento conocido VR 2431 (ISU 3927) forma una rama distinta
de otros aislados estadounidenses. El análisis de las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos también demostró que el aislado VR
2431 (ISU 3927) presenta la máxima variación en las ORF 2 a 4, con
respecto a otros aislados estadounidenses. Muchas de estas
variaciones en el aislado VR 2431 (ISU 3927), producen sustituciones
de aminoácidos no conservadas. Sin embargo, estos cambios no
conservados en el aislado VR 2431 (ISU 3927), en comparación con
otros aislados estadounidenses, no parecen limitarse a una región
particular; están presentes a lo largo de las ORF 2 a 4. Por lo
tanto, aún no se ha esclarecido completamente una correlación
específica entre las variaciones de secuencia y la virulencia viral
(aunque ciertas posiciones en la ORF 3 parecen estar posiblemente
relacionadas con la virulencia; véase la Fig. 2B, posiciones 30, 48,
54-56, 134, 140, 143, 147, 153, 206 y 215; los
aminoácidos en una o más de estas posiciones pueden servir como base
para mutar otras proteínas conocidas codificadas por la ORF 3 de
PRRSV).
La identidad de secuencias de aminoácidos entre
siete aislados de PRRSV estadounidenses fue de
91-99% en la ORF 2, 86-98% en la
ORF 3, 92-99% en la ORF 4 y 88-97%
en la ORF 5. El aislado estadounidense menos virulento conocido
tiene mayores variaciones de secuencia en las ORF 2 a 4 que en las
ORF 5 a 7, en comparación con otros aislados estadounidenses. En la
glicoproteína de la envuelta principal codificada por la ORF 5 se
identificaron tres regiones hipervariables con potencial
antigénico.
\newpage
La comparación por parejas de las secuencias de
las ORF 2 a 7 y el análisis del árbol filogenético dio a entender
la existencia de al menos tres grupos de variantes de PRRSV (o
genotipos minoritarios) dentro del genotipo principal del PRRSV
estadounidense. El aislado estadounidense menos virulento conocido
forma una rama distinta de otros aislados estadounidenses con
diferente virulencia. Los resultados de este estudio tienen
implicaciones para la taxonomía de PRRSV y el desarrollo de
vacunas.
La Figura 1 muestra una comparación de
secuencias de nucleótidos de las ORF 2 a 5 de los aislados
estadounidenses VR 2431 (ISU 3927), VR 2429 (ISU 22) y VR 2430 (ISU
55) con otros aislados de PRRSV conocidos. La secuencia de
nucleótidos de VR 2385 (ISU 12) se muestra en la parte superior y
sólo se indican las diferencias. El codón de iniciación de cada ORF
se indica por +> y el codón de terminación de cada ORF se indica
por asteriscos (*). Las secuencias de unión
líder-ARNm para los ARNm subgenómicos 3, 4 y
4-1 están subrayadas, y las localizaciones de las
secuencias de unión con respecto al codón de iniciación de cada ORF
se indican por números negativos (-) de nucleótidos cadena arriba
de cada ORF. Las secuencias de VR 2385 (Solicitudes de Patente de
Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435), VR
2332, VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894) (Solicitud de Patente
de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/301.435) usada en este
alineamiento se presentaron previamente.
Para propagar el PRRSV se usó la línea celular
ATCC CRL 11171. Las células se cultivaron en medio esencial mínimo
de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%
y antibióticos 1 X (penicilina G a 10.000 unidades/ml,
estreptomicina a 10.000 mg/ml y anfotericina B a 25 mg/ml).
Se aislaron tres aislados estadounidenses de
PRRSV usados en este estudio, denominados VR 2429 (ISU 22), VR 2430
(ISU 55) y VR 2431 (ISU 3927) a partir de pulmones de cerdo
obtenidos de diferentes granjas de Iowa durante los brotes de PRRS.
Los tres aislados se purificaron en placa tres veces en células CRL
11171 antes de la experimentación adicional. Los estudios de
patogenicidad comparativos demostraron que el aislado ISU 3927 es
el aislado menos virulento entre 10 aislados de PRRSV
estadounidenses diferentes. El aislado VR 2429 (ISU 22) es un
aislado de alta virulencia y el aislado VR 2430 (ISU 55) es
"moderadamente" patogénico. Los tres aislados de virus usados
en este experimento se sometieron a siete pases.
Se infectaron monocapas confluentes de células
CRL 11171 con los tres aislados estadounidenses de PRRSV VR 2429
(ISU 22), VR 2430 (ISU 55) y VR2431 (ISU 3927), respectivamente, a
una multiplicidad de infección (m.d.i.) de 0,1. A las 24 horas
después de la infección, las células infectadas se lavaron tres
veces con tampón PBS frío. Después se aislaron los ARN
intracelulares totales por extracción con isotiocianato de
guanidinio y fenol-cloroformo (Stratagene). La
presencia de especies de ARN con especificidad del virus en la
preparación de ARN se confirmó por hibridación de transferencia de
Northern (datos no mostrados). Los ARN intracelulares totales se
cuantificaron espectrofotométricamente.
Se sintetizó ADN complementario (c) de primera
cadena a partir de los ARN intracelulares totales por transcripción
inversa usando cebadores aleatorios como se ha descrito previamente
(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest. 5:
254-258). Para la amplificación de las regiones
codificantes de la proteína entera de las ORF 2 a 5 de los tres
aislados de PRRSV, se diseñaron dos series de cebadores basándose en
las secuencias de VR 2385 y LV. Los cebadores JM259
(5'-GGGGATCCTTTTGTGGAGCCGT-3')
y JM260
(5'-GGGGAATTCGGGATAGGGAATGTG-3')
amplificaron la secuencia de las ORF 4 y 5 y los cebadores XM992
(5'-GGGGGATCCTGTTGG-TAATAG(A)GTCTG-31
y XM993
(5'-GGTGAATTCGTTTTATTTCCCTCCGGGC-3')
amplificaron la secuencia de las ORF 2 y 3. Se introdujeron sitios
de restricción únicos (EcoRI o BamHI) en el extremo 5' de estos
cebadores para facilitar la clonación. Se sintetizó una base
degenerada, G (A), en el cebador XM 992 basándose en las secuencias
de VR 2385 y LV (Meulenberg et al., 1993; Solicitud de
Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/301.435). La PCR se
realizó como se ha descrito previamente (Meng et al., 1993,
J. Vet. Diagn. Invest., 5: 254-258).
Los productos de RT-PCR se
analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Los dos
fragmentos de PCR que representan las ORF 2 y 3 así como las ORF 4
y 5, respectivamente, se purificaron por el procedimiento Glassmilk
(kit GENECLEAN, BIO 101, Inc.). Cada uno de los fragmentos
purificados se digirió con BamHI y EcoRI y se clonó en el vector
pSK+ como se ha descrito previamente (Meng et al., 1993).
Para la transformación de los plásmidos recombinantes se usaron
células E. coli DH 5\alpha. Se seleccionaron colonias
blancas y se cultivaron el caldo LB que contenía 100 mg/ml de
ampicilina. Las células E. coli que contenían plásmidos
recombinantes se lisaron con lisozima y los plásmidos después se
aislaron usando la columna Qiagen (QIAGEN Inc.).
Los plásmidos que contenían insertos virales se
secuenciaron con un Secuenciador de ADN automático (Applied
Biosystem, Inc.). Se secuenciaron tres o más clones de ADNc
independientes que representaban la secuencia entera de las ORF 2 a
5 de cada uno de los tres aislados de PRRSV con cebadores
universales e inversos. También se usaron varios cebadores con
especificidad de virus, XM969
(5'-GATAGAGTCTGCCCTTAG-3'), XM970
(5'-GGTTT
CACCTAGAATGGC-3'), XM1006 (5'-GCTTCTGAGATGAGTGA-3'), XM077 (5'-CAACCAGGCGTAAACACT-3') y XM078 (5'-CTGAGCAATTACAGAAG-3') para determinar la secuencia de las ORF 2 a 5.
CACCTAGAATGGC-3'), XM1006 (5'-GCTTCTGAGATGAGTGA-3'), XM077 (5'-CAACCAGGCGTAAACACT-3') y XM078 (5'-CTGAGCAATTACAGAAG-3') para determinar la secuencia de las ORF 2 a 5.
Los datos de las secuencias se combinaron y
analizaron usando los programas de Software informático MacVector
(International Biotechnologies, Inc.) y GeneWorks (IntelliGenetics,
Inc.). Se realizaron análisis filogenéticos usando el paquete de
software PAUP versión 3.1.1. (David L. Swofford, Illinois Natural
History Survey, Champaign, IL). PAUP emplea el algoritmo de máxima
parsimonia para construir árboles filogenéticos.
Se determinaron las secuencias de las ORF 2 a 5
de cinco aislados de PRRSV, VR 2474 (ISU 79), VR 2475 (ISU 1894),
VR 2429 (ISU 22), VR 2430 (ISU 55) y VR 2431 (ISU 3927), y se
compararon con otros aislados de PRRSV conocidos incluyendo VR
2385, VR 2332 y LV (Meulenberg et al., 1993). Las secuencias
de las ORF 6 y 7 de los aislados VR 2385, VR 2429 (ISU 22), VR 2430
(ISU 55), VR 2474 (ISU 79), VR 2475 (ISU 1894) y VR 2431 (ISU 3927)
se presentaron previamente (Solicitud de Patente de Estados Unidos
con el Nº de Serie 08/301.435). Se ha demostrado que los aislados
usados en este experimento difieren en neumovirulencia en cerdos
infectados experimentalmente (Solicitudes de Patente de Estados
Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435). VR 2431 (ISU
3927) es el aislado menos virulento entre 10 aislados diferentes de
PRRSV (Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/131.625 y Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de
Serie 08/301.435).
Al igual que otros aislados de PRRSV
estadounidenses, las ORF 2 a 4 de estos aislados solapaban entre sí
(Fig. 1). Sin embargo, a diferencia de LV, las ORF 4 y 5 de los
aislados estadounidenses están separadas por 10 nucleótidos (Fig.
1). Las ORF 4 y 5 de LV solapaban por un nucleótido. La sustitución
de un solo nucleótido desde A del codón de iniciación de la ORF 5
en LV a T en los aislados estadounidenses pone el codón de
iniciación de la ORF 5 de los aislados estadounidenses 10
nucleótidos cadena abajo del codón de terminación de la ORF 4. Por
lo tanto, aparece una secuencia no codificante de 10 nucleótidos
entre las ORF 4 y 5 de los aislados estadounidenses conocidos (Fig.
1).
La ORF 2 de VR 2474 (ISU 79) tiene 3 nucleótidos
menos que otros aislados estadounidenses. La sustitución de un solo
nucleótido desde TGG a TAG justo antes del codón de terminación de
la ORF 2 crea un nuevo codón de terminación de VR 2474 (ISU 79)
(Fig. 1). También se encontró una deleción de 3 nucleótidos en la
ORF 5 de VR 2431 (ISU 3927), en comparación con otros aislados
estadounidenses (Fig. 1). Los tamaños de las ORF 2 a 5 de todos los
aislados estadounidenses son idénticos, con la excepción de la ORF 2
de VR 2473 (ISU 79) y la ORF 5 de VR 2431 (ISU 3927), teniendo
ambas 3 nucleótidos menos que las otras ORF (Fig. 1).
Las comparaciones de secuencia de las ORF 2 a 5
de los 7 aislados de PRRSV estadounidenses mostrados en la Fig. 1
indican que hay variaciones considerables en las secuencias de
nucleótidos en las ORF 2 a 5 de los aislados estadounidenses (Fig.
1). La identidad de secuencias de nucleótidos fue de
96-98% en la ORF 2, 92-98% en la
ORF 3, 92-99% en la ORF 4 y 90-98%
en la ORF 5 entre VR 2385, VR 2332, VR 2429 (ISU 22), VR 2430 (ISU
55), VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894) (Tabla 2).
El aislado menos virulento VR 2431 (ISU 3927)
tiene la mayor variación entre los siete aislados estadounidenses
(Fig. 1 y Tabla 2). La identidad de secuencias de nucleótidos entre
VR 2431 (ISU 3927) y otros aislados estadounidenses fue de
93-94% en la ORF 2, 89-90% en la ORF
3 y 91-93% en la ORF 4 (Tabla 2). Al igual que las
ORF 6 y 7 (Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de
Serie 08/301.435), la ORF 5 de VR 2431 (ISU 3927) no tiene cambios
significativos con la excepción de una deleción de 3 nucleótidos
(Fig. 1). La ORF 5 de VR 2431 (ISU 3927) comparte una identidad de
secuencias de nucleótidos de 91-93% con la ORF 5 de
otros aislados estadounidenses (Tabla 2).
Sin embargo, se encontró una variación de
secuencias considerable en las ORF 2 a 5 entre LV y los aislados
estadounidenses (Fig. 1 y Tabla 2). La identidad de secuencias de
nucleótidos entre LV y los aislados estadounidenses fue de
65-67% en la ORF 2, 61-64% en la ORF
3, 63-66% en la ORF 4 y 61-63% en la
ORF 5 (Tabla 2). También existen variaciones genéticas
considerables en las ORF 6 y 7 entre LV y PRRSV estadounidense
(Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie
08/131.625 y 08/301.435). Estos resultados indican que el aislado
menos virulento VR 2431 (ISU 3927) también es el que está
relacionado de una forma más distante de los aislados
estadounidenses, produciéndose variaciones genéticas principalmente
en las ORF 2 a 4.
La sustitución de un solo nucleótido de TGG a
TAG antes del codón de terminación en la ORF 2 observada en VR 2474
(ISU 79) también estaba presente en los aislados VR 2430 (ISU 55) y
VR 2431 (ISU 3927), produciendo los dos siete ARNm sg, pero no en
los aislados VR 2429 (ISU 22), VR 2475 (ISU 1894) o VR 2385, que
sintetizan cada uno sólo seis ARNm sg (Solicitudes de Patente de
Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435). Los
resultados indican que es muy probable que la secuencia de unión
líder-ARNm 4-1 de VR 2430 (ISU 55) y
VR 2431 (ISU 3927) sean iguales a VR 2474 (ISU 79) (Fig. 1).
Se determinó que las secuencias de unión
líder-ARNm para los ARNm sg 3 y 4 de VR 2474 (ISU
79) y VR 2431 (ISU 1894) eran GUAACC 89 nucleótidos cadena arriba
de la ORF 3 para el ARNm sg 3, y UUCACC 10 nucleótidos cadena
arriba de la ORF 4 para el ARNm sg 4 (Solicitud de Patente de
Estados Unidos con el Nº de Serie 08/301.345; véase también el
Experimento 2 mostrado más adelante). Una comparación de secuencias
de los aislados VR 2429 (ISU 22), VR 2430 (ISU 55) y VR 2431 (ISU
3927) con los aislados VR 2385, VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU
1894) indica que las secuencias de unión líder-ARNm
para los ARNm sg 3 y 4 están conservadas entre los aislados
estadounidenses (Fig. 1).
La Fig. 2 muestra el alineamiento de las
secuencias de aminoácidos deducidas de las ORF 2 (A), ORF 3 (B),
ORF 4 (C) y ORF 5 (D) de los aislados estadounidenses VR 2429 (ISU
22), VR 2430 (ISU 55) y VR 2431 (ISU 3927) con otros aislados de
PRRSV conocidos. La secuencia de VR 2385 se muestra en la parte
superior y sólo se indican las diferencias. Las deleciones están
indicadas por (-). La secuencia del péptido señal propuesta en la
ORF 5 de LV (D) está subrayada (Meulenberg et al., 1995). Se
indicaron tres regiones hipervariables con potenciales antigénicos
en la ORF 5 (D) por asteriscos (*). Las secuencias publicadas usadas
en este alineamiento eran LV (Meulenberg et al., 1993), VR
2385 (Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie
08/131.625 y 08/301.435), VR 2332, VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU
1984) (Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/301.435).
Basándose en el alto contenido de aminoácidos
básicos y su naturaleza hidrófila, se prevé que el producto de
traducción de la ORF 7 sea la proteína de la nucleocápsida
(Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie
08/131.625 y 08/301.435; Meulenberg et al., 1993; Conzelmann
et al., 1993; Mardassi et al., 1994). El producto de
la ORF 6 carece de una posible secuencia señal
amino-terminal y contiene varias regiones
hidrófobas que pueden representar los posibles fragmentos
transmembrana. Por lo tanto, se predijo que el producto de la ORF 6
era la proteína M (Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los
Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435; Meulenberg et al.,
1993; Conzelmann et al., 1993).
El análisis informático demuestra que los
productos codificados por las ORF 2 a 5 de los aislados
estadounidenses tienen características de hidropatía que recuerdan
a las proteínas asociadas a la membrana. Los productos de
traducción de las ORF 2 a 5 contienen un extremo amino hidrófobo.
Las secuencias hidrófobas N-terminales pueden
funcionar como una secuencia señal para cada una de estas ORF, y
pueden estar implicadas en el transporte de las ORF 2 a 5 al
retículo endoplásmico de células infectadas. En el extremo carboxi
se encontró al menos un dominio hidrófobo adicional
en cada una de las ORF 2 a 5. Estos dominios hidrófobos adicionales pueden funcionar como anclajes de membrana.
en cada una de las ORF 2 a 5. Estos dominios hidrófobos adicionales pueden funcionar como anclajes de membrana.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de las
ORF 2 a 5 de los siete aislados estadounidenses examinados también
variaban considerablemente (Fig. 2), indicando que la mayoría de las
diferencias de nucleótidos observadas en la Fig. 1 no son
mutaciones silenciosas. La identidad de secuencias de aminoácidos
entre VR 2385, VR 2332, VR 2429 (ISU 22), VR 2430 (ISU 55), VR 2474
(ISU 79) y VR 2475 (ISU 1984) fue de 95-99% en la
ORF 2, 90-98% en la ORF 3, 94-98%
en la ORF 4 y 88-97% en la ORF 5 (Tabla 2).
De nuevo, el aislado menos virulento VR 2431
(ISU 3927) presentó más variaciones con otros aislados
estadounidenses en las ORF 2 a 4 (Fig. 2 y Tabla 2) que en las ORF
5 a 7 (Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/301.435 y Tabla 2). Las ORF 2 a 5 de LV comparten sólo una
identidad de secuencias de aminoácidos de 57-61%,
55-56%, 65-67% y
51-55% con esas ORF de los aislados estadounidenses,
respectivamente (Tabla 2). Se encontraron deleciones e inserciones
a lo largo de las ORF 2 a 5 en la comparación del aislado de LV
europeo y los aislados estadounidenses (Fig. 2).
La comparación de secuencias del producto de la
ORF 5 demostró que la región N-terminal de la ORF 5
es extremadamente variable, tanto (a) entre los aislados
estadounidenses y LV como (b) entre los diversos aislados
estadounidenses (Fig. 2D). En LV, los primeros
32-33 restos aminoacídicos de la ORF 5 pueden
representar la secuencia señal (Meulenberg et al., 1995;
Fig. 2D). Por lo tanto, la posible secuencia señal de la ORF 5 en
todos los aislados de PRRSV es muy heterogénea. Esta heterogeneidad
no se debe a ninguna presión de selección inmune del hospedador,
porque el péptido señal se escindirá y no estará presente en los
viriones maduros.
También se identificaron tres regiones
hipervariables adicionales comparando las secuencias de aminoácidos
de la ORF 5 de todos los aislados de PRRSV disponibles (Fig. 2D).
Las variaciones de aminoácidos en estas tres regiones son
significativas y no están conservadas estructuralmente (Fig. 2D). El
análisis informático indica que las tres regiones hipervariables
son hidrófilas y antigénicas. De esta manera, es probable que estas
regiones se expongan a la membrana viral y estén bajo la presión de
selección inmune del hospedador. Sin embargo, pueden ser necesarios
otros experimentos para confirmar las funciones específicas de estas
regiones hipervariables como determinantes antigénicos en la
proteína de la envuelta de la ORF 5.
Previamente se ha demostrado que el PRRSV
estadounidense y el PRRSV europeo representan dos genotipos
distintos, basándose en el análisis de los genes M y N ((Solicitud
de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/301.435). Para
determinar las relaciones filogenéticas de los aislados de PRRSV
estadounidenses, primero se alinearon las ORF 2 a 7 del los siete
aislados de PPRSV estadounidenses mostrados en la Fig. 1 y 2 con el
programa GeneWorks (intelligenetics, Inc.). Después se usó el
programa PAUP (David L. Swofford, Illinois Natural History Survey,
Champaign, IL) para construir el árbol filogenético que ilustra la
relación entre los aislados estadounidenses de PRRSV.
El árbol filogenético de la Fig. 3 se construyó
por métodos de máxima parsimonia con la ayuda del paquete de
software PAUP versión 3.1.1. La rama con la menor longitud (más
parsimoniosa) se encontró realizando la opción de búsqueda
exhaustiva. Las longitudes de las ramas (números de sustituciones de
aminoácidos) se proporcionan encima de
cada rama. Las secuencias usadas en el análisis son LV, VR 2385, VR 2332, VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894).
cada rama. Las secuencias usadas en el análisis son LV, VR 2385, VR 2332, VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894).
El árbol filogenético indica que existen al
menos tres grupos de variantes (o genotipos minoritarios) dentro
del genotipo de PRRSV estadounidense principal. El aislado de PRRSV
estadounidense menos virulento, VR 2431 (ISU 3927), forma una rama
distinta de otros aislados estadounidenses (Fig. 3). Los aislados VR
2429 (ISU 22), VR 2474 (ISU 79), VR 2475 (ISU 1894) y VR 2332
forman otra rama que representa un segundo genotipo minoritario. El
tercer genotipo minoritario se representa por los aislados VR 2430
(ISU 55) y VR 2385 (Fig. 3). También se obtuvo un árbol muy similar
analizando los últimos 60 nucleótidos de la ORF 1b de los siete
aislados estadounidenses presentados en la Fig. 1 (datos no
mostrados). También se produjo una topología de árbol idéntica por
el método de agrupamiento por parejas con media aritmética no
ponderada (UPGMA) usando el programa GeneWorks (datos no
mostrados).
En resumen, los diferentes genotipos de PRRSV se
han confirmado y se han esclarecido adicionalmente. Se han
identificado al menos tres genotipos minoritarios dentro del
genotipo mayoritario de PRRSV estadounidense, basándose en un
análisis de la secuencia de las ORF 2 a 7. También se han confirmado
variaciones genéticas no sólo entre los PRRSV europeos y los PRRSV
estadounidenses, sino también entre los aislados de PRRSV
estadounidenses, indicando la naturaleza heterogénea de PRRSV. El
aislado de PRRSV estadounidense menos virulento VR 2431 (ISU 3927)
tiene variaciones de secuencias inesperadamente elevadas en las ORF
2 a 4 en comparación con otros aislados estadounidenses.
\newpage
Experimento
2
Durante la replicación de PRRSV, se sintetizan
seis ARNm subgenómicos (ARNm sg), además del ARN genómico. Estos
ARNm sg se caracterizan en este experimento.
Los ARNm sg de PRRSV forman una serie anidada
3'-coterminal en células infectadas con PRRSV. Cada
uno de estos ARNm sg es policistrónico y contiene múltiples fases
de lectura abierta, excepto el ARNm sg 7 (como se muestran por
análisis de transferencia de Northern usando sondas con
especificidad de ORF). Los ARNm sg no se empaquetaron en viriones y
sólo se detectó el ARN genómico en viriones purificados, lo que
sugiere que la señal de encapsidación de PRRSV probablemente se
localiza en la región de la ORF 1.
Los números de ARNm sg en células infectadas con
PRRSV varían entre aislados de PRRSV con diferente virulencia. En
el Experimento 1 anterior se demostró que una especie adicional de
ARNm sg en algunos aislados de PRRSV procedía de la secuencia
cadena arriba de la ORF 4, y se ha denominado ARNm sg
4-1.
Las secuencias de unión
líder-ARNm de los ARNm sg 3 y 4 de los aislados VR
2474 (ISU79) y VR 2475 (ISU 1894), así como los ARNm sg
4-1 del aislado VR 2474 (ISU 79), contienen un
motivo común de secuencia de seis nucleótidos
T(G)TA(G/C)ACC. El análisis de la
secuencia del ARN genómico de estos dos aislados estadounidenses y
la comparación con el virus Lelystad (LV) reveló heterogeneidad de
las secuencias de unión líder-ARNm entre aislados de
PRRSV. Los números, localizaciones y las secuencias de las regiones
de unión líder-ARNm variaban entre los aislados
estadounidenses y LV, así como entre los aislados estadounidenses.
Los tres últimos nucleótidos, ACC, de las secuencias de unión
líder-ARNm son invariables. Se encontraron
variaciones en los tres primeros nucleótidos.
Comparando la secuencia 5' terminal del ARNm sg
4-1 con la secuencia genómica de VR 2474 (ISU 79) y
VR 2475 (ISU 1894), se descubrió que una sustitución de un solo
nucleótido, de T en VR 2475 (ISU 1894) a C en VR 2474 (ISU 79),
conducía a una nueva secuencia de unión líder-ARNm
en ISU 79 y, por lo tanto, a una especie adicional de ARNm sg (ARNm
sg 4-1). En el extremo 5' del ARNm sg
4-1 se identificó una pequeña ORF, denominada ORF
4-1, con una capacidad de codificación de 45
aminoácidos.
Virus y células. Los aislados de PRRSV
usados (VR 2429 (ISU 22), VR 2430 (ISU 55), VR 2474 (ISU 79), VR
2475 (ISU 1894) y VR 2431 (ISU 3927) se aislaron a partir de
pulmones de cerdo obtenidos de diferentes granjas en Iowa. para el
aislamiento y crecimiento (cultivo) de los virus se usó una línea
celular continua, ATCC CRL 11171. Estos aislados de PRRSV se
clonaron biológicamente por tres vueltas de purificación en placa y
se cultivaron en las células CRL 11171. Todos los aislados de virus
usados en este estudio estaban en el séptimo pase.
VR 2429 (ISU 22) y VR 2474 (ISU 79) son muy
patógenos y producen una consolidación de 50 a 80% de los tejidos
pulmonares en cerdos privados de calostro, nacidos por cesárea, de
cinco semanas de edad, infectados experimentalmente, de los que se
realizaron necropsias a los 10 días después de la inoculación. Por
el contrario, VR 2430 (ISU 55), VR 2475 (ISU 1894) y VR 2431 (ISU
3927) tienen baja patogenicidad y producen sólo una consolidación de
10 a 25% de tejidos pulmonares en el mismo experimento (Solicitudes
de Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y
08/301.435).
Preparación de ARN intracelulares totales con
especificidad de virus, ARN poli (A)* y ARN de viriones. Se
infectaron monocapas confluentes de células CRL 11171 con diferentes
aislados de PRRSV al séptimo pase a una multiplicidad de infección
(m.d.i.) de 0,1. Se aislaron ARN intracelulares totales con
especificidad para PRRSV a partir de las células infectadas con
PRRSV por un método convencional con isotiocianato de guanidinio
(Stratagene). El ARN poli (A)* se enriqueció a partir de los ARN
intracelulares totales por cromatografía en columna de oligo
(dT)-celulosa (Invitrogen).
Para el aislamiento del ARN de los viriones de
PRRSV, se infectaron células CRL 11171 confluentes con el aislado
VR 2431 (ISU 3927) de PRRSV a una m.d.i. de 0,1. Cuando más de 70%
de las células infectadas mostraron un efecto citopático, los
cultivos se congelaron y descongelaron tres veces, y el medio de
cultivo se clarificó a 1200 x g durante 20 min a 4ºC. El virus
después se precipitó con polietilenglicol y posteriormente se
purificó por centrifugación en gradiente de cloruro de cesio como
se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº
de Serie 08/131.625. El virus purificado se trató con RNasa A a una
concentración final de 20 \mu/ml durante 90 min a 37ºC. Después,
el virus se sedimentó y el ARN de los viriones se aisló usando un
método convencional con isotiocianato de guanidinio.
Síntesis de ADNc y reacción en cadena de la
polimerasa. Se sintetizó ADNc a partir de ARN intracelulares
totales por transcripción inversa usando cebadores aleatorios y se
amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR) como se ha descrito previamente (Meng et
al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:
254-258).
Análisis de transferencia de Northern. Se
usaron diez \mug de ARN intracelulares totales procedentes de
células infectadas con virus y células infectadas de forma simulada
por calle en un gel de formaldehído-agarosa. Para
la separación del ARN poli (A)* y el ARN de viriones, se cargaron
quince ng de ARN de virión y 0,2 \mug de ARN poli (A)* por calle.
El ARN se desnaturalizó con formaldehído de acuerdo con un método
convencional (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, Nueva York). La separación electroforética del ARN,
la transferencia del ARN y la hibridación se realizaron como se
describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de
Serie 08/131.625. En algunos experimentos, también se utilizaron
geles de agarosa con glioxal-DMSO como se describe
en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/131.625.
Para la preparación de las sondas, se generó un
fragmento de ADNc específico de cada una de las ORF 1b a 7 por
RT-PCR con cebadores con especificidad de ORF. Los
cebadores se diseñaron de tal forma que cada par de cebadores
amplificara sólo un fragmento específico de una ORF dada, y las ORF
vecinas solapantes no se incluyen en ninguna sonda de ADNc dada.
Los pares de cebadores para generar sondas de ADNc que representan
las ORF 1b a 7 son IM729/IM732 para la ORF 1b, IM312/IM313 para la
ORF 2, XM1022/IM258 para la ORF 3, XM1024/XMI023 para la ORF 4,
PP287/PP286 para la ORF 5, PP289/XM780 para la ORF 6 y PP285/PP284
para la ORF 7 (Tabla 3).
Clonación, secuenciación y análisis de la
secuencia de nucleótidos. Se diseñaron cebadores para
RT-PCR basándose en secuencias del aislado de PRRSV
VR 2385, que amplificaron las regiones codificantes de proteína
entera de las ORF 2 a 5 de los aislados de PRRSV VR 2474 (ISU 79) y
VR 2475 (ISU 1894). Se usaron los cebadores JM259 y JM260 para la
amplificación de las ORF 4 y 5, y se usaron los cebadores XM992 y
XM993 para la amplificación de las ORF 2 y 3 (Tabla 3). Se
introdujeron sitios de restricción únicos (EcoRI y BamHI) en los
extremos de los productos de la PCR, permitiendo de esta manera una
estrategia de casete para reemplazar estas ORF.
Cada uno de los productos de PCR de las ORF
2-3 y ORF 4-5 de VR 2474 (ISU 79) y
VR 2475 (ISU 1894) se dirigió con EcoRI y BamHI, y después se
purificó y clonó en el vector pSK+ como se ha descrito previamente
(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5.
254-258). Los plásmidos que contenían insertos
virales se secuenciaron con un secuenciador de ADN automático
convencional (Applied Biosystems, Inc.). Al menos tres clones de
ADNc que representaban la secuencia entera de las ORF 2 a 5 de cada
aislado de virus se secuenciaron con cebadores universales e
inversos, así como otros cebadores de secuenciación con
especificidad de virus (XM969, XM970, XM1006, XM078 y XM077; véase
la Tabla 3).
Para la determinar las secuencias de unión
líder-ARNm de los ARNm sg 3, 4 y
4-1, se usó el par de cebadores IM755 y DP586
(Tabla 3) para RT-PCR para amplificar las secuencias
5' terminales correspondientes. Los productos de PCR resultantes se
purificaron y secuenciaron por secuenciación de PCR directa usando
cebadores específicos de virus XMD77 y XM141 (Tabla 3). Las
secuencias se combinaron y se analizaron por los programas de
software informáticos MacVector (International Biotechnologies,
Inc.) y GeneWorks (IntelliGenetics, Inc).
Oligonucleótidos. Los oligonucleótidos
sintéticos usados en este estudio se resumen en la Tabla 3. Estos
oligonucleótidos se sintetizaron como ADN monocatenario usando un
sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems) y se
purificaron por cromatografía líquida de alta presión (HPLC).
Los ARNm sg no se empaquetan en viriones de
PRRSV. Para determinar si los ARNm sg de PRRSV se empaquetan,
se purificaron viriones del aislado de PRRSV VR 2431 (ISU 3927) por
gradiente de CsCl. Los viriones purificados se trataron con RNasa A
antes de sedimentar el virión y de extraer el ARN, para retirar
cualquier especie de ARN que pueda haberse adherido a la superficie
del virión. Se separaron ARN de viriones tratados con RNasa A junto
con los ARN intracelulares totales del aislado VR 2431 (ISU 3927) de
células infectadas con PRRSV en un gel de formaldehído y se
hibridaron con una sonda generada a partir de la secuencia 3'
terminal del genoma viral por PCR con cebadores PP284 y PP285
(Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/131.625; Tabla 3).
Sólo se detectó el ARN genómico en los viriones
purificados del aislado de PRRSV VR 2431 (ISU 3927) (Fig. 4) y no
se observaron cantidades detectables de ARNm sg en los viriones
purificados incluso después de 3 semanas de exposición. Por el
contrario, se detectaron siete especies de ARNm sg, además del ARN
genómico, en las células infectadas con VR 2431 (ISU 3927) (Fig.
4). Se observaron resultados similares con otros dos aislados
estadounidenses, VR 2430 (ISU 55) y VR 2474 (ISU 79).
Variación en los números de ARNm sg entre
aislados de PRRSV estadounidenses con diferente virulencia. Se
ha demostrado que todos los arterivirus conocidos antes de la
presente invención, incluyendo el PRRSV estadounidense y el PRRSV
europeo, producen seis ARNm sg, excepto tres variantes de LDV
(LDV-P, LDV-a y
LDV-v), que sintetizan siete ARNm sg. Sin embargo,
en la cepa LDV-C se produce una serie anidada de
seis ARNm sg.
Para comparar si hay cualquier variación en los
ARNm sg entre los aislados de PRRSV estadounidenses, se infectaron
monocapas confluentes de células CRL 11171 con cinco aislados
diferentes de PRRSV estadounidense con diferente virulencia a una
m.d.i. de 0,1. Se aislaron ARN intracelulares totales a partir de
las células infectadas con virus 24 h después de la infección. Se
generó un fragmento de ADNc a partir del extremo 3' del genoma
viral por PCR con los cebadores PP284 y PP285 (Tabla 3). El
fragmento de ADNc se marcó con ^{32}P-dCTP por el
método de extensión de cebador aleatorio, y se hibridó con los ARN
intracelulares totales (separados en un gel de formaldehído).
Los análisis de los ARN demostraron que en las
células infectadas con uno de los cinco aislados de PRRSV
estadounidense con diferente virulencia estaba presente una serie
anidada de seis o más ARNm sg (Fig. 5). Se obtuvieron resultados
similares cuando los ARN intracelulares totales se separaron en un
gel de agarosa con glioxal-DMSO. Los aislados de
PRRSV VR 2430 (ISU 55), VR 2474 (ISU 79) y VR 2431 (ISU 3927)
produjeron siete ARNm sg fácilmente distinguibles, mientras que los
aislados VR 2429 (ISU 22) y VR 2475 (ISU 1894) produjeron seis ARNm
sg (Fig. 5). El aislado de PRRSV estadounidense VR 2385 también
produce seis ARNm sg (Solicitud de Patente de Estados Unidos con el
Nº de Serie 08/131.625). Se localizó una especie adicional de ARNm
sg entre los ARNm sg 3 y 4, y se denominó ARNm sg
4-1. Los ARNm sg diferían poco, si diferían algo, en
tamaño entre los cinco aislados de PRRSV (Fig. 5). Sin embargo, no
parece haber correlación entre la neumovirulencia y el número de
ARNm sg observados en estos cinco aislados.
El ARNm sg 4-1 no es un ARN
interferente defectuoso y no es resultado de la unión no específica
de las sondas a ARN ribosómicos. Se ha demostrado que, en
coronavirus, se generaba una diversidad de ARN interferentes
defectuosos (ARN ID) de diferentes tamaños cuando MHV se sometía a
pases seriados en cultivos de tejidos a una alta m.d.i. También se
observaban ARN ID en células infectadas con torovirus durante el
pase no diluido. Por lo tanto, se investigó la posibilidad de que
el ARNm sg 4-1 de PRRSV fuera un ARN ID.
Para excluir esta posibilidad, la solución madre
de virus original del aislado de PRRSV VR 2474 (ISU 79), que
produce la especie adicional de ARNm sg 4-1, se
sometió a cuatro pases en células CRL 11171 a diferentes m.d.i. de
0,1, 0,01 y 0,001, respectivamente. En un experimento de control, se
realizaron cuatro pases no diluidos de la solución madre de virus
original de VR 2474 (ISU 79). Después de cuatro pases, se aislaron
los ARN intracelulares totales a partir de células infectadas con el
virus y se repitió el análisis de transferencia de Northern con la
misma sonda generada a partir del extremo 3' del genoma viral.
Los análisis de los ARNm sg demostraron que la
especie adicional de ARNm sg 4-1 aún estaba presente
en todas las preparaciones de ARN con diferente m.d.i., así como en
preparaciones de ARN procedentes de pases no diluidos (Fig. 6A).
Además, no hubo interferencia o reducción en la síntesis de otros
ARNm sg en presencia del ARNm sg 4-1, como
normalmente ocurre con el ARN ID.
Se ha demostrado que los ARN ID de MHV
desaparecían después de dos pases de alta dilución. Por lo tanto, si
la solución madre de virus original de VR 2474 (ISU 79) contenía
ARN ID, entonces el ARN ID desaparecía después de cuatro pases de
alta dilución. Los datos experimentales anteriores sugieren que, a
diferencia del ARN ID, la replicación del ARNm sg
4-1 es independiente de la cantidad de virus
convencional. De esta manera, el ARNm sg 4-1 no es
un ARN ID.
En el análisis de transferencia de Northern de
los ARN intracelulares totales, las sondas pueden unirse de manera
no específica a los ARN ribosómicos 18S y 28S, que son abundantes en
las preparaciones de ARN citoplásmico total. Como alternativa, los
ARN ribosómicos abundantes pueden producir retraso de los ARNm sg
con especificidad de virus que pueden co-migrar de
manera ondulada con los ARN ribosómicos en el gel.
Se han observado dos bandas adicionales debidas
a la unión no específica de sondas a los ARN ribosómicos en células
infectadas con LV y en células infectadas con LDV. Por lo tanto, es
posible que el ARNm sg 4-1 de PRRSV se deba a la
unión no específica de sondas a los ARN ribosómicos.
Para descartar esta posibilidad, se aisló ARN
poliadenilado a partir de ARN intracelulares totales de células CRL
11171 infectadas con cualquiera de dos aislados de PRRSV, VR 2430
(ISU 55) y VR 2474 (ISU 79). Tanto VR 2430 (ISU 55) como VR 2474
(ISU 79) producen la especie adicional de ARNm sg
4-1 (Fig. 5). El análisis de transferencia de
Northern del ARN poliadenilado demostró que aún estaba presente la
especie adicional de ARNm sg 4-1 en células
infectadas con cualquiera de estos dos aislados (Fig. 6B), indicando
que el ARNm sg 4-1 no se debe a la unión no
específica de una sonda a los ARN ribosómicos.
Los ARNm sg representan una serie anidada
3'-coterminal y el ARNm sg 4-1
procede de la secuencia cadena arriba de la ORF 4. En células
infectadas con VR 2385 se detectan seis ARNm sg, además del ARN
genómico, usando una sonda de ADNc del extremo 3' del genoma viral
(Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie
08/131.625). De esta manera, al igual que el virus Berne (BEV),
LDV, EAV, los coronavirus y LV, la replicación de PRRSV
estadounidense también requiere la síntesis de una serie anidada
3'-coterminal de ARNm sg (Solicitudes de Patente de
Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435).
Para analizar estos ARNm sg con más detalle, se
amplificaron por PCR siete fragmentos de ADNc específicos para cada
una de las ORF 1b a 7. El diseño de los cebadores para la PCR se
basó en la secuencia de VR 2385. Las secuencias y localizaciones de
los cebadores, IM729 e IM782 para la ORF 1b, IM312 e IM313 para la
ORF 2, XM1022 e IM258 para la ORF 3, XM1024 y XM1023 para la ORF 4,
PP286 y PP287 para la ORF 5, PP289 y XM780 para la ORF 6 y PP284 y
PP285 para la ORF 7 y la región 3' no codificante (NCR), se muestran
en la Tabla 3. Los cebadores se diseñaron de tal forma que cada
serie de cebadores sólo amplificara un fragmento de una ORF
particular, y las secuencias solapantes entre ORF vecinas no se
incluyen en ningún fragmento dado. Por lo tanto, cada uno de estos
siete fragmentos de ADN representa sólo una ORF particular con la
excepción del fragmento 7, que representa tanto la ORF 7 como
3'-NCR.
Estos siete fragmentos de ADN se marcaron con
^{32}P-dCTP e hibridaron con transferencias de
Northern de ARN intracelulares totales extraídos de células
infectadas con cualquiera de dos aislados estadounidenses de PRRSV,
VR 2475 (ISU 1894) y VR 2474 (ISU 79). Como control se incluyeron
los ARN intracelulares totales aislados a partir de células CRL
11171 infectadas de forma simulada.
Los análisis de transferencia de Northern
demostraron que la Sonda 1, generada a partir de la ORF 1b,
hibridaba sólo con el ARN genómico. Las Sondas 2 a 7 hibridaban
cada una con una o más especies de ARN adicionales además del ARN
genómico (Fig. 7). Los resultados indican que se forma una serie
anidada 3'-coterminal de seis ARNm sg de VR 2475
(ISU 1894) o más ARNm sg de VR 2474 (ISU 79) en las células
infectadas con PRRSV (Figs. 7A y 7B), codificando el ARN
3'-terminal más pequeño (ARNm sg 7) la ORF 7. Todos
los ARNm sg del PRRSV estadounidense contienen el extremo 3' del
ARN genómico, pero se extienden varias distancias hacia el extremo
5' del genoma, dependiendo del tamaño del ARNm sg dado.
El ARNm sg 4-1 del aislado de
PRRSV VR 2474 (ISU 79) hibridaba con las sondas 4 a 7, pero no con
las sondas 1, 2 y 3 (Fig. 7B), lo que sugiere que el ARNm sg
4-1 contiene las ORF 4 a 7, así como el
3'-NCR. Por lo tanto, el ARNm sg
4-1 se genera a partir de la secuencia cadena arriba
de la ORF 4.
Una sustitución de un solo nucleótido conduce
a la adquisición de la especie adicional del ARNm sg
4-1. Los datos de hibridación de transferencia
de Northern demostraron que el ARNm sg 4-1 procede
de la secuencia cadena arriba de la ORF 4 (Fig. 7B). Para
determinar la localización exacta y la secuencia de unión
líder-ARNm del ARNm sg 4-1, se
diseñó una serie de cebadores, IM755 y DP586 (Tabla 3). El cebador
directo IM755 se basó en el extremo 3' de la secuencia líder de VR
2385, y el cebador inverso DP586 se localiza en la ORF 4 (Tabla
3).
La RT-PCR con los cebadores
IM755 y DP586 se realizó usando ARN intracelulares totales aislados
a partir de células infectadas con VR 2475 (ISU 1894) o VR 2474
(ISU 79). VR 2474 (ISU 79) produce ARNm sg 4-1, pero
VR 2475 (ISU 1894) no (Fig. 5). Se aplicó un tiempo de extensión de
PCR de 30 segundos para amplificar preferentemente los fragmentos
cortos que representaban las secuencias 5' terminales de los ARNm sg
3, 4 y 4-1.
El análisis de los productos de
RT-PCR demostró que dos fragmentos con tamaños de
aproximadamente 1,1 kb y 0,45 kb se amplificaban a partir de los
ARN totales de las células infectadas con virus VR 2475 (ISU 1894)
(Fig. 8A). Estos dos fragmentos representan partes 5' de los ARNm sg
3 y 4, respectivamente. Además de los dos fragmentos observados en
el aislado VR 2475 (ISU 1894), también se amplificó un tercer
fragmento de aproximadamente 0,6 kb que representaba la parte 5'
del ARNm sg 4-1 a partir de los ARN totales de
células infectadas con VR 2474 (ISU 79) (Fig. 8A).
Para determinar las secuencias de unión
líder-ARNm de los ARNm sg 3, 4 y
4-1, los productos de RT-PCR de VR
2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894) se purificaron a partir de un gel
de agarosa usando un kit GENECLEAN (Bio 101, Inc.) y se
secuenciaron directamente con un Secuenciador de ADN automático
(Applied Biosystems). Los cebadores usados para secuenciar el
extremo 5' de los productos de RT-PCR (XM141 y
XM077, Tabla 3) se diseñaron basándose en las secuencias genómicas
de VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894) (Fig. 9). Las secuencias de
unión líder-ARNm (en las que el líder une el cuerpo
del ARNm durante la síntesis de los ARNm sg) de los ARNm sg 3, 4 y
4-1 de los dos aislados de PRRSV estadounidense se
determinaron comparando las secuencias del extremo 5' de los ARNm
sg y el ARN genómico de los dos aislados (Fig. 8B).
Las secuencias de unión
líder-ARNm de los ARNm sg 3 y 4 de VR 2475 (ISU
1894) y VR 2474 (ISU 79) eran idénticas. Para el ARNm sg 3, la
secuencia de unión líder (GUAACC) se localiza 89 nucleótidos
cadena arriba de la ORF 3. Para el ARNm sg 4, UUCACC se
localiza 10 nucleótidos cadena arriba de la ORF 4 (Fig. 8B y Fig.
9). La secuencia de unión líder-ARNm del ARNm sg
4-1 de VR 2474 (ISU 79) es UUGACC, localizada
236 nucleótidos cadena arriba de la ORF 4 (Figs. 8B y 9).
El alineamiento de las secuencias genómicas de
VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894) demuestra que la sustitución
de un solo nucleótido, de T en VR 2475 (ISU 1894) a C en VR 2474
(ISU 79), conduce a la adquisición de una secuencia de unión
líder-ARNm adicional, UUGACC, en VR 2474 (ISU
79) (Figs. 8B y 9). Por lo tanto, se forma una especie más de ARNm
sg (4-1) (Fig. 5). Además de las ORF 4 a 7
contenidas dentro del ARNm sg 4, el ARNm sg 4-1
contiene en el extremo 5' una ORF pequeña adicional (ORF
4-1) con una capacidad codificante de 45 aminoácidos
(Fig. 9). Esta pequeña ORF se detiene justo un nucleótido antes del
codón de iniciación de la ORF 4.
El análisis de secuencias de las ORF 2 a 7 de
dos aislados estadounidenses revela heterogeneidad de las secuencias
de unión líder-ARNm. Se clonaron y secuenciaron
las ORF 2 a 5 de VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894) (véase el
Experimento 1 anterior). VR 2474 (ISU 79) produce siete ARNm sg
fácilmente distinguibles, mientras que VR 2475 (ISU 1894) produce
seis ARNm sg distinguibles (Figs. 5 y 7). Se secuenciaron al menos
tres clones de ADNc en cualquier región dada de las ORF 2 a 5 para
cada aislado de virus, usando cebadores universales e inversos, así
como cebadores con especificidad de virus XM969, XM970, XM1006,
XM078 y XM077 (Tabla 3). En la Solicitud de Patente de Estados
Unidos con el Nº de Serie 08/301.435 se describen las secuencias de
las ORF 6 y 7 de VR 2475 (ISU 1894) y VR 2474 (ISU 79).
El análisis de la secuencia demostró que las ORF
2 a 7 de VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU 1894) solapan entre sí,
con la excepción de una región no codificante de 10 nucleótidos
entre la ORF 4 y la ORF 5. La misma observación se hizo previamente
para VR 2385 (Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de
Serie 08/301.435). Esto es muy poco habitual, ya que todos los
miembros de la familia Arteriviridae propuestos, incluyendo
LV, contienen ORF solapantes. Sin embargo, las ORF de coronavirus
se separan por secuencias no codificantes intergénicas. Por lo
tanto, el PRRSV estadounidense parece ser algo similar a los
coronavirus en términos de la organización genómica en las regiones
de unión de las ORF 4 y 5.
La ORF 2 de VR 2475 (ISU 1894) tenía un
aminoácido más que la de ISU 79 (Fig. 9). El codón de terminación
de la ORF 2, TAG, se cambió por TGG en VR 2475 (ISU 1894)
inmediatamente seguido de un nuevo codón de terminación TAG en VR
2475 (ISU 1894) (Fig. 9). Los tamaños de otras ORF de VR 2474
(ISU79) y VR 2475 (ISU 1894) eran idénticos (Fig. 9). No hubo
deleciones o inserciones en las ORF 2 a 7 de estos aislados. Sin
embargo, están presentes numerosas sustituciones a lo largo de toda
la secuencia de las ORF 2 a 7 entre VR 2474 (ISU 79) y VR 2475 (ISU
1894) (Fig. 9).
Los números y localizaciones de las secuencias
de unión líder-ARNm determinadas o previstas
variaban entre VR 2475 (ISU 1894) y VR 2474 (ISU 79) (Fig. 9).
Además de la secuencia de unión líder-ARNm 4
regular, TTCACC, 10 nucleótidos cadena arriba de la ORF 4,
había una secuencia de unión líder-ARNm
4-1 adicional (TTGACC) localizada 236
nucleótidos cadena arriba de la ORF 4 en VR 2474 (ISU 79) (Fig. 9).
Las secuencias de unión líder-ARNm de los ARNm sg 4
y 4-1 estaban separadas por 226 nucleótidos, lo cual
se correlaciona con los tamaños estimados de los ARNm sg 4 y
4-1 observados en el análisis de transferencia de
Northern (Fig. 5) y amplificación por RT-PCR (Fig.
8A).
La secuencia de unión líder-ARNm
3 es idéntica entre VR 2475 (ISU 1894) y VR 2474 (ISU 79)
GTAACC, localizada 89 nucleótidos cadena arriba de la ORF 3.
Las secuencias de unión líder-ARNm previstas de los
ARNm sg 2 y 6 de VR 2475 (ISU 1894) y VR 2474 (ISU 79) también eran
iguales (Fig. 9).
Sin embargo, las secuencias de unión
líder-ARNm 5 previstas de VR 2475 (ISU 1894) y VR
2474 (ISU 79) son diferentes (Fig. 9). Hay 3 posibles secuencias de
unión líder-ARNm 5 para VR 2474 (ISU 79)
(GCAACC, GAGACC y TCGACC, localizadas 55, 70 y
105 nucleótidos cadena arriba de la ORF 5, respectivamente). También
se encontraron dos secuencias de unión líder-ARNm 5
potenciales en VR 2475 (ISU 1894) (GAAACC y TCGACC,
localizadas 70 y 105 nucleótidos cadena arriba de la ORF 5,
respectivamente) (Fig. 9). Las diferencias se debían a las
sustituciones de dos nucleótidos en las secuencias de unión
líder-ARNm 5 previstas de estos aislados (Fig.
9).
Además de la secuencia de unión
líder-ARNm 7 15 nucleótidos cadena arriba de la ORF
7, se encontró una secuencia de unión líder-ARNm 7
adicional (ATAACC), localizada 129 nucleótidos cadena arriba
de la ORF 7 en cada uno de estos dos aislados (Fig. 9). Sin
embargo, el ARNm sg correspondiente a esta secuencia de unión
líder-ARNm 7 adicional no se distinguía claramente
del ARNm sg 7 abundante que producía una banda muy difusa en la
transferencia de Northern (Figs. 5, 6 y 7).
También se encontraron variaciones en los
números y localizaciones de las secuencias de unión
líder-ARNm entre LV y los dos aislados
estadounidenses analizados en este experimento comparando las
secuencias de unión líder-ARNm de LV con las de los
dos aislados estadounidenses VR 2475 (ISU 1894) y VR 2474 (ISU 79).
Considerados conjuntamente, estos datos indican que los ARNm sg de
PRRSV son polimórficos y los números y los tamaños exactos de los
ARNm sg dependen del aislado de PRRSV particular analizado. Sin
embargo, una serie anidada de seis ARNm sg refleja con mayor
probabilidad la organización y transcripción del genoma de
arterivirus convencional.
- a.
- Los oligonucleótidos se diseñaron basándose en los datos de secuencia presentados en esta solicitud y en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos con los Nº de Serie 08/131.625 y 08/301.435.
- b.
- Los oligonucleótidos complementarios al ARN genómico tienen polaridades negativas (-).
Claims (15)
1. Una preparación purificada que comprende un
ácido polinucleico que codifica al menos un polipéptido seleccionado
entre:
- una proteína con la secuencia de ISU55 mostrada en la Fig. 2A, codificada por la ORF 2 del aislado de PRRSV depositado en la ATCC con el Nº de Acceso VR 2430;
- una proteína con la secuencia de ISU55 mostrada en la Fig. 2B, codificada por la ORF 3 de VR 2430;
- una proteína con la secuencia de ISU55 mostrada en la Fig. 2C, codificada por la ORF 4 de VR 2430;
- una proteína con la secuencia de ISU55 mostrada en la Fig. 2D, codificada por la ORF 5 de VR 2430,
- donde la preparación purificada no es el virus VR 2430 natural.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La preparación purificada de la
reivindicación 1, donde dicho ácido polinucleico codifica una
proteína con la secuencia de ISU55 mostrada en la Fig. 2D,
codificada por la ORF 5 de VR 2430.
3. Una preparación purificada que comprende un
ácido polinucleico que tiene la fórmula (V):
5'-
\varepsilon - \zeta - \iota - \kappa - \xi
-3'
en la
que
\kappa, es un polinucleótido que comprende
genes que codifican dicho al menos un polipéptido y opcionalmente
uno o más genes unidos operativamente al mismo que se seleccionan
entre el grupo consistente en (a) un marcador o gen indicador
convencional, (b) genes que codifican al menos un polipéptido o
fragmento antigénico del mismo, codificado por una ORF 5 de una
cepa Iowa de PRRSV; y (c) genes que codifican al menos un
polipéptido, o un fragmento antigénico del mismo, codificado por
una ORF 6 u ORF 7 de una cepa Iowa de PRRSV;
\varepsilon que está presente opcionalmente,
es una secuencia polinucleotídica 5' terminal que proporciona un
medio para expresar operativamente el polinucleótido \kappa;
\zeta es un polinucleótido de la fórmula KTV
ACC, donde K es T, G o U, y V es A, G o C;
\iota es un polinucleótido de aproximadamente
130 nucleótidos de longitud como máximo;
y \xi que está presente opcionalmente y que
puede estar unido operativamente a \varepsilon, es una secuencia
polinucleotídica 3' terminal que no reprime la expresión operativa
del polinucleótido \kappa,
\newpage
donde el ácido polinucleico no consiste en la
secuencia
4. La preparación purificada de la
reivindicación 1, donde dicho ácido polinucleico codifica al menos
una región hipervariable de una proteína codificada por una ORF 5
de una cepa Iowa de PRRSV.
5. Un ácido polinucleico que codifica al menos
un polipéptido que comprende al menos una región hipervariable de
la ORF 5 de una cepa Iowa de PRRSV, seleccionado entre:
- la región hipervariable 1: SNDSSSH, SSSNSSH, SANSSSH, HSNSSSH, SNSSSSH, NNSSSSH, NGGDS ST(Y);
- la región hipervariable 2: ANKFDWAVET, ANKFDWAVEP, AGEFDWAVET, ADKFDWAVEP, ADRFD WAVEP, SSHFGWAVET; y
- la región hipervariable 3: LTCFVIRFA, LICFVIRFT, LACFVIRFA, LTCFVIRFV, LCTFIIR FA, FICFVIRFA, FVCFVIRAA.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El ácido polinucleico de la reivindicación 5,
donde el polipéptido comprende secuencias de aminoácidos
adicionales de una ORF 5 de PRRSV.
7. Un polipéptido purificado codificado por el
ácido polinucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Una vacuna que comprende (a) una cantidad
eficaz del polipéptido de la reivindicación 7 para proteger a un
cerdo contra el síndrome reproductivo y respiratorio porcino, y (b)
un vehículo fisiológicamente aceptable.
9. Una vacuna que comprende (a) una cantidad
eficaz del ácido polinucleico de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7 para proteger a un cerdo contra el síndrome reproductivo y
respiratorio porcino, y (b) un vehículo fisiológicamente
aceptable.
10. Un anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido de la reivindicación 7.
11. El anticuerpo de la reivindicación 10, donde
dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
12. Uso de un anticuerpo de acuerdo con las
reivindicaciones 10 u 11, en la preparación de un medicamento para
tratar a un cerdo que padece el síndrome reproductivo y respiratorio
porcino.
13. Un kit de diagnóstico para ensayar el virus
del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, que comprende el
anticuerpo de la reivindicación 10 o la reivindicación 11 y un
agente de diagnóstico que indica una reacción inmunológica positiva
con dicho anticuerpo.
14. Un método para producir un polipéptido, que
comprende expresar el ácido polinucleico de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en un sistema de expresión operativo.
15. Un vector de expresión que contiene el ácido
polinucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 bajo el
control operativo de un promotor.
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